WO2020040609A1 - 타액 중의 s100 단백질을 이용한 초기 치주염의 진단방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 - Google Patents

타액 중의 s100 단백질을 이용한 초기 치주염의 진단방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 Download PDF

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periodontitis
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김현덕
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서울대학교 산학협력단
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    • G01N2800/18—Dental and oral disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing initial periodontitis using S100 protein in saliva, a method of providing information, a composition, and a kit.
  • Periodontitis one of the major oral diseases, is an infection caused by a balance between periodontal disease inflammation and the immune response, which can lead to tooth loss if the periodontitis worsens.
  • Periodontitis is associated with increased systemic inflammation through changes in proteins, immunoglobulins and inflammatory mediators, and the diagnosis of periodontal disease is associated with a number of clinical trials such as periodontal depth (PD) and clinical attachment level (CAL). It can be judged based on the indicator.
  • PD periodontal depth
  • CAL clinical attachment level
  • S100A8 and S100A9 proteins are known as small calcium-binding proteins, are known as epithelial cells, granulocytes.
  • monocytes S100A8 and S100A9 proteins are released into the extracellular environment under cellular stress, acting as a potent inducer for the immune system, and monocytes and macrophages are the most abundant sources of S100A8 and S100A9 proteins.
  • TLR4 Toll Like Receptor 4
  • S100A8 and S100A9 proteins are not only associated with a variety of human disorders, including acute and chronic inflammatory conditions, autoimmune diseases, but also play an important role in normal physiological processes, in particular S100A8 and gingival crevicular fluid (GCF).
  • GCF gingival crevicular fluid
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2001-0034357 discloses a method for diagnosing periodontal disease by detecting a specific protein in the gingival sulcus, but solves the problem that collection of gingival sulcus is performed by an invasive method. I haven't.
  • the periodontitis diagnosis method and periodontitis diagnosis that can provide the effect that can be diagnosed periodontitis by collecting saliva in a non-invasive way
  • the purpose is to provide a method of providing information.
  • the present invention provides a method for diagnosing periodontitis, comprising the step of measuring the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 protein in saliva isolated from the subject.
  • the present invention is to separate the saliva collected from the subject and the normal control, respectively; Measuring S100A8 and S100A9 protein expression levels from the isolated saliva; And measuring whether the amount of S100A8 protein in saliva of the subject is higher than the amount of S100A8 protein in saliva of the normal control, and the amount of S100A9 protein in saliva of the subject is lower than the amount of S100A9 protein in saliva of the normal control. To provide information for diagnosing periodontitis.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing periodontitis comprising a preparation for measuring the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 protein and a periodontitis diagnostic kit comprising the same.
  • the periodontitis diagnosis method and periodontitis diagnosis information providing method of the present invention is a non-invasive method to collect the saliva can not only diagnose the periodontitis, but also by measuring the amount of S100A8 and S100A9 protein expression can be diagnosed early periodontitis early Have
  • the present invention relates to biomarkers and their use for the diagnosis of periodontitis.
  • the present inventors have experimentally confirmed the increase and decrease of the amount of S100A8 and S100A9 protein in saliva depending on the presence of periodontitis, and completed the present invention.
  • the present invention relates to a periodontitis diagnostic method, periodontitis diagnostic information providing method, periodontitis diagnostic composition, periodontitis diagnostic kit using S100A8 and S100A9 proteins in saliva, periodontitis diagnostic use using S100A8 and S100A9 proteins and any implementation thereof Contains the sun.
  • the 'subject' is a human having periodontitis
  • the 'normal control' means a periodontal health person who does not have periodontitis having the same health behaviors as sex and age and smoking.
  • the S100A8 protein and the S100A9 protein are proteins encoded by the S100A8 and S100A9 genes and are a family of S100 proteins including two EF-hand type (helix-loop-helix) calcium-binding motifs. It can be understood as a protein.
  • the S100A8 protein and the S100A9 protein include a protein recognized as S100A8 protein and S100A9 protein in the art, and may include, for example, a protein defined in Korean Patent Publication No. 10-2015-0090240.
  • the method of diagnosing periodontitis of the present invention comprises measuring the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 protein in saliva isolated from a subject.
  • the diagnostic method of the present invention the step of collecting and separating saliva from the subject and the normal control, respectively; Measuring S100A8 and S100A9 protein expression levels from the isolated saliva; And when the amount of S100A8 protein expression in the saliva of the subject is higher than the amount of S100A8 protein expression in the saliva of the normal control, and / or the amount of S100A9 protein expression in the saliva of the subject is lower than the amount of S100A9 protein in saliva of the normal control, And diagnosing that it is periodontitis.
