ES2483724T3 - Biomarcadores, métodos y kits para el diagnóstico de artritis reumatoide - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado, donde la detección del complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

Description

Biomarcadores, métodos y kits para el diagnóstico de artritis reumatoide

5 Sector de la técnica

La presente invención reivindica la prioridad a la Solicitud de Patente Europea Nº EP 09 305 266 presentada el 30 de marzo de 2009 y la Solicitud de Patente Europea Nº EP 09 306 063.0 presentada el 6 de noviembre de 2009.

Estado de la técnica

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune crónica que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial. Se caracteriza por inflamación y proliferación celular en la cápsula sinovial de las articulaciones que en último término puede dar lugar a destrucción del cartílago y hueso, deformidad articular y pérdida de

15 movilidad. La AR causa habitualmente problemas en varias articulaciones al mismo tiempo, a menudo de manera simétrica. La AR tiende precozmente a afectar primero las articulaciones pequeñas, tales como las articulaciones de las muñecas, manos, tobillos y pies. Según progresa la enfermedad, también pueden estar implicadas las articulaciones de los hombros, codos, rodillas, caderas, mandíbula y cuello. A diferencia de otras afecciones artríticas que solo afectan áreas en o alrededor de las articulaciones, la AR es una enfermedad sistémica que produce inflamación en tejidos extra-articulares por todo el cuerpo incluyendo la piel, vasos sanguíneos, corazón, pulmones y músculos.

La AR se asocia con dolor, deformidad, descenso de la calidad de vida, y discapacidad que afecta a su vez a la capacidad de los pacientes para llevar una vida normal y productiva. Estudios recientes han demostrado que 5 años

25 después de la aparición de la enfermedad, aproximadamente un tercio de los pacientes con AR no son capaces de trabajar, y a los 10 años, la mitad de los pacientes tienen una discapacidad funcional importante (A. Young y col., Rheumatology, 2007, 46: 350-357). En consecuencia, la AR impone una carga importante a la sociedad. Muchos datos también sugieren que la AR se asocia con una disminución en la esperanza de vida.

Aunque la AR se ha estudiado extensamente, la etiología y patogénesis de la enfermedad sigue sin comprenderse completamente. Los factores que pueden aumentar el riesgo de AR incluyen: el sexo del individuo (las mujeres tienen 2 o 3 veces más probabilidad que los hombres de desarrollar la enfermedad); la edad (la AR se produce más comúnmente entre las edades de 40 y 60 años, aunque puede atacar a niños, adolescentes y adultos más ancianos); la genética (la AR se encuentra fuertemente asociada con el antígeno HLA-DR4 del tejido heredado tipo

35 complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) - más específicamente DRB1*0401 y DRB 1*0404); y el tabaquismo (la AR es aproximadamente 4 veces más común en fumadores que en no fumadores).

Actualmente no existe una cura fiable para la AR. El tratamiento se dirige esencialmente a aliviar el dolor, reducir la inflamación y detener o ralentizar el daño articular y la destrucción ósea. La estrategia terapéutica actual es la prescripción de fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) precozmente en la afección, debido a que los pacientes que se tratan pronto con tales fármacos tienen mejores resultados, con mayor preservación de la función, menos incapacidad laboral, y menor riesgo de muerte prematura. Los avances recientes en el entendimiento de la patofisiología de la AR han dado lugar al desarrollo de nuevos DMARD, llamados modificadores biológicos de la respuesta. Los DMARD biológicos se diseñan para dirigirse y bloquear la acción de

45 ciertas células clave o moléculas, tales como el factor alfa de necrosis tumoral (TFN-), interleucina-1 (IL-1), células T, y células B, implicadas en la reacción inmunitaria anormal que se asocia con la AR. En comparación con los DMARD tradicionales, los agentes biológicos tienen un inicio de acción mucho más rápido y pueden ofrecer una respuesta clínica mejor con una prevención a largo plazo del daño articular (J.K.D. de Vries-Bouwstra y col., Rheum. Dis. Clin. North Am., 2005, 31: 745-762).

Debido a que la destrucción articular irreversible se puede evitar por la intervención en estadios tempranos de la enfermedad, es importante el diagnóstico precoz de la AR. Sin embargo, el diagnóstico definitivo de AR puede ser difícil. Los ensayos inmunológicos que se pueden llevar a cabo para el diagnóstico de AR incluyen, en particular, la medición de los niveles del factor reumatoide (RF), y anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP). El

55 ensayo serológico de RF es complicado debido a su sensibilidad y especificidad moderadas, y a las altas tasas de positividad en otras enfermedades inflamatorias crónicas e infecciosas (T. Dorner y col., Curr. Opin. Rheumatol, 2004, 16: 246-253). El ensayo de anticuerpos anti-CCP es particularmente útil en el diagnóstico de AR, con alta especificidad, positividad precoz en el proceso de la enfermedad, y capacidad para identificar pacientes que probablemente tengan enfermedad grave y daño irreversible. Sin embargo, un resultado negativo en el ensayo de anticuerpos anti-CCP no excluye la AR.

El documento de AUGER I Y COL. () identificó la PAD4 y BRAF como autoantígenos específicos de la AR, por exploración con 8.268 matrices proteicas en sueros de pacientes con AR. Sin embargo, AUGER Y COL: (), los documentos de MICHELLE Y COL. (07-2008) y ZHAO JINXIA Y COL (06-2008), cada documento 65 por separado, desvela los inmunoensayos para el diagnóstico de artritis reumatoides (AR) en un sujeto, que comprende la detección de al menos un biomarcador, tal como por ejemplo, péptidos de PAD4, pero no desvelan

BRAF y/o péptidos de BRAF. El documento WO 2004/020595 desvela métodos para diagnosticar un gran número de afecciones tales como por ejemplo la AR, midiendo el nivel de ciertos biomarcadores polinucleótidos y/o polipéptidos. El péptido de sec. 382 (169 aminoácidos) comprende una región que es idéntica al 100% con la SEC ID Nº 9 (20 aminoácidos) de la presente solicitud.

5 Por lo tanto, hay una gran necesidad de nuevos marcadores biológicos de AR. En particular, son altamente deseables, biomarcadores que permitieran un diagnóstico fiable y el seguimiento en estados precoces de la enfermedad y que permitan la intervención precoz para prevenir potencialmente el dolor, la destrucción articular y la incapacidad a largo plazo.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere en general a la mejora de los sistemas y estrategias de diagnóstico de artritis reumatoide (AR). En particular, la invención se refiere a biomarcadores peptídicos que reaccionan específicamente

15 con anticuerpos presentes en el suero de pacientes con AR. Más específicamente, la presente invención concierne a secuencias de aminoácidos de la PAD4, BRAF y calpastatina humanas, y métodos para utilizar tales secuencias en el diagnóstico de AR, en particular en el diagnóstico de AR en pacientes negativos al CCP.

Realizaciones de la invención:

1. Un método in vitro para el diagnóstico de la artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto la muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde al menos un biomarcador es el péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que

25 comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y detectar el complejo biomarcador anticuerpo formado, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

2. El método in vitro de la realización 1, comprendiendo además dicho método las etapas de: poner en contacto un muestra biológica obtenida del sujeto con al menos otro biomarcador durante un tiempo y en condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde al menos el otro biomarcador se selecciona del grupo constituido por: péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden o consisten en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC

35 ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprenden o consisten en una secuencia que se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y cualquier combinación de las mismas, y detectando cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se forme, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

3.

El método in vitro de acuerdo con la realización 2, en la que al menos el otro biomarcador es un péptido de menos de 50 aminoácidos.

4.

El método in vitro de la realización 2, donde dicho método se lleva a cabo con tres péptidos de BRAF, tres

45 péptidos de PAD4, y dos péptidos de calpastatina y donde los tres péptidos de BRAF consisten en las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº 9, los tres péptidos de PAD4 consisten en las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, y SEC ID Nº 4, y los dos péptidos de calpastatina consisten en las SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 12.

5. Un método in vitro de detección de la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto la muestra biológica con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcadoranticuerpo, donde al menos un marcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas o combinaciones de las

55 mismas, y detectando cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se forme, donde la detección de un complejo péptido de BRAF-anticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en la muestra biológica.

6.

El método in vitro de cualquiera de las realizaciones 1-5, donde el sujeto es negativo al CCP o la muestra biológica se obtiene de un paciente negativo al CCP.

7.

El método in vitro de cualquiera de las realizaciones 1-6, que además comprende la medición, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, de la concentración de al menos un marcador seleccionado de entre el grupo constituido por proteína C reactiva, amiloide A sérico, interleucina 6, proteínas S100, osteopontina, factor

65 reumatoide, metaloproteasa de la matriz 1, metaloproteasa de la matriz 3, ácido hialurónico, sCD14, marcadores de angiogénesis, y productos del metabolismo del hueso, cartílago, o sinovia.

8.

Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoides en un sujeto, comprendiendo dicho kit: al menos un biomarcador, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

9.

El kit de la realización 8 que comprende además al menos otro biomarcador, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo de: péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el al menos otro biomarcador y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.

10.

Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicho kit: al menos 8 biomarcadores que comprenden: tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por los péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas y dos péptidos de calpastatina seleccionados de entre el grupo de péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo que se forma entre el biomarcador y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto negativo al CCP.

11.

Un kit para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit: al menos un biomarcador, donde al menos el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcadoranticuerpo que se forma entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica, donde el autoanticuerpo es un autoanticuerpo anti-BRAF que es indicativo de artritis reumatoide.

12.

Una matriz para el diagnóstico de artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicha matriz, al menos un biomarcador fijado en su superficie, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas.

13.

La matriz de la realización 12 que comprende además, al menos otro biomarcador fijado en su superficie, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo constituido por: péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de los mismas, y cualquier combinación de los mismos.

14.

Una matriz para el diagnóstico de la artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicha matriz, al menos ocho biomarcadores fijados en su superficie, donde los al menos ocho biomarcadores comprenden: tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, y SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas y dos péptidos de calpastatina seleccionados del grupo de péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia

seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas.

15. La matriz de cualquiera de las realizaciones 12-14 que comprende además, al menos un biomarcador

5 adicional fijado en su superficie, para detectar la presencia de autoanticuerpos específicos de AR en una muestra biológica, preferentemente anticuerpos antinucleares y anticuerpos anti-CCP.

16.

Un biomarcador de artritis reumatoide, donde el biomarcador es: un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y donde el biomarcador es reconocido por un autoanticuerpo anti-BRAF.

17.

Un kit de acuerdo con la realización 9 o la realización 10 o una matriz de acuerdo con cualquiera de las

realizaciones 13-15, donde los péptidos de PAD4 y péptidos de calpastatina son péptidos de menos de 50 15 aminoácidos.

Estos y otros objetivos, ventajas y características de la presente invención serán aparentes para los expertos habituados en la técnica que hayan leído la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra que los autoanticuerpos contra PAD4 presentes en el suero de pacientes con AR inhiben la citrulinación del fibrinógeno. El ensayo se llevó a cabo como se describe en la sección de los Ejemplos. Una relación de DO (ensayo)/DO (control) > 1 indica una activación de la citrulinación del fibrinógeno

25 por PAD4, mientras que una relación < 1 indica una inhibición de la citrulinación del fibrinógeno por PAD4.

La Figura 2 es un gráfico que muestra, para cada grupo de sueros de pacientes con AR, pacientes con SA y controles sanos, el porcentaje de suero que reconoce el péptido 22, el péptido 28, el péptido 61 y el péptido 63. Los sueros positivos se definían como sueros para los que se midió un valor de DO de más de dos veces el valor de fondo (véase la sección de Ejemplos para los detalles experimentales).

