CN108530520B - 一种锰离子结合肽及其筛选方法、亲和性能的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环保领域，具体涉及锰离子结合肽，与锰离子有高度的亲和力，应用于环境金属污染中锰离子的生物修复。本发明提供锰离子结合肽的筛选方法，利用噬菌体肽库展示筛选出与锰离子特异性结合最强的肽；以噬菌体随机十二肽库为基础，利用含四环素的LB培养基筛选出具有四环素抗性的大肠杆菌ER2738作为噬菌体的宿主细胞，通过去除Ni2+的Ni‑NTAagarose树脂的淘洗，能够筛选出对锰离子专一亲和力的噬菌体多肽。本发明提供锰离子结合肽亲和性能的检测方法，通过酶联免疫法，测定快速准确的比较不同噬菌体多肽对锰离子的亲和能力,且通过这种方法将锰离子结合肽快速的应用于环境锰污染的治理。

Description

一种锰离子结合肽及其筛选方法、亲和性能的检测方法
技术领域
本发明属于环保领域，具体涉及一种锰离子结合肽及其筛选方法、亲和性能的检测方法。
背景技术
锰离子结合肽是一种金属结合肽，在现代科技中金属结合肽应用于环境的重金属污染治理，由于其效果明显、效率高、成本低，逐渐取代物理修复和化学修复，成为当前治理环境重金属污染不可或缺的途径之一。金属离子结合肽是通过与环境中的金属离子以化学作用形成复合物从而降低，富集或者消除金属离子对生物细胞的毒性。
锰污染是指锰对环境的污染，空气中超过500微克/立方米可造成锰中毒，水中二价锰对人、畜和水生生物的毒性很小，地表水一般为8微克/立方米，土壤中锰含量平均值为1000ppm。而锰污染通过锰离子结合肽的方式治理的方式，还未实现。如何获得高亲和力的锰离子结合肽(结合分子)以及得到与特殊靶分子高效结合的肽类配体，是本领域人员亟须解决的问题。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种锰离子结合肽，这种锰离子结合肽与锰离子有高度的亲和力，应用于环境金属污染中锰离子的生物修复。
本发明的另一个目的是提供一种锰离子结合肽的筛选方法，利用噬菌体肽库展示筛选出与锰离子特异性结合最强的肽；以噬菌体随机十二肽库为基础，利用含四环素的LB培养基筛选出具有四环素抗性的大肠杆菌ER2738作为噬菌体的宿主细胞，通过去除Ni2+的Ni-NTAagarose树脂的淘洗，能够筛选出对锰离子专一亲和的噬菌体多肽。
本发明的再一个目的是提供一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法，通过酶联免疫法比较不同噬菌体多肽对锰离子的亲和能力，高效、快速方便。
本发明技术方案如下：
本发明提供一种锰离子结合肽，其序列中包括有DXXD、HXHH或PXXP，所述X代表任何氨基酸。
本发明优选的技术方案中，锰离子结合肽，包括如下序列多肽的一种或者两种以上的组合；
SEQIDNO.1:DYHDPSRLRCGR、
SEQIDNO.2:DYHDPSRLRWGR、
SEQIDNO.3:DHHDPSQHTLRK、
SEQIDNO.4:DYHDPSPPTLRK、
SEQIDNO.5:DYHDPSLPTLRK、
SEQIDNO.6:LESMITQSNRIN、
SEQIDNO.7:GNNPLHVHHDKR、
SEQIDNO.8:GHGPHRFDKWIQ、
SEQIDNO.9:ADTVDSCLANSH、
SEQIDNO.10:DYHDPSSPTLRK。
本发明的另一个目的是一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，筛选四环素抗性的大肠杆菌，将Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+，添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育，洗脱，洗脱物滴度测定，洗脱物扩增，扩增物滴度测定，确定第二轮筛选噬菌体的投放量，第二轮筛选，重复多轮筛选，菌斑扩增，快速纯化。
其中，所述Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+的方法为:吸取0.3-0.8mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,3500-4500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.1％-0.5％的TBST清洗3次后，加入1-3mL的MnCl2，存放于2-4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.1％-0.5％的TBST洗3次后得到无色树脂。
本发明优选的锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，
(1)筛选四环素抗性的大肠杆菌：在LB培养基中加入四环素，培养大肠杆菌，并制作大肠杆菌的生长曲线；
(2)Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+：吸取0.3-0.8mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,3500-4500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0，浓度为0.5mol/L的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.1％-0.5％的TBST清洗3次后，加入1-3mL，浓度为0.2g/L的MnCl2，存放于2-4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.1％-0.5％的TBST洗3次后得到无色树脂；
(3)添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育：取(2)得到的无色树脂添加0.5-1mL的BSA，2-4℃，转速150-200封闭慢摇1-3h，2000-5000r/min离心，去除上清液后，加入70-100μL的TBST，10-30μL的噬菌体随机十二肽库原始文库混匀，2-4℃，150-200转孵育1-3h，2000-3000r/min离心去除上清液，得到孵育液；
(4)洗脱：取300-500μL浓度为0.2mol/L,pH2.2的Gly加入(3)得到的孵育液中，3000-4000r/min离心1-3min，吸取上清液于无菌容器中，重复洗脱步骤，收集合并两次上清液得到洗脱物；
(5)洗脱物滴度测定：取8-10μL洗脱物，用TBS进行十倍稀释，稀释范围为101-104；
将培养到对数中期的ER2738菌液，分成每管200-400μL于无菌离心管中，共8管，取稀释后的洗脱物5-10μL依次加入菌液中，颠倒混匀，室温温育1-5min；提前融化顶层琼脂放置于35-45℃的水浴中预温，添加感染细菌于顶层琼脂中，每次一管，快速颠倒混匀后立刻倾注于35-40℃预温的LB/IPTG/X-gal平板中，适当倾斜平板以便于将顶层琼脂均匀铺开；待平板冷却后，用封口膜处理平板，以防止染菌；35-45℃暗培养过夜；待菌落成熟后，计算每个平板的菌落数，选取噬菌斑数约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每5-10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度；
(6)洗脱物扩增：预先培养ER2738单菌至对数期，2-4℃离心，取上清液，加入NaCl，沉淀噬菌体；低温离心，去除上清液，再短暂离心吸取残余上清液，沉淀物重悬于TBS中，悬液转入新的离心管中，低温使残留的细胞沉淀，二次上清液转入新管中，添加1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育，低温离心，弃上清再短暂离心，吸取去除残余上清液，沉淀物重悬于NaN3中，2-4℃离心1-3min，沉淀所有的残余不溶物，上清转移到新管中，2-4℃保存，得到扩增物；