  • the amount of S100A8 protein in saliva of the subject is higher than S100A8 protein in saliva of the normal control group by 60% or more, or the amount of S100A9 protein in saliva of the normal control group Lower than 40%, the subject may be diagnosed as periodontitis,
  • the expression level of S100A8 protein in the saliva of the subject is higher than the expression level of S100A8 protein in the saliva of the normal control group by 70% or more, or the amount of S100A9 protein expression in the saliva of the subject is 30 than the S100A9 protein expression level in the saliva of the normal control group. If lower than%, the subject may be diagnosed as periodontitis.
  • the amount of S100A8 protein in saliva of the subject is 3000 pg / ml or more, preferably 3000 pg / ml or more and 4000 pg / ml or less, or the amount of S100A9 protein in saliva of the subject is 800 pg / ml or less , Preferably 600 pg / ml or more and 800 pg / ml or less, the subject may be diagnosed as periodontitis,
  • the S100A8 protein expression level in saliva of the subject is 3300 pg / ml or more and 3700 pg / ml or when the S100A9 protein expression level in the saliva of the subject is 650 pg / ml or more and 750 pg / ml or less, It can be diagnosed as periodontitis.
  • the saliva may be saliva, but is not limited thereto.
  • the step of measuring the expression level of S100A8 and S100A9 protein from each of the isolated saliva in the present invention may be performed through an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), but is not limited thereto.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the method for providing information for diagnosing periodontitis of the present invention comprises the steps of collecting and separating saliva from the subject and the normal control, respectively; Measuring S100A8 and S100A9 protein expression levels from the isolated saliva; And if the amount of S100A8 protein expression in the saliva of the subject is higher than the amount of S100A8 protein expression in the saliva of the normal control, or the amount of S100A9 protein in the saliva of the subject is lower than the amount of S100A9 protein in saliva of the normal control group, the subject is periodontitis And diagnosing;
  • the amount of S100A8 protein in saliva of the subject is higher than S100A8 protein in saliva of the normal control group by 60% or more, or the amount of S100A9 protein in saliva of the normal control group Lower than 40%, the subject may be diagnosed as periodontitis,
  • the expression level of S100A8 protein in the saliva of the subject is higher than the expression level of S100A8 protein in the saliva of the normal control group by 70% or more, or the amount of S100A9 protein expression in the saliva of the subject is 30 than the S100A9 protein expression level in the saliva of the normal control group. If lower than%, the subject may be diagnosed as periodontitis.
  • the amount of S100A8 protein in saliva of the subject is 3000 pg / ml or more, preferably 3000 pg / ml or more and 4000 pg / ml or less, or the amount of S100A9 protein in saliva of the subject is 800 pg / ml or less , Preferably 600 pg / ml or more and 800 pg / ml or less, the subject may be diagnosed as periodontitis,
  • the S100A8 protein expression level in saliva of the subject is 3300 pg / ml or more and 3700 pg / ml or when the S100A9 protein expression level in the saliva of the subject is 650 pg / ml or more and 750 pg / ml or less, It can be diagnosed as periodontitis.
  • the saliva may be saliva, but is not limited thereto.
  • the step of measuring the expression level of S100A8 and S100A9 protein from each of the isolated saliva in the present invention may be performed through an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), but is not limited thereto.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • composition for diagnosing periodontitis comprising an agent for measuring the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 protein.
  • the expression level of the S100A8 and / or S100A9 protein can be measured from a biological sample of the desired individual.
  • the “biological sample” may include, for example, one or more selected from the group consisting of subject-derived tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like, preferably saliva, and more preferably, more Preferably the saliva may be saliva.
  • the agent for measuring the expression level of the S100A8 and / or S100A9 protein is not particularly limited, but includes, for example, antibodies, siRNA, reagents, and the like, which complementarily bind to the S100A8 and / or S100A9 proteins. do.
  • a periodontal cancer diagnostic kit comprising a composition for diagnosing periodontal cancer comprising an agent for measuring the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 protein.
  • the kit can diagnose periodontitis by confirming the expression level of one or more of S100A8 and S100A9 proteins in saliva.
  • the kit for diagnosing periodontitis may include one or more other constituent compositions, solutions or devices suitable for analytical methods as well as antibodies, siRNA, etc. specific for the diagnosis of periodontitis.
  • the subject of diagnosis may include periodontitis as a disease.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the diagnostic kit of the present invention may include the necessary elements necessary to perform an ELISA.
  • ELISA kits comprise antibodies specific for the S100A8 and S100A9 proteins.
  • Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for marker proteins and have little cross-reactivity to other proteins and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • Other ELISA kits are capable of binding reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with the antibody) and substrates or antibodies thereof. Other materials and the like.
  • periodontitis was collected by invasive methods for the diagnosis of periodontitis, periodontitis was not smoothly diagnosed, and there was a problem that early detection of periodontitis was difficult.
  • the present inventors are characterized in that it provides an effect to enable early diagnosis of periodontitis by collecting saliva in a non-invasive way to overcome the above problems.