La Figura 3 es un gráfico que muestra, para cada grupo de autoanticuerpos anti-PAD4 que inhiben la citrulinación del fibrinógeno (pacientes RA1 a RA20), que activan la citrulinación del fibrinógeno (pacientes RA24 a RA29) y que no tienen efecto sobre la citrulinación del fibrinógeno (pacientes RA21 a RA 23), el porcentaje de

35 autoanticuerpos que reconocen solo el extremo N de los péptidos, solo el extremo C de los péptidos, o ambos terminales N y C de los péptidos.

La Figura 4 es un gráfico que muestra, para cada grupo de autoanticuerpos contra PAD4 que reconocen los péptidos 22, péptido 28, péptido 61 y péptido 63, el porcentaje de autoanticuerpos que inhiben, activan, o no tienen efecto sobre la citrulinación del fibrinógeno.

La Figura 5 es un esquema que presenta un modelo que explica como los autoanticuerpos contra PAD4 podían inhibir a PAD4. (A) La unión con el calcio podría abrir el dominio de unión al sustrato de PAD4. (B) El sustrato podría entonces unirse a PAD4 y se podría citrulinar. (C) Los autoanticuerpos contra PAD4 pueden interferir el

45 cambio de conformación o la unión al sustrato.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la unión de los péptidos de BRAF a los autoanticuerpos contra BRAF. Los péptidos de BRAF, P10, P16, P25 y P33 se ensayaron por ELISA en el suero de 21 pacientes de RA, 33 pacientes de SPA, y 60 voluntarios sanos. Después de lavarlos, se añadió un anti-IgG humana conjugado con peroxidasa, y se leyó la densidad óptica a 405 nm. La DO de fondo se obtuvo añadiendo cada suero sin péptido en un pocillo. Los sueros positivos se definieron por un valor de la DO mayor del doble del valor de fondo.

La Figura 7 es una tabla que muestra que los péptidos de BRAF (P10, P16 y P25) identifican AR en el 50% de los pacientes negativos al CCP. El gris indica un péptido positivo (es decir, un péptido de BRAF que está

55 sometido a la unión con autoanticuerpos contra BRAF presentes en el suero de los pacientes negativos al CCP). La unión se determinó por ELISA como se describe en el Ejemplo II.

La Figura 8 es un gráfico que muestra que los autoanticuerpos contra BRAF presentes en el suero de pacientes con AR activan la fosforilación de MEK1. Los autoanticuerpos anti-BRAF purificados de los pacientes se incubaron con BRAF y MEK1. Para cada paciente, se incluyeron un control positivo (BRAF y MEK1) y un control negativo (anticuerpos BRAF y MEK1 y control C1). La activación o inhibición de la fosforilación de MEK1 se detectó midiendo la relación entre la DO de ensayo / DO del control positivo. Una relación >1 indicaba activación, la relación < 1 indicaba inhibición.

65 La Figura 9 es un gráfico que muestra la unión de péptidos de PAD4, BRAF y Calpastatina a autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con AR. Los péptidos de PAD4 (péptidos 22, 61 y 63), los péptidos de BRAF

(P10, P16 y P25) y péptidos de Calpastatina (P’16 y P’28) se pusieron en contacto con los sueros de 118 pacientes de AR y 100 sueros de control. La unión se determinó y evaluó como se describe en el Ejemplo II.

La Figura 10 es un gráfico que muestra que los péptidos de PAD4 (péptidos 22, 61 y 63), los péptidos de BRAF

5 (P10, P16 y P25) y los péptidos de Calpastatina (P’16 y P’28) se reconocen en pacientes negativos al CCP. Estos péptidos se pusieron en contacto con los sueros de 83 pacientes de AR negativos al CCP y 29 pacientes de AR negativos al CCP. La unión se determinó y se evaluó como se describe en el Ejemplo II.

Descripción detallada de la invención

A lo largo de la especificación, se emplean varios términos que se definen en los párrafos siguientes.

Como se utiliza en el presente documento la término “sujeto” se refiere a un ser humano o a otro animal (por ejemplo, un primate, perro, gato, cabra, caballo, cerdo, ratón, rata, conejo y similares), que pueden padecer AR, pero

15 que pueden o no tener la enfermedad. En muchas realizaciones de la presente invención, el sujeto es un ser humano. En tales realizaciones, el sujeto a veces se denomina “individuo”. El término “individuo” no denota una edad en particular, y por lo tanto engloba niños, adolescentes y adultos.

La expresión “sujeto sospechoso de tener AR” se refiere a un sujeto que presenta uno o más síntomas indicativos de AR (por ejemplo, dolor, agarrotamiento o hinchazón de las articulaciones), o que se explora para detectar AR (por ejemplo, durante el examen físico). De manera alternativa o adicionalmente, un sujeto sospechoso de tener AR puede tener uno o más factores de riesgo (por ejemplo, edad, sexo, historia familiar, fumador, etc.). El término engloba sujetos que no se han ensayado para detectar AR como los sujetos que han recibido un diagnóstico preliminar.

25 La expresión “muestra biológica” se utiliza en el presente documento en su sentido más amplio. Una muestra biológica generalmente se obtiene de un sujeto. Una muestra puede ser cualquier tejido biológico o fluido con el que se pueden ensayar los biomarcadores de la presente invención. Frecuentemente, una muestra puede ser una “muestra clínica”, es decir, una muestra derivada de un paciente. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a estos, fluidos corporales que pueden o no contener células, por ejemplo sangre (por ejemplo, sangre entera, suero o plasma), orina, líquido sinovial, saliva, tejidos o muestras de biopsia de aspiración por aguja fina, y muestras de archivo con una historia conocida de diagnóstico, tratamiento y/o resultado. Las muestras biológicas también pueden incluir partes de tejidos tales como partes congeladas que se han tomado con fines histológicos. La expresión “muestra biológica” también engloba cualquier material derivado del procesamiento de una muestra biológica. Los

35 materiales derivados incluyen, pero no se limitan a, células (o su descendencia) aisladas de la muestra, o proteínas extraídas de la muestra. El procesamiento de una muestra biológica puede implicar una o más de entre: filtración, destilación, extracción, concentración, inactivación de componentes de interferencia, adición de reactivos, y similares. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, la muestra biológica es una muestra serológica y es (o se deriva de) sangre entera, suero o plasma obtenidos de un sujeto.

Los términos “normal” y “sano” se utilizan de manera intercambiable en el presente documento. Se refieren a un sujeto que no ha mostrado ningún síntoma de AR, y que no se ha diagnosticado de AR o de lesiones en hueso o cartílago. Preferentemente, un sujeto normal no está bajo una medicación que afecte a la AR y no ha sido diagnosticado de cualquier otra enfermedad (en particular una enfermedad inflamatoria autoinmune). En ciertas

45 realizaciones, los sujetos normales tienen sexos, edades y/o índices de masa corporal similares en comparación con el sujeto del que se obtiene la muestra biológica que se va a ensayar. El término “normal” también se utiliza en el presente documento para calificar una muestra obtenida de un sujeto sano.

En el contexto de la presente invención, el término “control”, cuando se utiliza para caracterizar un sujeto, se refiere a un sujeto que está sano o a un paciente al que se le ha diagnosticado una enfermedad específica distinta de AR. La expresión “muestra control” se refiere a una, o más de una, muestra que se ha obtenido de un sujeto sano o de un paciente diagnosticado de una enfermedad distinta de AR.

El término “autoanticuerpo”, como se utiliza en el presente documento, tiene su significado en la comprensión de la

55 técnica, y se refiere a un anticuerpo que lo produce el sistema inmunitario de un sujeto y que se dirige contra una o más de las proteínas propias el sujeto. Los autoanticuerpos pueden atacar las células, tejidos, y/u órganos propios, causando inflamación y daños.

Como se utiliza en el presente documento, el término “autoantígeno” se refiere a un antígeno endógeno, o a un fragmento activo del mismo, que estimula la producción de autoanticuerpos en el cuerpo de un sujeto, como en las reacciones autoinmunitarias. El término también engloba cualquier sustancia que pueda formar un complejo antígeno-anticuerpo con los autoanticuerpos presentes en un sujeto o en una muestra biológica obtenida de un sujeto.

65 Los términos “biomarcador” y “marcador” se utilizan de manera intercambiable en el presente documento. Se refieren a una sustancia que es un indicador distintivo de un proceso biológico, un acontecimiento biológico, y/o una

afección patológica. En el contexto de la presente invención, la expresión “biomarcador de AR” engloba péptidos de BRAF, péptidos de PAD4 y péptidos de Calpastatina que se proporcionan aquí, que son reconocidos específicamente por autoanticuerpos anti-PAD4 presentes en la muestra biológica (por ejemplo, una muestra de sangre) de un paciente con AR. En ciertas realizaciones preferidas, los biomarcadores de la invención son péptidos

5 de menos de 50 aminoácidos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “indicativo de AR”, cuando se aplica a un proceso o acontecimiento, se refiere a un proceso o acontecimiento que es diagnóstico de AR, tal como el proceso o acontecimiento que se encuentra significativamente más a menudo en sujetos con AR que en sujetos sanos y/o en sujetos que sufren una enfermedad distinta de AR.

Los términos “proteína”, “polipéptido”, y “péptido” se utilizan de manera intercambiable en el presente documento, y se refiere a secuencias de aminoácidos de una variedad de longitudes, que estén en sus formas neutras (sin carga) o como sales, y que estén modificadas o no modificadas por glicosilación, oxidación de cadenas laterales, o 15 fosforilación. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos en una proteína nativa de longitud completa. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos es un fragmento más pequeño de la proteína de longitud completa. En otras realizaciones más, la secuencia de aminoácidos está modificada por sustituyentes adicionales unidos a las cadenas laterales de los aminoácidos, tales como unidades glucosilo, lípidos, o iones inorgánicos tales como los fosfatos, así como modificaciones relativas a la conversión química de cadenas tales como la oxidación de grupos sulfhidrilo. Por tanto, el término “proteína” (o sus términos equivalentes) pretende incluir la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa de longitud completa, o un fragmento de la misma, sujeta a modificaciones que no cambien significativamente sus propiedades específicas. En particular el término “proteína” engloba las isoformas proteicas, es decir, variantes que están codificadas por el mismo gen, pero que se diferencian en su pI o MW, o ambos. Tales isoformas se pueden diferenciar por su secuencia de aminoácidos (por ejemplo, como resultado de

25 cortes y empalmes alternativos o proteolisis limitada), o como alternativa, pueden producirse por modificación posttraduccional diferencial (por ejemplo, glucosilación, acilación, fosforilación).

El término “análogo”, cuando se utiliza en el presente documento en referencia a una proteína o polipéptido, se refiere a un péptido que posee una función similar o idéntica que la proteína o polipéptido pero que no necesariamente tiene que comprender una secuencia de aminoácidos similar o idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína o polipéptido o una estructura que sea similar o idéntica a la de la proteína o polipéptido. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, un análogo tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 30%, más preferentemente, al menos aproximadamente: un 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína o el polipéptido. En ciertas

35 realizaciones preferidas, un análogo de un péptido biomarcador de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 80% o al menos un 85% idéntica a la secuencia de aminoácidos del péptido biomarcador.

El término “fragmento”, cuando se utiliza en el presente documento en referencia a una proteína o polipéptido, se refiere a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácido (preferentemente, de al menos aproximadamente: 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, o 250 restos de aminoácido) de la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido. El fragmento de proteína o polipéptido puede o no poseer la misma actividad funcional que la proteína o el polipéptido. En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, un fragmento de un péptido marcador de la invención comprende

45 una secuencia de aminoácidos de al menos 10 restos de aminoácido consecutivos de la secuencia de aminoácidos del péptido biomarcador.

