CN108033998B - 一个靶向镉离子的金属结合肽z3及其应用 - Google Patents

一个靶向镉离子的金属结合肽z3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于废水处理技术领域，具体涉及一个靶向镉离子的金属结合肽Z3及其应用的专利申请。金属结合肽序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：DYNYDRSDSRLT。本发明利用随机噬菌体十二肽库的筛选技术，得到了能与镉离子具有高亲和力的特异性结合的十二肽，进一步将该结合肽编码基因整合进入酿酒酵母后，利用酿酒酵母凝集素表面展示系统EBY100，将具有特异吸附镉离子的金属结合肽展示在其细胞壁的外表面，从而可以作为吸附剂加以应用。初步试验表明：每克湿菌体能够吸附257毫克的镉离子，每克干菌体能够吸附约2500‑3000毫克镉离子，表现出良好的应用效果，具备了一定的产业化应用前景。

Description

一个靶向镉离子的金属结合肽Z3及其应用
技术领域
本发明属于废水处理技术领域，具体涉及一个靶向镉离子的金属结合肽Z3及其应用的专利申请。
背景技术
在所有危害人类健康的剧毒物质中，美国毒物管理的委员会（ATSDR）把镉列在了第六位。由于隔对动物和人类具有致癌性，因此在环境污染治理中，如何消除包括镉在内的重金属水污染是令人头疼的世界性的难题。
传统的含镉废水处理工艺主要包括化学沉淀法（氢氧化物或硫化物）、离子交换法、铁氧体电解法、蒸发浓缩法和膜分离法等。但这些方法存在投资大、运行费用高、有局限性、工艺复杂、费用昂贵、产生二次污染等缺点，因此寻求高效、低廉、方便、环保的含镉废水处理技术已成为全世界化学、环境和生物学家共同努力的目标。
随着基因工程技术的出现，传统的微生物遗传育种方法被打破。研究发现，在各种动植物和微生物细胞内存在着对金属离子具有亲和力的蛋白质（肽），称为金属结合蛋白（肽），这种蛋白可与环境中的各种金属离子结合从而降低或消除对生物细胞的毒性。但进一步研究发现该技术也存在着局限性，主要原因是外源肽在细胞质内表达不稳定，半衰期短，容易被受体菌内蛋白酶水解，限制其在工业化中的应用。但由于该方法良好的生态环保性，因而仍是研究热点，也因此，寻找新的适于工业化应用的金属结合肽及生物处理废水方法，具有十分重要的应用意义。
发明内容
本申请主要目的是提供一个靶向镉离子的金属结合肽，利用该结合肽可制备微生物细胞表面吸附剂，从而可以实现对废水中镉离子的有效吸收和降解。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一个靶向镉离子的金属结合肽Z1，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.1所示，具体为： MHPNAGHGSLMR；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z1的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：ATGCATCCGAATGCGGGGCATGGTTCGCTTATGCGG。
一个靶向镉离子的金属结合肽Z2，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ADWYHWRSHSSS；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z2的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQ IDNO.4所示，具体为：GCTGATTGGTATCATTGGAGGTCTCATAGTAGTTCT。
一个靶向镉离子的金属结合肽Z3，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：DYNYDRSDSRLT；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQ IDNO.6所示，具体为：GATTATAATTATGATCGTTCGGATAGTGGTCTTACT。
