CN107290539B - 用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物及其应用，本发明属于医药技术领域。本发明从噬菌体随机肽库中筛选出对自身免疫性疾病血清标志物具有结合能力的多肽，通过人工合成，用于血清标志物的免疫学检测。所述的多肽组合物包括SEQ ID NO.1‑19所示序列的全部或部分。此外，本发明还公开了含有所述多肽组合物的芯片、酶联免疫反应板以及试剂盒。本发明得到的多肽序列对自身免疫性疾病患者血清标志物具有良好的结合能力，可用于自身免疫病的诊断和评价。

Description

用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一组检测自身免疫病患者血清标志物的多肽，还涉及该多肽组合在制备多肽芯片、酶联免疫吸附法抗体检测试剂盒中的应用，可实现对血浆/血清中自身免疫病标志物的检测。本发明属于医药技术领域。
背景技术
自身免疫病(AID)是临床常见、治疗困难的一大类疾病，是由于机体识别“自我”的耐受机制遭到破坏，机体免疫系统针对自身抗原产生过度应答，破坏正常组织结构，从而导致一系列病变的发生。自身免疫病的发病机制十分复杂，涉及包括遗传、感染、免疫功能异常等在内的众多因素，但具体机制至今尚未明确。
系统性红斑狼疮(SLE)以青年妇女多见，发病高峰在15～40岁生育期，但婴幼儿、老年也可发病，男女之比为1:5～1:10，我国患病率约为70/10万人，各地区报道有差异。SLE病因、发病机制尚不完全清楚，可能为内外因素激发存在遗传易感性的个体，导致机体免疫系统紊乱而发病，其中重要的特征是可以产生抗核抗体等多种自身抗体，而且自身抗体和抗原形成免疫复合物，沉积于组织器官血管翳，激活补体系统，产生血管炎，这就是导致SLE多组织、器官损伤的共同免疫病理基础。
类风湿关节炎(RA)是一种以对称性、多关节、小关节病变为主要病变的慢性自身免疫病。主要病理学改变为慢性滑膜炎、滑膜增生和纤维化。其发病率在自身免疫性结缔组织病中居首位，全世界RA病人约占总人口的1.4％，我国发病率为0.35％～0.4％，致残率达15％，每年新增病例约400万。类风湿关节炎的危害呈逐年升高趋势。
目前，自身免疫病的诊断方法非常有限，主要是在结合临床的基础上，依赖实验室检查，在AID患者体内检测到高效价的自身抗体，筛选和明确新的血清标志物，一直以来都是自身免疫病的发病机制、诊断和治疗的相关基础与临床研究工作的重点。
1985年Smith首次报道了噬菌体展示(phage-display)技术，目前噬菌体展示技术已有很大发展。噬菌体展示技术的原理：噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，它以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。不仅能筛选天然蛋白的线性表位还能筛选天然蛋白不存在的模拟表位。该技术可以大大加快对血清标志物配体的筛选速度，并可以高通量的进行筛选研究。
发明内容
本发明的目的在于提供了一组检测自身免疫病患者血清标志物的多肽及其应用方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明通过以丝状噬菌体M13为载体构建的噬菌体随机多肽文库为配体库选取自身免疫病患者和正常人血清与噬菌体肽库进行阴性和阳性筛选。从而筛选出新的具有临床诊断价值的多肽序列，并通过实验验证其与临床疾病的相关性，提供一种检测自身免疫病患者血清标志物的多肽(或多肽组合)，并由此制备的检测试剂盒，用于临床辅助诊断自身免疫病。
本发明的一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物，所述的多肽组合物包括具有SEQ ID NO.1-19所示氨基酸序列的多肽的全部或部分。
进一步的，本发明还提出了所述的多肽组合物在制备检测自身免疫病患者血清标志物的芯片、酶联免疫反应板或者试剂盒中的应用。其中，优选的，所述的自身免疫疾病包括但不限于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、结节性多动脉炎。
一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的酶联免疫反应板，其上包被有以上所述的多肽组合物，优选的，所述的酶联免疫反应板为聚乙烯微量反应板。
一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的芯片，其上包被有以上所述的多肽组合物。
其中，优选的，所述的芯片为硝酸纤维素膜涂层玻璃芯片或树脂芯片。
其中，优选的，所述的芯片按照以下方法制备得到：