  • the present invention proceeded with the approval (Approval No .: S-020060000) of the Seoul National University Dental College Institutional Review Board, all participants voluntarily participated and provided written consent.
  • the present invention is a cross-sectional study consisting of randomly selected subjects in a large cohort study.
  • Selection criteria of the participants included in the present invention are as follows.
  • the present invention was progressed by selecting 326 participants who met the above selection criteria.
  • the radiation ABL of each natural tooth was evaluated by a trained dentist using panoramic radiographs (Pax-Primo, Vatech Global, Seoul).
  • ABL alveolar bone loss
  • CEJ cemento-enamel junction
  • Proximal periodontitis with more than 3 mm of proximal bone loss in two or more nonadjacent teeth was classified as “incipient periodontitis” and more than 30% of proximal bone loss in more than 5 mm of “severe periodontitis”. Participants diagnosed with early periodontitis or severe periodontitis were considered periodontitis ("yes") compared to participants without periodontitis ("no").
  • saliva ie saliva
  • saliva was collected from each participant. 1 hour prior to saliva collection, participants were instructed not to eat, drink or brush their teeth, and were passively drooled or spitting for 10 minutes in a 50 ml conical tube to maintain consistency of the collected saliva. Saliva was collected using the method, and the saliva secretion rate was recorded.
  • the vial containing saliva was centrifuged at 2600 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., and then 1 ml of the supernatant was aliquoted into a autoclaved 1.5 ml Eppendorf tube. The aliquots were then stored at -80 ° C for further analysis.
  • S100A8 and S100A9 protein expression in saliva was detected by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the five components of metabolic syndrome are:
  • hypertriglyceridemia (more than 150 mg / dl triglycerides)
  • low HDL cholesterol (less than 40 mg / dl for men and less than 50 mg / dl for women)
  • high blood pressure (more than 130 mmHg systolic, more than 85 mmHg diastolic, taking blood pressure medication)
  • Metabolic syndrome was considered to be included when included in three or more of the above components.
  • the waist circumference was measured horizontally between the rib cage and the iliac crest by a trained examiner using a measuring tape.
  • Serum biomarkers included in the present invention include fasting plasma glucose, triglycerides and HDL cholesterol, and were tested using assays commonly used in the art.
  • the blood pressure (deflator and diastolic, mmHg) was measured twice in a 15 minute interval using a mercury manometer, and the average of the two test values was used for analysis. Diagnosed hypertension from the measured blood pressure.
  • S100A8 and S100A9 protein expression levels were detected in saliva after controlling for age, sex, smoking, drinking, education, physical activity and metabolic syndrome variables.
  • the mean concentration of S100A8 protein was found in participants with periodontitis ("yes", 3490.4 ⁇ 1.1 pg / ml, log value 3.54 ⁇ 0.04, p ⁇ 0.001) participants without periodontitis ("no", 2050.2 ⁇ 1.1 pg / ml, log Value 3.31 ⁇ 0.05, p ⁇ 0.001) it was confirmed that significantly higher by about 70%.
  • log 10 S100A8 in saliva was found to be significantly increased in periodontitis patients than periodontal health of Korean adults, and after adjusting the disturbance parameters (adjusted), log 10 S100A8 in saliva is periodontitis It can be seen that the participant with an increase compared to the participants without periodontitis, log 10 S100A9 of saliva can be seen that the participants with periodontitis decreased than the participants without periodontitis.
  • the present invention is not simply confirmed that the expression level of small calcium-binding proteins, ie, S100A8 and S100A9 proteins, is increased in the periodontitis patients, but the expression level of S100A8 protein is increased, but the expression level of S100A9 protein is increased.
  • the present invention relates to diagnosing periodontitis by relatively decreasing the amount of S100A8 and S100A9 protein expression in saliva,
  • the periodontitis diagnosis method and periodontitis diagnosis information providing method of the present invention is a non-invasive method to collect the saliva can not only diagnose the periodontitis, but also by measuring the amount of S100A8 and S100A9 protein expression can be diagnosed early periodontitis early It is expected to provide a periodontitis diagnostic composition and a periodontitis diagnostic kit comprising the same, comprising a preparation for measuring the amount of S100A8 and S100A9 protein expression, it is expected to be able to diagnose periodontitis more easily in hospitals and homes.

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Abstract

본 발명은 대상체로부터 분리된 타액을 채취하는 단계; 상기 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 분석하는 단계; 및 상기 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높고, 상기 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체를 치주염과 연관시키는 단계;를 포함하는 치주염 진단 방법 및 치주염 진단용 정보제공방법에 관한 것으로, S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주염 진단용 조성물 및 상기 치주염 진단용 조성물을 포함하는 치주염 진단 키트를 제공할 수 있다.

