CN114292902A - 用于识别目标rna的环状核酶探针及基于其介导的细胞rna自引发扩增成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于识别目标RNA的环状核酶探针及基于其介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，该环状核酶探针包含识别序列、核酶序列及编码序列三种功能区，能够可特异性杂交并切断RNA底物，无需外加扩增引物，而是用目标RNA作为引物原位自引发扩增，以克服外加引物带来的非特异性杂交扩增产生的背景噪音干扰，从而提高成像灵敏度和特异性。本发明基于上述创新设计的环状核酶探针介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，可以在保证检测高灵敏度的同时、拥有高的成像信噪比，从而实现细胞内RNA的高效灵敏成像分析。

Description

用于识别目标RNA的环状核酶探针及基于其介导的细胞RNA自 引发扩增成像方法

技术领域

本发明涉及RNA原位成像技术领域，具体涉及一种用于识别目标RNA的环状核酶探针及基于其介导的细胞RNA自引发扩增成像方法。

背景技术

RNA原位荧光成像可获取单细胞转录本序列及其拷贝数与亚细胞位置等多种信息，弥补测序技术无法获得空间信息的不足，对全面研究单细胞转录本不可或缺。

最常见的RNA荧光原位成像技术为单分子荧光原位杂交(single-moleculefluorescence in situ hybridization,smFISH)，通过数十条短单链DNA荧光探针 (～30nt)特异性杂交RNA序列，从而形成可分辨的亮斑点。然而，smFISH方法信号弱，且只能检测长链RNA(>800nt)，不能用于序列较短RNA如剪接变体、small RNA等检测。

相反，基于滚环扩增(rollingcircle amplification,RCA)或杂交链式反应(hybridization chain reaction,HCR)的成像方法一般仅需识别靶标RNA的某段保守序列(～30nt)，并通过核酸扩增或组装生成具有重复序列的长链DNA产物，用于放大荧光信号，实现单分子成像，适用于各种长度的RNA。其中，HCR产物为双链，但其扩增效率有限；RCA产物为单链，易于后续核酸杂交与组装，可与其他信号放大技术联合使用，提升灵敏度。

然而，现有的基于RCA的扩增成像方法需要外加引物探针引发扩增，存在非特异结合或扩增反应，导致较高背景荧光干扰、损失成像信噪比和灵敏度。因此，发展高特异高灵敏的细胞RNA原位成像方法仍旧是一个迫切需求和重大挑战。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于识别目标 RNA的环状核酶探针及基于其介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，能够解决现有技术中由于外加引物带来的非特异性杂交扩增产生的背景噪音干扰问题，从而提高成像灵敏度和特异性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一种用于识别目标RNA的环状核酶探针，该环状核酶探针包含：识别序列、核酶序列及编码序列三种功能区；其中：

所述识别序列分为两段，与目标RNA完全互补；

所述核酶序列为来自8-17家族的8-17NG核酶，能够特异性识别切断RNA 碱基-NG-间的磷酸二酯键；

所述编码序列分为两部分：条码1和条码2(两种荧光的编码，可以形成更多的编码)，针对不同目标RNA设计不同的条码1和条码2，能够识别检出多种RNA；

识别序列与目标序列(RNA的一段序列)的互补配对特异性杂交至目标 RNA上，使核酶序列形成能够发挥酶切活性的结构，在2价阳离子的参与下实现对于目标RNA的切断。

优选地，所述目标RNA能够作为引物，以环状核酶探针为模板，在聚合酶 Phi29的参与下引发滚环扩增，实现目标RNA的原位自引发扩增。

优选地，该环状核酶探针全长90～100nt。

优选地，两段识别序列长度均为15nt。

优选地，加入与编码序列相同的检出探针，检出探针上携带荧光基团，用于单分子的荧光成像。

本发明还公开了基于上述的用于识别目标RNA的环状核酶探针介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，包括以下步骤：

1)将细胞样本固定处理后，加入所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，该环状核酶探针特异性杂交目标RNA，并使核酶序列形成能够发挥酶切活性的结构，在2价阳离子的参与下实现对于目标RNA的切断；

