CN112251508B

CN112251508B - 一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN112251508B
Application number: CN202011026301.3A
Authority: CN
Inventors: 朱作斌; 李颖; 韩从辉
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Jiangsu Kuanran Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112251508A

Abstract

本发明公开了一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用。该标志物为tRF‑Pro‑AGG‑003和tRF‑Val‑AAC‑010，tRF‑Pro‑AGG‑003的序列为SEQ ID NO.1，tRF‑Val‑AAC‑010的序列为SEQ ID NO.2。该标志物对非梗阻性无精子症具有特异性和灵敏性，可用于制备非梗阻性无精子症的诊断试剂盒。本发明的两个精浆外泌体标志物tRF‑Pro‑AGG‑003和tRF‑Val‑AAC‑010在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者精浆中差异表达，其能够较好地诊断性非梗阻性无精子症，并能够预测无精子症取精结果，其效果优于常用的血浆卵泡刺激素水平及睾丸体积等指标。

Description

一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物诊断和医药领域，具体涉及一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用。

背景技术

无精子症的发生率占男性不育症的10％-20％。根据睾丸中有无精子可分为两类：一类是睾丸具有正常精子发生的阻塞性无精子症(obstructive azoospermia,OA)。另一类是睾丸精子发生障碍的非阻塞性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)。对非阻塞性无精症的准确诊断可以为临床医生提供有价值的指导。尽管精液中的常规生化标志物，例如柠檬酸，酸性磷酸酶，果糖和α-葡萄糖苷酶等可用于辅助诊断OA患者；睾丸体积，血清卵泡刺激素(FSH)水平等可辅助诊断NOA患者，但是仍有一部分患者无法利用这些指标进行正确的诊断。

睾丸活检的病理诊断是确定睾丸精子发生状态的“金标准”。然而，侵入性手术不仅给患者带来痛苦，而且还可能引起生精管的进行性和不可逆转的破坏。睾丸穿刺取精进行辅助生殖是治疗无精子症患者的重要手段，然而睾丸穿刺取精成功率并不高，通过准确、无创的术前评估对提高睾丸穿刺取精成功率具有重要意义。本专利旨在鉴定可以准确评估睾丸精子提取成功率的生物标志物。外泌体是大多数细胞分泌的细胞外囊泡，直径为30-150nm，具有脂质双层膜结构。非阻塞性无精子症患者睾丸不能产生精子，其组织结构与能够产生精子的阻塞性无精子症患者的睾丸组织显着不同。因此，NOA患者和OA患者产生的精浆中的外泌体也不同。因此，精浆外泌体是区分睾丸病理和生理状况的潜在生物标记物的重要来源。

近年来，人们发现一种新型的调控性小非编码RNA，称为tRNA衍生的小RNA(tRNA-derived small RNA,tsRNA)，在人精液中富集。tsRNA是通过对tRNA及其前体进行精确调控而产生的片段。据报道，tsRNA的组成和数量高度依赖于特定的细胞类型和病理状况，使其成为一类出色的生物标志物。最近的研究发现，tsRNA在睾丸和精子细胞中表达。由于tsRNA在哺乳动物的精子成熟和受精中起着重要作用，并且它们在精浆和外泌体中的富集程度高于miRNA，这表明tsRNA可以用作NOA诊断的有前途的生物标记。

发明内容

本发明的目的之一在于克服已有无创诊断指标不能有效诊断非梗阻性无精子症的不足，提供一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物。

本发明的目的之二在于提供上述精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物。

本发明的目的之三在于提供一种含有上述精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物的非梗阻性无精子症诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物，该标志物为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010，tRF-Pro-AGG-003的序列为：GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTCG(SEQ ID NO.1)；tRF-Val-AAC-010的序列为GTTTCCGTAGTGTAGTGGTTAT(SEQ ID NO.2)。

精浆外泌体tsRNA标志物tRF-Pro-AGG-003的特异性引物的序列为：

F：GATCGGCTCGTTGGTCTAGG(SEQ ID NO.3)；

R：ACGTGTGCTCTTCCGATCTCG(SEQ ID NO.4)；

精浆外泌体tsRNA标志物tRF-Val-AAC-010的特异性引物的序列为：

F：GATCGTTTCCGTAGTGTAGTGGT(SEQ ID NO.5)；

R：gacgtgtgctcttccgatcta(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供一种非梗阻性无精子症诊断试剂盒，该试剂盒含有上述精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物。