一个靶向镉离子的金属结合肽Z4，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：GLHTWATNLYSM；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQ IDNO.8所示，具体为：GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTCGATG。
所述靶向镉离子的金属结合肽（Z1、Z2、Z3、Z4）在废水处理中的应用，可以靶向结合镉离子。
利用所述靶向镉离子的金属结合肽（Z1、Z2、Z3、Z4）编码碱基所构建的重组质粒（pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4）。
利用所述靶向镉离子的金属结合肽所制备的微生物吸附剂，通过将靶向镉离子的金属结合肽的编码碱基整合进入酿酒酵母基因组中制备获得；具体而言，将重组质粒pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4转化酿酒酵母后，进一步筛选、鉴定获得转基因酿酒酵母。
所述靶向镉离子的金属结合肽所制备的微生物吸附剂，为液体形态或固体形态，所述固体形态的微生物吸附剂，通过如下步骤制备获得：
（1）将含有金属结合肽编码碱基的酿酒酵母置于YPD培养基中，30℃、200 rpm摇菌培养至OD600约为0.6；
（2）将步骤（1）中菌液离心收集菌体后，将菌体转移至诱导培养基YNB-CAA培养基内，30℃、200 rpm过夜摇动培养，离心收集菌体，将菌体溶于无菌的蒸馏水中，将配置好的海藻酸钠包埋载体和蒸馏水重悬的酿酒酵母菌液混合均匀；
将混合好的液体以相同的速度滴加到无菌的氯化钙溶液中，造粒，20℃静止放置24 h；
（3）用无菌水对步骤（2）中造粒后固体（即固定化后细胞）清洗不少于三次，4℃放置保存备用即可。
固定化后酿酒酵母，呈颗粒状，观察表明：颗粒大小均匀、形状一致，直径在3-5 mm之间，且韧性较好，不易破裂。应用时，将固定化后转基因酿酒酵母置于含有镉离子的诱导培养基YNB-CAA中进行培养吸附即可。
微生物蛋白展示技术和基因工程技术的结合为水污染处理提供了一种新的解决途径。微生物展示技术是将编码目的肽（广义地包括多肽和蛋白）)的DNA片段通过基因重组的方法构建和表达在噬菌体外壳蛋白、细菌（外膜蛋白、菌毛及鞭毛）或酵母（糖蛋白）等微生物的表面，利用宿主细胞内蛋白转运系统将外源目的肽运送并锚定在外膜表面，可以有效实现结合肽在细胞表面的固定，由于这种细胞对金属离子的吸附主要源于细胞表面的金属结合肽，因此我们将其称为细胞表面吸附剂。
本发明利用随机噬菌体十二肽库的筛选技术，得到了能与镉离子具有高亲和力的特异性结合的十二肽，进一步将该结合肽编码基因整合进入酿酒酵母后，利用酿酒酵母凝集素表面展示系统EBY100，将具有特异吸附镉离子的金属结合肽展示在其细胞壁的外表面，从而可以作为吸附剂加以应用。初步试验表明：该细胞表面吸附剂对含镉量为7000mg/L的高浓度废水，每克湿菌体能够吸附257毫克的镉离子，每克干菌体能够吸附约2500-3000毫克镉离子。对含镉量为500mg/L及其该浓度以下的废水达到了100%的吸收率，表现出良好的应用效果，具备了一定的产业化应用前景。
附图说明：
图1为重组大肠杆菌116的单酶切验证结果，其中，M代表DNA Marker，1代表pYD1空质粒，2代表pYD1-Z1片段，3代表pYD1-Z2片段，4代表pYD1-Z3片段，5代表pYD1-Z4片段；
图2为重组大肠杆菌116的PCR验证结果，其中M代表DNA Marker，1代表Z1 PCR片段，2代表Z2 PCR片段，3代表Z3 PCR片段，4代表Z4 PCR片段；
图3为重组酿酒酵母验证结果；
图4为镉离子标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分生物材料、实验试剂等背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
大肠杆菌（Escherichia coli）2738，购自NEB公司，是M13噬菌体可以侵染的一种宿主菌，它是一种强F+菌株，该菌具有四环素抗性；
随机的十二肽噬菌体展示文库（phage display-12），购自NEB公司，该文库是将随机排列的十二个肽序列，整合至M13丝状噬菌体的表面衣壳蛋白上；
