CN105705652A - 协助鉴别诊断中风的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法。所述方法包括：(i)测定获自患者的离体样品中生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的浓度；以及(ii)建立所述生物标志物的浓度的统计学意义。任选地，所述方法还包括以下步骤：(iii)测定获自患者的离体样品中生物标志物IL-6和sTNFR1的浓度；(iv)确定所述患者的性别；以及(v)与所述患者的性别结合，建立五种生物标志物的浓度的统计学意义。本发明也提供基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针，用于协助鉴别诊断中风的方法。

Description

协助鉴别诊断中风的方法

发明背景

中风是全世界第三大导致死亡的原因，并且可被定义为脑功能的快速发展丧失，原因是向脑的血液供应的中断。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganisation)统计，全世界每年一千五百万的人患有中风，具有五百万的死亡以及另五百万永久地残疾。据推测，高血压是这一千五百万中风例中一千两百七十万例的贡献因子。在英国，每年大约150,000人具有中风，并且中风导致每年约53,000的死亡。仅在英国，每年中风花费经济估计80亿英镑，并且中风患者占据所有医院急性病床的大约20％以及长期病床的25％。

中风可被归类为三种子类型：

i)缺血性中风(IS)：当向脑的血液供应减少时发生，其导致脑损害。当血管堵塞时(通常由血凝块)，发生缺血性中风。该凝块在动脉粥样硬化斑块处局部地形成(血栓形成型中风)，或可选地其发生是由于源自血流中别处的移动颗粒或碎片(栓塞性中风)；

ii)短暂性脑缺血发作(TIA)：其为‘微中风’，当向脑的血液供应暂时减少时发生。如果症状被快速地解决(24小时内个体返回正常的健康)则诊断为TIA；以及

iii)出血性中风(HS)：当血液积累在头骨拱顶内时(通常当变弱的血管破裂时)发生。可将出血性中风分类为两种主要的子类型，即脑内的(脑组织内)和蛛网膜下腔的(脑的表层附近及其保护层下)。

IS和TIA导致所有中风例的大约85％，HS导致15％。为了使中风后的神经性损害缩到最小，关键是快速和准确地诊断中风患者，以便可施用适当的治疗。例如，为了打破凝块，可施用溶解血栓的疗法，如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)。然而，这样的疗法仅在IS中是准许的，并且对HS是不利的。TIA的性质不需要这样的疗法，而诸如华法林和阿司匹林的血液稀释剂是这样的病例的处方药。

目前，如果怀疑中风，评估身体的症状，并且通常进行电脑断层(CT)扫描。CT扫描对鉴定HS患者具有好的敏感性(大约90％敏感性)但对鉴定IS和TIA患者具有弱的敏感性(大约20％敏感性)。在实践中，TIA由于其短暂性的性质而极少发生或不发生组织损害，因此CT扫描作为诊断技术是无效的。磁共振成像(MRI)改善IS诊断的敏感性(至多大约80％)但增加时间需求、机器的可及性，并且昂贵的费用限制了其在中风诊断中的使用。CT扫描用于IS和TIA检测的弱敏感性意味着用于检测IS和TIA的基于生物流体的诊断生物标志物试验将为非常珍贵的工具以协助临床医生诊断中风子类型。基于生物流体的生物标志物具有促进和提高中风诊断准确性的潜能。

多种候选生物标志物已被提议用于中风和中风子类型描述的诊断，并且现有技术中对IS/TIA与HS的区分存在若干描述，例如EP1238284、WO2010/086697、WO2010/012834和WO2002/012892。

EP1419388公开了区分HS与IS以及所有中风类型与非中风对照的数据。然而，迄今为止还没有发现任何一种在临床实践中的用途，并且存在具有高敏感性和特异性以能够进行准确诊断的所有三种中风子类型的生物标志物的真实临床需求。

使用血液试验对三种不同中风子类型的鉴别诊断将利于更知情的临床决策，潜在地使得不需要昂贵且不快速的神经成像诊断学，并且可改善患者的临床结果。

发明概述

根据第一方面，本发明提供协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法，其包括：测定获自患者的离体样品中生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的浓度；以及建立生物标志物的浓度的意义。

根据第二方面，本发明提供基底，其包含生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的探针，用于本发明第一方面所述的协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法。

根据第三方面，本发明涉及包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针的基底在本发明第一方面所述的协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法中的用途。

根据第四方面，本发明涉及VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFR1作为出血性中风的生物标志物和/或作为出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的区分指标的用途。