El término “homólogo” (u “homología”), como se utiliza en el presente documento, es sinónimo del término “identidad” y se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptido o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando la misma base o el mismo aminoácido ocupan una posición en dos secuencias comparadas, entonces las respectivas moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias corresponde al número de coincidencias o de posiciones homólogas que comparten dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas y multiplicado por 100. En general, una comparación se hace cuando las dos secuencias se alinean para dar una homología máxima. Las secuencias de aminoácidos homólogas

55 comparten secuencias de aminoácidos idénticas o similares. Los restos similares son sustituciones conservadoras para, o “mutaciones de punto permitidas” de, que se corresponden con los restos de aminoácidos en una secuencia de referencia. Las “sustituciones conservadoras” de un resto en una secuencia de referencia son sustituciones que son funcionalmente o físicamente similares al correspondiente resto de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamaño similar, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad para formar enlaces covalentes o de hidrógeno o similares. Sustituciones conservadoras particularmente preferidas son las que cumplen los criterios definidos para una “mutación de punto aceptada” por Dayhoff y col. ("Atlas of Protein Sequence y Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352).

Las expresiones “marcado”, “marcado con un agente detectable” y “marcado con un resto detectable” se utilizan de 65 manera intercambiable en el presente documento. Estas expresiones se utilizan para especificar que una entidad (por ejemplo, un péptido de PAD4, un péptido de BRAF, un péptido de Calpastatina) se puede visualizar, por

ejemplo, después de la unión con otra entidad (por ejemplo, un autoanticuerpo anti-PAD4, un autoanticuerpo anti-BRAF o un autoanticuerpo anti-calpastatina). Preferentemente, un resto o agente detectable se selecciona tal que genere una señal que pueda medirse y cuya intensidad se relaciona con la cantidad de entidad unida. En los métodos basados en matrices, un agente o resto detectable también se selecciona preferentemente tal que genere

5 una señal localizada, permitiendo de esta manera la resolución espacial de la señal a partir de cada mancha de la matriz. Los métodos para marcar proteínas y polipéptidos se conocen bien en la técnica. Los polipéptidos marcados se pueden preparar por incorporación o por conjugación con un marcador, que es detectable directa o indirectamente por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, o químicos, o cualquier otro medio adecuado. Los agentes adecuados detectables incluyen, pero no se limitan a estos, varios ligandos, radionúclidos, colorantes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, micropartículas, enzimas, marcadores colorimétricos, marcadores magnéticos, y haptenos.

Las expresiones “matriz proteica” y “chip proteico” se utilizan en el presente documento de manera intercambiable. Se refieren a una superficie de sustrato sobre el que se han inmovilizado diferentes proteínas o polipéptidos, en una

15 manera ordenada, en manchas discretas sobre el sustrato. Las matrices proteicas se pueden utilizar para identificar las interacciones proteína/proteína (por ejemplo las interacciones antígeno/anticuerpo), para identificar los sustratos de enzimas, o para identificar las dianas de moléculas pequeñas biológicamente activas. El término “micromatriz” se refiere más específicamente a una matriz que está miniaturizada de forma que requiere el examen microscópico para la evaluación visual.

El término “tratamiento” se utiliza en el presente documento para caracterizar un método que tiene como objetivo (1) retrasar o evitar la aparición de una enfermedad o afección (por ejemplo, AR); (2) ralentizar o detener la progresión, el agravamiento, o los deterioros de los síntomas de la afección; (3) dar lugar a mejoría en los síntomas de la afección; y/o (4) curar la afección. Un tratamiento puede administrarse antes de la aparición de la enfermedad, para

25 lograr una acción preventiva o profiláctica. También se puede administrar tras el inicio de la enfermedad, para conseguir una acción terapéutica.

Como se mencionó anteriormente, la presente invención proporciona biomarcadores que se pueden utilizar para detectar la presencia de autoanticuerpos específicos de AR en muestras biológicas obtenidas de pacientes. Estos marcadores son péptidos de PAD4 que se corresponden con epítopos de PAD4 humanos y lo cuales reaccionan específicamente con autoanticuerpos anti-PAD4 presentes en el suero de pacientes con AR. Otros biomarcadores son péptidos de BRAF que son epítopos de autoantígenos BRAF. Otros biomarcadores más son péptidos de calpastatina. Preferentemente, los biomarcadores son péptidos de menos de 50 aminoácidos. También se proporcionan métodos para utilizar estos biomarcadores para el diagnóstico de AR.

I – Péptidos Biomarcadores Péptidos de PAD4

Los anticuerpos críticos en AR se dirigen a los restos de citrulina de diferentes proteínas tales como Fibrina, Filagrina, y Vimentina. La citrulina se genera por conversión post-traduccional de restos de arginina. Este proceso está catalizado por un grupo de peptidil deiminasas de arginina dependientes del calcio, PAD. Se cree ampliamente que una de las enzimas PAD, la PAD4, tiene un papel que causa la aparición y progresión de la enfermedad AR debido a que se han identificado mutaciones en el gen PAD4 asociadas con AR en una variedad de poblaciones (A.

45 Suzuki y col., Nat. Genet., 2003, 34(4): 395-402; T. Iwamoto y col., Rheumatology, 2006, 45: 804-807; S.M. Harney y col., Rheumatology, 2005, 44: 869-872; T; Cantaert y col., Ann. Rheum. Dis., 2005, 64: 1316-1320).

La PAD4 no solo está implicada en la generación de epítopos citrulinados, es por sí misma una diana para anticuerpos específicos de AR. Ya se habían descrito autoanticuerpos contra PAD4 en los pacientes con AR (Y. Takizawa y col., Scand. J. Rheumatol., 2005, 3: 212-215; E.B. Roth y col., Clin. Exp. Rheumatol., 2006, 1: 12-18;

E.H. Halvorsen y col., Ann. Rheumatol. Dis., 2008, 67: 414-417; J. Zhao y col., J. Rheumatol., 2008, 35: 969-974). En 2008, los presentes solicitantes identificaron anticuerpos contra PAD4 en pacientes con AR utilizando matrices proteicas y análisis ELISA (I. Auger y col., Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594; EP 08 305 167, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad). Los solicitantes observaron que el 29% de 116 pacientes eran positivos

55 a PAD4 en comparación con ninguno de 33 pacientes con espondiloartropatía (AS) y el 3% de 60 controles sanos (p = 0 por el ensayo Chi cuadrado, 116 pacientes contra 93 controles).

Como se describe en el Ejemplo I posterior, los presentes solicitantes han identificado ahora epítopos de PAD4 humana que son reconocidos específicamente por los sueros de pacientes con AR. Estos epítopos se identificaron utilizando 65 péptidos solapantes de 20 aminoácidos (véase la Tabla 1 de EP 09 305 266.1) englobando la secuencia completa de la PAD4 humana (Número de registro de GenBank: NP_036519.1M locus NM_012387; SEC ID Nº 1). Estos péptidos se exploraron con los sueros de 29 pacientes y 2 controles de los que se sabía que contenían autoanticuerpos contra PAD4. Entre los 65 péptidos, 18 fueron reconocidos por los sueros ensayados. Cuatro péptidos (péptidos 22, 28, 61 y 63) fueron preferencialmente reconocidos por los sueros de pacientes de AR 65 y los controles que contenían autoanticuerpos anti-PAD4 (véase Tabla 2). Para confirmar aún más estos resultados, los solicitantes han ensayado el suero de 33 pacientes con espondiloartropatía (AS) y 33 individuos sanos por ELISA

utilizando los péptidos 22, 28, 61 y 63 como inmunoabsorbentes. Los autoanticuerpos que reconocen los péptidos 22, 61 y 63 se encontraron en un porcentaje significativamente más alto en el suero de pacientes con AR que en los controles (pacientes con AS e individuos sanos). Por el contrario, los anticuerpos que reconocían el péptido 28 se encontraron en un alto porcentaje en el suero de pacientes con AR así como en el suero de los controles (véase la

5 Figura 2).

El péptido 22 identificado como se describe en el presente documento se localiza en el dominio del extremo N de PAD4 y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

10 SEC ID Nº 2 VRVFQATRGKLSSKCSVVLG,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 211 a 230 de PAD4 humana.

El péptido 61 identificado como se describe en el presente documento se localiza en el dominio del extremo C de 15 PAD4 y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 3 PFGPVINGRCCLEEKVCSLL,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 601 a 620 de PAD4 humana.

20 El péptido 63 identificado como se describe en el presente documento se localiza en el dominio del extremo C de PAD4 y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 4 EPLGLQCTFINDFFTYHIRH, 25 la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 621 a 640 de la PAD4 humana.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona péptidos de PAD4 que son reconocidos específicamente por los autoanticuerpos anti-PAD4 presentes en los sueros de pacientes con AR. Los péptidos de

30 PAD4 de la invención tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, análogas de las mismas, y homólogas de las mismas. Las SEC ID Nos 2-4 se describieron anteriormente. La SEC ID Nº 5 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

35 SEC ID Nº 5 PFGPVINGRCCLEEKVCSLLEPLGLQCTFINDFFTYHIRH,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 601 a 640 de la PAD4 humana.

Péptidos de BRAF

40 La BRAF (también llamada B-raf) es una proteína serina-treonina quinasa de la familia de proteínas RAF, el gen BRAF codifica una proteína BRAF de 766 restos de aminoácidos (Número de registro GenBank: NP_004324.1), cuya secuencia se define en la SEC ID Nº 6.

45 Los presentes solicitantes han demostrado previamente que el dominio catalítico de BRAF (restos 456 a 712 en la SEC ID Nº 6) es una diana para los autoanticuerpos de pacientes afectados de AR y es un marcador específico de AR (I. Auger y col., Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594; EP 08 305 167). Los solicitantes han identificado ahora (véase el Ejemplo II) tres péptidos lineales en el dominio catalítico de BRAF que es reconocido casi únicamente por los pacientes con AR. Se ha demostrado que estos péptidos de BRAF, P10, P16,y P25, son reconocidos por los sueros

50 de pacientes negativos al CCP. El uso combinado de P10, P16 y P25 identifica el 50% de pacientes negativos al CCP.

El péptido P10 identificado como se describe en el presente documento tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

55 SEC ID Nº 7 RKTRHVNILLFMGYSTKPQL,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 506 a 525 de BRAF humana.

El péptido P16 identificado como se describe en el presente documento tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: 60 SEC ID Nº 8 YLHAKSIIHRDLKSNNIFLH,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 566 a 585 de BRAF humana.

El péptido P25 identificado como se describe en el presente documento tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 9 YSNINNRDQITFMVGRGYLS,

5 la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 656 a 675 de BRAF humana.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona péptidos de BRAF que son reconocidos específicamente por autoanticuerpos anti-BRAF presentes en los sueros de pacientes con AR. Los péptidos de BRAF de la invención tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, análogas de las mismas, y homólogas de las mismas. Las SEC ID Nos 7-9 se han descrito anteriormente.

Péptidos de Calpastatina

15 Los presentes solicitantes han observado que los pacientes que padecen AR y son homocigotos para HLADRB1*0404 reconocían una proteína sinovial de 100 kD identificada como calpastatina (Auger y col. Ann. Rheum. Dis., 2007, 66: 1588-1593). La calpastatina es un inhibidor de la calpaína endógena (cisteína proteasa dependiente del calcio), presente en la mayoría de los tejidos de mamíferos. La calpastatina consiste en un dominio del extremo amino L y cuatro dominios repetitivos inhibidores de calpaína - los dominios 1 a 4 (Menard y col., Immun. Today, 1996, 17: 545-547). La secuencia de aminoácidos de la isoforma A de la calpastatina humana se proporciona en la SEC ID Nº 10 (número de registro GenPept: NP_001035908).