Description

타액 중의 S100 단백질을 이용한 초기 치주염의 진단방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트
본 발명은 타액 중의 S100 단백질을 이용한 초기 치주염의 진단방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
주요 구강 질환 중 하나인 치주염은 치주 질환 염증과 면역 반응 사이의 균형이 무너져 발생하는 감염병으로, 치주염이 악화되면 치아 손실로 이어질 수 있다.
치주염은 단백질, 면역 글로불린 및 염증 매개체의 변화를 통한 전신 염증 증가와 관련이 있으며, 치주 질환의 진단은 치주 깊이 (PD, probing depth) 및 임상적 부착 수준 (CAL, clinical attachment level)과 같은 여러 임상 지표를 바탕으로 판단될 수 있다.
최근까지는 22 % 내지 57 % 범위의 서열 유사성을 갖는 20 개 이상의 인간 S100 단백질이 공지되어 있으며, 작은 칼슘-결합 단백질(Small calcium-binding proteins)으로 알려진, S100A8 및 S100A9 단백질은 상피 세포, 과립구(granulocyte) 및 단핵구(monocyte)에서 발현된다. S100A8 및 S100A9 단백질은 세포 스트레스에 따라 세포 외 환경으로 방출되어 면역 시스템에 강력한 유도물질로 작용하며, 단핵구 및 대 식세포(macrophage)는 S100A8 및 S100A9 단백질의 가장 풍부한 공급원이다.
S100A8 단백질은 톨 유사 수용체 4 (TLR4, Toll Like Receptor 4)를 통해 파골 세포(osteoclast)를 직접 활성화 한다. 이는 면역 복합체가 선천적 면역을 활성화하여 골 파괴를 조절하는 기전이다. 또한 대장암(colorectal carcinoma), 낭성 섬유증(cystic fibrosis) 및 류마티스 관절염과 같은 많은 병리학적 상태에 관여한다고 보고되고 있고, S100A9 단백질은 활성화된 복막 대식세포를 비활성화시켜 항염증 효과를 나타냄이 마우스 실험을 통해 확인된 바 있다.
S100A8 및 S100A9 단백질은 급성 및 만성 염증 상태, 자가 면역 질환을 비롯한 다양한 인간 장애와 관련이 있을 뿐만 아니라 정상적인 생리학적 과정에서 중요한 역할을 하며, 특히, 치은열구액 (GCF, gingival crevicular fluid) 중 S100A8 및 S100A9 단백질의 농도가 증가하는 것은 치주염과 상관 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 이는 S100A8 및 S100A9 단백질이 급성 및 만성 염증에 중요한 염증 매개체로 작용하기 때문으로, 치주염 환자에서 치은열구액 중 S100A8 및 S100A9 단백질의 농도가 유의하게 높다는 것이 확인되었기 때문이다.
이와 관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2001-0034357호에서는 치은열구액에서 특정 단백질을 검출하여 치주질환을 진단하는 방법을 개시하고 있으나, 치은열구액의 채취는 침습적인 방법으로 수행된다는 문제를 해결하지 못한 실정이다.
종래 치주염 진단 시 치은열구액 채취 등 침습적인 방법으로 체액을 채취하여 한다는 문제점을 해결하기 위해, 비침습적인 방법으로 타액을 채취하여 치주염의 진단이 가능한 효과를 제공할 수 있는 치주염 진단 방법 및 치주염 진단용 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 대상체로부터 분리된 타액에서 S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는, 치주염 진단방법을 제공한다.
또한 본 발명은 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계; 상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높고, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은지 측정하는 단계;를 포함하는 치주염 진단용 정보제공방법을 제공한다.
또한 본 발명은 S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주염 진단용 조성물과 이를 포함하는 치주염 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 치주염 진단 방법 및 치주염 진단용 정보제공방법은 비침습적인 방법으로 타액을 채취하여 치주염의 진단이 가능할 뿐만 아니라, S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하여 초기 치주염을 조기에 진단할 수 있다는 효과를 갖는다.
본 발명은 치주염 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자는, 치주염 유무에 따름 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량의 증감을 실험적으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질을 이용한, 치주염 진단방법, 치주염 진단용 정보제공방법, 치주염 진단용 조성물, 치주염 진단용 키트에 대한 것이며, S100A8 및 S100A9 단백질을 이용한 치주염 진단 용도 및 이의 일체의 실시 태양을 포함한다.
본 발명에서 '대상체'는 치주염을 보유한 인간이고, '정상 대조군'은 상기 대상체와 성 연령 및 흡연 등 건강행동이 동일한 치주염을 보유하지 않은 치주 건강자를 의미한다.
본 발명에서 S100A8 단백질 및 S100A9 단백질은 S100A8 및 S100A9 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로, 두 개의 EF-hand type(helix-loop-helix) 칼슘-결합 모티프(calcium-binding motifs)를 포함하는 S100 단백질의 패밀리 단백질로 이해될 수 있다.