(7)扩增物滴度测定：与洗脱物的滴度测定方法相同，扩增物的浓度梯度稀释改为101-1011,取108-1011的梯度进行扩增物的滴度测定；
(8)第二轮筛选噬菌体投放量的确定：选取噬菌斑数目约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度，根据所得的滴度确定下一轮进行筛选的噬菌体的投放量；
(9)二轮筛选：按洗脱、扩增、收集的步骤进行第二轮的筛选，所使用的TBST含有的Tween-20的体积浓度为0.5％-1％；
(10)多轮筛选：同第二轮的方法一样，进行多轮筛选，直至第五轮筛选得到洗脱物；从第三轮至第五轮的所有滴度中挑出色深，块大的蓝斑，即得到噬菌斑，其余洗脱物2-4℃保藏；
(11)噬菌斑的扩增：将大肠杆菌ER2738以1:100稀释于LB培养基中，准备1mL稀释后的大肠杆菌，加入选取的色深块大的噬菌斑，35-38℃摇床培养4.5-5h，得到噬菌斑扩增物；
(12)快速纯化：将(11)中的噬菌斑扩增物离心，取400-600μL含噬菌体上清液，加入100-200μL的PEG/NaCl，混匀，室温静置5-15min，4000-6000r/min离心5-10min，弃上清，2000-4000r/min进行短暂离心，吸去残余上清液，添加60-100μL碘化物缓冲液，使沉淀物彻底重悬于，加入200-300μL乙醇，室温温育5-15min，4000-6000r/min离心5-10min，弃上清，再用50-80％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥，沉淀重悬于20-50μL的TE，1-3mMEDTA中，即得到锰离子结合肽。将得到的锰离子结合肽进行35S或33p标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。
本发明再一个目的是提供一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法，采用ELISA法测定，将靶分子与噬菌体结合的复合物，加入HRP标记的抗-M13抗体，再加入底物显色反应，置于波长为405-415段的吸光值，吸光值越大，亲和能力越强；所述靶分子为包含有重金属离子的溶液，所述重金属离子为Mn2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+或其它重金属离子的其中一种。
本发明锰离子结合肽亲和性能的检测方法应用于环境中锰离子的定量与定性分析。
本发明优选的技术方案中，锰离子结合肽亲和性能的检测方法，包括如下步骤，
(1)用100-200μL浓度为100μg/mL的靶分子溶于0.1-0.3mol/L pH8.6 NaHCO3中包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆的一排包被板，在密封的湿盒中2-4℃包被过夜；
(2)甩出多余靶分子溶液，再倒置拍甩出去残液，每孔加封阻液，未包被的一排待也应加入封阻液，用来检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力；
(3)甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均将板倒置在干净的纸巾上，拍甩去除洗液，Tween浓度应与淘洗清洗步骤的浓度相同；
(4)在单独的封阻板中每孔预先加入浓度为150-240μL的TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒因子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至12孔2×105个病毒因子；
(5)将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温震荡1-2h；
(6)用1×TBS/Tween洗板6次；
(7)取新的ELISA板，添加封阻液；以1:4000-1:6000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔再加入150-250μL稀释的抗-M13抗体，室温震荡1-3h；
(8)用1×TBS/Tween洗板6次；
(9)往ELISA板的每个孔中加入150-250μL底物溶液，室温作用10-60min；
(10)用读板仪记录405-415处的吸光值。
本发明所述锰离子结合肽应用于环境金属污染中锰离子的生物修复，生物治理。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明锰离子结合肽经检测与锰离子有高度的亲和力，实验数据可证明，且在本发明之前未见报道类似或相同的多肽，能适用于环保领域。
2.本发明利用噬菌体肽库展示筛选出与锰离子特异性结合最强的肽；以噬菌体随机十二肽库为基础，利用含四环素的LB培养基筛选出具有四环素抗性的大肠杆菌ER2738作为噬菌体的宿主细胞，通过去除Ni2+的Ni-NTAagarose树脂的淘洗，通过这种方法能够筛选出对锰离子专一亲和力的噬菌体多肽。
3.本发明利用酶联免疫法检测锰离子结合肽结合锰离子的亲和力，检测快速简便准确，且通过这种方法，将锰离子结合肽与环境中的锰离子结合，从而实现环境中锰离子快速定性定量分析，置于环境中，不会造成二次污染，实现环境重金属污染的有效，简便和低费用处理。
附图说明：
图1为大肠杆菌ER2738生长曲线图；
图2为噬菌斑扩增效果图；
图3为噬菌体单链DNA琼脂糖凝胶电泳效果图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
一种锰离子结合肽，序列中包括有DXXD、HXHH或PXXP，所述X代表任何氨基酸。
具体的锰离子结合肽，包括如下序列多肽的一种或者两种以上的组合；
SEQIDNO.1:DYHDPSRLRCGR、
SEQIDNO.2:DYHDPSRLRWGR、
SEQIDNO.3:DHHDPSQHTLRK、
SEQIDNO.4:DYHDPSPPTLRK、
SEQIDNO.5:DYHDPSLPTLRK、
SEQIDNO.6:LESMITQSNRIN、
SEQIDNO.7:GNNPLHVHHDKR、
SEQIDNO.8:GHGPHRFDKWIQ、
SEQIDNO.9:ADTVDSCLANSH、
SEQIDNO.10:DYHDPSSPTLRK。
以上序列的多肽与锰离子具有高强度的亲和能力，以上多肽序列经NCBI的非冗余蛋白质序列数据库(Non-redundantproteinsequencedatabase)BlastP进行比对，结果未发现与其他已知的金属蛋白或结构域存在着任何同源性序列。ClustalX多重序列比对发现锰离子结合肽含有DXXD、HXHH、PXXP模式序列。
一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，筛选四环素抗性的大肠杆菌，将Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+，添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育，洗脱，洗脱物滴度测定，洗脱物扩增，扩增物滴度测定，确定第二轮筛选噬菌体的投放量，第二轮筛选，重复多轮筛选，菌斑扩增，快速纯化。
其中，所述Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+的方法为:吸取0.3-0.8mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,3500-4500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.1％-0.5％的TBST清洗3次后，加入1-3mL的MnCl2，存放于2-4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.1％-0.5％的TBST洗3次后得到无色树脂。
