CN113151459A - Bcr-abl1突变基因t315i的荧光检测方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，公开了一种BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途，BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：环状DNA模板的制备；DNAzyme特异性识别剪切反应；T4PNK特异性修饰；滚环扩增反应介导信号放大。本发明通过脱氧核酶DNAzymes特异性识别剪切、T4多核苷酸激酶T4PNK特异性修饰、滚环扩增反应RCA介导信号放大，成功构建了可用于T315I mRNA特异性检测的荧光方法，应用本发明策略对T315IRNA的测定，灵敏度高，重现性和稳定性好，能够满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

Description

BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途。

背景技术

目前，慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，大约95％的CML患者会出现9号染色体和22号染色体长臂之间的染色体易位，即t(9；22)(q34；q11)产生的费城染色体(Ph)。染色体易位的结果是基因重新组合形成特异性的BCR-ABL融合基因，导致下游一系列信号通路过度活化表达，引起细胞恶性增殖。选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibition，TKI)是治疗CML的重要手段，但是，ABL激酶结构域发生突变或其他原因会导致肿瘤耐药。其中，T315I突变是最重要的突变之一，一旦出现T315I突变，患者对现有的一、二代TKIs均耐药，预后极差。因此，尽早检出T315I突变对指导CML患者下一步用药及治疗，改善预后具有重要意义。

目前，基于聚合酶链式反应(Ranscription-polymerase chain reaction，PCR)的实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是临床检验BCR-ABL融合基因的常用技术。但RT-PCR只能定性，不能定量检测靶标分子，并且可能会因为RNA的降解造成假阴性，误导临床诊断。q-PCR技术克服了RT-PCR的缺陷，可以准确定量检测，但因为敏感性极高，存在一定的假阳性率。另外，PCR检测的普遍缺点是过程繁琐，体系复杂，耗时长、成本高。荧光原位杂交(FISH)技术通过染色体上荧光信号的分布，能直观地判断相应靶标分子的表达情况。但FISH检测的操作过程比较复杂，容易因为前处理不当造成结果假阳性或假阴性。另外，FISH检测费用高，还需要专业的仪器设备，因此，很难在临床检验中大规模推广。近年来，生物传感技术日益发展，基于电化学，荧光共振转移等多种平台的BCR-ABL融合基因检测方法种类很多，但检测性能参差不齐，对T315I突变基因的鉴别能力有待考量。

因此，为满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，现有技术旨在建立一种高灵敏、高特异性的荧光检测方法，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)临床检验BCR-ABL融合基因的常用技术中，RT-PCR只能定性，不能定量检测靶标分子，并且可能会因为RNA的降解造成假阴性，误导临床诊断；q-PCR技术由于敏感性极高，存在一定的假阳性率；PCR检测过程繁琐，体系复杂，耗时长、成本高。

(2)FISH检测的操作过程比较复杂，容易因为前处理不当造成结果假阳性或假阴性。另外，FISH检测费用高，还需要专业的仪器设备，很难在临床检验中大规模推广。

(3)现有基因检测方法性能参差不齐，对T315I突变基因的鉴别能力有待考量。

解决以上问题及缺陷的难度为：

1)现有的突变检测多通过基因测序方法或Taqman突变检测分析方法实现，该类方法成本高，且需要特殊、高端的仪器设备，普通的检测实验室难以配备。2)DNAzyme对底物RNA的特殊识别需要严格的碱基互补配对作用，后续的滚环扩增反应中，剪切引物同滚环模板之间需要严格的碱基互补配对。

解决以上问题及缺陷的意义为：

1)该专利主要利用DNAzyme对RNA的特殊识别及剪切作用，可在37℃的环境下无需特殊的扩增、检测仪器，即可特异性识别BCR-ABL1基因T315I突变位点，通过一系列等温扩增反应即可实现该位点的突变定量检测；且本专利涉及的检测方法中DNA设计合成成本低，环境耐受好，可极大降低目前突变位点的检测成本。2)通过合理设计DNAzyme序列，使其包含酶活性区及完全互补配对的靶RNA序列识别区，可实现单碱基突变位点T315I的识别及特异性剪切；通过科学设计滚环模板DNA序列同T315I序列严格互补，可实现剪切后产物的准确扩增，最终实现BCR-ABL1基因T315I位点的特异、高效扩增及定量检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。