大肠杆菌（E.coli）116菌株，购自Epicentre公司；
酿酒酵母EBY100，是一种毕赤酵母菌株，属于真核细胞，为一种色氨酸的缺陷型的菌株，只能在YPD培养基中生长；购于北京中科质检生物技术有限公司；
pMD T Vector，该质粒为T克隆载体，用于TA克隆，具有氨苄青霉素（Ampicillin）抗性基因片段，从Takara公司购得；
pYD1质粒：该质粒用于与目的片段连接之后的遗传转化，具有氨苄青霉素（Kanamycin）抗性基因片段，并且它以及它的重组质粒具有合成色氨酸的基因；购于北京中科质检生物技术有限公司；
噬菌体测序所用引物来自噬菌体随机文库试剂盒（购于NEB公司）；
其他引物及相关测序工作由金维智生物科技有限公司提供完成；
本申请中所涉及引物序列有：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
实验试剂：
培养基类：
LB培养基、YPD培养基（用于培养酿酒酵母EBY100），按现有技术常规配制制备即可；
LB/IPTG/Xgal平板：用来进行噬菌体培养以及噬菌体的蓝斑形成；制备时，在100mL的LB培养基加入1.5 g的Yeast Extract（酵母提取物），高温除菌后当它逐渐冷却至低于70℃时，放入1 mL的IPTG/X gal，充分混和，制作平板，将平板4℃冰箱避光贮存备用；
MD选择性培养基（又称YNB培养基）：用于酿酒酵母转化子的筛选；制备时，配方为：0.67%的YNB（含(NH4)2SO4，不含氨基酸），2%葡萄糖，0.01%亮氨酸，过滤除菌；固体培养基需加入2%琼脂；使用时，加入0.01%色氨酸的YNB培养基用于培养酿酒酵母EBY100；
YNB-CAA培养基：用于培养和诱导重组后的EBY100的基因表达；制备时，配方为：称取0.67%YNB（含硫酸铵，不含氨基酸），0.5%酸水解酪素，固体加入2%琼脂，加蒸馏水溶解，121℃、30 min灭菌；使用过程中，培养重组的酵母菌时需加20%葡萄糖母液至终浓度2%，诱导表达时加20%半乳糖母液至终浓度2%；
增殖培养基：用于测定固定化处理后的酿酒酵母菌的吸附效率；配方为：3%的葡萄糖，0.15%的酵母粉，0.25%的NH4Cl，0.53%的K2HPO4，0.025%的MgSO4·7H2O，0.1%NaCl，柠檬酸调pH至5.0，高温灭菌；
顶层琼脂：用于噬菌体的培养，是指覆盖在固体培养基即平板上薄薄的一层低浓度的琼脂；制备时，分别称取1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母粉，0.5%NaCl，0.1% MgCl2·6H2O，0.7%琼脂粉，高温高压灭菌；因为顶层琼脂易凝固，当进行噬菌体培养时，预温顶层琼脂需保持于40℃左右；
LB-Tet平板：用于培养肽库噬菌体的宿主菌ER2738，在100 mL的液体LB培养基称取1.5 g的Yeast Extract（酵母提取物）加进去，高温灭菌，当培养基温度小于70℃的时候，加入100 μL Tet溶液，混和均匀后制作平板置于4℃避光保存；
抗生素类试剂：
涉及有：氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、四环素（Tetracycline，Tet）、卡那霉素（Kanamycin，Km），按现有常规技术制备成母液保存备用即可；
生物酶类：
EcoR I、Xhol I等限制性内切酶，购自于Fermentas公司；
质粒提取过程中用到的RNaseA酶，购于Merck company；
TaqDNA聚合酶和DNA扩增phusion酶，购于上海市莱枫生物；
solutionI连接酶，购自Takara公司；
其他试剂：
DNA Leader Marker，购买于全式金生物技术有限公司（北京）；
SS-DNA，购自索莱宝公司的鲑鱼精DNA，是一种单链DNA；
