WO2020040612A1 - 타액 중의 mmp-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 - Google Patents

타액 중의 mmp-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 Download PDF

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    • G01N2333/96419—Metalloendopeptidases (3.4.24)

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic method, information providing method, compositions and kits for oral cancer using MMP-9 in saliva.
  • HNC Head and Neck Cancer
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • Oral squamous cell carcinoma occurs through a series of molecular mutations that lead to hyperplasia, dysplasia, uncontrolled cell growth from in situ carcinoma and invasive carcinoma.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2015-0125030 discloses a pharmaceutical composition for the treatment of pre-oral cancer and techniques related to the prediction or diagnosis of oral cancer or oral cancer.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2015-0125030
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned conventional technical problems, the present inventors completed the present invention by evaluating MMP-9 as a biomarker that can accurately predict and diagnose the occurrence, recurrence and prognosis of oral cancer.
  • MMP-9 can be suitably used as a biomarker for the diagnosis of oral cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing oral cancer, comprising measuring the concentration of Matrix-metalloproteinase-9 (MMP-9) in saliva isolated from a subject.
  • MMP-9 Matrix-metalloproteinase-9
  • the present invention the step of separating the saliva from the subject and the normal control, respectively;
  • It provides a method for providing oral cancer diagnostic information comprising the step of measuring whether the concentration of MMP-9 in the saliva of the subject is higher than the concentration of MMP-9 in the saliva of the normal control.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing oral cancer, which includes an agent for measuring the level of MMP-9.
  • the present invention provides a kit for diagnosing oral cancer comprising the composition.
  • MMP-9 in saliva as a biomarker, it can substantially help to screen high-risk individuals of oral cancer before or after the onset of oral cancer, which reduces the incidence of oral cancer and the survival rate. It is expected to be able to facilitate.
  • the recurrence of oral cancer can be predicted in advance, which can be usefully used for efficient treatment and management.
  • 1 is a graph showing the results of repeated measures ANOVA of MMP-9 in saliva according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing a receiver operating characteristic curve of MMP-9 (A) for oral squamous cell carcinoma according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to biomarkers and their use for predicting oral cancer diagnosis and prognosis.
  • MMP-9 Motrix-metalloproteinase-9
  • MMP-9 can be used as a biomarker that can accurately predict and diagnose the occurrence, recurrence and prognosis of oral cancer, and completed the present invention.
  • the present invention relates to oral cancer diagnostic method, oral cancer diagnostic information providing method, oral cancer diagnostic composition, and oral cancer diagnostic kit using MMP-9 in saliva, diagnostic use of oral cancer using MMP-9 and any implementation thereof Contains the sun.
  • Oral cancer diagnostic method of the present invention comprises the step of measuring the concentration of MMP-9 (Matrix-metalloproteinase-9) in saliva isolated from the subject.
  • MMP-9 Microx-metalloproteinase-9
  • ECM extracellular matrix
  • MMP-9 (Matrix-metalloproteinase-9) used in the present invention is a proteolytic enzyme that efficiently decomposes the components of ECM and the membrane.
  • the mechanism of MMP-9 is to break down type IV collagen, which is the main component of the basement membrane, and other types of collagen, such as type V, VII and X collagen, elastin and fibronectin.
  • the sequence of the MMP-9 protein is known and can be obtained by chemical synthesis (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc .. 85: 2149-2156, 1963) or using genetic recombination techniques. When prepared by chemical synthesis, it can be obtained using a polypeptide synthesis method well known in the art. For example, it includes a protein defined in Korean Patent Publication No. 10-2017-0098338.
  • oral cancer diagnosis method comprising the steps of collecting and separating saliva from the subject and the normal control, respectively; Measuring the concentration of MMP-9 from each of the isolated saliva; And diagnosing that the subject is oral cancer when the concentration of MMP-9 in the saliva of the subject is higher than the concentration of MMP-9 in the saliva of the normal control group.