一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，
(1)筛选四环素抗性的大肠杆菌：在LB培养基中加入四环素，培养大肠杆菌，并制作大肠杆菌的生长曲线；
(2)Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+：吸取0.3-0.8mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,3500-4500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0，浓度为0.5mol/L的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.1％-0.5％的TBST清洗3次后，加入1-3mL，浓度为0.2g/L的MnCl2，存放于2-4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.1％-0.5％的TBST洗3次后得到无色树脂；
(3)添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育：取(2)得到的无色树脂添加0.5-1mL的BSA，2-4℃，转速150-200封闭慢摇1-3h，2000-5000r/min离心，去除上清液后，加入70-100μL的TBST，10-30μL的噬菌体随机十二肽库原始文库混匀，2-4℃，150-200转孵育1-3h，2000-3000r/min离心去除上清液，得到孵育液；
(4)洗脱：取300-500μL浓度为0.2mol/L、pH2.2的Gly加入(3)得到的孵育液中，3000-4000r/min离心1-3min，吸取上清液于无菌容器中，重复洗脱步骤，收集合并两次上清液得到洗脱物；
(5)洗脱物滴度测定：取8-10μL洗脱物，用TBS进行十倍稀释，稀释范围为101-104；
将培养到对数中期的ER2738菌液，分成每管200-400μL于无菌离心管中，共8管，取稀释后的洗脱物5-10μL依次加入菌液中，颠倒混匀，室温温育1-5min；提前融化顶层琼脂放置于35-45℃的水浴中预温，添加感染细菌于顶层琼脂中，每次一管，快速颠倒混匀后立刻倾注于35-40℃预温的LB/IPTG/X-gal平板中，适当倾斜平板以便于将顶层琼脂均匀铺开；待平板冷却后，用封口膜处理平板，以防止染菌；35-45℃暗培养过夜；待菌落成熟后，计算每个平板的菌落数，选取噬菌斑数约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每5-10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度；
(6)洗脱物扩增：预先培养ER2738单菌至对数期，2-4℃离心，取上清液，加入NaCl，沉淀噬菌体；低温离心，去除上清液，再短暂离心吸取残余上清液，沉淀物重悬于TBS中，悬液转入新的离心管中，低温使残留的细胞沉淀，二次上清液转入新管中，添加1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育，低温离心，弃上清再短暂离心，吸取去除残余上清液，沉淀物重悬于NaN3中，2-4℃离心1-3min，沉淀所有的残余不溶物，上清转移到新管中，2-4℃保存，得到扩增物；
(7)扩增物滴度测定：与洗脱物的滴度测定方法相同，扩增物的浓度梯度稀释改为101-1011,取108-1011的梯度进行扩增物的滴度测定；
(8)第二轮筛选噬菌体投放量的确定：选取噬菌斑数目约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度，根据所得的滴度确定下一轮进行筛选的噬菌体的投放量；
(9)二轮筛选：按洗脱、扩增、收集的步骤进行第二轮的筛选，所使用的TBST含有的Tween-20的体积浓度为0.5％-1％；
(10)多轮筛选：同第二轮的方法一样，进行多轮筛选，直至第五轮筛选得到洗脱物；从第三轮至第五轮的所有滴度中挑出色深，块大的蓝斑，即得到噬菌斑，其余洗脱物2-4℃保藏；
(11)噬菌斑的扩增：将大肠杆菌ER27381:100稀释于LB培养基中，准备1mL稀释后的大肠杆菌，加入选取的色深块大的噬菌斑，35-38℃摇床培养4.5-5h，得到噬菌斑扩增物；
(12)快速纯化：将(11)中的噬菌斑扩增物离心，取400-600μL含噬菌体上清液，加入100-200μL的PEG/NaCl，混匀，室温静置5-15min，4000-6000r/min离心5-10min，弃上清，2000-4000r/min进行短暂离心，吸去残余上清液，添加60-100μL碘化物缓冲液，使沉淀物彻底重悬于，加入200-300μL乙醇，室温温育5-15min，4000-6000r/min离心5-10min，弃上清，再用50-80％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥，沉淀重悬于20-50μL的TE，1-3mMEDTA中，即得到锰离子结合肽。其中，将得到的锰离子结合肽进行35S或33p标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。
表1：多个噬菌体结合肽测序结果
Figure BDA0001634692140000081
Figure BDA0001634692140000091
其中，锰离子结合肽在测序前，通过琼脂糖凝胶电泳筛选，其方法如下，制备100mL，0.8％琼脂糖凝胶，微波炉加热溶解，待温度降低至60℃以下后加入2-5μL的Goldview染料，轻轻摇晃混匀后平浇于凝胶板上，插入加样梳，放置于水平台上等待凝胶冷却完全凝固后。去除胶带，小心取出加样梳。取出凝胶放置于电泳槽内，加入足量的电泳缓冲液，在外面进行DNA与0.2倍体积6×加样缓冲液的混合，然后进样，点Maker，接好电极插头，设置电压110-120v，电泳时间约为20min。电泳结束后，取出凝胶，放置于凝胶观察仪置胶板上，打开仪器电源开关，在软件上依次打开电源、可见光、紫外光等按钮，调节亮度、对比度、胶大小等，拍照记录，依次关闭上述按钮。选择结果清晰的编号送去测序。琼脂糖凝胶电泳结果可知，如图3所示，获得各个噬菌斑所含单链DNA的大概相对分子质量，10个噬菌斑所含DNA相对分子质量大致相当，约为6000bp，图中其中M1、M2、M3、M4、M5分别代表五种噬菌斑。
本发明筛选方法筛选得到的锰离子结合肽未见报道，并经过目的肽段的假阳性剔除软件分析，未发现类似序列，因此，可以初步判断经噬菌体随机十二肽库结合螯合树脂(IMAC)筛选得到了对锰离子具有很强结合能力的短肽，结合多肽序列分析，寻找锰离子结合肽的模式序列，并对筛选获得的锰离子结合肽进行酶联免疫分析试验，确定该短肽与锰离子及其他金属离子的结合能力；试验结果显示，经过Gly四轮筛选，洗脱的噬菌体滴度均呈现增长趋势，测序共得到五条序列，其中一条序列“DYHDPSLPTLRK”出现频率极高，分别在第三轮、第四轮、第五轮筛选条件下共有；另外四条序列只出现一次，序列分析未发现模式序列，多肽序列经NCBI的非冗余蛋白质序列数据库(Non-redundantproteinsequencedatabase)BlastP进行比对，结果未发现与其他已知的金属蛋白或结构域存在着任何同源性序列。ClustalX多重序列比对发现锰离子结合肽含有DXXD、HXHH、PXXP模式序列。
一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法，采用ELISA法测定，将靶分子与噬菌体结合的复合物，加入HRP标记的抗-M13抗体，再加入底物显色反应，置于波长为405-415段的吸光值，吸光值越大，亲和能力越强；所述靶分子为包含有重金属离子的溶液，所述重金属离子为Mn2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+或其它重金属离子的其中一种，