TBS、PEG/NaCl（20%（w/v）PEG-8000，2.5 mol/L的 NaCl）、IPTG/Xgal溶液、低浓度咪唑（20 mmol/L）、高浓度咪唑（200 mmol/L）、10%SDS溶液、溶液I（0.05 mol/L的葡萄糖，0.025 mol/L的Tris-HCl）、溶液II（1%的SDS，0.2 mol/L NaOH）、溶液III（质量分数29.44%的乙酸钾，体积分数11.5%的冰乙酸）、酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1）、TE/RNaseA溶液（将2 µL 10 mg/mL的RNaseA母液加入至1 mL TE溶液）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），l mmol.L-1EDTA（pH8.0））等，均为现有技术中常用试剂，常规配制即可。
实施例1
本实施例主要就镉离子金属结合肽的筛选获得过程简要介绍如下。
（一）首先制备镉离子螯合树脂
首先，在无菌超净台中取150 µL镍离子螯合树脂于1.5 ml的EP管中，10000 rpm离心10min，弃上清液；加入5ml的30 μg/mL CdSO4溶液；
在螯合树脂中放入500µL的TBS洗涤，8000 rpm离心5 min，弃上清；
螯合树脂中加入1 ml的0.5mol/L的EDTA（pH为8.0），8000 rpm离心5 min，弃上清；
在树脂中加入0.5 ml的0.1% TBST，12000 rpm离心5 min，弃上清液；
在每个EP管中加入等体积的TBST，吹打悬浮树脂，快速分装到新的EP管中，每管含有树脂混合液200 µL，放于4℃冰箱保存。
此即为镉离子螯合数脂（M+），同时以灭菌超纯水处理的树脂作为对照（M-）。
本申请中所采用的树脂为Ni-NTA Agarose树脂，上述操作后（对树脂进行TBS、TBST以及EDTA的洗涤），经过EDTA与Ni离子的结合，树脂由原来的蓝色变为无色，经洗涤除去EP管中的EDTA后，再次加载Cd2+。
（二）镉离子金属结合肽的筛选
将步骤（1）中所制备镉离子螯合树脂加入到噬菌体随机十二肽库（New EnglandBiolabs公司产品）中，进行多轮亲和筛选富集，洗去未吸附的或非特异结合的噬菌体，从肽库中筛选到与镉离子螯合树脂进行特异性结合的噬菌体，具体过程简介如下。
（1）对噬菌体文库的淘洗操作
（A）取100μL M+、M-树脂各一支，在EP管中分别加入1000 μL的 0.1 % TBST（pH7.4），12000 rpm离心，弃上清，清洗2遍；
然后在M+、M-树脂中分别加入噬菌体肽库（2×1011 pfu/mL）10 μL，25℃、100 rpm共温育1 h，温育结束后，4℃、2000 rpm离心30 s，小心地弃去上清液；
加入1000 μL 、0.1% TBST，100 rpm震荡1 min，4℃、2000 rpm离心30 s，倾倒上清，重复两次；
加入1000 μL 、0.1% TBST，4℃、2000 rpm离心30 s，弃去上清液，重复清洗5次；
加入300 μL、200 mmol的 ID溶液，25℃、100 rpm震荡孵育20 min；之后4℃、2000rpm离心30 s，吸取上清液到干净的EP管中，重复此操作一次；
合并2次淘洗液，并测定噬菌体滴度，计算P/N值；
（B）扩增洗脱物，测定扩增后的噬菌体滴度，进行第二轮的筛选；
（C）第三轮筛选时，先用1000 μL、0.3% TBST清洗4次；
加入500 μL、20 mmol的 ID溶液清洗4次，4℃、2000 rpm离心30 s，弃上清；
加入1000 μL、0.3% TBST清洗8次，4℃、2000 rpm离心30 s；
加入300 μL、200 mmol ID溶液，25℃、100 rpm摇床20 min，4℃、2000 rpm离心30s，取上清，重复此操作步骤2次；
最后合并2次淘洗液，测定淘洗下来的噬菌体的滴度，计算其P/N值；
（2）扩增淘洗液，测定淘洗下来的噬菌体滴度，可根据需要替代原来的噬菌体库继续进行淘洗。
上述操作中，对于洗脱液的扩增，可参考如下操作步骤：
（1） 挑取ER2730单菌落于LB-Tet培养基里，过夜摇菌，第二天，把培养物按照1：100的比例接种于20 mL的 LB液体培养基中，培养至对数前期；
（2）取10 µL的噬菌体淘洗液加进步骤（1）的20 mL的ER2730菌液中，37℃摇菌4.5h（前1 h转速为80 rpm，后3.5 h转速调至150 rpm）；
将培养物4℃、10000 rpm离心10 min，吸取上清（可重复离心一次）；
将上清液的80%吸出置于干净的EP管中，计算体积后，取其1/6体积的PEG/NaCl加入其中，4℃置放不少于60 min（最好过夜），使上清液中的噬菌体得到沉淀；