Los presentes solicitantes habían identificado previamente (véase el Ejemplo III) dos péptidos lineales de la

25 calpastatina que eran reconocidos por los sueros de pacientes negativos al CCP: P’16 y P’28, que son péptidos de 15 aminoácidos del locus NP_001035908.

El péptido P’16 identificado como se describe en el presente documento tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 11 IGPDDAIDALSSDFT,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 226 a 240 de la isoforma A de la Calpastatina humana y se localiza en el dominio repetitivo inhibidor de calpaína 1.

35 El péptido P’28 identificado como se describe en el presente documento tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 12 AVCRTSMCSIQSAPP,

la cual se corresponde con los restos de aminoácidos 406 a 420 de la isoforma A de la Calpastatina humana y se localiza en el dominio repetitivo inhibidor de calpaína 2.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona péptidos de calpastatina que son reconocidos

45 específicamente por autoanticuerpos anti-calpastatina presentes en los sueros de pacientes con AR. Los péptidos de calpastatina de la invención tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, análogas de las mismas, y homólogas de las mismas. Las SEC ID Nos 11-12 son las que se han descrito anteriormente.

Preparación de los biomarcadores peptídicos

Los biomarcadores peptídicos de la presente invención se pueden preparar por cualquier método adecuado, incluyendo síntesis química y métodos recombinantes.

55 Los péptidos de la invención son generalmente lo suficientemente cortos para que la síntesis química, utilizando métodos de referencia, sea factible. La síntesis de péptidos en fase sólida, que fue descrita inicialmente por R.B. Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 1963, 85: 2149-2154) es una estrategia rápida y fácil para sintetizar péptidos y pequeñas moléculas peptídicas de secuencias conocidas. Un compendio de tales técnicas de fase sólida se puede encontrar, por ejemplo, en “Solid Phase Peptide Synthesis” (Methods in Enzymology, G.B. Fields (Ed.), 1997, Academic Press: San Diego, CA (que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). La mayoría de estos procedimientos de síntesis implican la adición secuencial de uno o más restos de aminoácidos o restos de aminoácidos protegidos adecuadamente, a una cadena peptídica en crecimiento. Por ejemplo, el grupo carboxilo del primer aminoácido se une a un soporte sólido por medio de un enlace lábil, y se hace reaccionar con el

65 segundo aminoácido, cuyo grupo amino se ha protegido de antemano para evitar la autocondensación. Después del emparejamiento, se desprotege el grupo amino y se va repitiendo este proceso con el siguiente aminoácido. Una vez

que se ensambla el péptido deseado, se escinde del soporte sólido, se precipita, y el péptido libre resultante se puede analizar y/o purificar como se desee. Los métodos en solución, como los descritos, por ejemplo, en "The Proteins" (Vol. II, 3rd Ed., H. Neurath y col. (Eds.), 1976, Academic Press: New York, NY, pp. 105-237) también pueden utilizarse para sintetizar los biomarcadores de la invención.

5 En ciertas realizaciones, un biomarcador peptídico de la invención se proporciona inmovilizado en un portador sólido

o soporte (por ejemplo, una perla o una matriz). Los métodos para inmovilizar moléculas polipeptídicas en una superficie sólida se conocen en la técnica. Un péptido puede inmovilizarse bien sea por un enlace covalente o pasivamente a la superficie de un portador sólido o soporte. Ejemplos de materiales de portadores o soportes adecuados incluyen, pero sin limitarse a estos, agarosa, celulosa, nitrocelulosa, dextrano, Sephadex, Sepharosa, carboximetil celulosa, poliacrilamidas, poliestireno, polivinilo de cloro, polipropileno, papel de filtro, magnetita, resina de intercambio de iones, cristal, copolímero de poliamina-metil-vinil-éter de ácido maleico, copolímero de aminoácidos, copolímero de etileno ácido maleico, nylon, seda, y similares. La inmovilización de un biomarcador peptídico en la superficie de un portador sólido o soporte puede implicar unión cruzada, unión covalente o adsorción

15 física, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El portador sólido o soporte puede estar en forma de perla, partícula, un pocillo de microplaca, matriz, una cubeta, un tubo, una membrana, o de cualquier forma adecuada para llevar a cabo un método diagnóstico de acuerdo con la invención (por ejemplo, utilizando un inmunoensayo).

En particular, la invención proporciona una matriz o matriz proteica para el diagnóstico de AR, que comprende, inmovilizado en su superficie, al menos un biomarcador peptídico de la invención. Preferentemente, la matriz comprende más de un biomarcador peptídico de la invención. La matriz puede comprender además al menos otro biomarcador adicional de AR. Los biomarcadores adecuados de AR incluyen los biomarcadores que permiten la detección de la presencia de anticuerpos antinucleares y/o anticuerpos contra el CCP.

25 La presente invención también proporciona una matriz proteica de perlas en suspensión para el diagnóstico de AR. Esta matriz de perlas en suspensión comprende una suspensión de una o más partículas o perlas distintas, donde cada perla contiene características codificadas en relación a su tamaño, color, o señal fluorescente y donde cada perla está revestida con un biomarcador peptídico de la presente invención. Ejemplos de matrices de perlas en suspensión incluyen la matriz de perlas en suspensión thexMAP® (Luminex Corporation).

II – Métodos de diagnóstico

Como se ha mencionado anteriormente, los biomarcadores peptídicos desvelados en el presente documento son reconocidos específicamente por los sueros de pacientes con AR, y en particular por los sueros de pacientes con AR 35 negativos al CCP.

En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar AR en un sujeto. Tales métodos comprenden poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto que se va a ensayar con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo unas condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcadoranticuerpo; y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado.

En ciertas realizaciones, el al menos un biomarcador es un péptido de PAD4 que tiene una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, análogas

45 de las mismas, y fragmentos de las mismas. En estos métodos, la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos anti-PAD4 en la muestra biológica, y por lo tanto es indicativa de AR en el sujeto. Se pueden utilizar más de un péptido de PAD4 en estos métodos.

En otras realizaciones, el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, análogas de las mismas, y fragmentos de las mismas. En estos métodos, la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en la muestra biológica, y por lo tanto es indicativa de AR en el sujeto. Se pueden utilizar más de un péptido de BRAF en estos métodos.

55 La presente invención también proporciona métodos para diagnosticar AR en un sujeto. Tales métodos comprenden poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto que se va a ensayar con al menos dos biomarcadores durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcadoranticuerpo; y detectando cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado. Los al menos dos biomarcadores se pueden seleccionar de entre:

Péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas;

65 Péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7,

SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas, Péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas; y

5 cualquier combinación de los mismos En este método, la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de AR en el sujeto.

En otras realizaciones, se utilizan más de dos biomarcadores peptídicos, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 biomarcadores peptídicos. En ciertas realizaciones preferidas, se utilizan 8 biomarcadores peptídicos, es decir, tres péptidos de PAD4, tres péptidos de BRAF y dos péptidos de calpastatina. En realizaciones particularmente preferidas, los tres péptidos de PAD4 consisten en las SEC ID Nos 2-4, los tres péptidos de BRAF consisten en las SEC ID Nos 7-9 y los dos péptidos de calpastatina consisten en las SEC ID Nos 11-12.

15 Muestras biológicas

Los métodos de diagnóstico de la presente invención se pueden aplicar al estudio de cualquier tipo de muestra biológica permitiendo ensayar uno o más biomarcadores inventivos. Ejemplos de muestras biológicas adecuadas, incluyen, pero sin limitarse a estas, orina, sangre completa, suero, plasma, saliva, y líquido sinovial. Las muestras biológicas utilizadas en la práctica de la invención pueden ser muestras recientes o congeladas recolectadas de un sujeto, o muestras de archivo con una historia conocida del diagnóstico, tratamiento y/o resultado. Las muestras biológicas se pueden recolectar por medios no invasivos, tales como, por ejemplo, por extracción de sangre de un sujeto, o utilizando una aspiración por aguja fina o una biopsia por aguja. En ciertas realizaciones, la muestra biológica es una muestra serológica y se selecciona de entre el grupo constituido por sangre completa, suero,

25 plasma.

En realizaciones preferidas, los métodos inventivos se llevan a cabo en la muestra biológica en sí misma sin, o con un procesamiento limitado de la muestra.

Sin embargo, de manera alternativa, los métodos inventivos se pueden llevar a cabo sobre un extracto proteico preparado de la muestra biológica, En este caso, el extracto proteico contiene preferentemente el contenido proteico total. Los métodos de extracción de proteínas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo "Protein Methods",

D.M. Bollag y col., 2ª Ed., 1996, Wiley-Liss; "Protein Purification Methods: A Practical Approach", E.L. Harris and S. Angal (Eds.), 1989; "Protein Purification Techniques: A Practical Approach", S. Roe, 2ª Ed., 2001, Oxford University

35 Press; "Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization", H. Ahmed, 2005, CRC Press: Boca Raton, FL). Se pueden utilizar varios kits para extraer proteínas de los fluidos corporales y tejidos. Tales kits están disponibles comercialmente en, por ejemplo, BioRad Laboratories (Hercules, CA), BD Biosciences Clontech (Mountain View, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL), e Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Las instrucciones que describen en detalle el protocolo a seguir están incluidas habitualmente en todos estos kits. La sensibilidad, el tiempo de procesamiento y los costes pueden ser diferentes de un kit a otro. Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente el kit(s) más adecuado(s) para una situación en particular.

Detección de complejos biomarcador-anticuerpo

45 Los métodos de diagnóstico de la presente invención generalmente implican la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el biomarcador peptídico y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica ensayada. En la práctica de la invención, la detección de tal complejo se puede llevar a cabo por cualquier método adecuado (véase, por ejemplo, E. Harlow y A. Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY).

Por ejemplo, la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo se puede llevar a cabo utilizando un inmunoensayo. Hay disponible un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayos, incluyendo el radioinmunoensayo, inmunoensayos enzimáticos (EIA), ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), e

55 inmunoprecipitación de inmunofluorescencia. Los inmunoensayos se conocen bien en la técnica. Los métodos para llevar a cabo tales ensayos así como las aplicaciones prácticas y procedimientos se resumen en los libros de texto. Ejemplos de tales libros de texto incluyen P. Tijssen, En: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R.H. Burdon y v. P.H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990), pp. 221-278 y varios volúmenes de Methods in Enzymology, Eds. S.P. Colowick y col., Academic Press, que trata sobre métodos de detección inmunológica, especialmente los volúmenes 70, 73, 74, 84, 92 y 121. Los inmunoensayos pueden ser competitivos o no competitivos.

Por ejemplo, cualquiera de varias variaciones de la técnica de ensayo sándwich se puede utilizar para llevar a cabo un inmunoensayo. Brevemente, en un ensayo sándwich típico aplicado a la detección de, por ejemplo, 65 autoanticuerpos anti-PAD4 de acuerdo con la presente invención, un biomarcador peptídico PAD4 no marcado se inmoviliza sobre una superficie sólida (como se ha descrito anteriormente) y la muestra biológica que se va a

ensayar se pone en contacto con el biomarcador unido durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcador-anticuerpo. Después de la incubación, se añade un anticuerpo que está marcado con un resto detectable y que reconoce específicamente anticuerpos de las especie ensayada (por ejemplo, uno anti IgG humana para sujetos humanos) y se incuba bajo condiciones que permitan la formación de un complejo ternario

5 entre cualquier biomarcador unido al autoanticuerpo y el anticuerpo marcado. Cualquier material no unido se lava, y se determina la presencia de cualquier autoanticuerpo anti-PAD4 en la muestra por observación/detección de la señal producida directa o indirectamente por el resto detectable. Variaciones de este ensayo incluyen un ensayo, en el que tanto la muestra biológica como el anticuerpo marcador se añaden simultáneamente al biomarcador peptídico PAD4 inmovilizado.