본 발명에서 S100A8 단백질 및 S100A9 단백질은, 해당 분야에서 S100A8 단백질 및 S100A9 단백질로 인식하는 단백질을 포함하며, 예를 들어, 대한민국 공개특허 제10-2015-0090240호에 정의된 단백질을 포함할 수 있다.
<치주염 진단방법>
본 발명의 치주염 진단 방법은 대상체로부터 분리된 타액에서 S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 진단 방법은, 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계; 상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높거나, 및/또는 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단하는 단계;를 포함한다.
일 실시예를 들어, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 60% 이상으로 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 40% 이하로 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있으며,
바람직하게는, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 70% 이상으로 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 30% 이하로 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있다.
다른 실시예를 들어, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 3000 pg/ml 이상, 바람직하게는 3000 pg/ml 이상 4000 pg/ml 이하이거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 800 pg/ml 이하, 바람직하게는 600 pg/ml 이상 800 pg/ml 이하이면, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있으며,
더욱 바람직하게는, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 3300 pg/ml 이상 3700 pg/ml 이하이거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 650 pg/ml 이상 750 pg/ml 이하이면, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 타액은, 침일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 수행될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
<치주염 진단용 정보제공방법>
본 발명의 치주염 진단용 정보제공방법은 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계; 상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단하는 단계;를 포함한다.
일 실시예를 들어, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 60% 이상으로 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 40% 이하로 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있으며,
바람직하게는, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 70% 이상으로 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 30% 이하로 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있다.
다른 실시예를 들어, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 3000 pg/ml 이상, 바람직하게는 3000 pg/ml 이상 4000 pg/ml 이하이거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 800 pg/ml 이하, 바람직하게는 600 pg/ml 이상 800 pg/ml 이하이면, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있으며,
더욱 바람직하게는, 상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 3300 pg/ml 이상 3700 pg/ml 이하이거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 650 pg/ml 이상 750 pg/ml 이하이면, 상기 대상체가 치주염임을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 타액은, 침일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계;는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 수행될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
<치주염 진단용 조성물>
본 발명의 일 구현예에 있어서, S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 S100A8 및/또는 S100A9 단백질의 발현량은 목적하는 개체의 생물학적 시료로부터 측정될 수 있다.
상기 "생물학적 시료"는, 예를 들면, 대상체 유래 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있지만, 바람직하게는 타액인 것이 보다 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 타액은 침일 수 있다.
본 발명에서 상기 S100A8 및/또는 S100A9 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 상기 S100A8 및/또는 S100A9 단백질에 상보적으로 결합하는 항체, siRNA, 시약 등 일체를 포함한다.
<치주염 진단용 키트>
본 발명의 일 구현예에 있어서, S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주암 진단용 조성물을 포함하는 치주암 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 타액 중의 S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 확인하여 치주염을 진단할 수 있다. 상기 치주염 진단용 키트는 치주염 진단에 특이적인 항체, siRNA 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 진단의 대상이 질환으로 치주염을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로서, 본 발명의 진단용 키트는 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 S100A8 및 S100A9 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
종래에는 치주염 진단을 위해 침습적 방법으로 치은열구액을 채취하여 치주염을 진단하였기 때문에 치주염 진단이 원활하게 이루어지지 않으며, 치주염의 조기 발견이 어렵다는 문제점이 있었다. 본 발명자들은 상기의 문제점을 극복하기 위해 비침습적 방법으로 타액을 채취하여 치주염 조기 진단을 가능하게 하는 효과를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
본 발명은 서울 대학교 치과 대학 인간 대상 기관 심의위원회의 승인(승인 번호: S-020060000)을 받아 진행하였으며, 모든 참가자들은 자발적으로 참여하였고, 서면 동의서를 제공하였다. 본 발명은 대규모 코호트(cohort) 연구에서 무작위로 선택된 대상으로 구성된 단면(cross-sectional) 연구이다.
참가자들은 양평 지역의 코호트(cohort)에서 단면적으로(cross-sectionally) 선발되었으며, 2010년부터 2014년까지 한국 질병 통제 예방 센터의 지원을 받아 진행된 한국 질병 역학 연구 (KoGES)에 등록한 3090명의 참가자 중 무작위로 선택되었다.
본 발명에 포함된 참가자의 선발 기준은 다음과 같다.
1) 40-85세 연령 그룹.
2) 파노라마 방사선 사진을 이용한 폐포 골 손실(ABL)에 따라 EU 지침에 의해 치주염으로 진단됨.
3) 분석 및 검증을 위한 적절한 타액 샘플을 보유함.
4) 대사 증후군에 대한 의료 정보를 보유함.
5) 흡연, 음주, 교육 및 신체 활동과 같은 기타 건강 관련 행동 요인에 대한 완전한 정보를 가지고 있어야 함.