本发明另一目的在于提供一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：

(1)本发明所涉及T315I检测所需DNA序列如下表所示：

表1本发明涉及T315I突变位点检测所需相关DNA序列

其中，1)T315I为RNA序列，其中粗下划线表示剪切后的f1产物，波浪线表示f2产物；其中斜体U为突变位点；2)T-DNAzyme序列中双下划线表示DNAzyme的催化活性区域；其两端为同T315I序列互补区域；3)Cir-DNA序列中单下划线表示环状模板同f1互补DNA序列；(4)序列T315I/S1和T315I/S2与T315I不同点在于突变位点U分别替换为单碱基G和单碱基A，作为特异性实验的干扰RNA序列。

(2)在均相反应体系中，当T315I基因存在时，T-DNAzyme同T315I基因序列识别并互补；在Mg²⁺存在的条件下，用T-DNAzyme的酶活性催化区域激活产生剪切活性，将T315I基因剪切为两段裂解产物f1和f2，并在f1的3’端剪切位点产生3’端2’3’-环磷酸二酯末端和f2的5’端剪切位点产生5’端羟基末端；

(3)利用T4 PNK酶进行修饰，切除f1的2’3’-环磷酸二酯末端并引入3’-OH末端，经T4 PNK修饰过的f1命名为f1’；

(4)反应过后，f1’片段可以当作引物，引发滚环扩增反应；在phi29 DNA聚合酶的作用下，RCA反应产生大量含重复序列的单链DNA；

(5)RCA产生的单链DNA与体系中存在的拉链探针发生链置换反应，单链DNA与携带荧光基团的D-oligo完全互补，置换出游离C-oligo，导致荧光信号的产生，通过检测荧光信号强度即可获知T315I基因的量。

进一步，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括以下步骤：

步骤一，环状DNA模板的制备；

步骤二，DNAzyme特异性识别剪切反应；

步骤三，T4 PNK特异性修饰；

步骤四，滚环扩增反应介导信号放大。

进一步，步骤一中，所述环状DNA模板的制备，包括：

(1)将浓度为2μM的5’端磷酸化后的线性DNA模板Cir-DNA和浓度为6μM的连接模板Ligation混合于1×T4 DNA连接缓冲液中，加热至90℃反应5min，随后缓慢冷却至室温，使Cir-DNA和Ligation之间进行杂交反应；

(2)向反应液中加入3.5U/μL的T4 DNA连接酶，充分混匀，于16℃孵育16h完成连接反应；反应后温度升至65℃保持10min，使连接酶失去活性；

(3)向反应产物中加入0.25U/μL的Exo I和5U/μL的Exo III，于37℃孵育5h以消化未成环的单链DNA或非特异性杂交的双链DNA，反应结束后温度升至80℃孵育20min使外切酶失去活性；

(4)反应结束后，环状DNA模板制备完成，4℃下可保存1月。

进一步，所述1×T4 DNA连接缓冲液包括：100mM氯化镁，400mM Tris-盐酸，5mMATP，100mM DTT，pH 7.8。

进一步，步骤二中，所述DNAzyme识别剪切反应，包括：

(1)反应液配制：2μM DNAzyme探针，2U/μL的RNase抑制剂混合于1×缓冲液中；

(2)识别剪切反应：将不同浓度的T315I分子添加至上述反应液中，最终体积为10μL，充分混合后于37℃孵育30min；随后利用pH 8.0的乙二胺四乙酸盐调节浓度，使其终浓度为30mM，终止剪切反应。

进一步，所述1×缓冲液包括：10mM Tris-盐酸，100mM氯化镁，100mM氯化钾，0.01mg/mL BSA。

进一步，步骤三中，所述T4 PNK修饰，包括：

将0.5μL浓度为0.5U/μL的T4 PNK加入至催化剪切反应的产物中，此时反应液最终体积为10.5μL，充分混合后于37℃孵育30min。

进一步，步骤四中，所述滚环扩增反应，包括：

(1)工作液的配制：250μM的dNTPs混合液、0.5U/μL的phi29 DNA聚合酶，500nM的环状DNA模板，0.2mg/mL的BSA以及1μM的拉链探针(1μM D-oligo同1μM C-oligo混合加热至90℃并保持5min，随后缓慢降温至室温，得到拉链探针)混合于1×phi29 DNA聚合酶缓冲液；