本发明首先从精浆中分离了外泌体，并制备了tsRNA文库用于高通量测序，并去除干扰tsRNA文库构建的RNA修饰。然后，通过RT-qPCR验证tsRNA作为生物标志物的价值并利用生物信息分析方法预测其参与无精子症的调控网络，进一步确定所选tsRNA能够应用于非梗阻性无精子症的诊断。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、睾丸组织来源的外泌体能够真实反映睾丸组织的病理状态，本发明的两个精浆外泌体标志物tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者精浆中差异表达，其能够较好的诊断性非梗阻性无精子症，并能够预测无精子症取精结果，其效果优于常用的血浆卵泡刺激素水平及睾丸体积等指标，精浆外泌体tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010的表达水平相对于血液FSH水平及睾丸体积对非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症及健康人群的区分度更好。并且进一步确定tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者睾丸组织样本中也有表达差异，以进一步确定其作为诊断非梗阻性无精子症的可行性。

2、本发明的标志物tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010能够区分非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症，且其参与非梗阻性无精子症的致病，是一个可用于诊断非梗阻性无精子症的优良指标，且具有作为靶标治疗非梗阻性无精子症的潜在价值。

附图说明

图1为高通量筛选具有诊断非梗阻性无精子症患者的生物标志物的研究策略。图中：NOA:睾丸活检取精失败的20-40岁非梗阻性无精子症症患者；OA:睾丸活检取精成功的20-40随梗阻性无精子症患者；Ctrl：已育且精液常规正常的20-40岁健康个体；IO：重度精子发生障碍患者。

图2为外泌体形态的透射电子显微镜照片。

图3为外泌体粒径分析：横坐标表示粒径大小，纵坐标表示粒径浓度分布。

图4为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在非梗阻性无精子症(NOA)与梗阻性无精子症(OA)及健康人(Ctrl)精浆外泌体中的差异表达情况：纵坐标表示tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010相对于内参U6基因的相对表达量。统计学分析采用双尾T检验，***P<0.001。

图5为ROC曲线下面积(AUC)。

图6为精浆外泌体tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010、血浆FSH水平及睾丸体积对NOA、OA及Ctrl的验证样本的区分度散点图。

图7为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症睾丸组织中差异表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

如图1所示：本发明首先通过分析非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症和健康对照人群精浆外泌体中的差异tsRNA，然后对选择的差异tsRNA在更多非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症、严重生精功能障碍患者及健康对照人群样本中进行实时荧光定量PCR验证，最后确定筛选到的tsRNA是否在梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者睾丸组织样本中是否有表达差异，以进一步确定其作为诊断非梗阻性无精子症的可行性，同时对其进行生物信息学功能分析，确定其在精子发生过程中可能调控机制。各具体方案实施如下：

1、精液样本收集

本发明中样本使用说明：无精子症的诊断标准为：禁欲一周后，3次或3次以上精液离心(WHO推荐转速3000r/min，离心15分钟)后镜检未发现精子，同时排除不射精和逆行射精等即诊断为无精子症。非梗阻性无精子症：对需要进行辅助生殖的无精子症且符合手术指标的患者在知情同意的情况下进行睾丸活检取精，本发明中睾丸活检仍未取到精子的20-40岁无精子症患者作为睾丸活检取精失败的非梗阻性无精子症患者，能够取到足量可以应用于辅助生殖的精子的20-40岁患者为梗阻性无精子症患者。重度生精功能不良患者样本：禁欲1周后，精液常规分析3次以上者，精子密度低于500万而查不出任何病因的20-40岁患者作为生精功能不良患者。健康对照人群样本：已育的30-40岁健康男性且精液常规正常的个体。

2、外泌体提取

本发明首先从精浆中分离了外泌体。禁欲一周后取1-3ml精液样本3000r/min，离心15分钟，取上层精液2ml左右并使用

外泌体分离试剂盒(Umibio,Cat：UR52130，中国)进行外泌体分离。简介如下，每个样品在3000xg 4℃条件下离心10分钟，取上清然后在10000xg 4℃条件下离心20分钟，去除细胞和碎片，然后加入相应的试剂量(样本：试剂＝1:1)。混合物在4℃条件下涡流并孵育2小时，然后在4℃下10000xg离心60分钟以沉淀外泌体。用1×PBS重悬外泌体，然后于外泌体纯化过滤器中在3000xg 4℃下纯化10分钟。对外泌体进行分析时对纯化后的外泌体按照1:100的浓度进行稀释使用。

本发明通过透射电子显微镜观察外泌体的形态(图2)和

纳米颗粒跟踪分析器分析外泌体的粒径(图3)确认了所测tsRNA来源于外泌体。

3、TRIZOL法提取外泌体RNA

3.1、外泌体匀浆。在离心收集得到的外泌体样品中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次。

3.2、两相分离。匀浆后样品于15℃到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15℃到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

3.3、RNA沉淀。将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

3.4、RNA清洗。移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7,500×g离心5分钟。

3.5、重新溶解RNA沉淀。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

4、外泌体RNA样本前处理

制备的外泌体RNA中利用rtStarTMtRF&tiRNA前处理试剂盒(Cat#AS-FS-005,Arraystar)去除干扰tsRNA文库构建的RNA修饰，然后对其进行高通量测序。RNA前处理是检测tsRNA的关键，RNA前处理介绍如下：