El segundo anticuerpo (es decir, el anticuerpo añadido en un ensayo sándwich como se ha descrito anteriormente) se puede marcar con cualquier resto detectable adecuado, es decir, cualquier entidad que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable analíticamente que permita la detección del complejo ternario, y en consecuencia, la detección del complejo biomarcador-anticuerpo.

15 La detección puede ser tanto cualitativa o cuantitativa. Los métodos de marcado de moléculas biológicas tales como anticuerpos, se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo, “Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B”, Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, W.B. Jakoby y M. Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY; y M. Wilchek y E.A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32).

Los restos detectables que se utilizan más comúnmente en inmunoensayos son las enzimas y los fluoróforos. En el caso de inmunoensayos enzimáticos (EIA o ELISA), una enzima tal como la peroxidasa de rábano rusticano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, y similares, se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Los sustratos que se utilizan con las enzimas específicas se

25 eligen generalmente por la producción de un cambio de color detectable, por la hidrólisis de la enzima correspondiente. En el caso de inmunofluorescencia, el segundo anticuerpo se une químicamente a un resto fluorescente sin alteración de su capacidad de unión. Después de la unión del anticuerpo marcado fluorescentemente al complejo biomarcador-anticuerpo y la eliminación de cualquier material no unido, se detecta la señal fluorescente generada por el resto fluorescente y opcionalmente se cuantifica. De manera alternativa, el segundo anticuerpo se puede marcar con radioisótopo, un resto quimioluminiscente, o un resto bioluminiscente.

Diagnóstico de AR

En los métodos de la presente solicitud, la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de la

35 presencia de autoanticuerpos anti-PAD4, autoanticuerpos anti-BRAF, o autoanticuerpos anti-calpastatina en la muestra biológica ensayada y por lo tanto es indicativa de AR en el sujeto del que se obtuvo la muestra biológica. Por lo tanto, los métodos de la presente solicitud, se pueden utilizar para el diagnóstico de AR en los pacientes. En particular, los métodos de la invención se pueden utilizar para ensayar sujetos sospechosos de tener AR.

Un experto en la técnica apreciará que se puede hacer un diagnóstico de AR solamente con los resultados obtenidos por un método proporcionado en el presente documento. De manera alternativa, un médico puede también considerar otros parámetros clínicos o patológicos que se utilizan en los métodos para diagnosticar AR existentes. Por tanto, los resultados obtenidos utilizando los métodos de la presente solicitud se pueden comparar y/o combinar con los resultados de otras pruebas, ensayos o procedimientos llevados a cabo para el diagnóstico de

45 AR. Tal comparación y/o combinación puede ayudar a proporcionar un diagnóstico más afinado.

Por ejemplo, los métodos de diagnóstico de AR de la presente solicitud se pueden utilizar en combinación con los criterios ARA (es decir, los criterios revisados en 1987 por el Colegio Americano de Reumatología para la clasificación de AR descritos en F.C. Arnett y col., Arthritis Rheum., 1988, 31: 315-324). De acuerdo con los criterios ARA, se dice que un paciente tiene AR si el paciente muestra al menos 4 de los siguientes criterios: 1) agarrotamiento matutino durante al menos 1 hora; 2) artritis de 3 o más áreas articulares; 3) artritis de articulaciones de las manos; 4) artritis simétricas; 5) nódulos reumatoides; 6) factor reumatoide sérico (RF); y 7) cambios radiográficos, donde los criterios 1-4 deben estar presentes desde hace al menos 6 meses.

55 De manera alternativa o adicionalmente, los resultados de los métodos de diagnóstico de AR de la presente solicitud se pueden utilizar en combinación con los resultados de uno o más ensayos que empleen otros biomarcadores de AR. Por tanto, en ciertas realizaciones, el diagnóstico de AR se puede basar en resultados de un método de la presente solicitud y en resultados de uno o más ensayos adicionales que utilicen un biomarcador de AR diferente. Por ejemplo, se puede ensayar un panel de biomarcadores de AR bien individualmente o simultáneamente, por ejemplo, utilizando una tecnología basada en perlas o un chip.

Ejemplos de biomarcadores de AR adecuados incluyen, pero no se limitan a, CCP, proteína C reactiva, amiloide A sérica, interleucina 6 (IL6), proteínas S100, osteopontina, factor reumatoide, metaloproteasa de la matriz 1 (MMP-1), metaloproteasa de la matriz 3 (MMP-3), ácido hialurónico, sCD14, marcadores de angiogénesis (tales como factor 65 de crecimiento endotelial vascular o VEGF), y productos del metabolismo del hueso, cartílago o sinovia (tales como piridinolina o su forma glucosilada; desoxipiridinolina; telopéptidos entrecruzados; neoepítopos de colágeno, proteína

de la matriz oligomérica de cartílago, proteína de la capa intermedia del cartílago; matrilinas, condromodulatinas, osteocalcina, y similares)

En ciertas realizaciones, los métodos de la invención se utilizan para el diagnóstico de AR en pacientes negativos al

5 CCP. Además, como se presenta en el presente documento en la sección de los Ejemplos, los solicitantes han demostrado, en particular, que un método de la invención que utiliza la combinación de ocho biomarcadores peptídicos (3 péptidos de PAD4, 3 péptidos de BRAF, y 2 péptidos de calpastatina) permite el diagnóstico de AR en más del 70% de sujetos negativos al CCP. Las expresiones “paciente negativo al CCP” y “sujeto negativo al CCP” se utilizan en el presente documento de manera intercambiable. Se refieren a un sujeto cuyo suero no contiene anticuerpos (o al menos no anticuerpos detectables) dirigidos contra proteínas citrulinadas.

III – Kits

En otro aspecto, la presente invención proporciona kits que comprenden materiales útiles para llevar a cabo los

15 métodos diagnósticos de acuerdo con la presente invención. Los procedimientos diagnósticos proporcionados en el presente documento se pueden llevar a cabo en laboratorios diagnósticos, laboratorios experimentales, o por facultativos. La invención proporciona kits que se pueden utilizar en estos distintos entornos.

Los materiales y reactivos para detectar autoanticuerpos anti-PAD4, autoanticuerpos anti-BRAF y/o autoanticuerpos anti-calpastatina en una muestra biológica y/o para el diagnóstico de AR en un sujeto de acuerdo con la presente solicitud, se pueden incluir juntos en un kit. Cada kit de la invención comprende al menos un biomarcador peptídico inventivo preferentemente en una cantidad que sea adecuada para la detección de autoanticuerpos en una muestra biológica.

25 La presente solicitud desvela un kit que comprende al menos un péptido de PAD4 que tiene una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas.

En una realización, un kit inventivo comprende al menos un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos, de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas.

35 En otras divulgaciones más, un kit comprende al menos dos biomarcadores seleccionados de entre el grupo constituido por:

Péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas; Péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas, Péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos, preferentemente de menos de 50

45 aminoácidos, que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, análogas de las mismas y fragmentos de las mismas; y

cualquier combinación de los mismos En ciertas divulgaciones, el kit comprende al menos 8 marcadores, tres péptidos de PAD4, 3 péptidos de BRAF y 2 péptidos de calpastatina, como se ha descrito anteriormente. Preferentemente los tres péptidos de PAD4 consisten en las SEC ID Nos 2-4, los tres péptidos de BRAF consisten en las SEC ID Nos 7-9, y los dos péptidos de calpastatina consisten en las SEC ID Nos 11-12.

El biomarcador(es) incluido en un kit puede o no inmovilizarse en una superficie de sustrato (por ejemplo, perlas,

55 matrices, y similares). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un kit inventivo puede incluir una matriz para diagnosticar AR como se proporciona en la presente solicitud. De manera alternativa, puede incluirse una superficie de sustrato en un kit inventivo para la inmovilización de los biomarcadores peptídicos.

Un kit comprende también generalmente al menos un reactivo para la detección de un complejo biomarcadoranticuerpo formado entre el péptido biomarcador incluido en el kit y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica. Tal reactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo marcado que reconoce específicamente anticuerpos de la especie ensayada (por ejemplo, un anti IgG humana para sujetos humanos), como se ha descrito anteriormente.

Dependiendo del procedimiento, el kit puede comprender además uno o más de: un tampón y/o reactivos de 65 extracción, tampón y/o reactivos de bloqueo, tampón y/o reactivos de inmunodetección, tampón y/o reactivos de marcado, y medios de detección. Se pueden incluir en el kit los protocolos de cómo utilizar estos tampones y

reactivos para llevar a cabo diferentes etapas del procedimiento.

Los diferentes reactivos incluidos en el kit se pueden suministrar en forma sólida (por ejemplo liofilizada) o líquida. Los kits de la presente invención pueden comprender opcionalmente diferentes envases (por ejemplo, viales,

5 ampollas, tubos de ensayo, matraces o botellas) para cada tampón o reactivo individual. Cada componente generalmente será adecuado como una alícuota en su respectivo envase o se proporcionará en forma de concentrado. Se pueden proporcionar también otros envases adecuados para realizar ciertas etapas de los métodos desvelados. Los envases individuales del kit se mantienen preferentemente en un confinamiento cercano para la venta comercial.

En ciertas realizaciones, un kit contiene instrucciones de cómo utilizar sus componentes para el diagnóstico de AR en un sujeto de acuerdo con un método de la invención. Las instrucciones para utilización del kit de acuerdo con los métodos de la invención pueden comprender instrucciones para procesar la muestra biológica obtenida del sujeto y/o para llevar a cabo el ensayo, y/o instrucciones para interpretar los resultados. Un kit puede también contener la

15 información en la forma que prescriba la agencia gubernamental que regula la fabricación, uso y venta de productos farmacéuticos y biológicos.

IV – Desarrollo de productos terapéuticos nuevos para AR

Los epítopos de PAD4 y/o de BRAF identificados por los solicitantes pueden ser dianas atractivas para la identificación de compuestos o sustancias potencialmente útiles para tratar la AR o prevenir la progresión de AR.

Como se mencionó anteriormente, la PAD4 no solo es una diana para anticuerpos específicos en la AR, también está implicada en la generación de epítopos citrulinados. Los presentes solicitantes han demostrado que los

25 autoanticuerpos anti-PAD4 inhiben la citrulinación del fibrinógeno por la PAD4 (véase la sección de Ejemplos). Los solicitantes también han demostrado que los anticuerpos anti-PAD4 reconocen específicamente 3 epítopos en PAD4, 2 de los cuales (péptidos 61 y 63) se localizan en el dominio de unión al sustrato de PAD4. Evitando la unión de los autoanticuerpos anti-PAD4 a estos epítopos de PAD4 podría revertirse la acción inhibidora de los autoanticuerpos y restaurar la actividad enzimática de PAD4.

La BRAF es una diana interesante para los anticuerpos. La BRAF es una serina-treonina quinasa implicada en la transducción de señales mitógenicas desde la membrana al núcleo. La BRAF regula la cascada de señalización de las proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK). Las MAPK también tienen un papel en la producción de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-, IL-1, IL-6). Para ensayar si los autoanticuerpos contra BRAF pueden influenciar

35 la actividad de BRAF como quinasa, los solicitantes han desarrollado un ensayo de fosforilación utilizando BRAF, MEK1 (su principal sustrato) y autoanticuerpos BRAF purificados de sueros de pacientes con AR; y han descubierto que el 80% de los autoanticuerpos anti BRAF activan la fosforilación in vitro de MEK1 por la BRAF. Este resultado sugiere que los anticuerpos anti-BRAF podían activar la ruta de la MAP quinasa por medio de BRAF, dando lugar a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y a la inflamación articular. Los solicitantes también han demostrado que los autoanticuerpos anti-BRAF reconocen específicamente 3 epítopos en la BRAF (péptidos P10, P16 y P25). Por lo tanto los anticuerpos anti-BRAF pueden constituir una diana para el control de la inflamación en AR.