具体的，所述的锰离子结合肽亲和性能的检测方法，包括如下步骤，
(1)用100-200μL，浓度为100ug/mL的靶分子溶于0.1-0.3mol/L,pH为8.6的NaHCO3中包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆的一排包被板，在密封的湿盒中2-4℃包被过夜；
(2)甩出多余靶分子溶液，再倒置拍甩出去残液，每孔加封阻液，未包被的一排待也应加入封阻液，用来检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力；
(3)甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均将板倒置在干净的纸巾上，拍甩去除洗液，Tween浓度应与淘洗清洗步骤的浓度相同；
(4)在单独的封阻板中每孔预先加入150-240μLTBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒因子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至12孔2×105个病毒因子；
(5)将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温震荡1-2h；
(6)用1×TBS/Tween洗板6次；
(7)取新的ELISA板，添加封阻液；以1:4000-1:6000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔再加入150-250μL稀释的抗-M13抗体，室温震荡1-3h；
(8)用1×TBS/Tween洗板6次；
(9)往ELISA板的每个孔中加入150-250μL底物溶液，室温作用10-60min；
(10)用读板仪记录405-415处的吸光值。
以上所述锰离子结合肽应用于环境金属污染中锰离子的生物修复。
本发明实施例使用的材料及其他的要求如下：
1.材料要求
(1)噬菌体展示文库：100μL，1.5×1013pfu/mL。贮存于含50％甘油的TBS溶液中。复杂度约2.7×109个转化子。
(2)测序引物：5-GTATGGGATTTTGCTAAACAA-3,100pmol,1pmol/μL
(3)E.coliER2738宿主菌
(4)链霉亲和素Streptavidin,冻干粉1.5mg
(5)生物素，10mM100μL。以上均购自NewEnglishBiolabs公司。
2培养基与试剂
(1)LB培养基g/L：酵母提取物5g，NaCl5g胰蛋白胨10g。
(2)LB/IPTG/X-gal培养基g/L:添加15g/L的琼脂粉于LB培养基中，高温灭菌，冷却低于70℃时加入1mL的IPTG/X-gaL溶液，混匀。
(3)IPTG/X-gal:1.25g的IPTG与1g的X-gaL溶于25mL的DMF中，-20℃避光保存。
(4)LB-tet(四环素)平板：称取NaCl0.5g，酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1g，琼脂粉1.5g充分溶解，高温灭菌，待培养基冷却至70℃以下时，迅速加入四环素储液100μL，摇匀，倒平板，避光冷却，以封口膜缠绕，避光存储于4℃冰箱备用。
(5)TBS缓冲液：50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，调节pH＝7.5。高温灭菌常温储存备用。
(6)0.1％TBST缓冲液：往配置好的TBS缓冲液中加入0.1％(v/v)的Tween-20，高温灭菌，常温贮存备用。
(7)0.5％TBST缓冲液:往配置好的TBS缓冲液中加入0.5％(v/v)的Tween-20，高温灭菌，常温贮存备用。
(8)0.2mol/LGlycine-HCl：甘氨酸0.75g，BSA0.5g，混溶于80mL灭菌超纯水中，调节pH为2.2，定容至100mL，过滤除菌，避光常温贮存。
(9)1mg/mLBSA：称取1mgBSA，溶于1mL灭菌超纯水，过滤除菌，分装于无菌的离心管中，4℃贮存备用。
(10)EDTA：配置0.5mol/L的EDTA,调节pH＝8.0，高温灭菌，常温贮存备用。
(11)碘化物缓冲液：称取1.214gTris-HCl、0.0372gEDTA、59.956gNaI，溶解于80mL去离子水，而后调节pH为8.0，定溶至100mL，过滤除菌后避光保存。
(12)TE溶液：称取1.21gTris-HCl与0.0372gEDTA混合溶解于80mL去离子水，调节pH为8.0,并定容至100mL，121℃高温灭菌30min，贮存于室温待用。
(13)0.2g/LMnCl2溶液：称取0.02gMnCl2溶解于100mL的蒸馏水中，高温灭菌，常温贮存备用。
(14)顶层琼脂：称取0.5gNaCl、0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、0.1gMgCl2·6H2O、0.7g琼脂粉，混合溶解于100mL单蒸水，高温灭菌，常温贮存。
3.设备
(1)TG16-WS台式高速离心机
(2)台式冷冻高速离心机
(3)P402N分析天平
(4)电子万用炉
(5)DYY-12电泳仪
(6)摇床
(7)电子天平
(8)THZ-C台式恒温振荡器
(9)LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅
(10)SW-CJ-IFD烘箱
(11)PK-S22电热恒温水浴锅
4药品
牛血清蛋白、Tris-base、IPTG、X-gal、四环素、琼脂糖、MgCl2·6H2O、琼脂、聚乙二醇8000均购自Sigma公司；Ni-NTAagarose树脂、Sodiumiodide(碘化钠)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)购自Amersco公司；Goldview染料购自赛百盛公司；叠氮钠溶液(NaN3,10％)：购自源叶生物有限公司。
本发明锰离子结合肽的筛选方法的具体实施例：
实施例1
一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，
(1)筛选四环素抗性的大肠杆菌：在LB培养基中加入四环素，培养大肠杆菌，并制作大肠杆菌的生长曲线；
(2)Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+：吸取0.3mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,3500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0，浓度为0.5mol/L的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.1％的TBST清洗3次后，加入1mL，浓度为0.2g/L的MnCl2，存放于2℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.1％的TBST洗3次后得到无色树脂；
(3)添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育：取(2)得到的无色树脂添加0.5mL的BSA，2℃，转速150封闭慢摇1h，2000r/min离心，去除上清液后，加入70μL的TBST，10μL的噬菌体随机十二肽库原始文库混匀，2℃，150转孵育1h，2000r/min离心去除上清液，得到孵育液；
(4)洗脱：取300μL浓度为0.2mol/L,pH为2.2的Gly加入(3)得到的孵育液中，3000r/min离心1min，吸取上清液于无菌容器中，重复洗脱步骤，收集合并两次上清液得到洗脱物；
