CN107190074A - hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的环状RNA：hsa_circRNA_103127，其序列如SEQ ID NO：1所示。相较于正常人群而言，该环状RNA在唐氏综合征病人体内表达显著上调，且经过统计，这种表达的上调具有统计学意义上的相关性。因此，该环状RNA具有作为唐氏综合征相关的生物标志物的潜能。

Description

hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种新的环状hsa_circRNA_103127及其应用。
背景技术
唐氏综合征(Down Syndrome，DS)，即21-三体综合征，也可称作先天愚型或Down综合征，是由于第21号染色体异常而导致的出生缺陷类疾病，是出生缺陷疾病中最常见的一种染色体非整倍体遗传性疾病。基于唐氏综合征的发病机制仍不清楚，目前针对该病仍然没有有效的治疗方法，出生干预是目前降低出生缺陷的重要手段，而出生干预主要依赖于产前诊断与产前筛查。产前筛查主要在孕早期(7～12周)以及孕中期(15～20周)检测孕妇的一定指标包括孕妇年龄的筛查、超声筛查、胎儿母体血清学的筛查以及联合筛查方案等以评估胎儿是否患有DS的风险。传统的产前诊断则主要采用的是侵入性的取样手段，包括脐带取血，羊膜腔穿刺以及绒毛膜取样等，利用DS遗传学诊断技术、DS分子学诊断技术、荧光原位杂交(FISH)、聚合链反应(QF-PCR)以及短串联重复序列(STR)等技术对胎儿样本进行分析诊断。然而，传统的产前筛查具有检出率低、漏检率高和结果容易出现假阳性的缺点，产前诊断则因为侵入式取样的手段容易产生出血、流产或患有其它并发症。
为了提高产前筛查的准确性以及产前诊断的安全性，研究者们一直在探索新的DS无创伤性产前诊断方法。无创性产前诊断具有简便、安全以及可靠等优点，其中包括母血胎儿细胞途径，母血胎儿游离DNA途径和母血胎儿游离RNA途径。然而由于胎儿有核细胞中的基因组涵盖了胎儿全部的遗传信息，因而存在于孕妇循环血中的胎儿有核细胞成为了最初研究者们的研究方向。但这种方法存在的最大问题在于胎儿有核细胞在母体血液中含量极少，无法达到分析诊断的要求，最终使临床应用受到了一定的限制。
综上所述，基于传统产前筛查和产前诊断的缺陷，以及已有无创性产前诊断方法的不足，使得探索新的无创性唐氏综合征胎儿产前诊断标志物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于公开一种新的环状hsa_circRNA_103127。
本发明所采取的技术方案是：公开了一种环状RNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，该环状RNA作为唐氏综合征检测、治疗、预后靶点的应用。
一种唐氏综合征检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测序列为SEQ ID NO：1的环状 RNA的试剂。
优选的，该试剂盒中含有实时荧光定量检测序列为SEQ ID NO：1的环状RNA的引物序列。
优选的，检测环状RNA引物序列是：
F：5’-GACCGTCGCCAGCCAAAC-3’(SEQ ID NO：4)；
R：5’-GAGTCCAGCGGCAAAACTATAA-3’(SEQ ID NO：5)。
定量检测序列为SEQ ID NO：1的环状RNA的试剂在制备唐氏综合征检测试剂中的应用。
定量检测环状RNA的试剂为实时荧光定量检测序列为SEQ ID NO：1环状RNA的引物序列。
优选的，环状RNA引物序列是：
F：5’-GACCGTCGCCAGCCAAAC-3’(SEQ ID NO：4)；
R：5’-GAGTCCAGCGGCAAAACTATAA-3’(SEQ ID NO：5)。
本发明的有益效果是：本发明申请公开的CircRNA在唐氏综合征病人与正常人群体内表达具有比较明显的表达差异，目前用于唐氏综合征的临床辅助诊断技术尚不完善，因此该 CircRNA具有作为唐氏综合征相关的生物标志物的潜能。
具体实施方式
实施例1
在对唐氏综合症的研究过程中，发现一种环状RNA，其序列是：TGTTATAGTTTTGCCGCTGGACTCTTCCCTCCCTTCCCCCACCCCATCAGGATGATATGAGACTTGAAAGAAGACGATGCATACAGGAGGAGAGACTTCAGCATGCAAACCTTCATCTGTTCGGCTTGCACCGTCATTTTCATTCCATGCTGCTGGCCTTCAGATGGCTGGACAGATGCCCCATTCACATCAGTACAGTGACCGTCGCCAGCCAAACATAAGTGACCAACAGGTTTCTGCCTTATCATATTCTGACCAGATTCAGCAACCTCTAACTAACCAG(SEQ ID NO：1)，将其命名hsa_circRNA_103127。
实施例2样本及处理
12例胎儿脐带血标本从深圳市人民医院临床医学研究中心中心实验室获得，其中包括6 例经G显带染色体核型分析确诊为标准型唐氏综合征胎儿的脐带血标本(2男4女)以及6 例正常胎儿脐带血(2男4女)，孕龄均为18-22周；12例儿童外周血标本从桂林市中国人民解放军第一八一部队医院广西代谢性疾病研究重点实验室获得，其中包括6例唐氏综合征患儿外周血标本(2男4女)以及6例健康儿童外周血标本(2男4女)，年龄均为0-15岁。本研究已经深圳市人民医院以及桂林市解放军第一八一部队医院伦理委员会的批准，并均征得患者的知情同意，所有受试者均提供书面知情同意书。
分别采用RT-PCR技术在DS患儿与健康儿童的外周血中进行了验证。同时对于验证得出的差异性变化的circRNA所对应的mRNA，发明人采用RT-PCR技术在外周血中进行了检测。
RT-PCR验证的具体实验步骤为：
(1)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板：
a针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一个确定表达该基因的cDNA模板进行PCR 反应：
轻弹管底，将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40个PCR 循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；
b将PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；
c将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10-1、1×10-2、 1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9，这几个梯度浓度的DNA。
(2)进行RT-PCR反应：
a将所有cDNA样品分别配置RT-PCR反应体系。体系配置如下：
轻弹管底，将溶液混合，5000rpm，短暂离心；
b加样：
将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μL cDNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。最后，在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；
c将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应：
所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃， 60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。
(3)结果与计算：
RT-PCR时各样品的加样量均为2μL，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因β-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。
实施例3实验结果
以β-actin为内参照物，分别运用RT-PCR技术在外周血中对上述circRNA进行了验证。 PCR引物序列如表1：
表1 RT-PCR引物列表
利用2-ΔΔCt法计算差异倍数，结果如表2。
表2 circRNA验证结果
结果表明，相较于健康人群，在唐氏综合症患者中，hsa_circRNA_103127的表达量会显著升高，二者存在着明显的正相关的关系。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第一八一医院
<120> hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 283
<212> DNA
<213> hsa_circRNA_103127
<400> 1
tgttatagtt ttgccgctgg actcttccct cccttccccc accccatcag gatgatatga 60
gacttgaaag aagacgatgc atacaggagg agagacttca gcatgcaaac cttcatctgt 120
tcggcttgca ccgtcatttt cattccatgc tgctggcctt cagatggctg gacagatgcc 180
ccattcacat cagtacagtg accgtcgcca gccaaacata agtgaccaac aggtttctgc 240
cttatcatat tctgaccaga ttcagcaacc tctaactaac cag 283
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgtaacaa cgcatctcat att 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaccgtcgcc agccaaac 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagtccagcg gcaaaactat aa 22