(1)采用固相多肽合成方法获得具有SEQ ID NO.1-19所示氨基酸序列的多肽的全部或部分；
(2)将合成好的多肽粉末瞬时离心；用分析天平分别称取1.5mg左右的粉末至1.5mL离心管，根据多肽的亲水特性分为疏水多肽和亲水多肽两组，分别溶解；对于亲水型多肽直接根据称取的多肽量，加相应体积的纯水溶解至2mg/mL，对于疏水型多肽，先加入50μL二甲基亚砜，使多肽充分溶解后，再加入纯水，使多肽浓度达到2mg/mL；
(3)把溶解好的多肽以及阳性对照、阴性对照品根据芯片阵列顺序排布，分别取300μL至96孔板，置于芯片点样仪样品区；
(4)将硝酸纤维素膜涂层玻璃芯片或树脂芯片放置在芯片点样仪的芯片区，检查点样仪的液路系统，确保水位正常，打开加湿器，待点样区湿度达到60％后，运行芯片点制程序，点样方式为喷点或者针点；
(5)芯片点制完成后，芯片在室温、60％湿度状况下，放置30min，之后转入4℃冰箱保存，即得。
一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的试剂盒，所述的试剂盒包括以上所述的酶联免疫反应板或所述的芯片、样品稀释液、封闭液、洗液以及抗人二抗。
其中，优选的，所述的封闭液为含有1w/w％BSA的0.02M PBS缓冲液，所述的洗液为含有0.05v/v％Tween 20的0.02M的PBS缓冲液，所述的样品稀释液为含有0.05v/v％Tween20的0.02M的PBS缓冲液，所述的抗人二抗为荧光素、辣根过氧化物酶、生物素标记的抗人IgG和IgM的重链抗体。更优选的，所述的抗人二抗为Cy3标记的小鼠抗人IgG、Alexa Fluor647标记的小鼠抗人IgM或其组合。
其中，优选的，使用所述的试剂盒检测自身免疫病患者血清标志物时，按照以下方法进行：
(1)从4℃冰箱取出所述的芯片室温平衡15min，用4-5mL封闭液封闭芯片并室温摇2h；
(2)弃封闭液，加入4-5mL洗液，置于摇床上，室温放置5min；
(3)取出芯片，倒掉洗液，将芯片装在芯片杂交反应板上，使用样品稀释液按照体积比1:10稀释血清样品，分别在每张芯片中加入血清样本或阴性对照100μl，置于摇床上，4℃放置过夜；
(4)取下芯片快速放入清洗盒，加入4-5mL洗液，置于摇床上，室温放置5min，共清洗5次；
(5)清洗完成后向芯片中加入稀释后的抗人二抗，摇床上，室温放置1h；
(6)取出芯片，按照步骤(4)清洗5次后，用纯水，清洗芯片；
(7)芯片离心甩干，置于GenePix4000B扫描仪，进行芯片扫描。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供的一组多肽序列及其检测试剂盒，可以通过结合血清中的抗体来辅助诊断和评价疾病，其中所述疾病选自自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病包括但不限于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、结节性多动脉炎。
附图说明
图1为文库质粒图谱；
图2为噬菌体与血清标志物淘洗流程；
图3为噬菌体计数及克隆筛选平板；
图4为多肽测序引物位置；
图5为芯片扫描部分结果；
图中数字表示不同的血清样本编号；
图6为单个多肽诊断正常人和系统性红斑狼疮患者(SLE)的ROC曲线图，敏感性为60.0％、特异性为94.0％；
图7为联合多肽诊断正常人和系统性红斑狼疮患者(SLE)的ROC曲线图，敏感性为73.3％、特异性为88.0％；
图8为联合多肽诊断正常人和类风湿关节炎患者(RA)的ROC曲线图，敏感性为81.7％、特异性为76.0％；
注：Sensitivity敏感性；Specificity特异性；Criterion标准，准则。纵坐标代表敏感性，横坐标代表1减去特异性，曲线下面积代表诊断效能。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1血清包被及噬菌体的吸附与洗脱
选取自身免疫病患者及正常人血清各30例，分别混合后，按1:10倍稀释后加入到96孔板中，每孔150微升，4℃30r/min轻微震荡孵育过夜后倒掉孔中的包被液，加满封闭缓冲液，4℃孵育2h。倒掉孔中的封闭缓冲液，用TBST(TBS+0.1v/v％Tween-20)快速洗涤6次，用100μL的TBST缓冲液稀释2×1011pfu的噬菌体原始文库(含E.coli ER2738宿主菌试剂盒，由美国New England Biolabs公司生产)，文库质粒图谱如图1，加入已包被正常人混合血清的孔中，室温温和摇动60min。收集未与正常人混合血清结合的噬菌体上清于无菌微量离心管中。用1mL的TBST缓冲液稀释，加到已包被自身免疫病患者混合血清的孔板中，室温温和摇动60min，弃上清，去除未结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，加入非特异性缓冲液(0.2MGlycine-HCl(pH2.2)，1mg/ml BSA)温和摇动15min，以分离已结合的分子，最后加入15μL1M Tris-HCl(pH 9.1)，获得可以和自身免疫病患者血清结合的噬菌体储液，测定其滴度后备用。如此进行2～3次淘洗，过程如图2。