상기의 선발 기준을 충족하는 326 명의 참가자를 선정하여, 본 발명을 진행하였다.
상기의 선발 기준 중, 2)에 대하여, 각 자연치의 방사선 ABL은 파노라마 방사선 사진 (Pax-Primo, Vatech Global, Seoul)을 사용하여 훈련된 치과 의사에 의해 평가되었다. 치주염의 결정적인 척도인 ABL(alveolar bone loss)은 치아의 백악법랑경계(CEJ, cemento-enamel junction)에서 근위 치조골 크레스트(alveolar bone crest)의 가장 높은 지점까지 남은 치아의 근심과 원위를 측정하여 평가하고 기록하였다. 세 번째 어금니를 제외한 모든 자연 치아의 근심 및 원위 부분을 측정하였다.
2 이상의 인접하지 않은 치아에서 근위 뼈 손실이 3 mm 이상인 경우 “초기(incipient) 치주염”, 치아의 30 % 이상에서 근위 뼈 손실이 5mm 이상인 경우 “심각한(severe) 치주염”으로 분류하였다. 초기 치주염 또는 심각한 치주염으로 진단된 참가자는 치주염이 없는 참가자 ("no")와 비교하여 치주염 ("yes")으로 간주하였다.
대상체로부터 분리된 타액을 채취하는 단계
샘플링 프로토콜에 대해 참가자에게 통지 한 후 각 참가자로부터 자극되지 않은 전체 타액, 즉, 침을 채취하였다. 타액 채취 1 시간 전에 참가자에게 음식을 먹거나 마시거나 양치하지 말라고 지시하였으며, 채취한 타액의 일관성을 유지하기 위해 50ml 원추형 튜브에서 10 분 동안 수동적으로 침을 흘리거나(passive drool) 또는 침을 뱉는(spitting) 방법을 사용하여 타액을 채취하였으며, 타액 분비율을 기록하였다.
타액이 담긴 바이알을 4 ℃에서 15 분 동안 2600 xg에서 원심 분리 한 다음, 고압멸균된 1.5ml 에펜도르프 튜브에 상청액 1ml을 분취(aliquot)하였다. 이후 분취된 바이알을 추가 분석을 위해 -80 ℃에 보관 하였다.
상기 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 분석하는 단계
타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트로 검출하였다.
상기 ELISA 키트 제조사가 제공한 S100A8 및 S100A9 표준 시약을 사용하여 표준 곡선(standard curve)을 그린 후, 제공된 시약 희석제를 사용하여 채취한 타액을 농도의존적(concentration dependent manner) 방식으로 희석(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32)하여, 샘플을 제조하였다.
사회 인구 통계학적 변수는 연령, 성별(남성, 여성) 및 흡연 여부, 음주 여부, 교육 수준(중졸, 고졸, 혹은 그 이상), 신체 활동(매일 운동함, 전혀 운동하지 않음), 대사 증후군(NCEP 지침에 의해 진단) 등의 행동 요인이 있으며, 모든 변수는 면담을 통해 확인하였다.
대사 증후군의 5 가지 구성 요소는 다음과 같다.
1) 중추 비만 (남성 둘레 90 cm 이상, 여성 85 cm 이상)
2) 고트리글리세리드혈증 (트리글리세리드 150 mg/dl 초과)
3) 낮은 HDL 콜레스테롤 (남성 40 mg/dl 미만, 여성 50 mg/dl 미만)
4) 고혈압 (수축기 130 mmHg 초과, 이완기 85 mmHg 초과, 혈압 약물 복용)
5) 고혈당 (110 g/dl 초과)
대사 증후군은 상기의 구성 요소 중 3 개 이상에 포함되는 경우, 해당하는 것으로 간주하였다.
상기의 구성 요소 중, 1)에 대하여, 허리 둘레는 훈련된 검사관이 측정 테이프를 사용하여 수평으로 흉곽과 장골능(iliac crest) 사이 중간 정도의 위치에서 측정하였다.
생화학적 변수(상기의 구성 요소 중, 2), 3) 및 5))에 대해서는, 12 시간 공복 혈액 샘플을 채취하였다.
본 발명에 포함된 혈청 바이오 마커는 공복 혈장 포도당, 트리글리세리드 및 HDL 콜레스테롤을 포함하며, 이 분야에서 통상적으로 사용되는 검사법을 사용하여 검사하였다.
상기의 구성 요소 중, 4)에 대해서는, 수은 압력계를 사용하여 15 분 간격으로 두 번, 앉은 자세에서 혈압 (수축기 및 이완기, mmHg)을 측정하였고, 두 시험 값의 평균을 분석에 사용하였으며, 의사는 측정된 혈압을 통해 고혈압을 진단하였다.