2)加入T4PNK切除核酶切断底物切口处的基团产生3’-OH；

3)目标RNA作为引物，以环状核酶探针为模板，在聚合酶的参与下引发滚环扩增，实现目标RNA的原位自引发扩增，得到扩增产物；

4)加入与编码序列相同的检出探针，与步骤4)获得的扩增产物特异性杂交，检出探针上携带荧光基团，实现细胞RNA的单分子荧光成像。

优选地，所述切口处产生的末端为不能延伸的2’,3’-环磷酸基团，加入 T4PNK切除该2’,3’-环磷酸基团产生3’-OH。

优选地，扩增产物会锚定在目标RNA上，获得目标RNA位置信息。

优选地，聚合酶采用聚合酶Phi29，能够识别RNA引物，具有链置换活性及单链3’-5’的外切活性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计的环状核酶探针包含识别序列、核酶序列及编码序列三种功能区，能够可特异性杂交并切断RNA底物，无需外加扩增引物，而是用目标RNA 作为引物原位自引发扩增，以克服外加引物带来的非特异性杂交扩增产生的背景噪音干扰，从而提高成像灵敏度和特异性。相较于smFISH信号弱，且受限于目标物的长度(kb级别目标物)，基于RCA的扩增成像方法需要外加引物探针引发扩增，存在非特异结合或扩增反应，导致较高背景荧光干扰、损失成像信噪比和灵敏度的现有方法，本发明基于上述创新设计的环状核酶探针介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，可以在保证检测高灵敏度的同时、拥有高的成像信噪比，从而实现细胞内RNA的高效灵敏成像分析。

附图说明

图1为本发明的方法原理示意图；

图2为环状核酶探针特异性识别目标物引起RNA自引发扩增的可行性；其中，A为不同反应体系中RCA的实时荧光曲线；B为环状核酶切断底物后并延伸后的Tm值测定；C为代表性的原位细胞成像图；D为C中两种方法的成像图进行的统计数据结果；

图3为单个编码区编码的RNA成像和两个编码区编码的RNA成像。

图4为三种细胞系内多种RNA的同时成像。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1、制备环状核酶探针

依次通过杂交、连接及酶切步骤构建该探针，具体如下：10μM锁式探针和30μM连接模板探针在10μl 1×T4DNA连接酶反应缓冲液中于55℃条件下杂交2小时，然后加入3μlT4DNA连接酶于37℃孵育2小时，65℃孵育30分钟。然后加入25个单位的核酸外切酶Ⅰ和400个单位的核酸外切酶Ⅲ于37℃下过夜反应，80℃加热30分钟使反应体系中的酶失活，反应所得的环形探针储存于-20℃条件下备用。

制得的探针在试管内验证其识别可行性及特异性(图1所示)，其中涉及的滚环扩增反应包括如下步骤：10μl 1×phi29 DNA聚合酶缓冲液中包括0.1mM 环形探针、2.5mMdNTPs、0.2μM DNA引物、5个单位的phi29 DNA聚合酶、 5个单位的T4PNK磷酸激酶及20个单位的RNase抑制剂，于37℃下孵育1小时，之后65℃反应20分钟终止酶反应。RCA反应用实时荧光定量PCR仪、凝胶电泳表征。如图1可验证环状核酶探针特异性识别目标物并可介导RNA自引发扩增。

2、基于制备的环状核酶探针介导的细胞RNA自引发扩增成像方法

选用乳腺细胞系MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231作为成像样本。将细胞以6000个/孔的密度种于PDMS小室中过夜培养，之后用1×PBS缓冲液清洗细胞三次后使用4％多聚甲醛固定细胞，经过Triton X-100预处理后，加入环状核酶探针过夜杂交，次日，在细胞内加入RCA反应体系进行扩增反应2小时。最后，杂交荧光探针，杂交混合液中包括200nM荧光标记探针、20％甲酰胺缓冲液以及2x SSC缓冲液，37℃下反应半个小时；2x SSC清洗细胞三次，用 DAPI染料进行核染。