  • the concentration of MMP-9 in saliva when the concentration of MMP-9 in saliva is measured at 500ng / ml or more, it can be diagnosed as oral cancer, and preferably, oral cancer can be selected when it is 900ng / ml or more.
  • the oral cancer may be oral squamous cell carcinoma (OSCC), but is not limited thereto.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • the subject means a subject for diagnosis of oral cancer, and includes a human subject.
  • the human subject includes a person suspected of having oral cancer, a person with oral cancer, a person who is not suspected of having oral cancer, a person who needs diagnosis of oral cancer, or a person who is recovering after the invention and needs to measure oral cancer prognosis. .
  • Oral cancer diagnostic method of the present invention may be one or more selected from the group consisting of biological samples, for example, tissues, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine, etc. isolated from the subject, more preferably saliva
  • the saliva may be saliva.
  • Oral cancer diagnostic method of the present invention may include detecting the MMP-9 in saliva, and measuring the concentration of MMP-9 through immunoassay.
  • the immunoassay may include, but is not limited to, a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • oral cancer diagnosis may include progression and recurrence of oral cancer, and the prognosis may be relapse, survival, or disease free survival.
  • Oral cancer diagnostic information providing method of the present invention, the step of collecting and separating the saliva from the subject and the normal control, respectively; Measuring the concentration of MMP-9 from each of the isolated saliva; And determining whether the concentration of MMP-9 in saliva of the subject is higher than the concentration of MMP-9 in saliva of the normal control group.
  • the oral cancer may be oral squamous cell carcinoma (OSCC), but is not limited thereto.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • the present invention relates to a composition for diagnosing oral cancer, including an agent for measuring the level of MMP-9.
  • the level of MMP-9 that is, the concentration of MMP-9
  • the concentration of MMP-9 can be measured from a biological sample of the desired individual.
  • the “biological sample” may include, for example, one or more selected from the group consisting of subject-derived tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like, preferably saliva, and more preferably, more Preferably the saliva may be saliva.
  • the agent for measuring the level of the MMP-9 in the present invention is not particularly limited, for example, the MMP- such as antibodies, siRNA, reagents and the like complementary to all or part of the protein of the MMP-9
  • the value of 9 includes all means and substances which can be measured.
  • kits for diagnosing oral cancer comprising a composition for diagnosing oral cancer comprising a formulation for measuring the level of MMP-9.
  • the kit can diagnose oral cancer by checking the level of MMP-9 in saliva, that is, the concentration of MMP-9.
  • the kit for diagnosing oral cancer may include an antibody, siRNA, or the like specific to the diagnosis of oral cancer, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods.
  • the subject of diagnosis may include oral cancer as a disease, and preferably, oral squamous cell carcinoma.
  • the kit may be an RT-PCR kit, a DNA chip kit, an ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit, but is not limited thereto.
  • MRM multiple reaction monitoring
  • the diagnostic kit of the present invention may include essential elements known in the art as the kit is necessary for performing an ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the protein.
  • Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for marker proteins and have little cross-reactivity to other proteins and are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies.
  • the ELISA kit can also include antibodies specific for the control protein.
  • Other ELISA kits are capable of binding reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (eg conjugated with the antibody) and substrates or antibodies thereof. Other materials and the like.
  • the pilot test with 10 participants showed that the concentration of MMP-9 (mean ⁇ standard deviation, ng / ml) was 921.5 ⁇ 810.2 ng / ml in the patient group and the concentration in the control group was 40.4 ⁇ 32.1. ng / ml.
  • Type I errors were 0.05, type II errors were 0.8, and 76 patients and 152 controls were evaluated under two ratio conditions between the patient and control groups. In addition, four subsequent studies involving an attrition rate of 50% required a group of 106 patients. Thus, MMP-9 was designed as 318 patients (106 patients and 212 controls).