4.1、3’末端去乙酰化处理

a)按照下表配制去乙酰化反应液：

b)涡旋混合，37℃孵育40分钟。

c)依次加入19μL Deacylation Stop Buffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。

4.2、去除3’-cP与添加5’-P

d)将上一步骤的反应液置于冰上，依次加入下表中的试剂：

e)涡旋混合，37℃孵育40分钟。

f)70℃孵育5分钟以终止反应。

g)重新抽提RNA。

4.3、去甲基化处理

h)融解除Demethylase和Reverse Transcriptase外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，以待使用。

i)配制去甲基化反应液：

j)进行去甲基化反应

在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μl无核酸酶水与10μl DemethylationStop Buffer(5×)，终止去甲基化反应。

k)重新抽提RNA.

4.4、连接3′接头

l)在200μL无RNA酶的PCR管中依次加入下列试剂：

m)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上。

n)向PCR管中添加下列反应试剂：

o)在热循环仪中25℃孵育1小时。

注意：延长孵育时间和降低孵育温度(18h；16℃)可以增大甲基化修饰RNA比如piRNA的连接效率，但同时也可能形成串联产物。

4.5、反转录引物(Reverse Transcription Primer)杂交(试剂盒：rtStar^TMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar))

此步反应对抑制接头二聚体的形成十分关键。反转录引物可与多余的3’接头杂交，从而将单链DNA接头转化为双链DNA分子。而双链DNA分子不是T4 RNA Ligase 1的底物，因此多余的3’接头不会与5’接头连接。

注意：如果总RNA起始量为100ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。

p)向步骤o的PCR管里加入下列试剂：

q)在热循环仪中依次75℃孵育5min，37℃孵育15min，25℃孵育15min。

4.6、连接5′接头

r)在20μL无酶水中重悬5’接头。

注意：如果总RNA起始量为100ng，将5′接头用无酶水1：2稀释。

s)在单独的无核酸酶的200μL PCR管中加入0.6NμL的5’接头。(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却。

注意：将剩余的5’重悬接头储存在-80℃冰箱。为了避免RNA降解，在接头变性后30分钟内使用接头。

t)向步骤q中的PCR管中依次加入下列反应物，充分混合。

u)热循环仪25℃孵育1小时。

4.7、反转录反应

v)在无核酸酶的200μL PCR管加入下列反应物：

w)热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。

注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应。然后将样本置于-20℃冰箱保存。

5、高通量测序筛选差异表达tsRNA

5.1首先进行文库制备。采用琼脂糖电泳检测提取外泌体的总RNA的完整性，然后在NanoDrop ND-1000仪器上进行核酸定量。外泌体总RNA利用Arraystar公司的rtStar^TMtRF&tiRNA前处理试剂盒，去除3’氨酰基末端与3‘环磷酸末端，磷酸化5’羟基末端，并移去m1A,m3C等多种甲基化修饰。外泌体总RNA前处理后，利用

Multiplex Small RNALibrary Prep Set for Illumina试剂盒进行1)3’端接头连接；2)5’端接头连接；3)cDNA合成；4)PCR扩增等处理。最后用安捷伦2100生物分析仪对完成的文库进行定量分析。根据定量结果将等量的文库混合，用于仪器上的测序。

5.2制备的外泌体cDNA文库测序。首先将混合良好的文库中的DNA片段用0.1MNaOH变性，生成单链DNA分子，并以1.8pM的浓度加载到NextSeq 500/550 V2 kit(#FC-404-2005,Illumina)试剂盒上。利用Illumina NextSeq 500测序平台测序，测序运行50个周期。

5.3数据分析。利用Solexa pipeline v1.8软件进行图像及碱基读取分析，利用FastQC软件对测序数据进行质控分析，利用bowtie软件将碱基序列与miRDeep2数据库中的成熟tRNA和前体tRNA进行配对(完全配对或者只允许有一个碱基错配)。tsRNA的表达量根据测序的reads数计算。差异表达tsRNA利用R语言包edgeR分析。与OA患者样本比较，在NOA患者中最终发现38个tsRNAs上调，46个tsRNAs下调(差异超过3倍，P<0.05)。然后发现NOA患者和健康人群之间有100个tsRNAs差异表达(16个上调，84个下调)。

6、实时荧光定量PCR验证

在这些差异tsRNA中，通过实时荧光定量PCR方法在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者精浆和睾丸组织中进行了验证，最终确定了tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010可以作为非梗阻性无精子症诊断标志物。实时荧光定量PCR实施条件如下：