附图简述

图1为使用本发明的生物标志物区分TIA与其他中风类型的ROC曲线分析；

图2为使用本发明的生物标志物区分IS与其他中风类型的ROC曲线分析；

图3为使用本发明的生物标志物区分HS与其他中风类型的ROC曲线分析；

图4为显示男性和女性个体中每种中风子类型的GFAP浓度的图表；

图5为显示男性和女性个体中每种中风子类型的VCAM1浓度的图表；

图6为显示男性和女性个体中每种中风子类型的CRP浓度的图表；

图7为显示男性和女性个体中每种中风子类型的sTNFR1浓度的图表；

图8为显示男性和女性个体中每种中风子类型的IL-6浓度的图表；和

图9显示数据和相应的ROC曲线分析，其分别地比较设计分类算法用于从所有中风类型区分HS的逻辑回归和神经网络方法。

发明详述

本发明涉及基于生物标志物的方法和生物芯片，其可被用来协助区分三种中风子类型：出血性中风(HS)、缺血性中风(IS)和短暂性脑缺血发作(TIA)。

除非另有规定，所有本文提及的术语‘中风’涵盖所有三种形式的中风。

本文使用的术语‘缺血性中风(IS)’指中风的类型，当向脑的血液供应减少时发生，其导致脑损害。当血管堵塞时(通常通过血凝块)，缺血性中风发生。该凝块在动脉粥样硬化斑块下可局部地形成(血栓形成型中风)，或可选地其发生是由于源自血流中其他处的移动颗粒或碎片(栓塞性中风)。术语‘短暂性脑缺血发作(TIA)’指‘小中风’，当向脑的血液供应暂时性减少时发生。如果症状被很快地解决(24小时内个体返回正常的健康)则诊断为TIA。当血液在头骨拱顶内积累时(通常当变弱的血管破裂时)，术语‘出血性中风(HS)’发生。可将出血性中风分类为两种主要的子类型：脑内的(脑组织内)；和蛛网膜下腔的(脑表层周围并在其保护层下)。

本文提及的‘已患有或正患有中风的患者’包括已被诊断为当前正患有中风或已被诊断为之前中过中风的患者。中风可为最近的事件，这样的事件发动个体寻求临床帮助的过程。

术语“个体”和“患者”在本文可被交换地使用，并且指哺乳动物，其包括非灵长类(例如牛、猪、马、狗、猫、大鼠和小鼠)和灵长类(例如猴和人)。优选地，个体或患者为人。

本文使用的术语‘生物标志物’指存在于获自患者的生物样品中的分子，所述样品中生物标志物的浓度可指示病理状态。本文描述了多种生物标志物，本申请的发明人发现所述多种生物标志物单独或与其他诊断方法组合，或作为与其他生物标志物组合的互补生物标志物对鉴别不同的中风子类型是有用的。本文使用的术语‘互补生物标志物’指可被用于与其他中风生物标志物结合以支持诊断的生物标志物。

本领域很好理解的是，由于例如年龄、性别或种族/地区的遗传型，生物标志物的正常或‘背景’浓度可呈现出轻微的变化。因此，本发明的方法中使用的阈值也可由于根据靶患者/群体的优化而轻微地变化。

获自患者的生物学样品优选地为血液、血清或血浆样品。本文使用的术语‘离体(exvivo)’具有其在本领域中的通常含义，并且指已从患者的身体取走的样品。

当从患者抽取血液样品用于分析时，分析全血、血清或血浆。血液样品的分析可为数种分析方法学的方式，如与预分离步骤(如色谱法)结合的质谱法。优选的方法学基于免疫检测。也将免疫检测技术容易地并入便携式或手提式装置用于在临床环境的外部使用。可使用定量免疫分析如免疫印迹或ELISA来检测蛋白的量。分析的优选方法包括使用多分析物生物芯片，其能够使数个蛋白被同时地检测和定量。2D凝胶电泳也是可被用于多分析物分析的技术。

本发明的第一方面提供协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风(HS)，缺血性中风(IS)和短暂性脑缺血发作(TIA)的方法，其包括：测定获自患者的离体样品中VCAM-1、GFAP和CRP的浓度，并且建立生物标志物的浓度的意义。使用向后逐步的逻辑回归，本申请的发明人发现生物标志物GFAP、VCAM、CRP显著地影响可区分TIA、IS和HS的预测模型。