(2)滚环扩增反应：将T4 PNK修饰反应后的产物10.5μL加入滚环扩增反应工作液中，最终体积100μL，充分混合后于37℃孵育1h；将反应最终产物100μL置于石英比色皿中，室温下使用Cary Eclipse荧光分光光度计在480nm的激发波长、5nm的狭缝尺寸下记录500nm-600nm的荧光光谱，并将518nm处的荧光强度用于数据分析。

进一步，所述1×phi29 DNA聚合酶缓冲液包括：10mM硫酸铵，50mM Tris-盐酸，4mMDTT，10mM氯化镁，pH 7.5。

本发明的另一目的在于提供一种慢性粒细胞白血病检测试剂盒，所述慢性粒细胞白血病检测试剂盒包含所述用途中的BCR-ABL1突变基因T315I。

该慢性粒细胞白血病检测试剂盒用于BCR-ABL1突变基因T315I位点的检测与市场上现有的突变位点检测方法相比，所具备的优点及积极效果为：1)本发明通过脱氧核酶(Deoxyribozymes，DNAzymes)特异性识别剪切、T4多核苷酸激酶(T4 PNK)特异性修饰、滚环扩增反应(Rolling circle amplification，RCA)介导信号放大，成功构建了可用于T315ImRNA特异性检测的荧光方法；2)应用本发明策略对T315I mRNA的测定，灵敏度高，重现性和稳定性好；3)该专利检测试剂盒主要包含多条DNA序列及反应相关生物酶，DNA序列成本较低，环境稳定性能好，且扩增反应条件为37℃的恒温条件，无需温度灵敏且精密可控的高端仪器设备，降低了现有检测成本及检测条件；4)实验结果证明，本发明提供的荧光检测T315I mRNA分子的方法是可行的，有望用于临床慢粒病人骨髓样本及血液样本中靶标T315I mRNA的准定量确检测，并能够满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A是本发明实施例提供的PAGE凝胶电泳结果示意图；

图中：泳道1：T-DNAzyme；泳道2：T-DNAzyme和T315I RNA；泳道3：Mg²⁺作用下，T-DNAzyme剪切T315I RNA所得产物；泳道4：泳道3产物添加T4 PNK酶；泳道5：泳道3产物添加phi29 DNA聚合酶及环状模板；泳道6：泳道3产物在T4 PNK酶修饰后进行RCA反应产物。

图1B是本发明实施例提供的T315I RNA荧光检测方法对T315I RNA及空白对照荧光检测曲线示意图。

图2是本发明实施例提供的不同反应流程下，反应体系荧光信号结果图(误差棒：标准偏差，n＝3)。

图3A是本发明实施例提供的不同Mg²⁺浓度下，反应体系荧光信号结果图。

图3B是本发明实施例提供的不同Mg²⁺浓度下，DNAzyme剪切产物PAGE电泳结果图。

图4A是本发明实施例提供的不同反应时间下，DNAzyme剪切产物PAGE电泳结果图。

图4B是本发明实施例提供的不同反应时间下，反应体系荧光信号结果图。

图5是本发明实施例提供的9个不同浓度T315I RNA(0，1f M，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM)的荧光信号结果图及线性拟合标准曲线图。

图6是本发明实施例提供的制备的荧光检测T315I RNA方案特异性分析结果图。

图7是本发明实施例提供的T-DNAzyme作用BCR-ABL1突变基因T315I的mRNA的原理示意图。

图8是本发明实施例提供的催化剪切诱导扩增反应用于T315I突变基因检测示意图。

图9是本发明实施例提供的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。

如图9所示，本发明实施例提供的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括以下步骤：

S101，环状DNA模板的制备；

S102，DNAzyme特异性识别剪切反应；

S103，T4 PNK特异性修饰；

S104，滚环扩增反应介导信号放大。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：构建BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法