Por lo tanto, se pueden desarrollar exploraciones para identificar compuestos o sustancias que eviten la unión de los autoanticuerpos anti-PAD4 a epítopos PAD4, en particular al péptido 61 y/o péptido 63. De manera similar, se

45 pueden desarrollar exploraciones para identificar compuestos o sustancias que eviten la unión de autoanticuerpos anti-BRAF a epítopos BRAF, en particular a los péptidos P10, P16 y/o P25.

Tales exploraciones se pueden llevar a cabo en cualquier sistema biológico adecuado tal como un fluido biológico, o células aisladas. Generalmente, las exploraciones se llevan a cabo utilizando células que pueden cultivarse en equipos de cultivo tisular de referencia. Las células adecuadas incluyen todas las células apropiadas normales o transformadas derivadas de cualquier fuente reconocida. Preferentemente, las células son de origen mamífero (humanas o animales, tales como de roedor o simio). Más preferentemente, las células son de origen humano. Las células mamíferas pueden ser de cualquier origen tisular u orgánico (por ejemplo, hueso, cartílago, o líquido sinovial) y de cualquier tipo celular siempre y cuando las células expresen PAD4 y/o PAD4. Las células que se utilizan en la 55 práctica de los métodos de la presente invención pueden ser células primarias, células secundarias, o células inmortalizadas (por ejemplo, líneas celulares establecidas). Se pueden preparar por técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, las células se pueden aislar de hueso, cartílago o líquido sinovial) o se pueden obtener de fuentes comerciales inmunológicas y microbiológicas (por ejemplo, de la colección americana de cultivos tipo, Manassas, VA). De manera alternativa o adicional, las células se pueden modificar genéticamente para contener, por ejemplo, un gen de interés. Un ensayo desarrollado para una selección primaria de fármacos (es decir, una selección en primera ronda) se lleva a cabo preferentemente utilizando líneas celulares establecidas, que están disponibles comercialmente y normalmente son relativamente fáciles de cultivar, aunque el ensayo que se usa más tarde en el proceso de desarrollo de fármacos se lleva a cabo, preferentemente utilizando células primarias y secundarias, que generalmente son más difíciles de obtener, manteniendo y/o cultivando células inmortalizadas pero

65 que representan mejores modelos experimentales para la situación in vivo. Los métodos de selección se pueden llevar a cabo utilizando células contenidas en una pluralidad de pocillos de una placa de ensayo multi-pocillo.

Como apreciará un experto habituado en la técnica, se puede explorar cualquier tipo de compuesto o agente. Un compuesto candidato puede ser un compuesto sintético o natural; puede ser una molécula única o una mezcla o complejo de diferentes moléculas. Los compuestos candidatos pueden explorarse individualmente. De manera

5 alternativa, los compuestos comprendidos en colecciones o bibliotecas se pueden explorar simultáneamente.

Las colecciones de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles en, por ejemplo, Pan Laboratories (Bothell, WA) or MycoSearch (Durham, NC). Las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles comercialmente en Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), Microsource (New Milford, CT), y Aldrich (Milwaukee, WI). También se han desarrollado bibliotecas de compuestos candidatos y están disponibles comercialmente en grandes compañías químicas, que incluyen, por ejemplo, Merck, Glaxo Welcome, Bristol-Meyers-Squibb, Novartis, Monsanto/Searle, y Pharmacia UpJohn. Además, las colecciones naturales, las bibliotecas producidas sintéticamente y los compuestos se modifican fácilmente por medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Las bibliotecas químicas son relativamente fáciles de

15 preparar por síntesis automática tradicional, PCR, clonación o métodos sintéticos propios (véase, por ejemplo, S.H. DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 1993, 90:6909-6913; R.N. Zuckermann y col., J. Med. Chem. 1994, 37: 2678-2685; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33: 2059-2060; P.L. Myers, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8: 701-707).

Utilizando el péptido 61 y/o el péptido 63 de PAD4 o el péptido P10, péptido P16 y/o el péptido P25 de BRAF como diana(s), se pueden encontrar agentes útiles para el tratamiento de AR en una gran variedad de clases de productos químicos.

Ejemplos

25 Los siguientes ejemplos describen algunos de los modos preferidos de hacer y practicar la presente invención. Sin embargo, se debería entender que los ejemplos son solamente con fines ilustrativos y no significa que limiten el ámbito de la invención. Además, a menos que la descripción de un Ejemplo se presente en tiempo pasado, el texto, como el resto de la especificación, no pretende sugerir que los experimentos se hayan llevado a cabo o se hayan obtenido realmente los datos.

Algunos de los resultados presentados posteriormente fueron presentados por los presentes solicitantes en un artículo científico (Auger y col., Ann. Rheum. Dis., 2009, 68: 591-594).

35 Ejemplo 1: Péptidos de PAD4 para el diagnóstico de AR

Pacientes y métodos

Pacientes de AR y controles

Los pacientes de AR se seleccionaron del Ala de Reumatología del Hospital La Concepción de Marsella, Francia. Estos pacientes cumplían los criterios de 1987 del Colegio Americano de Reumatología para AR (F.C. Arnett y col., Arthritis Rheum., 1988, 31: 315-324). Los pacientes con espondiloartropatía (AS) eran del Ala de Reumatología del Hospital La Concepción de Marsella. Sirvieron como controles normales los voluntarios del personal del laboratorio y

45 del Centro de Transfusión de Sangre de Marsella. Todos los participantes firmaron un consentimiento informado.

Purificación de Autoanticuerpos contra PAD4

Las placas de ELISA se revistieron con 1 g de PAD4 por pocillo durante una noche a 4 ºC, utilizando proteína recombinante PAD4 (Abnova Corporation, H0023569P01). Se seleccionaron los sueros de 29 pacientes de AR y 2 de dos controles que contenían autoanticuerpos contra PAD4 (I. Auger y col., Ann. Rheum. Dis., 2008 Oct 28). Los sueros se diluyeron a 1:2 en PBS y se incubaron durante 3 horas. Después de lavarse, se purificaron los autoanticuerpos contra PAD4 en PBS a pH 2, se neutralizaron en tampón Tris 1 M, y se cuantificaron. La presencia de autoanticuerpos anti-PAD4 se confirmó por transferencia puntual.

Ensayo de Citrulinación en el laboratorio

Se incubó Fibrinógeno humano (Sigma) con una concentración final de 10 mg/ml con 1 g de PAD4 (Abonova Corporation) en tampón de trabajo (Tris HCl 100 mM, CaCl2 5 mM, DTT 5 mM, pH 7,5) en presencia de 1 g de autoanticuerpos purificados contra PAD4, durante 4 horas a 55 ºC. Se incluyó un control positivo para cada paciente (incubación de fibrinógeno con PAD4 en tampón de trabajo en presencia de 1 g de autoanticuerpos de control anti C1 o C2). Cada mezcla de reacción se incubó dos veces con perlas de sefarosa proteína A para eliminar anticuerpos.

65 Cada mezcla de reacción se revistió entonces en placas ELISA por duplicado y se bloqueó con PBS que contenía un 5% de leche. Para detectar la citrulinación del fibrinógeno, se utilizó un suero que contenía autoanticuerpos contra

fibrinógeno citrulinado pero no anticuerpos contra PAD4. Después de lavar con Tween 20 al 0,1%, se añadió un anti-IgG humano conjugado con peroxidasa (Sigma, Francia). Se leyó la densidad óptica (DO) a 405 nm. Se determinó la activación o inhibición de la citrulinación por la PAD4 calculando la relación de la DO medida para la muestra de ensayo entre la DO medida para el control positivo. Una relación > 1 indicaba activación, una relación < 1 indicaba

5 inhibición.

Péptidos sintéticos

Los péptidos (Neosystem, Strasbourg, Francia) se sintetizaron utilizando un sistema en fase sólida y se purificaron. 10 Un total de 65 péptidos de 20 aminoácidos solapantes sobre 10 aminoácidos derivados de PAD4 (locus NM_012387), restos 1 a 663.

Mapeado de Péptidos de PAD4

15 Las placas se revistieron durante una noche con 10 g/pocillo de péptidos de PAD4 diluidos en tampón salino de fosfato (PBS), pH 7,4. Se bloquearon las placas con PBS que contenía un 5% de leche. Se incubó el suero diluido a

1:100 en PBS durante 2 horas. Después de lavarlos con Tween 20 al 0,1%, se añadió un anti-IgG humano conjugado con peroxidasa. Se leyó la densidad óptica a 405 nm. La DO de fondo se obtuvo añadiendo cada suero a un pocillo sin péptidos. Los sueros positivos se definieron como un valor de DO de más de dos veces la DO de fondo

20 (I Auger y col., Ann. Rheum. Dis., 2007, 66: 1588-1593).

Análisis estadístico

Se calcularon los valores de p utilizando el ensayo Chi cuadrado. 25

Resultados

Inhibición de la Citrulinación del Fibrinógeno por los autoanticuerpos contra PD4

30 Para ensayar si los anticuerpos dirigidos contra PAD4 interfieren la actividad de PAD4, se analizó la citrulinación del fibrinógeno en presencia de los autoanticuerpos anti-PAD4 purificados de 29 pacientes y 2 controles sanos. La detección de citrulinación se cuantificó después por ELISA.

Se observó la inhibición de la citrulinación del fibrinógeno en 22 de los 31 autoanticuerpos purificados contra PAD4;

35 se observó la activación de la citrulinación del fibrinógeno en 6 de los 31 autoanticuerpos purificados contra PAD4; y se encontró que 3 de los 31 autoanticuerpos purificados contra PAD4 no tenían efecto sobre la citrulinación de fibrinógeno (Figura 1).

Cuatro Epítopos lineales de PAD4 son reconocidos por Autoanticuerpos contra PAD4

40 Para identificar los epítopos para células B en PAD4, se sintetizaron los 65 péptidos de 20 aminoácidos solapantes que englobaban la secuencia completa de la PAD4 humana. Estos péptidos se exploraron con los sueros de 29 pacientes de AR y 2 controles que se sabía que contenían autoanticuerpos anti-PAD4.

45 Entre los 65 péptidos, 18 fueron reconocidos por los sueros ensayados. Diez (10) de estos péptidos se localizaron en el dominio del extremo N y los otros 8 péptidos se localizaron en el dominio del extremo C. Cuatro péptidos (22, 28, 61 y 63) fueron reconocidos preferencialmente por los sueros de pacientes con AR y los controles (Tabla 1). Además, 15 de los 31 sueros de los pacientes de AR eran positivos al péptido 22, 25 de los 31 eran positivos al péptido 28, 8 de los 31 eran positivos para el péptido 61, y 16 de los 31 eran positivos para el péptido 63. Los

50 péptidos 22 y 28 se localizaban en el dominio del extremo N de PAD4, mientras que los péptidos 61 y 63 estaban localizados en el dominio del extremo C de PAD4.

Tres epítopos lineales de PAD4 se asocian con pacientes con AR

55 Para confirmar la reactividad observada, se ensayaron los sueros de 33 pacientes con espondiloartropatía (AS) y 33 individuos sanos por ELISA utilizando los péptidos 22, 28, 61 y 63 como inmunoabsorbentes.