在优选的实施方案中，所述方法还包括：测定获自患者的离体样品中IL-6和sTNFR1的浓度；确定患者的性别；以及与患者的性别结合建立五种生物标志物的浓度的意义。

已发现性别对体内稳态和疾病中生物标志物水平具有主要的影响。本申请的发明人发现与性别组合的五种生物标志物GFAP、VCAM、CRP、IL-6和sTNFR1可被用来开发可准确地预测患者呈现有哪种中风类型的概率的算法以允许相关的治疗。

除上述所描述的实施方案的任一项以外，本发明的方法也可进一步包括测定生物标志物ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白、D-二聚体和FABP中一种或多种的浓度，以及将浓度值用于统计学算法中以区分不同的中风子类型。

优选地，将每种生物标志物的浓度值输入统计学算法以产生输出值，所述输出值与HS、IS或TIA的鉴别诊断相关。在一个实施方案中，所述方法被用来鉴别诊断HS和IS/TIA。

技术人员将意识到用于开发统计学算法的许多合适的方法，并且所有这些方法在本发明的范围内。合适的分类算法的实例包括多项式逻辑回归、多层感知器神经网络(MLP)、人工神经网络、支持向量机和随机森林分类。本申请的发明人发现多项式逻辑回归和MPL在本发明的情况中均可实现类似的性能，其暗示了本发明的方法中使用的分析物(即生物标志物)而不是产生算法模型所使用的方法的重要性。然而，在一个优选的实施方案中，统计学算法包括逻辑回归方程。

可通过接受者操作特性(ROC)很好地描述根据本发明所使用的统计学方法的准确性。ROC曲线处理了所述测试的敏感性(真阳性的数量)和特异性(真阴性的数量)。因此，指定生物标志物组合的敏感性和特异性的值指示所述检测的准确性。例如，如果生物标志物的组合具有80％的敏感性和特异性，从患有中风的100例患者中，从确定具体生物标志物组合的存在可正确地鉴定80例为中风的阳性，而从不患有中风的100例患者中，80例准确地检验为所述疾病的阴性。

如果两种或更多种生物标志物被用于诊断方法中，可得到合适的数学模型，如逻辑回归方程。逻辑回归方程可包含其他变量，如患者的年龄和性别。ROC曲线可被用来评估逻辑回归模型的准确性。逻辑回归方程可被独立地使用或被用于算法中以协助做出临床决策。尽管逻辑回归方程是这样的情况中使用的常见数学/统计学方法，并且在本发明的情况中是优选的，但也可使用其他数学/统计学方法。

通过实例的方式，适用于本发明的用于指示患者(疑似已具有或当前正经历中风)中风类型的生物标志物组合GFAP、CRP和VCAM的逻辑回归方程(分类阈值0.5)计算如下：

其中[GFAP]、[CRP]和[VCAM]为取自所述患者的血液样品中测出的GFAP、CRP和VCAM的浓度(参见表1的118号的AUC值)。

优选地，对之前被诊断为正患有中风，或之前患有中风的患者实施协助鉴别诊断HS、IS和TIA的方法。本发明的方法的目的是鉴定患者正患有或已患有哪种中风子类型，以便可施用适当的治疗。因此，在一个实施方案中，一旦做出中风子类型的鉴别诊断，本发明的方法包括对患者施用适当治疗的进一步步骤。例如，如果实施本发明方法的结果确定患者已患有或正患有IS，可施用适当的治疗如溶解血栓的疗法(例如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA))以打破凝块。可结合由医师所确定的其他适当的疗法施用该治疗。如果实施本发明方法的结果确定患者已患有或正患有TIA，可开处方并施用血液稀释剂，如华法林和阿司匹林。如果实施本发明方法的结果确定患者已患有或正患有HS，然后通常将这些患者送至外科病房以修复损害的血管。

可使用本领域已知的任何合适的诊断方法或技术，实施诊断患者正患有或已患有中风的初步步骤，所述诊断方法或技术包括扫描技术如CT和MRI，或分析患者样品的中风生物标志物。然而，在优选的实施方案中，通过以下步骤患者被诊断为正患有或已患有中风：测定获自患者的离体样品中至少两种生物标志物的浓度，并且通过将每种生物标志物的浓度值与相应的对照值比较来建立生物标志物的浓度的意义。优选地，至少两种生物标志物选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、IL-6、sTNFR1、D-二聚体和CRP，以及优选地，两种生物标志物中至少一种选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白和VCAM-1。根据初步诊断中风的该优选的方法，将患者和对照的每种生物标志物浓度值输入统计学算法以产生输出值，所述输出值指示是否已发生中风。用于本发明的该实施方案的优选生物标志物组合为表1或表2中列举的那些生物标志物。这些表提供了用于中风与对照比较的不同生物标志物组合的敏感性、特异性和AUC数据。