치주학(periodontics)에 의한 특성 변수의 분포 ("yes": 치주염이 있는 참가자, "no": 치주염이 없는 참가자)는, 연속형 변수(continuous variables)에 대해 평균값 및 표준 편차 (평균 ± SD)를 사용하였고, 범주형 변수(categorical variables)에 대해 빈도(frequency) 및 백분율 분포를 사용하였다.
통계적으로 유의한 차이는 범주형 변수에 대한 카이 제곱(Chi-square) 검정과 연속형 변수에 대한 T-검정을 사용하였고, Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 S100A8 (p <0.001) 및 S100A9 (p <0.001) 단백질의 정규 분포를 조사했으나, S100A8 및 S100A9 단백질 발현량이 정규 분포를 따르지 않기 때문에, S100A8 및 S100A9 단백질의 발현량은 log10(1+S100A8 및 S100A9)의 방정식을 사용하여 공통 로그로 변환하였다. S100A8 및 S100A9 단백질 발현량의 공통 로그(log10)변환 값은 실질적으로 정규 분포를 이루는 것을 확인하였으며, 이에 매개변수해석(parametric analysis)을 분석에 적용하였다. 공분산 분석 (ANCOVA)은 교란변수를 제어 한 후 치주염("yes" or "no")에 의해 log10S100A8 및 log10S100A9의 조정된 양 (평균 ± 표준 오차 (SE))을 추정하기 위해 적용되었다.
하기 표 1을 참조하면, 연령, 성별, 흡연, 음주, 교육, 신체 활동 및 대사 증후군 등 교란변수에 맞게 조정된 다변수 로지스틱 회귀 분석(Multivariable logistic regression analysis)을 적용하여 연관성을 평가[조정된 승산 비 (aORs, the adjusted odds ratios) 및 95 % 신뢰 구간 (CI)]하였다. 치주학에서 S100A8 및 S100A9 단백질에 대한 스크리닝 능력을 평가하기 위해 수신기 작동 특성 (ROC, receiver operating characteristi) 곡선을 AUC(the area under the curve)로 통계를 평가하는데 적용하였다.
Figure PCTKR2019010792-appb-T000001
상기 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높고, 상기 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체를 치주염과 연관시키는 단계
타액 바이오 마커 S100A8 및 S100A9와 치주염의 연관성을 평가하기 위해 평균 연령이 64.54 ± 10.14 인 141 명의 남성 및 185 명의 여성이 본 발명에 참가자로 포함되었다. 하기 표 2를 참조하면, 치주염이 있는 참가자("yes")은 치주염이 없는 참가자("no")보다 남성이 많고 흡연자가 더 많은 것을 확인할 수 있다 (p <0.05). 치주염에 연령, 음주, 교육, 신체 활동 및 대사 증후군에 의한 영향은 없는 것으로 볼 수 있었다.
Figure PCTKR2019010792-appb-T000002
하기 표 3을 참조하면, 기초 분석(crude analysis)에서, S100A8 단백질의 발현량은 치주염이 있는 참가자("yes")의 경우 약 71 % 더 높았으나 (p = 0.020), S100A9 단백질의 발현량은 치주염이 없는 참가자("no")의 경우 약 31 % 더 높았다 (p <0.001).
조정된 분석(adjusted analysis)에서는 연령, 성별, 흡연, 음주, 교육, 신체 활동 및 대사 증후군 변수를 제어 한 후, 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 검출하였다. S100A8 단백질의 평균 농도는 치주염이 있는 참가자("yes", 3490.4±1.1 pg/ml, 로그 값 3.54 ± 0.04, p<0.001)에서 치주염이 없는 참가자("no", 2050.2±1.1 pg/ml, 로그 값 3.31 ± 0.05, p<0.001)보다 약 70 %만큼 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 반면, 타액 중 S100A9 단백질의 평균 농도는 치주염이 없는 참가자("no", 919.45±1.1 pg/ml, 로그 값 2.97±0.04, p=0.019)보다 치주염이 있는 참가자("yes", 715.14±1.1 pg/ml, 로그 값 2.86±0.04, p=0.019)에서 약 28 %만큼 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2019010792-appb-T000003
연령, 성별, 흡연, 음주, 교육, 신체 활동 및 대사 증후군 변수를 제어한 후 다변수 로지스틱 회귀 분석에서 타액 중 log10S100A8 수치가 1 증가할 때, 치주염 확률은 2.2 배 (OR = 2.2, 95% CI: 1.42-3.50) 증가하는 것으로 볼 수 있다. 그러나, 타액 중 log10S100A9 수치가 1 증가할 때 치주염 확률은 0.5 배 (OR = 0.5, 95% CI: 0.24-0.86) 감소하는 것으로 볼 수 있다.