Los autoanticuerpos contra el péptido 22, el péptido 61 y el péptido 63 se encontraron en más pacientes de AR que en los controles (Figura 2). Además, 15 de los 29 pacientes de AR eran positivos para el péptido 22 frente a 7 de los

Los autoanticuerpos contra el péptido 28 se encontraron en altos porcentajes en los controles. Además 24 de los 29 10 pacientes eran positivos frente a 20 de los 33 pacientes de AS y 10 de los 33 individuos sanos (p = 0,002 por el

ensayo Chi cuadrado, 29 pacientes frente a 66 controles).

Reconocimiento de péptidos por autoanticuerpos contra PAD4 e inhibición de la citrulinación por PAD4

5 Se analizó el patrón de péptidos de autoanticuerpos contra PAD4 que inhiben (pacientes AR1 a AR20), que activan (pacientes AR24 a AR29), o que no tienen efecto (pacientes AR21 a AR23) sobre la citrulinación por PAD4.

No se observó ninguna diferencia en el número de péptidos que reconocían los autoanticuerpos que se sabía que inhibían o activaban PAD4 (Tabla 2). Sin tener en cuenta su acción (activación o inhibición), la mayoría de los autoanticuerpos contra PAD4 reconocían péptidos localizados en el dominio del extremo N y en el dominio del extremo C. Entre los anticuerpos contra PAD4 que inhibían PAD4, 5 de los 20 reconocían exclusivamente péptidos localizados en el dominio del extremo N, 1 de 20 reconocían exclusivamente péptidos localizados en el dominio del extremo C y 14 de 20 reconocían péptidos localizados en el dominio del extremo N y en el dominio del extremo C (Figura 3).

15 Entre los anticuerpos contra PAD4 que no tienen efecto sobre la citrulinación por PAD4, 3 de los 3 reconocían péptidos localizados en el dominio del extremo N y en el dominio del extremo C.

Entre los autoanticuerpos contra PAD4 que activan PAD4, 1 de 6 reconocen exclusivamente los péptidos localizados en el dominio del extremo N, ninguno de los 5 reconocían los péptidos localizados en el dominio del extremo C, y 3 de los 6 reconocían los péptidos localizados en el dominio del extremo N y en el dominio del extremo C.

Los péptidos 22 y 61 fueron reconocidos preferencialmente por los autoanticuerpos contra PAD4 que inhiben PAD4 (Figura 4). Además, 12 de 20 autoanticuerpos contra PAD4 que inhiben

25 PAD4 eran positivos al péptido 22 en comparación con 2 de los 5 autoanticuerpos contra PAD4 que activan PAD4. Además el péptido 61 era reconocido por 6 de los 20 autoanticuerpos contra PAD4 que inhiben PAD4 frente a ninguno de los 6 autoanticuerpos contra PAD4 que activan PAD4. Sin embargo, se encontró que entre los autoanticuerpos contra PAD4 que no tenían efecto sobre la citrulinación de PAD4, 2 de 3 reconocían el péptido 61.

Conclusiones

Utilizando matrices proteicas y ensayos ELISA, los presentes solicitantes habían encontrado anteriormente que la PAD4 es un autoantígeno en pacientes con AR. Los autoanticuerpos contra PAD4 ya se habían descrito en la AR. La PAD4 está implicada en la generación de epítopos citrulinados. Los autoanticuerpos contra los epítopos

35 citrulinados son altamente específicos de AR. La presencia de estos autoanticuerpos antes de la aparición de AR sugiere un papel potencial en la patofisiología de la enfermedad.

El estudio presentado en el presente documento se sometió a un ensayo para ver si los autoanticuerpos contra PAD4 interfieren con la actividad de PAD4. Los solicitantes han desarrollado un ensayo de citrulinación casero con PAD4, fibrinógeno y autoanticuerpos contra PAD4 purificados a partir de sueros de pacientes con AR. Como regla general, se observó que los autoanticuerpos contra PAD4 inhiben la citrulinación del fibrinógeno por la PAD4. Además, se encontró que 22 de los 31 autoanticuerpos purificados contra PAD4 inhibían la citrulinación de fibrinógeno por la PAD4.

45 Con el fin de identificar los epítopos reconocidos por autoanticuerpos contra PAD4, se utilizaron 65 péptidos de 20 aminoácidos que englobaban la secuencia completa de PAD4 en un ensayo ELISA directo. Se encontró que los autoanticuerpos contra PAD4 reconocen cuatro epítopos principales: el péptido 22 (que corresponde con los restos de aminoácidos 211-230 de la PAD4 humana); el péptido 28 (restos de aminoácidos 271-290); péptido 61 (restos de aminoácidos 601-620) y péptido 63 (restos de aminoácidos 621-640). Los péptidos 22 y 28 se localizan en el dominio del extremo N de PAD4 (que engloba los restos de aminoácidos 1-300), mientras que los péptidos 61 y 63 se localizan en el dominio del extremo C de PAD4 (que engloba los restos de aminoácidos 301-663). Los autoanticuerpos que reconocen los péptidos 22, 61 y 63 se encontraron en un alto porcentaje en pacientes con AR en comparación con los controles.

55 Se han identificado cinco motivos de unión al Ca2+ en PAD4, tres están en el dominio del extremo N y dos están en el dominio del extremo C (K Arita y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 10: 5291-5296; K Arita y col., Natl. Struct. Mol. Biol., 2004, 11: 777-783). El dominio del extremo N parece que está implicado en cambios conformacionales mediados por el Ca2+. Después de unirse al Ca2+, los cambios conformacionales generan una hendidura activa y el sustrato se une a la PAD4. El dominio del extremo N puede tener también influencia en la actividad enzimática de la PAD4. Además, el gen PADI4 presenta dos haplotipos principales. En algunas poblaciones, uno es susceptible a AR y en la otra no es susceptible a AR. Estos dos haplotipos contienen cuatro polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en exones del dominio del extremo N (posiciones 55, 82, 112, y 117). El dominio del extremo C contiene el dominio de unión al sustrato y el dominio catalítico.

65 En 2008, Harris y col., mapearon los epítopos de PAD4 por inmunoprecipitación de truncamientos de PAD4 traducidas in vitro con anticuerpos contra PAD4 (M.L. Harris y col., Arthritis Rheum., 2008, 58(7): 1958-1967). Se

identificaron dos tipos de suero. Se descubrió que los sueros tipo I reconocían exclusivamente la PAD4 de longitud completa (1-663) y se descubrió que los sueros tipo dos reconocían tanto la de longitud completa (1-663) como la PAD4 truncada (1-523). Los autoanticuerpos tipo II contra PAD4 necesitan contribuciones exclusivamente del dominio del extremo N de PAD4 (1-119). Sin embargo, los autoanticuerpos tipo I contra PAD4 necesitan

5 contribuciones del dominio del extremo N (1-119) y del dominio del extremo C (523-663) de PAD4.

En las matrices proteicas y en los ensayos ELISA llevados a cabo por los presentes solicitantes, cada autoanticuerpo contra PAD4 reconocían la PAD4 de longitud completa (1-663) (I Auger y col., Ann. Rheum. Dis., 2008 Oct. 28). Entre los autoanticuerpos contra PAD4 de pacientes con AR, solamente 3 de 29 reconocían la PAD4

10 truncada (restos 1 a 111) (datos no mostrados). En el extenso ensayo de péptidos, 7 de los 29 autoanticuerpos contra PAD4 reconocían exclusivamente los péptidos localizados en el dominio del extremo N (211-290) de PAD4. Uno de 29 autoanticuerpos contra PAD4 reconocían exclusivamente los péptidos localizados en el dominio del extremo C (611-630). Finalmente, se descubrió que 19 de 29 autoanticuerpos contra PAD4 reconocían los péptidos localizados en el dominio del terminal N (211-290) y el dominio del extremo C (601-650).

15 Se descubrió que la mayoría de los autoanticuerpos contra PAD4 inhiben la citrulinación del fibrinógeno por PAD4. La mayoría de los autoanticuerpos reconocen péptidos localizados en el dominio del extremo N (principalmente el péptido 22 o el péptido 28) y el dominio del extremo C (principalmente el péptido 61 y el péptido 63). Sin el deseo de quedar ligados por teoría alguna, los solicitantes proponen el siguiente modelo para explicar cómo los

20 autoanticuerpos contra PAD4 inhiben la citrulinación (Figura 5): la interacción de los autoanticuerpos con el péptido 22 o el péptido 28 pueden interferir con los cambios conformacionales mediados por la unión con el Ca2+. La unión con el calcio y la unión al sustrato son importantes para generar el sitio activo en PAD4 (K Arita y col., Nat. Struct. Mol. Biol., 2004, 11: 777-783). También es posible que debido a que los autoanticuerpos contra PAD4 se unen a 40 aminoácidos en el dominio del extremo C de PAD4, se bloquee la interacción de PAD4 y su sustrato. Esto puede

25 explicar por qué los autoanticuerpos contra PAD4 inhiben la citrulinación mediada por PAD4.

Aún queda por aclarar cómo puede influir esta inhibición en el desarrollo de la inmunización anti-citrulina en los pacientes con AR. Los solicitantes están en proceso de estudio de esta cuestión.

30 Ejemplo II: Péptidos de BRAF para el diagnóstico de AR en negativos al CCP

Pacientes y Métodos

Pacientes de AR y Controles

35 Se seleccionaron 118 pacientes con AR del Ala de Reumatología del Hospital La Concepción, Marsella, Francia. Estos pacientes cumplían con los criterios de 1987 del Colegio Americano de Reumatología para la AR. Para todos los pacientes se obtuvo el genotipo HLA-DR y la titulación anti CCP. 89 de los 118 pacientes de AR eran positivos al CCP y 20 eran negativos al CCP. Se utilizaron como controles pacientes (33) con espondiloartropatía (AS) del

40 mismo hospital en Marsella y voluntarios sanos (60) del personal de INSERM UMR639 y del centro de Transfusión de Sangre de Marsella.

Péptidos sintéticos

45 Se sintetizaron cuarenta péptidos de 20 aminoácidos que englobaban los restos 416 a 766 de BRAF (locus NP_004324.1) utilizando un sistema en fase sólida y se purificaron (Neosystem, Strasbourg, Francia). La secuencia de BRAF utilizada para la síntesis de péptidos presentaba un polimorfismo en la posición 599 (V599E, valina sustituida por glutamato), una mutación que se observa en cánceres humanos y que se asocia con un aumento de la actividad quinasa.

Detección de Autoanticuerpos por ELISA

Se recubrieron las placas durante una noche con 10 g/pocillo de péptido diluido en tampón salino fosfato (PBS), pH 7,4. Las placas se bloquearon con PBS que contenía un 5% de leche. Los sueros diluidos a 1:100 en PBS se

55 incubaron durante 2 horas. Después de lavarlos con Tween 20 al 0,1%, se añadió un anti-IgG humana conjugado con peroxidasa (Sigma, Francia). Se leyó la densidad óptica (DO) a 405 nm. La DO de fondo se obtuvo añadiendo cada suero a un pocillo en ausencia de proteína. Un suero positivo se definió como el que presentaba un valor de DO de más de dos veces la DO de fondo.

60 Análisis estadístico

Los valores de p se calcularon utilizando el ensayo Chi cuadrado.

Resultados

Autoanticuerpos contra BRAF que reconocen 4 epítopos lineales en BRAF

5 Para identificar los epítopos para células B en BRAF, se sintetizaron 40 péptidos de 20 aminoácidos que englobaban el dominio catalítico de BRAF. Estos 40 péptidos se exploraron con los sueros de 21 pacientes de AR que se sabía que contenían autoanticuerpos contra BRAF. Entre los 40 péptidos, 14 fueron reconocidos por los sueros ensayados. Los sueros de pacientes con AR reconocieron preferencialmente cuatro péptidos, P10 (SEC ID Nº 7, posiciones 506-525 de la BRAF humana,), P16 (SEC ID Nº 8, posiciones 566-585 de la BRAF humana,), P25 (SEC

10 ID Nº 9, posiciones 656-675 de la BRAF humana), y P33 (SEC ID Nº 13). Además, 18 de 21 sueros reconocieron al P10, 8 reconocían al P16, 15 reconocían al P25, y 6 reconocían al P33 (véase la Tabla 2).