(5)洗脱物滴度测定：取8μL洗脱物，用TBS进行十倍稀释，稀释范围为101-104；将培养到对数中期的ER2738菌液，分成每管200μL于无菌离心管中，共8管，取稀释后的洗脱物5μL依次加入菌液中，颠倒混匀，室温温育1min；提前融化顶层琼脂放置于35℃的水浴中预温，添加感染细菌于顶层琼脂中，每次一管，快速颠倒混匀后立刻倾注于35℃预温的LB/IPTG/X-gal平板中，适当倾斜平板以便于将顶层琼脂均匀铺开；待平板冷却后，用封口膜处理平板，以防止染菌；35℃暗培养过夜；待菌落成熟后，计算每个平板的菌落数，选取噬菌斑数约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每5μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度；
(6)洗脱物扩增：预先培养ER2738单菌至对数期，2℃离心，取上清液，加入NaCl，沉淀噬菌体；低温离心，去除上清液，再短暂离心吸取残余上清液，沉淀物重悬于TBS中，悬液转入新的离心管中，低温使残留的细胞沉淀，二次上清液转入新管中，添加1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育，低温离心，弃上清再短暂离心，吸取去除残余上清液，沉淀物重悬于NaN3中，2℃离心1min，沉淀所有的残余不溶物，上清转移到新管中，2℃保存，得到扩增物；
(7)扩增物滴度测定：与洗脱物的滴度测定方法相同，扩增物的浓度梯度稀释改为101-1011,取108-1011的梯度进行扩增物的滴度测定；
(8)第二轮筛选噬菌体投放量的确定：选取噬菌斑数目约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度，根据所得的滴度确定下一轮进行筛选的噬菌体的投放量；
(9)二轮筛选：按洗脱、扩增、收集的步骤进行第二轮的筛选，所使用的TBST含有的Tween-20的体积浓度为0.5％；
(10)多轮筛选：同第二轮的方法一样，进行多轮筛选，直至第五轮筛选得到洗脱物；从第三轮至第五轮的所有滴度中挑出色深，块大的蓝斑，即得到噬菌斑，其余洗脱物2℃保藏；
(11)噬菌斑的扩增：将大肠杆菌ER27381:100稀释于LB培养基中，准备1mL稀释后的大肠杆菌，加入选取的色深块大的噬菌斑，35℃摇床培养4.5h，得到噬菌斑扩增物；
(12)快速纯化：将(11)中的噬菌斑扩增物离心，取400μL含噬菌体上清液，加入100μL的PEG/NaCl，混匀，室温静置5min，4000r/min离心5min，弃上清，2000r/min进行短暂离心，吸去残余上清液，添加60μL碘化物缓冲液，使沉淀物彻底重悬于，加入200μL乙醇，室温温育5min，4000r/min离心5min，弃上清，再用50％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥，沉淀重悬于20μL的TE，1mMEDTA中，即得到锰离子结合肽。将得到的锰离子结合肽进行35S或33p标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。
实施例2
一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，
(1)筛选四环素抗性的大肠杆菌：在LB培养基中加入四环素，培养大肠杆菌，并制作大肠杆菌的生长曲线；
(2)Ni-NTAagarose树脂去除Ni2+、添加Mn2+：吸取0.8mL的Ni-NTAagarose树脂于无菌容器中，加入预先处理的TBS缓冲液混匀,4500r/min离心去上清，重复3次，用pH8.0，浓度为0.5mol/L的EDTA清洗3次；同理，用浓度为0.5％的TBST清洗3次后，加入3mL，浓度为0.2g/L的MnCl2，存放于4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用浓度为0.5％的TBST洗3次后得到无色树脂；
(3)添加噬菌体随机十二肽库原始文库孵育：取(2)得到的无色树脂添加1mL的BSA，4℃，转速200封闭慢摇3h，5000r/min离心，去除上清液后，加入100μL的TBST，30μL的噬菌体随机十二肽库原始文库混匀，4℃，200转孵育3h，3000r/min离心去除上清液，得到孵育液；
(4)洗脱：取500μL，浓度为0.2mol/L,pH2.2的Gly加入(3)得到的孵育液中，4000r/min离心3min，吸取上清液于无菌容器中，重复洗脱步骤，收集合并两次上清液得到洗脱物；
(5)洗脱物滴度测定：取10μL洗脱物，用TBS进行十倍稀释，稀释范围为101-104；将培养到对数中期的ER2738菌液，分成每管400μL于无菌离心管中，共8管，取稀释后的洗脱物10μL依次加入菌液中，颠倒混匀，室温温育5min；提前融化顶层琼脂放置于45℃的水浴中预温，添加感染细菌于顶层琼脂中，每次一管，快速颠倒混匀后立刻倾注于40℃预温的LB/IPTG/X-gal平板中，适当倾斜平板以便于将顶层琼脂均匀铺开；待平板冷却后，用封口膜处理平板，以防止染菌；45℃暗培养过夜；待菌落成熟后，计算每个平板的菌落数，选取噬菌斑数约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度；
(6)洗脱物扩增：预先培养ER2738单菌至对数期，4℃离心，取上清液，加入NaCl，沉淀噬菌体；低温离心，去除上清液，再短暂离心吸取残余上清液，沉淀物重悬于TBS中，悬液转入新的离心管中，低温使残留的细胞沉淀，二次上清液转入新管中，添加1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育，低温离心，弃上清再短暂离心，吸取去除残余上清液，沉淀物重悬于NaN3中，4℃离心3min，沉淀所有的残余不溶物，上清转移到新管中，4℃保存，得到扩增物；
(7)扩增物滴度测定：与洗脱物的滴度测定方法相同，扩增物的浓度梯度稀释改为101-1011,取108-1011的梯度进行扩增物的滴度测定；
(8)第二轮筛选噬菌体投放量的确定：选取噬菌斑数目约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位pfu滴度，根据所得的滴度确定下一轮进行筛选的噬菌体的投放量；
(9)二轮筛选：按洗脱、扩增、收集的步骤进行第二轮的筛选，所使用的TBST含有的Tween-20的体积浓度为1％；
(10)多轮筛选：同第二轮的方法一样，进行多轮筛选，直至第五轮筛选得到洗脱物；从第三轮至第五轮的所有滴度中挑出色深，块大的蓝斑，即得到噬菌斑，其余洗脱物4℃保藏；
(11)噬菌斑的扩增：将大肠杆菌ER27381:100稀释于LB培养基中，准备1mL稀释后的大肠杆菌，加入选取的色深块大的噬菌斑，38℃摇床培养5h，得到噬菌斑扩增物；
(12)快速纯化：将(11)中的噬菌斑扩增物离心，取600μL含噬菌体上清液，加入200μL的PEG/NaCl，混匀，室温静置15min，6000r/min离心10min，弃上清，4000r/min进行短暂离心，吸去残余上清液，添加100μL碘化物缓冲液，使沉淀物彻底重悬于，加入300μL乙醇，室温温育15min，6000r/min离心10min，弃上清，再用80％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥，沉淀重悬于50μL的TE，3mMEDTA中，即得到锰离子结合肽。将得到的锰离子结合肽进行35S或33p标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。
实施例3
一种锰离子结合肽的筛选方法，包括以下步骤，
1.宿主菌ER2738的生长曲线制作
在LB培养基中加入四环素，培养大肠杆菌，即宿主菌ER2738。
(1)用接种针挑取-80℃下保藏的含有50％甘油缓冲剂的菌种ER2738划线接种于LB-tet平板，37℃暗培养过夜。
(2)挑取平板上ER2738单菌落于20mL(250mL三角瓶)液体LB-tet培养基中，37℃180rpm摇床过夜培养；
(3)将上述菌液按照1:100的比例稀释于新鲜的100mL的LB-tet液体培养基中，每间隔1h取3mL菌液测定OD600的吸光度值，绘制成曲线。
2.树脂的处理
(1)去除Ni2+