하기 표 4를 참조하면, 치주염이 있는 참가자("yes")의 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량 스크리닝 능력을 평가하기 위한, log10S100A8, log10S100A9, log10S100A8 및 log10S100A9 각각의 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선 그래프에서, 스크리닝 초기 치주염에 대한 c-statistics AUC (95% CI)가 log10S100A8 및 log10S100A9에 대해 0.69 (95% CI: 0.63-0.74, p <0.001)이고, 가장 높은 log10S100A8에 대해서는 0.67 (95% CI: 0.56-0.70, p <0.001)이고, log10S100A9에 대해서는 0.63 (95% CI: 0.61-0.73, p <0.001)인 것을 확인할 수 있다.
Figure PCTKR2019010792-appb-T000004
따라서 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량은 한국 성인의 치주염과 연관이 있음을 알 수 있다.
본 발명은 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량이 치주염과 연관되어 있음을 확인함에 있어,
1) 충분한 수의 성인들을 대상으로 다양한 잠재적 교란변수 제어한 후 실험을 진행하였다는 점; 2) 치과의사 및 전문의에 의해 임상적으로 실험을 수행하였다는 점; 3) 편파성(bias)이 최소화된 파노라마 방사선 사진을 사용하여 EU 가이드 라인에 따라 숙달된 치과의사에 의해 치주염을 평가하였다는 점; 4) S100A8 및 S100A9 단백질 각각의 발현량이 치주염에 연관이 있음이 최초로 확인되었다는 점; 5) 타액을 채취하는 것은 매우 간단하며 비침습적인 방법으로, ELISA 키트로 정량하기에도 용이하여, 병원이나 가정에서 신속 검사 키트(rapid kit)로 활용하기에도 매우 용이하다는 점; 등의 장점을 제공할 수 있다.
상기 표 3을 참조하면, 타액 중 log10S100A8는 한국 성인의 치주 건강자보다 치주염 이환자에서 유의미하게 증가하였음을 확인할 수 있으며, 또한, 교란변수 조정 후(adjusted), 타액 중 log10S100A8은 치주염이 있는 참가자가 치주염이 없는 참가자보다 증가한 것을 확인할 수 있으나, 타액 중 log10S100A9는 치주염이 있는 참가자가 치주염이 없는 참가자보다 감소한 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 치주염 환자에게서 칼슘-결합 단백질(Small calcium-binding proteins), 즉, S100A8 및 S100A9 단백질의 발현량이 증가한다는 것을 단순히 확인한 발명이 아닌, S100A8 단백질의 발현량은 증가하나, S100A9 단백질의 발현량은 감소한다는 것을 밝혀내어, 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량의 증감량을 상대적으로 판단하여 치주염을 진단하는 것에 관한 발명으로,
종래 기술 들이 S100A8 및/또는 S100A9 단백질을 검출하여 치주염을 진단하는 것과 비교하여, 타액 중 S100A8 및 S100A9 단백질을 검출하여 상대적인 증감량을 바탕으로 치주염을 진단하는 경우, 보다 낮은 농도의 S100A8 및 S100A9 단백질도 검출이 가능하여 초기 치주염을 조기에 진단할 수 있다.
본 발명의 치주염 진단 방법 및 치주염 진단용 정보제공방법은 비침습적인 방법으로 타액을 채취하여 치주염의 진단이 가능할 뿐만 아니라, S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하여 초기 치주염을 조기에 진단할 수 있다는 효과를 가지며, 상기의 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주염 진단용 조성물과 이를 포함하는 치주염 진단 키트를 제공하여, 병원과 가정에서 보다 손쉽게 치주염을 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 대상체로부터 분리된 타액에서 S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의발현량을 측정하는 단계;를 포함하는, 치주염 진단방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
    상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높거나, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단하는 단계;를 포함하는 치주염 진단 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
    상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높고, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은 경우, 상기 대상체가 치주염임을 진단하는 단계;를 포함하는 치주염 진단 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 타액은 침인 것을 특징으로 하는 치주염 진단 방법.
  5. 청구항 2 또는 3에 있어서,
    상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 60% 이상으로 높고,
    상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 40% 이하로 낮으면, 치주염으로 진단하는 것을 특징으로 하는 치주염 진단 방법.
  6. 청구항 2 또는 3에 있어서,
    상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 3000 pg/ml 이상이거나,
    상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 800 pg/ml 이하이면, 치주염인 것을 특징으로 하는, 치주염 진단 방법.
  7. 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
    상기 분리된 각각의 타액으로부터 S100A8 및 S100A9 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    상기 대상체의 타액 중 S100A8 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A8 단백질 발현량보다 높고, 상기 대상체의 타액 중 S100A9 단백질 발현량이 정상 대조군의 타액 중 S100A9 단백질 발현량보다 낮은지 측정하는 단계;를 포함하는 치주염 진단용 정보제공방법.
  8. S100A8 및 S100A9 단백질 중 하나 이상의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 치주염 진단용 조성물.
  9. 청구항 8에 따른 치주염 진단용 조성물을 포함하는 치주염 진단 키트.
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