Claims (8)

1.一种环状RNA，其序列是：
TGTTATAGTTTTGCCGCTGGACTCTTCCCTCCCTTCCCCCACCCCATCAGGATGATATGAGACTTGAAAGAAGACGATGCATACAGGAGGAGAGACTTCAGCATGCAAACCTTCATCTGTTCGGCTTGCACCGTCATTTTCATTCCATGCTGCTGGCCTTCAGATGGCTGGACAGATGCCCCATTCACATCAGTACAGTGACCGTCGCCAGCCAAACATAAGTGACCAACAGGTTTCTGCCTTATCATATTCTGACCAGATTCAGCAACCTCTAACTAACCAG(SEQ ID NO：1)。
2.权利要求1所述的环状RNA作为唐氏综合征检测、治疗、预后靶点的应用。
3.一种唐氏综合征检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有能够定量检测权利要求1所述的环状RNA的试剂。
4.根据权利要求3所述的唐氏综合征检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有实时荧光定量检测权利要求1所述的环状RNA的引物序列。
5.根据权利要求4所述的唐氏综合征检测试剂盒，其特征在于，所述环状RNA引物序列是：
F：5’-GACCGTCGCCAGCCAAAC-3’(SEQ ID NO：4)；
R：5’-GAGTCCAGCGGCAAAACTATAA-3’(SEQ ID NO：5)。
6.定量检测权利要求1所述环状RNA的试剂在制备唐氏综合征检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，定量检测权利要求1所述环状RNA的试剂为实时荧光定量检测权利要求1所述的环状RNA的引物序列。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述环状RNA引物序列是：
F：5’-GACCGTCGCCAGCCAAAC-3’(SEQ ID NO：4)；
R：5’-GAGTCCAGCGGCAAAACTATAA-3’(SEQ ID NO：5)。
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