将沉淀好的噬菌体4℃、12000 rpm离心20 min，去上清后再离心30 s，搜集沉淀；
（3）用1 mL的TBS把步骤（2）中沉淀物重新悬浮，并转移到新的无菌EP管，4℃、14000 rpm离心5 min，使残余的大肠杆菌细胞沉淀完全，取上清；
将上清液转入干净EP管，加入上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液（以进行二次沉淀），将溶液体系冰上放置1 h后，12000 rpm离心15 min，弃上清液；
用200 µL的TBS将沉淀物重新悬浮，4℃、10000 rpm离心1 min，使杂质得到沉淀；将的上清移进干净的EP管中，此即为扩增后的洗脱物，可直接进行后续反应或置于4℃保存备用。
上述操作中，噬菌体滴度测定，可参考如下操作步骤
（A） 挑取ER2730的单菌落置于5 mL的LB培养基中，37℃、200 rpm摇动培养至对数中期（OD约为0.5）；
（B）用微波炉加热融化上层琼脂，把它分装于灭菌的试管中，每份为3 mL，每个噬菌体的稀释度一管，并将其放在45℃左右的恒温箱里，避免凝固；
倒LB/IPTG/Xgal平板，37℃预温处理，各个噬菌体的稀释梯度需要准备一个平板；
（C） 用LB稀释得到的噬菌体，稀释范围为：
扩增过的噬菌体的培养液的稀释度为108、109、1010、1011，
未扩增的淘选的噬菌体淘洗物的稀释度为101、102、103、104；
各个噬菌体的稀释度做3个平行；
（D） 把步骤（1）中培养至对数中期的大肠杆菌ER2738菌液分装于1.5 mL的EP管中，每管 200 µL，各个噬菌体的稀释度需要准备一管；
将稀释好的噬菌体用移液枪各取10 µL，加到分装有大肠杆菌ER2738菌液的离心管中，快速震荡混匀，室温温育5 min；
（E）将感染大肠杆菌ER2738后的噬菌体加入到45℃预热的上层琼脂培养管中，每次一管，将菌体混合液与顶层琼脂迅速混合后并且马上倾倒在LB/IPTG/Xgal平板上，轻晃平板使上层琼脂摊开，平板放在工作台中冷却5 min， 37℃培养箱中培养过夜；
观察平板，计数每个平板上的蓝色噬菌斑的数目。
上述操作中，对于噬菌斑的扩增，可参考如下操作步骤：
（1） 从LB-Tet平板上用牙签挑取大肠杆菌ER2738的单菌落，接种在LB-Tet培养基里，37℃、200 rpm摇动培养；
（2）按1:100体积比例，用LB培养液稀释步骤（1）的培养液，分装到无菌试管中，每管1 mL；
用灭过菌的牙签或者是吸头在过夜的蓝斑总量不超过100个的IPTG/Xgal平板上挑取蓝色噬菌斑，接种上述无菌试管中，37℃摇床培养4.5 h（前半个小时需要慢摇）；
（3）将培养好的噬菌体转入到已灭菌的1.5 mL的EP管里，5000 rpm离心30 s，在超净台里吸取上清液至新的无菌的EP管中，二次离心后及为扩增所得噬菌斑，即可进行进一步实验，或者进行短期或长期保存备用；
短期保藏时，可吸取上清液的80%至新的EP管中，将此噬菌体悬液置于4℃，可保存几个月；或者将得到的噬菌体贮液与甘油以1：1的比例混匀置于-20℃可长期贮存。
上述操作过程中，噬菌体淘洗的过程中，每一轮都要对M-淘洗下来的噬菌体和M+淘洗下来的噬菌体进行滴度的测定，并且算出二者的比值即P/N值，以此作为判断筛得噬菌体特异性高低的依据。对每一次M+筛得的噬菌体进行扩增，代替原来的噬菌体库进行下一次的淘选实验。对扩增过的噬菌体也要进行噬菌体滴度的测定，以保证在每一轮的筛选时加入的噬菌体浓度不变（每一次进行的噬菌体扩增的过程都是一次富集目的结合肽的过程，保证每一次筛选开始时都具有相同的噬菌体浓度，就会使得表达该段特异性序列的这种噬菌体在库中的量持续增加）。
一般在P/N值到达50或60以上时，就可得到特异性的序列，此时即可挑选噬菌体进行测序。筛选结果表明，在第一轮第二轮筛选过程中，噬菌体克隆得到了富集，特异性逐渐增强，在第三轮中筛得的噬菌体具有较强的特异性，其P/N值达到了56，说明在这一轮筛得的结合肽对重金属离子Cd2+具有较强亲和力，可以特异性结合。第三轮淘洗后噬菌体稀释液产生蓝斑个数结果如下表所示：
Figure 598808DEST_PATH_IMAGE002
。
（三）对镉离子结合肽进行测序鉴定