Tres epítopos lineales en la BRAF son reconocidos por los pacientes con AR

15 Para confirmar la reactividad observada, los solicitantes ensayaron por ELISA los sueros de 33 pacientes con espondilopatía (AS) y de 60 individuos sanos en presencia de P10, P16, P25 y P33. Se encontraron autoanticuerpos contra P10, P16 y P25 en los pacientes con AR más a menudo que en los controles (véase Figura 6). Además, los sueros de 18 de 21 pacientes con AR reconocían al P16 frente a 10 de 93 controles (p < 10-7 por el ensayo Chi cuadrado). De manera similar, los sueros de 8 de 21 pacientes con AR reconocían al P16 frente a 1/93 controles (p

20 < 10-7 por el ensayo Chi cuadrado). Finalmente, los sueros de 15 de 21 pacientes reconocían al P25 frente a 0/93 controles (p < 10-7 por el ensayo Chi cuadrado). Los anticuerpos contra P33 eran menos específicos de AR. 6 de 21 pacientes con AR, pero también 6/33 pacientes con AS y 13/60 individuos sanos tenían anticuerpos anti P33 (p = 0,523 por el ensayo Chi cuadrado, en 21 pacientes de AR frente a 93 controles).

La frecuencia de sueros positivos en pacientes positivos al CCP y negativos al CCP se calculó por ELISA utilizando los péptidos P10, P16 y P25 como inmunoabsorbentes. Entre los pacientes positivos al CCP, 29/89 reconocían el

P10, 7/89 reconocían el P16, y 17/89 reconocían el P25. Entre los pacientes negativos al CCP, 13/29 reconocían el P10, 1/29 reconocían el P16, y 8/29 reconocía el P25. En combinación, el P10, P16 y P25 identificaban el 50% de pacientes negativos al CCP (Figura 7).

5 Conclusiones

Se han identificado tres péptidos lineales en BRAF reconocidos casi únicamente por los pacientes con AR. Los péptidos P10 (SEC ID Nº 7), P16 (SEC ID Nº 8) y P25 (SEC ID Nº 9) están localizados en el dominio catalítico de BRAF. Estos péptidos también eran reconocidos por sueros de pacientes negativos al CCP. La combinación de P10, P16 y P25 de BRAF identifica el 50% de pacientes negativos al CCP.

Ejemplo III: Biomarcadores para el diagnóstico de AR en pacientes negativos al CCP

Pacientes y Métodos Pacientes con AR y Controles

Más de cien (118) pacientes con AR se seleccionaron en el Ala de Reumatología del Hospital de La Concepción, Marsella, Francia, como se ha descrito anteriormente. También se ensayaron cien controles (pacientes con espondiloartropatía (AS) del Ala de Reumatología del Hospital La Concepción, Marsella, y voluntarios del personal del INSERM UMR639 y el Centro de Transfusión de Sangre de Marsella).

Péptidos sintéticos

25 Se sintetizaron sesenta y cinco péptidos de 20 aminoácidos que englobaban los restos 1 a 663 de la PAD4 tipo silvestre (NM_012387), 40 péptidos de 20 aminoácidos que englobaban los restos 416 a 766 de BRAF (NP_004324.1) utilizando el sistema en fase sólida y se purificaron (Neosystem, Strasbourg, Francia). Se utilizaron noventa y cuatro péptidos de 15 aminoácidos derivados de la isoforma A de calpastatina (locus NP_001035908), restos 1-708.

En particular, los péptidos de PAD4: 22 (SEC ID Nº 2), 61 (SEC ID Nº 3) y 63 (SEC ID Nº 4) son péptidos de 20 aminoácidos del locus NM_012387. Los péptidos de BRAF P10 (SEC ID Nº 7), P16 (SEC ID Nº 8) y P25 (SEC ID Nº 9) son péptidos de 20 aminoácidos del locus NP_004324.1. Los péptidos de Calpastatina P’16 (SEC ID Nº 11) y P’28 (SEC ID Nº 12) son péptidos de 15 aminoácidos del locus NP_001741.

Detección de autoanticuerpos por ELISA

El procedimiento utilizado es idéntico al que se describe en el Ejemplo II.

Análisis estadístico

Los valores de p se calcularon utilizando el ensayo Chi cuadrado.

Resultados

45 Ocho péptidos (3 péptidos de PAD4, 3 péptidos de BRAF y 2 péptidos de Calpastatina) son reconocidos por pacientes con AR.

Los solicitantes han identificado tres péptidos lineales en PAD4 que son reconocidos preferencialmente por los sueros de los pacientes con AR: los péptidos 22, 61 y 63; tres péptidos lineales en BRAF que son reconocidos casi exclusivamente por pacientes con AR: P10, P16, P25; y dos péptidos lineales en la calpastatina que se asocian preferencialmente con pacientes con AR: P’16 y P’28 (véase la Figura 9).

Los ocho péptidos son reconocidos por pacientes negativos al CCP

55 Estos 8 péptidos fueron reconocidos por los sueros de pacientes negativos al CCP (véase la Figura 10). Los enlazadores más eficaces son el P10 de BRAF y el P’28 de calpastatina. El P10 de BRAF es reconocido por el 44% de pacientes negativos al CCP y el P’28 de calpastatina por el 34% de pacientes negativos al CCP.

La combinación de péptidos de PAD4, BRAF y Calpastatina reconoce la AR en el 72% de los pacientes negativos al CCP

Para un autoantígeno, la mejor combinación para identificar pacientes negativos al CCP es la de péptidos de BRAF. La combinación de P10, P16 y P25 de BRAF identifica al 50% de pacientes negativos al CCP. Para dos 65 autoantígenos, la combinación de péptidos de BRAF y Calpastatina identifica el 69% de los pacientes negativos al CCP. Finalmente, la combinación de péptidos de PAD4, BRAF y calpastatina identifica el 72% de pacientes

negativos al CCP.

Conclusiones

5 Los presentes solicitantes han descubierto 8 péptidos (3 péptidos de PAD4, 3 péptidos de BRAF y 2 péptidos de calpastatina) que permiten la identificación del 72% de pacientes negativos al CCP. LISTADO DE SECUENCIAS 10 <110> INSERM Auger, Isabelle

<120> BIOMARCADORES, MÉTODOS Y KITS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ARTRITIS REUMATOIDE

<130> BCT100057QT 15

<150> EP 09 305 266.1

<151>

<150> EP 09 306 063.0 20 <151>

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.3 25 <210> 1

<211> 663

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 4

30 <210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 766

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 708

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:

   5 poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme el complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

   donde la detección del complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en un sujeto.
2. 2. El método in vitro de la reivindicación 1, comprendiendo dicho método además las etapas de:

   15 poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con al menos otro biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos otro biomarcador se selecciona de entre el grupo que consiste en:

   péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las

   25 mismas, y combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos; y

   detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

   donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

3. 3.

   El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 2, donde el al menos otro biomarcador es un péptido de menos de 50 aminoácidos.

4. 4.

   El método in vitro de la reivindicación 2, donde dicho método se lleva a cabo con tres péptidos de BRAF, tres

   35 péptidos de PAD4, y dos péptidos de calpastatina y donde los tres péptidos de BRAF consisten en las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8 y SEC ID Nº 9, los tres péptidos de PAD4 consisten en las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, y los dos péptidos de calpastatina consisten en las SEC ID Nº 11 y SEC ID Nº 12.
5. 5. Un método in vitro para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

   poner en contacto la muestra biológica con al menos un biomarcador durante un tiempo y bajo condiciones que permitan que se forme un complejo biomarcador-anticuerpo, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una

   45 secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y detectar cualquier complejo biomarcador-anticuerpo que se haya formado,

   donde la detección de un complejo péptido de BRAF- anticuerpo es indicativa de la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en la muestra biológica.
6. 6. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el sujeto es negativo al CCP o la muestra biológica se obtiene de un sujeto negativo al CCP.

   55 7. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además la medición, en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, de la concentración de al menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste en proteína C-reactiva, amiloide A sérica, interleucina 6, proteínas S100, osteopontina, factor reumatoide, metaloproteasa de la matriz 1, metaloproteasa de la matriz 3, ácido hialurónico, sCD14, marcadores de angiogénesis, y productos del metabolismo del hueso, cartílago o sinovia.
7. 8. Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicho kit:

   al menos un biomarcador, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el 65 grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas; y

   al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.

   5 9. El kit de la reivindicación 8 que comprende además al menos otro biomarcador, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo constituido por:

   péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y péptidos de calpastatina que tienen una secuencia e aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos, y

   15 al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el al menos otro biomarcador y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto.
8. 10. Un kit para el diagnóstico in vitro de artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicho kit:

   al menos ocho biomarcadores que comprenden:

   tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de BRAF que tienen una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia

   25 seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y dos péptidos de calpastatina seleccionados de entre el grupo constituido por los péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y combinaciones de las mismas, y

   35 al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el biomarcador y un autoanticuerpo presente en una muestra biológica obtenida del sujeto, donde la detección de un complejo biomarcador-anticuerpo es indicativa de artritis reumatoide en el sujeto negativo al CCP.
9. 11. Un kit para detectar la presencia de autoanticuerpos anti-BRAF en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:

   al menos un biomarcador, donde el al menos un biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el

   45 grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y al menos un reactivo para detectar un complejo biomarcador-anticuerpo formado entre el péptido de BRAF y un autoanticuerpo presente en la muestra biológica, donde el autoanticuerpo es un autoanticuerpo anti-BRAF que es indicativo de artritis reumatoide.
10. 12. Una matriz para diagnosticar artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo dicha matriz al menos un biomarcador fijado en su superficie, donde el biomarcador es un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de

    55 las mismas.
11. 13. La matriz de la reivindicación 12 que comprende además al menos otro biomarcador fijado en su superficie, donde el otro biomarcador se selecciona de entre el grupo constituido por:

    péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y

    65 combinaciones de las mismas, y cualquier combinación de los mismos.
12. 14. Una matriz para el diagnóstico de artritis reumatoide en un sujeto negativo al CCP, comprendiendo dicha matriz al menos ocho biomarcadores fijados en su superficie, donde los al menos ocho biomarcadores comprenden:

    tres péptidos de BRAF seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de BRAF que tienen una

    5 secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, tres péptidos de PAD4 seleccionados de entre el grupo constituido por péptidos de PAD4 que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo

    10 constituido por las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y dos péptidos de calpastatina seleccionados de entre el grupo que consiste en los péptidos de calpastatina que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, fragmentos de las mismas y combinaciones de las

    15 mismas.
13. 15. La matriz de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 que comprende además al menos un biomarcador adicional fijado en su superficie, para detectar la presencia de autoanticuerpos específicos de AR en una muestra biológica, preferentemente anticuerpos antinucleares y anticuerpos anti CCP.
14. 16. Un biomarcador de artritis reumatoide, donde el biomarcador es:

    Un péptido de BRAF que tiene una secuencia de aminoácidos de menos de 50 aminoácidos que comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID 25 Nº 9, fragmentos de las mismas, y combinaciones de las mismas, y donde el biomarcador es reconocido por un autoanticuerpo anti-BRAF.
15. 17. Un kit de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 o una matriz de acuerdo con cualquiera de las

    reivindicaciones 13-15, donde los péptidos de PAD4 y los péptidos de calpastatina son péptidos de menos de 50 30 aminoácidos.