提前预备无菌离心管，各吸取0.5mL的Ni-NTAagarose树脂于离心管中，分别标号A,B。分别加入预先处理的TBS缓冲液,颠倒混匀，4000r/min离心去上清，重复3次。再用0.5mol/LEDTA(pH8.0)清洗3次，同理，用0.1％的TBST清洗3次，使蓝色树脂变为无色。
(2)添加Mn2+
取A树脂，添加1mL的MnCl2,存放于4℃冰箱，过夜，用TBS洗3次，再用0.1％TBST洗3次后备用。
(3)洗脱液的处理
取上述处理过的A.B两管，分别添加1mL的BSA，4℃，150转封闭慢摇1h，2000r/min轻度离心，去上清。往A，B两管中加入90μL的TBST,10μL的原始文库(1×10-11pfu/mL),颠倒混匀，4℃，150转孵育1h，2000r/min离心去上清。
(4)洗脱液的收集
将300μL0.2mol的Gly(pH2.2)分别加入A管中，4000r/min离心1min，吸取上清液于无菌离心管中，重复上述实验，收集合并两次洗脱液。
3.洗脱物的测定
3.1培养前的准备
挑取ER2738单菌落接种于10mLLB培养基中，摇床培养至对数中期；细胞生长时,将顶层琼脂高温融化,分成3mL于无菌试管中,A、B各四管,放于45℃水浴中备用。
将提前预备好的LB培养基融化，待温度降低至70℃以下后加入预先配好的IPTG/X-gal,充分混匀，倒平板。避光无菌存放。
3.2洗脱物的处理
取10μL洗脱物，用TBS进行十倍稀释，稀释范围为101-104。每稀释一个梯度要更换一次带芯枪头，为了避免交叉污染。
4滴度的测定
(1)将培养到对数中期的ER2738菌液，分成每管200μL于无菌离心管中，共8管。取稀释后的洗脱物10μL依次加入菌液中，颠倒混匀，室温温育1-5min。
(2)提前融化顶层琼脂放置于45℃的水浴中预温，添加感染细菌于顶层琼脂中，每次一管，快速颠倒混匀后立刻倾注于37℃预温的LB/IPTG/X-gal平板中，适当倾斜平板以便于将顶层琼脂均匀铺开。
(3)待平板冷却后，用封口膜处理平板，以防止染菌。37℃暗培养过夜。
4.1滴度的计算
待菌落成熟后，计算每个平板的菌落数，选取噬菌斑数约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位(pfu)滴度.
5洗脱物的扩增
5.1扩增前的处理
挑取ER2738单菌落于10mL的LB培养基中过夜培养，将培养物1:100稀释于A、B两瓶LB培养基中。
将A、B的洗脱物各10μL加入到20mL的培养物中，培养至对数前期。
5.2培养物的过夜处理
将培养物分装于离心管中，4℃，12000r/min离心10min。上清转移到新离心管中，再离心。取80％离心后的上清液转移至新的离心管中，加入1/6的PEG/NaCl,4℃保存，过夜使噬菌体沉淀。
5.3培养物过夜后处理
将过夜后的培养物4℃，12000r/min低温离心15min，去除上清液，在短暂离心吸取残余上清液。沉淀物重悬于1mL的TBS中，悬液转入新的离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。
上清转入新管中，添加1/6的PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育60min，4℃离心10min。弃上清再短暂离心，吸取去除残余上清液。
沉淀物重悬与200μL的TBS0.02％的NaN3中，离心1min，沉淀所有的残余不溶物，上清转移到新管中。此为扩增后的洗脱物。4℃保存。
6扩增物的滴度
与洗脱物的滴度测定方法相同，由于扩增物溶度较高，所以将扩增物的浓度梯度稀释改为101-1011,取108-1011的梯度来进行扩增物的滴度测定。
7淘洗程度的计算
通过第一轮洗脱物的扩增后，选取噬菌斑数目约为100的平板，将所得到的菌斑数乘以相应的稀释因子即可得到每10μL噬菌体的空斑形成的单位(pfu)滴度，根据所得的滴度确定下一轮进行淘洗的加入量。
8第二轮淘洗
采用上述第一轮的方法，即洗脱-洗脱物滴度测定-扩增-扩增物滴度测定的方法步骤进行第二轮的淘洗，所使用的TBST含有的Tween-20的体积浓度由0.1％变更为0.5％。
9多轮淘洗
通常淘洗至第三轮便可筛选出具有Mn2+离子结合能力强的肽段，本次实验为保证实验的准确性，淘洗至第五轮。通过对上一轮洗脱物和扩增物进行的滴度测定，从而确下一轮洗脱时噬菌体的投放量，下一轮同样使用含0.5％tween的TBST缓冲液进行洗脱，在LB/IPTG/X-gal平板上测定滴度。第五轮的洗脱物不必再扩增，从第三轮至第五轮的所有滴度中挑取色深，块大的蓝斑进行模板的纯化测序，其余洗脱物4℃保藏。
10噬菌斑的扩增
(1)将ER2738培养过夜，1:100稀释于LB培养基中，每个要鉴定克隆的一管，每管1mL。
(2)用无菌竹签或吸头，挑选一色深块大的噬菌斑于上述1mL培养管中。
(从噬菌斑数在100以内的平板上挑选，以保证挑选出的噬菌斑仅含有一个DNA序列)。
(3)37℃摇床培养4.7h。
11快速纯化
按上述方法进行噬菌斑的扩增，离心。在首次离心后，取500μL含噬菌体上清液转入一新鲜离心管中。加入200μL的PEG/NaCl，混匀，室温静置10min。6000r/min离心10min，弃上清。2000r/min进行短暂离心，小心吸去残余上清液。添加100μL碘化物缓冲液，使沉淀物彻底重悬于，加入250μL乙醇。室温温育10min。6000r/min离心10min，弃上清。再用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μL的TE,1mMEDTA中。取5μL上述模板溶液进行35S或33p标记的手工双脱氧测序，或染料标记的自动循环双脱氧测序。
本发明锰离子结合肽亲和性能的检测方法，实施例如下，
实施例4
一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法采用ELISA法测定，将靶分子与噬菌体结合的复合物，加入HRP标记的抗-M13抗体，再加入底物显色反应，置于波长为405-415段的吸光值，吸光值越大，亲和能力越强；所述靶分子为包含有重金属离子的溶液，所述重金属离子为Mn2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+或其它重金属离子的其中一种。
具体的包括如下步骤，
(1)用100μL的100μg/mL的靶分子溶于0.1mol/LpH8.6NaHCO3中包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆的一排包被板，在密封的湿盒中2-4℃包被过夜；
(2)甩出多余靶分子溶液，再倒置拍甩出去残液，每孔加封阻液，未包被的一排待也应加入封阻液，用来检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力；
(3)甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均将板倒置在干净的纸巾上，拍甩去除洗液，Tween浓度应与淘洗清洗步骤的浓度相同；
(4)在单独的封阻板中每孔预先加入150μLTBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒因子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至12孔2×105个病毒因子；
(5)将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温震荡1h；
(6)用1×TBS/Tween洗板6次；
(7)取新的ELISA板，添加封阻液；以1:4000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔再加入150μL稀释的抗-M13抗体，室温震荡1h；
(8)用1×TBS/Tween洗板6次；
(9)往ELISA板的每个孔中加入150μL底物溶液，室温作用10min；
(10)用读板仪记录405-415处的吸光值。