为保证每个被挑选的噬菌斑仅含有一个DNA序列，将个数不足100的噬菌体双层平板进行ELISA鉴定，对阳性单克隆噬菌体经扩增后，提取噬菌体单链DNA进行测序（金唯智公司完成），获得其基因序列。
对第三轮淘洗得到的噬菌体进行测序分析，结果获得与镉离子亲和的金属结合肽；即，共获得4条多肽序列，具体如下：
靶向镉离子的金属结合肽Z1，包含12个氨基酸，多肽序列如SEQ ID NO.1所示，具体为： MHPNAGHGSLMR；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z1的编码碱基，包括36个碱基，碱基序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：ATGCATCCGAATGCGGGGCATGGTTCGCTTATGCGG；
靶向镉离子的金属结合肽Z2，包含12个氨基酸，多肽序列为：ADWYHWRSHSSS；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z2的编码碱基，包括36个碱基，具体为：GCTGATTGGTATCATTGGAGGTCTCATAGTAGTTCT；
靶向镉离子的金属结合肽Z3，包含12个氨基酸，多肽序列为：DYNYDRSDSRLT；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，具体为：GATTATAATTATGATCGTTCGGATAGTGGTCTTACT；
靶向镉离子的金属结合肽Z4，包含12个氨基酸，多肽序列为：GLHTWATNLYSM；
所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码碱基，包括36个碱基，具体为：GGTTTGCATACTTCGGCTACTAATCTGTATTCGATG。
实施例2
在实施例1获得镉离子金属结合肽基因序列基础上，本实施例主要介绍一下将该基因整合进入酿酒酵母细胞、并制备镉离子吸附剂的相关实验。
（1）构建质粒载体
根据步骤（1）中获知的十二肽金属结合序列，人工合成对应的碱基序列，将该基因片段与双酶切后pYD1质粒（EcoR
Figure DEST_PATH_IMAGE003
与Xho
Figure 457174DEST_PATH_IMAGE003
双酶切）进行连接，并转化大肠杆菌116，分别构建重组质粒pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4。
对转化产物进行阳性抗性筛选后，小量抽提质粒，进行酶切验证（结果如图1所示），然后进行菌落PCR验证（结果如图2所示），显示条带分别在5kb与0.4kb左右，测序验证说明得到目的条带基因序列正确，大量抽提质粒备用。
（2）转化酿酒酵母EBY100
利用醋酸锂转化法，将步骤（1）中所构建重组质粒携转入酿酒酵母EBY100中，在缺少色氨酸的筛选平板筛选出转化子，菌落PCR检验和测序验证后，确保镉离子金属结合肽基因序列正确整合进入酿酒酵母中，具体过程如下。
首先，采用醋酸锂法制作酿酒酵母EBY100感受态细胞备用（酿酒酵母EBY100用YPD液体培养基培养）。
其次，采用热激法，将步骤（1）中所构建重组质粒转入上述所制备的酿酒酵母EBY100感受态细胞中，具体步骤为：
取一管分装好的酿酒酵母感受态，在EP管里分别加重组质粒（重组质粒pYD1-Z1、pYD1-Z2、pYD1-Z3、pYD1-Z4分别操作）10 µL，鲑鱼精DNA 10 µL，1×LiAc/10%PEG-3350/1×TE 700 µL，将它们混合均匀；
打开水浴锅，调至30℃温育30 min；
将水浴锅调至42℃，在EP管中加入88 µL的DMSO，混合均匀，立即放入42℃热激7min，之后，4000 rpm转速离心1 min，弃取上清液，收集菌体；
加入1 ml 1×TE重悬菌体，4000 rpm转速离心1 min，弃去上清，再用100 µL的1×TE重悬菌体。
在缺少色氨酸的MD筛选平板（含2%琼脂的MD选择性培养基）进行筛选，具体而言：
在4℃冰箱取出准备好的MD筛选平板，取50 µL转化菌液涂布于MD平板，30℃倒置培养72 h。筛选转化子。