表1

[Lsel(L-选择蛋白)Psel(P-选择蛋白)]

表2

[Lsel(L-选择蛋白)Psel(P-选择蛋白）]

在上述初步诊断中风的优选方法中，对照值可源自获自没有经历过中风的一个或多个个体的生物学样品中相应生物标志物的浓度。没有经历过中风的这样的一个或多个个体可为例如健康的个体，患有除中风以外的疾病的个体。可选地，对照值可相应于中风事件之前获自患者的样品中每种生物标志物的浓度。

为避免疑义，术语‘相应生物标志物’意指关于患者样品被测定的相同生物标志物组合的浓度也被用来测定对照值。例如，如果测定了患者样品中ICAM-1和L-选择蛋白的浓度，则也测定对照样品中ICAM-1和L-选择蛋白的浓度。

在优选的实施方案中，将患者和/或对照的每种生物标志物浓度值输入一个或多个统计学算法以产生输出值，所述输出值指示是否已发生中风。

使用统计学技术导出截取浓度或截取值；多种不同的方法适用于开发统计学算法并且是本领域技术人员公知的。生物标志物统计学分析的标准方法是使用单变量方法以比较多个组的生物标志物水平，并且突出跨具体组和具体组之间浓度显著不同的生物标志物。

可通过使样品与具有探针的基底接触来测定生物标志物浓度，所述探针对生物标志物组合中包括的每种生物标志物具有特异性。可使用本领域公知的多种技术监测和定量生物标志物与其各自探针之间的相互作用。生物标志物浓度被优选地测量为ng/ml。

因此，本发明的第二方面提供基底，其包含对VCAM-1、GFAP和CRP特异的探针。所述基底适合于在本发明的方法中使用，用于协助鉴别诊断HS、IS和TIA。优选地，所述基底还包含对IL-6和sTNFR1特异的探针，并且还可任选地包含表1和/或表2中所列的生物标志物中任一种或多种的探针。

本文使用的术语‘特异’意指探针只结合本发明的生物标志物的一种，与本发明的其他生物标志物或被分析的生物学样品中其他分析物的结合可忽略。这确保了使用本发明的生物标志物的诊断检测及其结果的完整性不被其他结合事件连累。

优选地，探针被固定在基底的表面上，优选地被共价地固定。基底可为能够支持一种或多种探针的任何物质，但优选地为固态装置，如生物芯片。生物芯片为平面的基底，其可为例如，矿物质或基于聚合物的，但优选地为陶瓷的。当鉴定本发明的多种生物标志物/蛋白时，对技术人员显而易见的是，不仅鉴定全长的蛋白，而且鉴定蛋白的片段或数个片段是可能的，条件是允许蛋白的准确鉴定。类似地，尽管本发明的优选探针是多克隆或单克隆抗体，也使用其他探针如适配体探针、分子印迹聚合体探针、噬菌体探针、短链抗体片段探针和其他基于抗体的探针。

优选地，固态装置被用于本发明的方法中，优选生物芯片阵列技术系统(BAT)(可获自RandoxLaboratoriesLimited)。更优选地，可使用EvidenceEvolutionandEvidenceInvestigator仪器(可获自RandoxLaboratories)来测定样品中生物标志物的水平。

在本发明相关的第三方面中，本发明第二方面所述的包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针的基底被用于本发明第一方面所述的用于协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法中。

根据第四方面，本发明涉及VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFR1作为出血性中风的生物标志物和/或作为出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的区分指标的用途。

本发明也提供试剂盒，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针，以及任选地IL-6和/或sTNFR1的探针，另外的试剂，基底/反应表面和/或使用说明书。这样的试剂盒可被用来根据本发明第一方面鉴别诊断患者的中风子类型。

本发明将参考以下非限制性实施例进一步描述。

实施例

患者组

该研究由被希腊雅典的KAT总医院急诊室收治的98例显示中风症状的患者组成。在收治时以及在第1、第2、第3和第7天抽取血液样品。中风症状的发作到医院收治之间的平均时间是3.2小时。患者的平均年龄是75.2岁(标准误差9.4)。临床评估(使用背景部分强调的标准)和神经成像技术鉴定44例缺血性中风(IS)、25例出血性中风(HS)，29例短暂性脑缺血发作(TIA)；60位健康个体作为对照(C)。