实施例5
一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法采用ELISA法测定，将靶分子与噬菌体结合的复合物，加入HRP标记的抗-M13抗体，再加入底物显色反应，置于波长为405-415段的吸光值，吸光值越大，亲和能力越强；所述靶分子为包含有重金属离子的溶液，所述重金属离子为Mn2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+或其它重金属离子的其中一种。
具体的包括如下步骤，
(1)用200μL100μg/mL的靶分子溶于0.3mol/LpH8.6NaHCO3中包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆的一排包被板，在密封的湿盒中4℃包被过夜；
(2)甩出多余靶分子溶液，再倒置拍甩出去残液，每孔加封阻液，未包被的一排待也应加入封阻液，用来检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力；
(3)甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均将板倒置在干净的纸巾上，拍甩去除洗液，Tween浓度应与淘洗清洗步骤的浓度相同；
(4)在单独的封阻板中每孔预先加入240μLTBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒因子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至12孔2×105个病毒因子；
(5)将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温震荡2h；
(6)用1×TBS/Tween洗板6次；
(7)取新的ELISA板，添加封阻液；以1:6000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔再加入250μL稀释的抗-M13抗体，室温震荡3h；
(8)用1×TBS/Tween洗板6次；
(9)往ELISA板的每个孔中加入250μL底物溶液，室温作用60min；
(10)用读板仪记录405-415处的吸光值。
实施例6
一种锰离子结合肽亲和性能的检测方法采用ELISA法测定，将靶分子与噬菌体结合的复合物，加入HRP标记的抗-M13抗体，再加入底物显色反应，置于波长为405-415段的吸光值，吸光值越大，亲和能力越强；所述靶分子为包含有重金属离子的溶液，所述重金属离子为Mn2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+或其它重金属离子的其中一种。
具体的包括如下步骤，
(1)RP底物溶液的准备
ABTS贮液可以提前准备：称取22mgABTS溶解于100mL5mM的柠檬酸钠中，调节pH4.0，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前在21mLABTS贮液中加入36μL30％的H2O2。
(2)样品前处理
A在扩增的噬菌斑进行DNA测序时，将所剩余的噬菌斑上清4℃保存。
B对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，在20mLLB培养基中接种ER2738单菌落，37℃培养至稍有浑浊。或者，将ER2738单菌落过夜培养后1:100稀释于20mLLB培养基中。
C将5μL噬菌体上清液加入到ER2738培养管中，37℃摇床培养4.5h。
D将上述培养物转入无菌离心管中，10000r/min离心10min。上清转入新管中，再离心。
E取上清液的80％于新鲜离心管中，加入1/6的PEG/NaCl,4℃过夜沉淀。
F10000r/min，4℃离心15min，弃上清，再离心，吸取残余上清液。
G沉淀重悬于1mL的TBS中，4℃离心5min除去沉淀中所有的残余上清。
H上清转入新鲜离心管中，加入1/6的PEG/NACL在沉淀。冰上作用30min。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心。吸去残余上清液。
I沉淀重悬于50μL的TBS中，按上述的方法进行噬菌体的滴度测定。4℃保存。
(3)酶联免疫分析
a用150μL100μg/mL的靶分子(溶于0.1mol/LpH8.6NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆的一排包被板，在密封的湿盒中4℃包被过夜。
b首先甩出多余靶分子溶液，然后倒置平板于纸巾上，拍甩出去残液。每孔加封阻液。另外，未包被的一排待鉴定克隆也应加入封阻液，用来检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。
c甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均将板倒置在干净的纸巾上，拍甩去除洗液。Tween浓度应与淘洗清洗步骤的浓度相同。
d在单独的封阻板中每孔预先加入200μLTBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒因子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至12孔2×105个病毒因子。
e用移液枪将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡1.5h。
f用1×TBS/Tween洗板6次。
G取新的ELISA板，添加封阻液，以1:5000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔再加入200μL稀释抗体。室温震荡1h。
h用1×TBS/Tween洗板6次。
I往ELISA板的每个孔中加入200μL底物溶液，室温作用30min。
j用读板仪记录405-415处的吸光值。
实验数据：
本发明实施例3筛选多肽的结果如下，
(1)宿主菌ER2738的生长曲线制作
如图1所示，以含有四环素的100mLLB液体培养基培养大肠杆菌ER2738，每隔1h测定一次OD600值，得到的结果如图1所示，在0-1h为生长适应期、1-8h为对数生长期、8h之后进入稳定期，对数生长期又可细分为对数前期，对数中期，对数生长期前期在培养时间约为2h时，而对数生长中期在培养时间约为4-5h之间。
(2)多轮淘洗及扩增结果
通过去除Ni2+加Mn2+的处理树脂以及去除Ni2+的空离子树脂比较，以每一轮扩增后得到的数据选择100个左右的噬菌体平板，计算滴度，通过滴度来确定下一轮洗脱的添加量，以保证每一轮淘洗所添加的病毒因子是1×1011pfu/mL，得到如表2所示的数据，五轮淘洗结果下来，加载Mn2+的的树脂比空离子树脂所得的噬菌斑明显较多，尤其的第四轮，第五轮所差别不大，可能是由于长时间实验导致噬菌体衰退，当然由于实验存在如大肠杆菌的使用要求洗脱应培养至对数中期，扩增应先培养至对数前期等，存在一系列不确定因素导致实验结果不明显。
表2：淘洗一至五轮洗脱及扩增滴度数据
Figure BDA0001634692140000221
但总体而言，A树脂处理所得噬菌斑个数远超经B树脂处理过的噬菌斑个数，形成此结果的原因，可能是由于经过连续几轮的淘洗过后，有与金属Mn2+螯合的树脂相较于未与金属离子螯合的树脂而言，对噬菌体多肽具有较强的富集作用，能够筛选出对Mn2+具有高亲和力的多肽。每一轮洗脱所得的洗脱液，取AB各10μL加入培养至对数前期的ER2738中进行侵染，按上述实验步骤做噬菌体扩增的滴度测定，由于洗脱所得的噬菌体数量特别充足，为保证扩增结果明显，扩增选择稀释梯度为108至1011。其余条件不变，A树脂处理所得噬菌斑个数远超经B树脂处理过的噬菌斑个数，尤其是第三轮扩增，形成此结果的原因，可能是由于经过前两轮的淘洗-扩增后，有与金属Mn2+螯合的树脂相较于未与金属离子螯合的树脂而言，对噬菌体多肽具有较强的富集作用，能够筛选出对Mn2+具有高亲和力的多肽。