6.1、设计引物：

tRF-Pro-AGG-003：F：5’GATCGGCTCGTTGGTCTAGG3’(SEQ ID NO.3)；

R：5’ACGTGTGCTCTTCCGATCTCG3’(SEQ ID NO.4)。

tRF-Val-AAC-010：F：5’GATCGTTTCCGTAGTGTAGTGGT3’(SEQ ID NO.5)；

R：5’GACGTGTGCTCTTCCGATCTA3’(SEQ ID NO.6)。

内参基因U6：F：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’(SEQ ID NO.7)；

R：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’(SEQ ID NO.8)。

6.2、实时荧光定PCR反应体系。体系配制如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

6.3、实时荧光定PCR反应程序

95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行，升温速率为0.05℃/秒)。

6.4、结果与计算

各样品的目的基因(tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010)及管家基因(U6)分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

图4为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在非梗阻性无精子症(NOA)与梗阻性无精子症(OA)及健康人(Ctrl)精浆外泌体中的差异表达情况；纵坐标表示tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010相对于内参U6基因的相对表达量。统计学分析采用双尾T检验，***P<0.001。可以看出，本发明的两个精浆标志物tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010在非梗阻行无精子症和梗阻性无精子症患者精浆中差异表达。

7、tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010诊断非梗阻性无精子症的效果评价

利用GraphPad Prism6软件绘制受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线)，并计算其曲线下面积(Area Under Curve，AUC)、灵敏性和特异性。

以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线，如图5所示。ROC曲线下面积AUC越大表明诊断效果越好。tRF-Pro-AGG-003：AUC＝0.96，灵敏度＝95％，特异性＝87％，P<0.0001；tRF-Val-AAC-010：AUC＝0.96，灵敏度＝95％，特异性＝87％，P<0.0001；FSH：AUC＝0.86，灵敏度＝70％，特异性＝93％；睾丸体积：AUC＝0.85，灵敏度＝70％，特异性＝87％，说明常规非梗阻性无精子症的预测指标血液FSH水平和睾丸体积诊断非梗阻性无精子症的能力弱于精浆外泌体tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010。

图6A.精浆外泌体tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010对NOA、OA及Ctrl样本的区分度散点图。纵坐标表示tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010相对于内参U6基因的相对表达量。图6B.血浆FSH水平及睾丸体积对NOA、OA及Ctrl样本的区分度散点图。非梗阻性无精子症样本与梗阻性无精子症和健康对照人群区分度越好，表示该指标用于诊断非梗阻性无精子症效果更好。结果显示，精浆外泌体tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010的表达水平相对于血液FSH水平及睾丸体积对非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症及健康人群的区分度更好。

分析5例非梗阻性无精子症患者和5例梗阻性无精子症患者睾丸组织中tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010基因表达情况。结果如图7所示，睾丸组织中tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010基因表达情况与精浆中一致，进一步表明这两个标志物可以很好的反应睾丸的病理状态，是一种有价值的诊断非梗阻性无精子症的标志物。统计分析采用双尾T检验，*P<0.05。

利用从序列出发的本地靶点预测tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010的靶基因，并预测其参与精子发生调控的遗传机制。该靶点预测整合了miRanda和TargetScan两种数据库预测靶基因的算法进行预测，并对预测的靶基因进行组织特异性分析，发现tRF-Pro-AGG-003的12个靶基因在睾丸组织中特异性表达，tRF-Val-AAC-010的13个靶基因在睾丸组织中特异性表达。

进一步利用DAVID数据库对tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010靶基因进行GeneOntology(GO)基因生物学功能富集分析和GAD疾病富集分析，发现其靶基因与无精子症及精子发生密切相关，结果如表1所示，其中Category：生信分析类别，Term：生物学功能模块或疾病种类，Related Genes：与相关功能模块或疾病相关的基因，P-value：卡方检验统计P值。

表1 tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010靶基因基因功能富集分析

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 1

ggctcgttgg tctaggggta tgattctcg 29

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 1

gtttccgtag tgtagtggtt at 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcggctcg ttggtctagg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgtgtgctc ttccgatctc g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcgtttcc gtagtgtagt ggt 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacgtgtgct cttccgatct a 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttcggcag cacatatact aaaat 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

Claims

1.精浆外泌体tsRNA标志物的检测试剂在制备非梗阻性无精子症诊断试剂中的应用，其特征在于，该标志物为tRF-Pro-AGG-003和tRF-Val-AAC-010，tRF-Pro-AGG-003的序列如SEQ ID NO.1所示，tRF-Val-AAC-010的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种与非梗阻性无精子症诊断相关的精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物，其特征在于，tRF-Pro-AGG-003的特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；tRF-Val-AAC-010的特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求2所述的特异性引物在制备非梗阻性无精子症诊断试剂中的应用。

4.一种非梗阻性无精子症诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求2所述的精浆外泌体tsRNA标志物的特异性引物。