质粒pYD1或是基于此质粒的重组质粒上具有操控色氨酸合成的基因，所以重组质粒转入EBY100后，重组的酿酒酵母菌就会具有合成色氨酸的能力。EBY100不能在缺少色氨酸的培养基里生长，而重组EBY100含有pYD1质粒，能够在缺少色氨酸的培养基里生长，以此来筛选转化子。实际操作中，在对酵母菌感受态进行醋酸锂热激转化后，转化液涂布于筛选平皿2天左右后，可形成肉眼可见的菌落。初步确定阳性转化子的出现，并且进行进一步PCR验证。
对转化子进行菌落PCR（结果如图3所示），得到目的条带在0.4kb左右，大小正确。将目的片段回收，连T载体后送去测序，经过比对，镉离子金属结合肽基因序列完全正确。
实施例3
本实施例主要介绍一下对于废水中镉离子的实际吸附效果实验。
首先，绘制镉离子标准曲线（如图4所示），在1至10 μg/mL范围内得到线性方程Y=0.733X-0.023，其中R为0.99984，说明线性关系良好。
其次，将实施例2中所制备鉴定正确的转基因酿酒酵母直接或者固定化后进行镉离子吸附，并对吸附效率的测定。
酿酒酵母直接进行镉离子吸附及镉离子吸附效率的测定，参考如下步骤进行操作：
（1）将酿酒酵母（或转基因酿酒酵母）接种于YNB平板中（EBY100需要在YNB培养基中添加色氨酸），30℃静置培养48 h；
在平板上挑取单菌落，接种于YNB培养基里，30℃、200 rpm摇床培养到OD600为0.6左右；
（2）将菌液转移至离心管中，离心收集菌体，把菌体转移至诱导培养基YNB-CAA培养基里，30℃、200 rpm过夜摇动；
将酵母菌悬浮于诱导培养基YNB-CAA培养基（配方为：0.67 % YNB，0.5 % 酸水解酪素，2 %半乳糖）里，并且在培养基里加入0.7 g镉离子（采用CdSO4盐），30℃、2000 rpm培养1 d；
（3）将菌液转移至离心管中，10000 rpm离心，吸取上清液，测定上清液体积，根据镉离子标准曲线计算镉离子浓度，计算吸附率。
将酿酒酵母（或转基因酿酒酵母）直接与镉离子共同培养进行吸附后，吸附24 h后，对酵母菌进行离心分离，测定上清液剩余体积、菌体湿重量以及上清液中镉浓度。在各个样品测定时，加标回收率在95%到105%之间。结果表明，重组后的酿酒酵母菌对镉离子的吸附效率得到提高，改良效果明显。具体吸附效果参见下表数据：
酿酒酵母吸附能力测定结果：
Figure 55645DEST_PATH_IMAGE004
。
从表中可以看出，原始菌株对镉离子也有较强的的吸附力，吸附率可以达到189mg/g。但与原始菌株EBY100比较，转化后的菌株对个粒子的吸附率均有提高，与原始菌株EBY100相比，镉离子的吸附效率提高了14.29-46.56%。该细胞表面吸附剂对含镉量为7000mg/L的高浓度废水，每克湿菌体能够吸附200-257毫克的镉离子，每克湿菌体能够吸附约2500-3000毫克菌体。对含镉量为500mg/L及其该浓度以下的废水达到了100%的吸收率，对镉离子废水的吸附效率效果非常好，具有良好的应用前景。
进一步地，可将上述液体形式的转基因酿酒酵母进行固定化，以便于进行应用，固定化时，具体参考如下步骤进行操作：
（1） 取菌液，于YNB培养基里培养36 h进行活化，挑取单菌落接种在YPD培养基里，30℃、200 rpm过夜培养；
以2%的接种量，接种于100 mL的YPD培养基中，30℃、200 rpm摇菌至OD600约为0.6；
（2）将菌液转移至离心管中，离心收集菌体，把菌体转移至诱导培养基YNB-CAA培养基里，30℃、200 rpm过夜摇动；
收集过夜培养后的菌体，用移液枪轻轻吹打让它溶于1 mL无菌的蒸馏水中，将配置好的海藻酸钠包埋载体和蒸馏水重悬的酵母菌液混合均匀；
将混合好的液体转移至无菌的注射器中，以相同的速度滴加到无菌的氯化钙溶液中，造粒，20℃静止放置24 h；
（3）用无菌水对步骤（2）中固定化细胞清洗不少于三次，4℃放置保存备用即可。
固定化后酿酒酵母，呈颗粒状，观察表明：颗粒大小均匀、形状一致，直径在3-5 mm之间，且韧性较好，不易破裂。应用时，将固定化后转基因酿酒酵母置于含有镉离子的诱导培养基YNB-CAA中进行培养吸附即可。初步应用效果表明，固定化后酿酒酵母仍然保持了较好地去除镉离子能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一个靶向镉离子的金属结合肽Z3及其应用
<130> none