实施例2与患者混合血清结合的噬菌体的滴度测定与克隆扩增
挑取复苏的E.coli ER2738单菌落于10ml LB培养基中，当培养物达对数生长期时，分装至1.5mL离心管中，每管200μL，同时每管加入10μL与患者混合血清结合的噬菌体储液，室温孵育5min，加入预温的顶层琼脂培养管中，并立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。待平板冷却后，倒置于37℃培养过夜。检查平板，计数﹤100个噬菌斑的平板上的噬菌斑数，如图3。挑取蓝色噬菌斑于1mL1:100稀释的ER2738过夜培养液中。37℃150r/min摇床培养4.5h。培养物转入1.5mL离心管中，离心30s，上清转入一新管中，再离心30s。将80％的上清转入新的离心管，此即为扩增的单克隆噬菌体储液。
实施例3与自身免疫病患者血清结合的阳性噬菌体ssDNA序列测定
将500μl含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μl PEG/NaCl，室温放置10min，4℃10,000r/min离心10min，弃上清液。再离心2min，小心吸去残余上清。沉淀物彻底重悬于100μL碘化物缓冲液中，加入250μL乙醇。室温温育10min。离心10min，弃上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μL TE[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA]中，用-96gIII测序引物5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’，100pmol/μL，1pmol/μL自动测序。所读序列相应于模板的反义链，将互补链写出，与图4(引自Ph.D.-12TMPhage DisplayPeptide Library Kit使用说明)中的上链对照进行检查。检查随机区域内每个密码子的第三位是否为G或T。对照遗传密码表由此链翻译得到氨基酸序列，并对含有精氨酸的多肽进行瓜氨酸化，共获得19条多肽，19条多肽序列详见表1。
表1多肽测序结果和瓜氨酸化多肽序列
SEQ ID NO. 序列(氨基酸缩写) 备注
1 QNELHAQ 08S0704
2 TALGHQPLMRNT 08S1204
3 TALGHQPLMCitNT 08S1204Cit
4 APWHNSWSEERT 13S1202
5 YLDEFAWYRFTH 13S1204
6 YLDEFAWYCitFTH 13S1204Cit
7 WPRPYYGDWFQT 13S1205
8 WPCitPYYGDWFQT 13S1205Cit
9 WPRPYYGEGFQT 13S1208
10 WPCitPYYGEGFQT 13S1208Cit
11 HPLTWNLRSSPA 13S1209
12 ADWYHWRSHSSS 13S1210
13 ADWYHWCitSHSSS 13S1210Cit
14 TSLDGRISYHNR 13S1212
15 TSLDGCitISYHNR 13S1212Cit
16 TSLDGRISYHNCit 13S1212Cit2
17 TSLDGCitISYHNCit 13S1212Cit3
18 LPLTRGYVGDQY 13S1215
19 LPLTCitGYVGDQY 13S1215Cit
实施例4多肽序列合成和芯片制备
采用固相多肽合成方法分别获得表1所示的19条多肽，将合成好的多肽粉末瞬时离心；用分析天平分别称取1.5mg左右的粉末至1.5mL离心管，根据多肽的亲水特性分为疏水多肽和亲水多肽两组，分别溶解。对于亲水型多肽直接根据称取的多肽量，加相应体积的纯水溶解至2mg/mL，对于疏水型多肽，先加入50μL二甲基亚砜，使多肽充分溶解后，再加入纯水，补足至根据终浓度计算的溶剂体积。把溶解好的多肽以及阳性对照(cy3-human IgG抗体、cy5-human IgM抗体、Goat anti humanIgG+humanIgM抗体)、阴性对照品根据芯片阵列顺序排布，分别取300μL至96孔板，置于芯片点样仪样品区。将NC膜包被的玻片放置在芯片点样仪的芯片区。检查点样仪的液路系统，确保水位正常，打开加湿器，待点样区湿度达到60％后，运行芯片点制程序，芯片点制完成后，芯片在室温、60％湿度状况下，放置30min，之后转入4℃冰箱保存。