1、材料与方法

1.1材料

Phi29 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶(PNK)、RNase抑制剂购自新英格兰Biolabs公司(中国北京)。T4 DNA连接酶、外切酶I、外切酶III、dsDNA标记和DNA片段纯化试剂盒购自TaKaRa(中国大连)。吐温、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、4’，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI)、4％多聚甲醛固定液、抗褪色固定介质、dNTPs等均为分析试剂级，购自生工生物(中国上海)，不需要进一步纯化即可使用。所有溶液均采用Millipore Milli-Q超纯水(Millipore,MA)配制。DNA和RNA序列分别购自生工生物(中国上海)和TaKaRa(中国大连)。

1.2检测仪器

Cary Eclipse荧光分光光度计为美国安捷伦公司产品。

1.3检测原理

如图7所示，在均相反应体系中，当T315I基因存在时，可用T-DNAzyme特异性识别并互补结合T315I基因序列，在Mg²⁺存在的条件下，激活T-DNAzyme的剪切活性，将T315I基因剪切为两段裂解产物(f1和f2)，并在f1的3’端剪切位点产生3’端2’3’-环磷酸二酯末端和f2的5’端剪切位点产生5’端羟基末端。然后，T4 PNK酶进行修饰，切除f1的2’3’-环磷酸二酯末端并引入3’-OH末端(经T4 PNK修饰过的f1命名为f1’)。反应过后，f1’片段可以当作引物，引发滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)反应。在phi29 DNA聚合酶的作用下，RCA反应产生大量含重复序列的单链DNA。随后，RCA产生的单链DNA与体系中存在的拉链探针发生链置换反应，单链DNA与携带荧光基团的D-oligo完全互补，置换出游离C-oligo，导致荧光信号的产生，通过检测荧光信号强度即可获知T315I基因的量。

2、环状DNA模板的制备

将浓度为2μM的5’端磷酸化后的线性DNA模板(Cir-DNA)和浓度为6μM的连接模板(Ligation)混合于1×T4 DNA连接缓冲液(100mM氯化镁，400mM Tris-盐酸，5mM ATP，100mMDTT，pH 7.8)中，加热至90℃反应5min，随后缓慢冷却至室温，使Cir-DNA和Ligation之间进行杂交反应。随后，向反应液中加入3.5U/μL的T4 DNA连接酶，充分混匀，于16℃孵育16h完成连接反应；反应后温度升至65℃保持10min，使连接酶失去活性。然后，向上述反应产物中加入0.25U/μL的Exo I和5U/μL的Exo III，于37℃孵育5h以消化未成环的单链DNA或非特异性杂交的双链DNA，反应结束后温度升至80℃孵育20min使外切酶失去活性。反应结束后，环状DNA模板制备完成，4℃下可保存1月。

3、T-DNAzyme识别剪切反应

(1)反应液配制：2μM T-DNAzyme探针，2U/μL的RNase抑制剂混合于1×缓冲液中(10mM Tris-盐酸，100mM氯化镁，100mM氯化钾，0.01mg/mL BSA)

(2)识别剪切反应：将不同浓度的T315I分子添加至上述反应液中，最终体积为10μL，充分混合后于37℃孵育30min。随后利用乙二胺四乙酸盐(pH 8.0)调节浓度，使其终浓度为30mM，终止剪切反应。

4、T4 PNK修饰

将0.5μL浓度为0.5U/μL的T4 PNK加入至催化剪切反应的产物中，此时反应液最终体积为10.5μL，充分混合后于37℃孵育30min。

5、滚环扩增反应

(1)工作液的配制：250μM的dNTPs混合液、0.5U/μL的phi29 DNA聚合酶，500nM的环状DNA模板，0.2mg/mL的BSA以及1μM的拉链探针(1μM D-oligo同1μM C-oligo混合加热至90℃并保持5min，随后缓慢降温至室温，得到拉链探针)混合于1×phi29 DNA聚合酶缓冲液(10mM硫酸铵，50mM Tris-盐酸，4mM DTT，10mM氯化镁，pH 7.5)。

(2)滚环扩增反应：将T4 PNK修饰反应后的产物(10.5μL)加入滚环扩增反应工作液中，最终体积100μL，充分混合后于37℃孵育1h。

将反应最终产物100μL置于石英比色皿中，室温下使用Cary Eclipse荧光分光光度计在480nm的激发波长、5nm的狭缝尺寸下记录500nm-600nm的荧光光谱，并将518nm处的荧光强度用于数据分析。