依照本发明实施例6检测方法检测的结果如下，
在扩增的噬菌斑进行DNA测序前，将所需测序的噬菌体按滴度测定的方法测出所含有的噬菌体的数量，用以计算酶联免疫时所需要添加的噬菌体，使不同的噬菌体用于做酶联免疫时所用的数量能保持在1012个左右。以保证酶联免疫的准确性。用读板仪记录405-415处的吸光值，由这个值可以看出不同噬菌体对Mn2+的吸附力不同，值越大表示Mn2+的结合能力越强，依照实施例6的方法分别以靶分子Cu2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+，测定与本发明筛选方法得到的如表1所示的编号为1001多肽结合能力，每组都做空白试验组以消除误差，测定结果如表3所示。(此处噬菌体是指带有锰离子结合肽的噬菌体。)
表3：1001多肽与靶分子ELISA实验数据表
Figure BDA0001634692140000231
由表中的所测的96组的数据经分析所得平均值可看出：Cu2+结合力度数值为0.064，Zn2+结合力度数值为0.066，Cr2+结合力度数值为0.062，Cd2+的结合力度数值为0.051，Co2+的结合力度数值为0.054，Mn2+的结合力度数值为0.219。因此可以看出：Mn2+>Zn2+>Cu2+>Cr2+>Co2+，因此可以看出编号为1001的多肽与五种重金属靶分子结合力实验中与Mn2+的结合力最强。
依照本发明实施例4检测方法检测的结果如下，
依照实施例6的方法分别以靶分子Cu2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+、Co2+、Mn2+，测定与本发明筛选方法得到的如表1所示的编号为1007多肽结合能力，每组都做空白试验组以消除误差，测定结果如表4所示。(此处噬菌体是指带有锰离子结合肽的噬菌体。)
表4：1007多肽与靶分子ELISA实验数据表
Figure BDA0001634692140000241
由表可知，实验所得的96组实验数据经处理分析后的平均值可知：Cu2+结合力度数值为0.039，Zn2+结合力度数值为0.009，Cr2+结合力度数值为0.001，Cd2+的结合力度数值为0.041，Co2+的结合力度数值为0.006，Mn2+的结合力度数值为0.181。因此可以看出：Mn2+>Zn2+>Cu2+>Cr2+>Co2+，因此可以看出编号为1007的多肽与五种重金属靶分子结合力实验中与Mn2+的结合力最强。
在此组数据中，由于前期设备的故障问题，所以此块数据板做完后并没有得到及时的数据测量，所以导致在后期的测试中出现各靶分子的后面四组数据出现为“0”的情况，所以当时为了核查数据的可靠性，将操作过程中的操作条件以及保存条件进行了一一核查，在排除这些问题的前提下，立足于本实验定性分析的原则下，判断出该多肽与靶分子Mn2+的结合力最强的结果可采用。
依照本发明实施例4检测方法检测的结果如下，
依照实施例4的方法以靶分子为Mn2+，测定与本发明筛选方法得到的如表1所示的编号为1006、1001、1007、999多肽结合能力，测定结果如表5所示。
表5：四种多肽与Mn2+结合数据表
Figure BDA0001634692140000251
在以上比较四种多肽与Mn2+的结合对比实验中，可以看出1006的平均值为0.053，1001的平均值为0.219，1007的平均值为0.181，999的平均值为0.050。可看出1001>1007>1006>999，因此可以看出四种多肽中，编号1001的多肽与Mn2+结合力度数值最大。
利用酶联免疫法有望实现环境重金属污染的有效，简便和低费用处理。本文通过酶联免疫的抗原-抗体结合显示，可以由数据明确地表示出我们所筛选的肽段的Mn2+的结合能力的大小，从而筛选出最利于我们研究的肽段，如Mn3、Mn5等结合力强的多肽。以便于后期进一步研究对Mn2+亲和性相对最强的序列融合到噬菌体表面。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 福建师范大学福清分校
<120> 一种锰离子结合肽及其筛选方法、亲和性能的检测方法
<140> 2018103558751
<141> 2018-03-07
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 1
Asp Tyr His Asp Pro Ser Arg Leu Arg Cys Gly Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 2
Asp Tyr His Asp Pro Ser Arg Leu Arg Trp Gly Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 3
Asp His His Asp Pro Ser Gln His Thr Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 4
Asp Tyr His Asp Pro Ser Pro Pro Thr Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 5
Asp Tyr His Asp Pro Ser Leu Pro Thr Leu Arg Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 6
Leu Glu Ser Met Ile Thr Gln Ser Asn Arg Ile Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 7
Gly Asn Asn Pro Leu His Val His His Asp Lys Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 8
Gly His Gly Pro His Arg Phe Asp Lys Trp Ile Gln
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 9
Ala Asp Thr Val Asp Ser Cys Leu Ala Asn Ser His
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(bacteriophage)
<400> 10
Asp Tyr His Asp Pro Ser Ser Pro Thr Leu Arg Lys
1 5 10

Claims (2)

1.一种锰离子结合肽，其特征在于：包括如下序列多肽的一种或者两种以上的组合；
包括如下序列多肽的两种以上的组合：
SEQ ID NO.1:DYHDPSRLRCGR、
SEQ ID NO.2:DYHDPSRLRWGR、
SEQ ID NO.3:DHHDPSQHTLRK、
SEQ ID NO.4:DYHDPSPPTLRK、
SEQ ID NO.5:DYHDPSLPTLRK、
SEQ ID NO.6:LESMITQSNRIN、
SEQ ID NO.7:GNNPLHVHHDKR、
SEQ ID NO.8:GHGPHRFDKWIQ、
SEQ ID NO.9:ADTVDSCLANSH、
SEQ ID NO.10:DYHDPSSPTLRK；
或者
包括如下序列其中的一种多肽：
SEQ ID NO.1:DYHDPSRLRCGR、
SEQ ID NO.2:DYHDPSRLRWGR、
SEQ ID NO.3:DHHDPSQHTLRK、
SEQ ID NO.4:DYHDPSPPTLRK、
SEQ ID NO.6:LESMITQSNRIN、
SEQ ID NO.8:GHGPHRFDKWIQ、
SEQ ID NO.9:ADTVDSCLANSH、
SEQ ID NO.10:DYHDPSSPTLRK。
2.根据权利要求1所述的锰离子结合肽在环境金属污染中锰离子的生物修复中的应用。
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