实施例5血清检测
1、样本
确诊为系统性红斑狼疮的患者的血清样本、确诊为类风湿关节炎患者的血清样本以及正常人的血清样本，对样本进行编号。
2、方法
从4℃冰箱取出实施例4制备得到的芯片室温平衡15min，用4-5mL封闭液(3％BSA溶于0.02M的PBS缓冲液中)封闭芯片并室温摇2h。弃封闭液，加入4-5mL洗液(PBST溶液，即含有0.05v/v％Tween 20的0.02M的PBS缓冲液)，置于摇床上，室温放置5min。取出芯片，快速装在芯片杂交反应板上，采用样品稀释液(PBST溶液，即含有0.05v/v％Tween 20的0.02M的PBS缓冲液)按照体积比1:10稀释血清，分别在每张芯片的16个阵列中加入血清样本或阴性对照(PBST)μL，置于摇床上，4℃放置过夜；取下芯片快速放入清洗盒，加入4-5mL洗液，置于摇床上，室温放置5min；重复步骤，共清洗5次；清洗完成后向清洗盒的芯片中加入稀释后的二抗(PBST按照体积比:1000稀释的Cy3-human IgG+647-human IgM)，摇床上，室温放置1h；洗液清洗5次后，用300mL纯水，清洗芯片。芯片离心1min甩干，置于GenePix4000B扫描仪，进行芯片扫描，部分样本的扫描结果如图5所示。
3、结果分析
分别统计各组阳性率制成列联表，并对列联表进行列联表卡方检验分析不同序列的蛋白芯片与自身免疫病患者及正常人的反应情况。采用Epidata3.1进行数据录入，利用SAS release 9.3(Serial 989155,SAS Institute Inc.,Shanghai,China)对数据进行多因素逻辑回归统计分析，并对多肽及多肽组合进行受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve，简称ROC曲线)分析。结果如图6-8所示。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> 用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物及其应用
<130> KLPI170293
<160> 19
<170> PatentIn 3.5
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<213> 多肽
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<210> 10
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 10
Trp Pro Cit Pro Tyr Tyr Gly Glu Gly Phe Gln Thr
<210> 11
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 11
His Pro Leu Thr Trp Asn Leu Arg Ser Ser Pro Ala
<210> 12
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 12
Ala Asp Trp Tyr His Trp Arg Ser His Ser Ser Ser
<210> 13
<211> 7
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 13
Ala Asp Trp Tyr His Trp Cit Ser His Ser Ser Ser
<210> 14
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 14
Thr Ser Leu Asp Gly Arg Ile Ser Tyr His Asn Arg
<210> 15
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 15
Thr Ser Leu Asp Gly Cit Ile Ser Tyr His Asn Arg
<210> 16
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 16
Thr Ser Leu Asp Gly Arg Ile Ser Tyr His Asn Cit
<210> 17
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 17