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met His Pro Asn Ala Gly His Gly Ser Leu Met Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcatccga atgcggggca tggttcgctt atgcgg 36
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Asp Trp Tyr His Trp Arg Ser His Ser Ser Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgattggt atcattggag gtctcatagt agttct 36
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Asp Tyr Asn Tyr Asp Arg Ser Asp Ser Arg Leu Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gattataatt atgatcgttc ggatagtggt cttact 36
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Leu His Thr Trp Ala Thr Asn Leu Tyr Ser Met
1 5 10
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtttgcata cttcggctac taatctgtat tcgatg 36

Claims (6)

1.一个靶向镉离子的金属结合肽Z3，其特征在于，其氨基酸序列为：DYNYDRSDSRLT。
2.权利要求1所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因，其特征在于，包括36个碱基，基因序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
GATTATAATTATGATCGTTCGGATAGTGGTCTTACT。
3.权利要求1所述靶向镉离子的金属结合肽Z3在废水处理中的应用，其特征在于，靶向结合镉离子。
4.利用权利要求2所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因所构建的重组质粒pYD1-Z3。
5.利用权利要求2所述靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因所制备的微生物吸附剂，其特征在于，通过将靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因整合进入酿酒酵母基因组中制备获得。
6.如权利要求5所述利用靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因所制备的微生物吸附剂，其特征在于，所述利用靶向镉离子的金属结合肽Z3的编码基因所制备的微生物吸附剂，为液体形态或固体形态，所述固体形态的微生物吸附剂，通过如下步骤制备获得：
（1）将含有金属结合肽Z3编码基因的酿酒酵母置于YPD培养基中，摇菌培养；
（2）将步骤（1）中菌液离心收集菌体后，将菌体转移至诱导培养基YNB-CAA培养基内，过夜培养，离心收集菌体，将菌体溶于无菌的蒸馏水中，将配置好的海藻酸钠包埋载体和蒸馏水重悬的酿酒酵母菌液混合均匀；
将混合好的液体匀速滴加到无菌的氯化钙溶液中，造粒，静止放置；
（3）用无菌水对步骤（2）中造粒后固体清洗。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE10050873A1 (de) * 2000-10-11 2002-04-25 Fraunhofer Ges Forschung Metallbindende, proteinhaltige Verbindungen, Verfahren zu deren Gewinnung und ihre Verwendung
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