实施例2：验证T315I荧光检测方法的可行性

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)对每一步的反应产物进行分析验证，如图1A所示，泳道1和泳道2的条带分别为T-DNAzyme和生物合成的模拟样本T315I RNA分子，二者亮度位置相当，证明没有发生剪切反应。当Mg²⁺存在时，该处条带亮度减弱，并且其下方出现了新的条带，新条带迁移率更高(泳道3)，说明在Mg²⁺的作用下，DNAzyme发挥其剪切作用，将T315I RNA分子剪切成新的RNA片段。当体系中仅加入部分RCA反应必须物T4 PNK酶时，电泳结果(泳道4)与泳道3一致，表明仅有T4 PNK酶时不能触发RCA反应。当体系中加入phi29 DNA聚合酶和环状模板时，泳道5内出现低迁移率的条带，即环状模板带，但迁移率高的条带部分仍与泳道3一致，该结果说明RCA反应仍未进行。随后，将泳道5体系内加入T4 PNK酶，电泳结果出现明显变化，出现了具有高分子量的DNA聚合物(RCA products)。最终电泳结果证明，DNAzyme在Mg²⁺的作用下对靶分子T315I RNA进行剪切，剪切产物进一步引发RCA反应的设计是可行的。

2.在完成RCA反应的体系中加入拉链探针，结果如图1B所示，当体系中不存在靶分子T315I RNA时，荧光信号很弱；而当体系中存在靶分子T315I RNA时，荧光信号出现明显增强。该结果证明，该荧光检测T315I RNA分子的方法是可行的。

实施例3：T315I荧光检测方法的条件优化

本发明还对几个关键的反应步骤及反应条件进行了优化，包括：整个反应中各部分体系的加入顺序，Mg²⁺浓度，以及反应时间。

1.首先本发明对反应流程进行了优化，分别采用一步法、两步法-1、两步法-2和逐步法对100nM靶分子进行检测。结果如图2所示，一步法检测的荧光信号值最低，两步法-2的荧光信号值比一步法稍高，但明显低于两步法-1和逐步法。两步法-1和逐步法荧光信号值相当，但逐步法反应时间过长，为达到简单快速的检测目的，本发明选用两步法-1作为反应流程。

2.其次，本发明对DNAzyme催化反应中的关键辅助因子即Mg²⁺浓度进行了优化。本实验采用了不同浓度的Mg²⁺(5nM，10nM，20nM，50nM，80nM，100nM)进行反应，结果如图3所示，随着Mg²⁺浓度的增加，荧光信号逐步增强，并趋于稳定。PAGE电泳结果显示，随着Mg²⁺浓度的增加，DNAzyme剪切产物条带逐渐加深，而DNAzyme和T315I RNA杂交的条带逐渐减弱，且趋于稳定，证明反应已达到平台期。综合后续RCA反应考虑，过高的Mg²⁺浓度会对反应有抑制作用，因此本发明选用100nM的Mg²⁺浓度作为最佳反应浓度。

3.最后，本发明对DNAzyme剪切反应时间进行了优化。如图4所示，0-20min时，随着反应时间的延长，荧光信号明显增强，到30min时达到最高值，随后趋于稳定。PAGE结果也表明，5-30min时，DNAzyme和T315I RNA杂交的条带逐渐减弱，随后条带颜色和位置变化不明显，证明30min时反应已达平台期。因此，本发明选用30min做为DNAzyme剪切反应的最优反应时间。

实施例4：T315I荧光检测方法的性能分析

在最佳实验条件下，本发明对不同浓度的T315I RNA进行检测。首先，将不同浓度的T315I RNA与2μM的DNAzyme探针，2U/μL的RNase抑制剂混合于剪切缓冲液中，于37℃孵育30min，随后加入EDTA终止剪切反应。剪切反应后，加入0.5μL浓度为0.5U/μL的T4 PNK，充分混合后于37℃孵育30min。随后，将T4PNK修饰反应后的产物加入滚环扩增反应工作液中，充分混合后于37℃孵育1h。最后，将反应最终产物置于石英比色皿中在480nm的激发波长、5nm的狭缝尺寸下记录500nm-600nm的荧光光谱，并将518nm处的荧光强度绘制标准曲线，结果如图5所示。实验结果显示，当T315I RNA浓度为1f M，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM时，检测到的荧光信号逐渐增强。将各浓度靶标RNA测得的荧光信号值减去空白组测得的荧光信号值，两者之差(ΔF)作为与校正后靶标RNA浓度相对应的荧光信号值。结果显示，在1f M-10nM之间，ΔF与T315I RNA的对数浓度呈线性关系，线性方程为ΔF＝74.90×lgC[T315I]+1111，(C为靶标RNA样本浓度，单位M)，且线性相关系数R²＝0.9934，最低检测限(Limit of detection，LOD)基于空白信号的三倍标准差(3σ)计算得到为9.4fM。