Thr Ser Leu Asp Gly Cit Ile Ser Tyr His Asn Cit
<210> 18
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 18
Leu Pro Leu Thr Arg Gly Tyr Val Gly Asp Gln Tyr
<210> 19
<211> 12
<212> PTR
<213> 多肽
<400> 19
Leu Pro Leu Thr Cit Gly Tyr Val Gly Asp Gln Tyr

Claims (11)

1.用于检测自身免疫病患者血清标志物的多肽组合物，其特征在于所述的多肽组合物由选自SEQ ID NO.1-19所示的多肽中的全部或部分多肽组成。
2.权利要求1所述的多肽组合物在制备检测自身免疫病患者血清标志物的芯片、酶联免疫反应板或者试剂盒中的应用，所述的自身免疫疾病为类风湿关节炎或系统性红斑狼疮。
3.一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的酶联免疫反应板，其特征在于所述酶联免疫反应板上包被有权利要求1所述的多肽组合物。
4.如权利要求3所述的酶联免疫反应板，其特征在于所述的酶联免疫反应板为聚乙烯微量反应板。
5.一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的芯片，其特征在于所述芯片上包被有权利要求1所述的多肽组合物。
6.如权利要求5所述的芯片，其特征在于所述的芯片为硝酸纤维素膜涂层玻璃芯片或树脂芯片。
7.如权利要求5或6所述的芯片，其特征在于所述的芯片按照以下方法制备得到：
（1）采用固相多肽合成方法获得SEQ ID NO.1-19所示的多肽中的全部或部分多肽；
（2）将合成好的多肽粉末瞬时离心；用分析天平分别称取1.5mg左右的粉末至1.5mL离心管，根据多肽的亲水特性分为疏水多肽和亲水多肽两组，分别溶解；对于亲水型多肽直接根据称取的多肽量，加相应体积的纯水溶解至2mg/mL，对于疏水型多肽，先加入50µL二甲基亚砜，使多肽充分溶解后，再加入纯水，使多肽浓度达到2mg/mL；
（3）把溶解好的多肽以及阳性对照、阴性对照品根据芯片阵列顺序排布，分别取300µL至96孔板，置于芯片点样仪样品区；
（4）将硝酸纤维素膜涂层玻璃芯片或树脂芯片放置在芯片点样仪的芯片区，检查点样仪的液路系统，确保水位正常，打开加湿器，待点样区湿度达到60%后，运行芯片点制程序，点样方式为喷点或者针点；
（5）芯片点制完成后，芯片在室温、60%湿度状况下，放置30min，之后转入4℃冰箱保存，即得。
8.一种用于检测自身免疫病患者血清标志物的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括权利要求3或4所述的酶联免疫反应板或权利要求5或6所述的芯片、样品稀释液、封闭液、洗液以及抗人二抗。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的封闭液为含有1w/w% BSA的0.02MPBS缓冲液，所述的洗液为含有0.05v/v%Tween 20的0.02M 的PBS缓冲液，所述的样品稀释液为含有0.05 v/v %Tween 20的0.02M 的PBS缓冲液，所述的抗人二抗为荧光素、辣根过氧化物酶、生物素标记的抗人IgG和IgM的重链抗体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述的抗人二抗为Cy3标记的小鼠抗人IgG、Alexa Fluor 647标记的小鼠抗人IgM或其组合。
11.如权利要求8-10任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于检测自身免疫病患者血清标志物时，按照以下方法进行：
（1）从4℃冰箱取出所述的芯片室温平衡15min，用4-5mL封闭液封闭芯片并室温摇2h；
（2）弃封闭液，加入4-5mL洗液，置于摇床上，室温放置5min；
（3）取出芯片，倒掉洗液，将芯片装在芯片杂交反应板上，使用样品稀释液按照体积比1:10稀释血清样品，分别在每张芯片中加入血清样本或阴性对照100uL，置于摇床上，4℃放置过夜；
（4）取下芯片快速放入清洗盒，加入4-5mL洗液，置于摇床上，室温放置5min，共清洗5次；
（5）清洗完成后向芯片中加入稀释后的抗人二抗，摇床上，室温放置1h；
（6）取出芯片，按照步骤（4）清洗5次后，用纯水，清洗芯片；
（7）芯片离心甩干，置于GenePix4000B 扫描仪，进行芯片扫描。
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