所有荧光图像均使用激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8STED 3X，Leica) 在63倍物镜下获得。验证环状核酶探针特异性识别目标物引起RNA自引发扩增的可行性，结果参见图2，(A)为不同反应体系中RCA的实时荧光曲线。结果可见：当T4PNK不存在时，RCA效率明显降低；而当加入错配的RNA、错配的环状核酶探针或者不加入RNA时，均不发生RCA。(B)为环状核酶切断底物后并延伸后的Tm值测定。结果可见：只有当环状核酶与RNA目标序列互补时才会发生切断和延伸反应，即Tm值右移；插入的琼脂糖电泳图同样说明了该结论。(C)为代表性的原位细胞成像图，即我们的方法(RNA-primed) 与之前外加引物的方法(primer-added)比较示意。结果可见：环状核酶序列 (RNA-primed)或者环状探针序列(primer-added)与目标RNA完全互补时，两种方法均有明显的单分子亮点信号，而当与目标RNA存在错配时，我们的方法没有背景噪音，之前外加引物的方法存在一些噪音亮点(D)为对于C中两种方法的成像图进行的统计数据结果。每个实验组统计了25个单细胞的荧光亮点数，结果与C图展示一致，即我们的方法不存在非特异性的扩增，没有成像背景噪音。

参见图3，为单个编码区编码的RNA成像和两个编码区编码的RNA成像结果。针对每个目标物RNA设计的环状核酶探针均含有两个编码区：条码1和条码2。不同的条码1或条码2序列可杂交不同数量的荧光探针产生不同的信号，从而实现不同目标物的荧光成像。图3中上图为不同条码1(1:1,3:1,8:1) 编码的三种RNA的原位成像；下图为不同条码1和条码2(1:1:1,8:8:1)编码的两种RNA的原位成像。

不同细胞系内9种RNA的同时成像图，结果如图4所示，即对9种胞内 RNA设计9种对应的带有编码功能的环状核酶序列，同时进行识别并触发RNA 自引发扩增成像，实现了细胞内9种不同RNA的同时成像。

由上述细胞成像图可知，环状核酶介导的RNA自引发扩增成像相比于外加引物的细胞成像，无非特异性的杂交或扩增产生的背景噪音，且可通过探针上的编码区域对不同的RNA进行成像分析。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于识别目标RNA的环状核酶探针，其特征在于，该环状核酶探针包含：识别序列、核酶序列及编码序列三种功能区；其中：

所述识别序列分为两段，与目标RNA完全互补；

所述核酶序列为来自8-17家族的8-17NG核酶，能够特异性识别切断RNA碱基-NG-间的磷酸二酯键；

所述编码序列分为两部分：条码1和条码2，针对不同目标RNA设计不同的条码1和条码2，能够识别检出多种RNA；

识别序列与目标序列的互补配对特异性杂交至目标RNA上，使核酶序列形成能够发挥酶切活性的结构，在2价阳离子的参与下实现对于目标RNA的切断。

2.根据权利要求1所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，其特征在于，所述目标RNA能够作为引物，以环状核酶探针为模板，在聚合酶Phi29的参与下引发滚环扩增，实现目标RNA的原位自引发扩增。

3.根据权利要求1所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，其特征在于，该环状核酶探针全长90～100nt。

4.根据权利要求1所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，其特征在于，两段识别序列长度均为15nt。

5.根据权利要求1所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，其特征在于，加入与编码序列相同的检出探针，检出探针上携带荧光基团，用于单分子的荧光成像。

6.基于权利要求1～5中任意一项所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针介导的细胞RNA自引发扩增成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将细胞样本固定处理后，加入所述的用于识别目标RNA的环状核酶探针，该环状核酶探针特异性杂交目标RNA，并使核酶序列形成能够发挥酶切活性的结构，在2价阳离子的参与下实现对于目标RNA的切断；

2)加入T4PNK切除核酶切断底物切口处的基团产生3’-OH；

3)目标RNA作为引物，以环状核酶探针为模板，在聚合酶的参与下引发滚环扩增，实现目标RNA的原位自引发扩增，得到扩增产物；

4)加入与编码序列相同的检出探针，与步骤4)获得的扩增产物特异性杂交，检出探针上携带荧光基团，实现细胞RNA的单分子荧光成像。

7.根据权利要求6所述的细胞RNA自引发扩增成像方法，其特征在于，所述切口处产生的末端为不能延伸的2’,3’-环磷酸基团，加入T4PNK切除该2’,3’-环磷酸基团产生3’-OH。

8.根据权利要求6所述的细胞RNA自引发扩增成像方法，其特征在于，扩增产物会锚定在目标RNA上，获得目标RNA位置信息。

9.根据权利要求6所述的细胞RNA自引发扩增成像方法，其特征在于，聚合酶采用聚合酶Phi29，能够识别RNA引物，具有链置换活性及单链3’-5’的外切活性。

Images