实施例5：T315I荧光检测方法的特异性分析

本发明通过合成与靶标T315I RNA序列相近的RNA样本(T315I/S-1，T315I/S-2含单核苷酸差异的T315I RNA)作为干扰RNA用于评估该检测方法对T315I RNA检测的特异性。为验证DNAzyme对靶标分子识别的特异性，本发明将三种干扰RNA与T315I RNA样本分别与DNAzyme共同温育30min，经PAGE电泳后，对剪切产物进行分析。只有靶分子为T315I RNA时，电泳产物中才出现迁移速率较快的低分子量条带(图6，插图，泳道4)，其他干扰RNA泳道内均无该条带出现，证明DNAzyme可以对T315I RNA特异性识别并进行剪切。另外，本发明将四种不同反应产物继续进行后续T4 PNK酶的修饰反应和RCA扩增反应，并对反应产物进行荧光检测。结果如图6所示，可以看出，当靶标分子为T315I RNA时，520nm处出现了明显增强的荧光信号，相比起来，其他三种干扰RNA的荧光信号非常微弱，该结果说明，所设计的荧光方法可以特异性的识别并检测T315I RNA。

实施例6：T315I荧光检测方法的回收率

此外，本发明将不同浓度的靶标T315I RNA片段添加在以10倍生理盐水稀释的血清中来模拟实际样本，经该方法检测后得到的结果如表2所示。当靶标T315I RNA浓度为25fM、100fM、2.5pM、100pM及2.5nM时，对应的回收率在88.0％-98.4％之间。以上结果表明该检测方法有望用于临床实际样本中靶标T315I RNA的准定量确检测。

表2添加T315I RNA样本至10％稀释血清的回收率

同时，本发明涉及到的基因序列包括：

SEQ ID NO：1：T315I：UCUAUAUCAUCAUUGAGUUCAUGA–C6-spacer

SEQ ID NO：2：F/T315I：FAM–UAUCAUCAUUGAGUUCAUGA–BHQ1

T315I/S

SEQ ID NO：3：

T-DNAzyme：CATGAACTCAAGGCTAGCTACAACGAGATGATATAG

SEQ ID NO：4：T/Cir-DNA：

PO4–TTTGATATAGAACGGGGGCTACTTTTTGATATAGAACGGGGGCTACTT

SEQ ID NO：5：T/Ligation：CTATATCAAAAAGTAGCC

SEQ ID NO：6：T/D-oligo：HEX-TTTTTGATATAGA

SEQ ID NO：7：T/C-oligo：ATCAAAAA–BHQ1

SEQ ID NO：8：T315I/S-1：UGUAUAUCAUCAGUGAGUUCAUGA–C6-spacer(C>G)

SEQ ID NO：9：T315I/S-2：UGUAUAUCAUCAAUGAGUUCAUGA–C6-spacer(C>A)

以上实施例仅为说明本发明中涉及T315I检测试剂盒中具体检测方法的原理、检测过程中实验条件的优化、检测性能分析及应用。其中以检测T315I性能分析(实施例4)说明本发明中的T315I检测操作步骤简单易学；检测准确、灵敏度高，其检测范围为10fM至10nM，最低检测限低至9.4fM。实施例6通过回收率实验检测并计算血清中添加T315I的浓度、回收率及标准差表明该检测方法准确度高，有望在临床慢性粒细胞白血病病人骨髓及外周血样本中进行T315I的检测应用，具有灵敏度高、成本低廉的优点。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110>周晓燕

<120>BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其应用

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Claims (10)