样品分析

检验获自本研究组患者的血液的EDTA血浆样品中的以下蛋白：VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和sTNFR1。使用并入生物标志物特异性抗体的多路生物芯片和EvidenceInvestigator(RandoxLaboratoriesLtd，Crumlin，UK)检测和定量所述蛋白。根据开发商的说明书进行同时的免疫分析。分析每种生物标志物的9点标准曲线和三种参考对照以允许结果的校验。对于CRPIS与TIA比较的分析，将样品稀释十倍。

统计学分析

将单个生物标志物应用于ROC曲线分析以评估敏感性和特异性。使用逻辑回归来模拟中风和中风子类型与多种生物标志物组合的浓度的从属性，随后通过ROC曲线分析来评估模拟的分类准确性。结果如图1-3所示。

性别与用于确定中风子类型的每一种生物标志物的相关性如图4-8所示。

结果

表3所示的数据显示使用本发明的生物标志物区分HS与IS/TIA。使用本发明的生物标志物区分HS与IS和TIA患者的ROC曲线分析如图3所示。

表3

此外，图1-3和表4示例了使用生物标志物的组合将所有中风患者归类为TIA、IS或HS患者，在使用多项式逻辑回归的该实例中，得出超过任何单独生物标志物的改善区分。

此外，设计归类算法的可选方法，如使用人工神经网络(参见图9和表5)显示相似的性能特点。

表5

曲线下的面积

a.非参数假设下

b.零假设：真实面积＝0.5

该表进一步示例了在通过本领域已知的任何方法导出的算法中组合目标生物标志物的鲁棒性。

缩写

GFAP-胶质纤维酸性蛋白

IL-6-白细胞介素-6

ICAM-1-细胞内粘附分子-1

VCAM-1-血管细胞粘附分子-1

CRP-C-反应蛋白

FABP-脂肪酸结合蛋白

sTNFR1-可溶的TNFα受体1

L-选择蛋白-淋巴细胞细胞粘附分子(CD62L)

P-选择蛋白-血小板细胞粘附分子

D-二聚体-纤维蛋白降解产物

Claims (15)

1.协助鉴别诊断已患有或正患有中风的患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法，其包括：

i)测定获自所述患者的离体样品中生物标志物VCAM-1、GFAP和CRP的浓度；以及

ii)建立所述生物标志物的浓度的统计学意义。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括：

iii)测定获自所述患者的离体样品中生物标志物IL-6和sTNFR1的浓度；

iv)确定所述患者的性别；以及

v)与所述患者的性别结合，建立五种生物标志物的浓度的统计学意义。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中将每种生物标志物的浓度值输入统计学算法以产生输出值，所述输出值与出血性中风、缺血性中风或短暂性脑缺血发作的鉴别诊断相关。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述方法被用来鉴别诊断出血性中风和缺血性中风/短暂性脑缺血发作。

5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述统计学算法包括逻辑回归方程。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者被诊断为正患有或已患有中风。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述患者通过以下步骤被诊断为已患有或正患有中风：测定获自所述患者的离体样品中至少两种生物标志物的浓度，并且通过将每种生物标志物的浓度值与相应的对照值比较，建立所述生物标志物的浓度的统计学意义，其中所述至少两种生物标志物选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白、VCAM-1、IL-6、sTNFR1、D-二聚体和CRP，并且其中两种生物标志物中至少一种选自ICAM-1、L-选择蛋白、P-选择蛋白和VCAM-1，其中将患者和对照的每种生物标志物浓度值输入统计学算法以产生输出值，所述输出值指示是否已发生中风。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。

9.基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针，用于权利要求1-8中任一项所述的协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法。

10.如权利要求9所述的基底，其还包含IL-6和sTNFR1的探针。

11.如权利要求9或10所述的基底，其中所述基底具有固定在其上的探针。

12.如权利要求9至11中任一项所述的基底，其中所述基底为生物芯片。

13.包含VCAM-1、GFAP和CRP的探针的基底在权利要求1至8中任一项所述的协助鉴别诊断患者的出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的方法中的用途。

14.如权利要求13所述的基底的用途，其中所述基底还包含IL-6和sTNFR1的探针。

15.VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFR1作为出血性中风的生物标志物和/或作为出血性中风、缺血性中风和短暂性脑缺血发作的区分指标的用途。