1.一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。

2.一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：

(1)在均相反应体系中，当T315I基因存在时，用连接DNAzyme的两个部分酶片段，在Mg²⁺存在的条件下，激活DNAzyme的剪切活性，将T315I基因剪切为两段裂解产物f1和f2，并在f1和f2的剪切位点分别产生3’端2’3’-环磷酸二酯末端和5’端羟基末端；

(2)利用T4 PNK酶进行修饰，切除f1的2’3’-环磷酸二酯末端并引入3’-OH末端，经T4PNK修饰过的f1命名为f1’；

(3)反应过后，f1’片段可以当作引物，引发滚环扩增反应；在phi29 DNA聚合酶的作用下，RCA反应产生大量含重复序列的单链DNA；

(4)RCA产生的单链DNA与体系中存在的拉链探针发生链置换反应，单链DNA与携带荧光基团的D-oligo完全互补，置换出游离C-oligo，导致荧光信号的产生，通过检测荧光信号强度即可获知T315I基因的量。

3.如权利要求2所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括以下步骤：

步骤一，环状DNA模板的制备；

步骤二，DNAzyme特异性识别剪切反应；

步骤三，T4 PNK特异性修饰；

步骤四，滚环扩增反应介导信号放大。

4.如权利要求3所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤一中，所述环状DNA模板的制备，包括：

(1)将浓度为2μM的5’端磷酸化后的线性DNA模板Cir-DNA和浓度为6μM的连接模板Ligation混合于1×T4 DNA连接缓冲液中，加热至90℃反应5min，随后缓慢冷却至室温，使Cir-DNA和Ligation之间进行杂交反应；

(2)向反应液中加入3.5U/μL的T4 DNA连接酶，充分混匀，于16℃孵育16h完成连接反应；反应后温度升至65℃保持10min，使连接酶失去活性；

(3)向反应产物中加入0.25U/μL的Exo I和5U/μL的Exo III，于37℃孵育5h以消化未成环的单链DNA或非特异性杂交的双链DNA，反应结束后温度升至80℃孵育20min使外切酶失去活性；

(4)反应结束后，环状DNA模板制备完成，4℃下可保存1月。

5.如权利要求4所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述1×T4 DNA连接缓冲液包括：100mM氯化镁，400mM Tris-盐酸，5mM ATP，100mM DTT，pH 7.8。

6.如权利要求1所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤二中，所述DNAzyme识别剪切反应，包括：

(1)反应液配制：2μM DNAzyme探针，2U/μL的RNase抑制剂混合于1×缓冲液中；

(2)识别剪切反应：将不同浓度的T315I分子添加至上述反应液中，最终体积为10μL，充分混合后于37℃孵育30min；随后利用pH 8.0的乙二胺四乙酸盐调节浓度，使其终浓度为30mM，终止剪切反应。

7.如权利要求6所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述1×缓冲液包括：10mM Tris-盐酸，100mM氯化镁，100mM氯化钾，0.01mg/mL BSA。

8.如权利要求1所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤三中，所述T4 PNK修饰，包括：

将0.5μL浓度为0.5U/μL的T4 PNK加入至催化剪切反应的产物中，此时反应液最终体积为10.5μL，充分混合后于37℃孵育30min。

9.如权利要求1所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤四中，所述滚环扩增反应，包括：

(1)工作液的配制：250μM的dNTPs混合液、0.5U/μL的phi29 DNA聚合酶，500nM的环状DNA模板，0.2mg/mL的BSA以及1μM的拉链探针混合于1×phi29DNA聚合酶缓冲液；

(2)滚环扩增反应：将T4 PNK修饰反应后的产物10.5μL加入滚环扩增反应工作液中，最终体积100μL，充分混合后于37℃孵育1h；将反应最终产物100μL置于石英比色皿中，室温下使用Cary Eclipse荧光分光光度计在480nm的激发波长、5nm的狭缝尺寸下记录500nm-600nm的荧光光谱，并将518nm处的荧光强度用于数据分析；

所述1×phi29 DNA聚合酶缓冲液包括：10mM硫酸铵，50mM Tris-盐酸，4mM DTT，10mM氯化镁，pH 7.5。

10.一种慢性粒细胞白血病检测试剂盒，其特征在于，所述慢性粒细胞白血病检测试剂盒包含权利要求1所述用途中的BCR-ABL1突变基因T315I。

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