  • the oral squamous cell carcinoma (OSCC) patient group participated in the outpatient clinic of the Oral and Maxillofacial Surgery of the Seoul National University Dental Hospital (SNUDH) from 2015 to 2018.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • the control group was randomly selected from the cardiovascular and periodontal health cohort of Yangpyeong, which is part of the Korean Genome and Epidemiologic Study (KoES) population supported by the Korea Centers for Disease Control and Prevention from 2010 to 2014.
  • KoES Korean Genome and Epidemiologic Study
  • the control group was randomly selected according to the age, sex and smoking status of cancer patients among the 3090 primary participants enrolled in the project. As a final diagnosis, out of 156 registered OSCC patients with OSCC, only 106 patient groups met the inclusion criteria for MMP-9 due to insufficient saliva samples for analysis.
  • control group was consistent with the patient group according to age, sex and smoking status. Finally, a total of 318 participants (106 patient groups and 212 controls) were included for the final analysis of MMP-9.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • the oral and maxillofacial pathology specialists examined the specimens histologically, and the oral and maxillofacial surgeons specialists used panoramic radiographs, enhanced computed tomography (CT), enhanced computed tomography (MRI), and Tumor type and location were examined using PET-CT (positron emission tomography-computed tomography).
  • CT computed tomography
  • MRI enhanced computed tomography
  • Tumor type and location were examined using PET-CT (positron emission tomography-computed tomography).
  • All participants provided demographic information such as age and gender, health-related behavioral variables and a history of systemic diseases.
  • Body mass index (BMI) contraction and relaxation blood pressure were obtained by physical examination, and pre-operative fasting plasma glucose (FPG) and fasting total cholesterol (FTC) were tested by serum laboratory tests. Obtained from the results.
  • FPG fasting plasma glucose
  • FTC fasting total cholesterol
  • Diabetes status Diabetes was verified by classifying FPGs into two groups according to diagnostic criteria of the American Diabetes Association (ADA).
  • ADA American Diabetes Association
  • Hypercholesterolemia Classified into two groups according to the criteria of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP-ATP III).
  • Hypertension Blood pressure was measured twice using a mercury manometer at 15 minute intervals in the sitting position of the subject's systolic blood pressure (SBP) (mmHg) and diastolic blood pressure (DBP) (mmHg). The average of the two measurements was used for analysis in the experiment.
  • SBP systolic blood pressure
  • DBP diastolic blood pressure
  • Hypertension was evaluated in two groups according to the Joint National Committee's criteria (2004, 7 th ) for the prevention, detection, evaluation and treatment of hypertension.
  • Radiographic alveolar bone loss (RABL) for each natural tooth is assessed by a trained dentist using a panoramic radiograph (Orthopantomograph OP100, GE Healthcare, Finland). It became.
  • Periodontitis was diagnosed by measuring RABL in the mesial and distal portions of the remaining teeth up to the highest point of the adjacent alveolar bone crest in the cemento-enamel junction (CEJ) of the tooth. At this time, the mesial and distal portions of all natural teeth except the third molar were measured.
  • saliva ie saliva
  • saliva was collected from each participant. 1 hour prior to saliva collection, participants were instructed not to eat, drink or brush their teeth, and were passively drooled or spitting for 10 minutes in a 50 ml conical tube to maintain consistency of the collected saliva. Saliva was collected using the method.
  • the vial containing the saliva was centrifuged at 2600 rpm for 15 minutes at 4 ° C, and then aliquot 1 ml of the supernatant in an autoclaved 1.5 ml Eppendorf tube. The aliquots were then stored in a freezer at -80 ° C and the necessary saliva samples thawed for use in the analysis. The same saliva collection method was used for the control.
  • Saliva biomarkers namely matrix-metalloproteinase-9 (MMP-9), were detected with a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.
  • MMP-9 matrix-metalloproteinase-9
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Quantikine® human MMP-9 immunoassay (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) was used for detection of MMP-9 in saliva. All experiments were performed according to the manufacturer's instructions.
  • ANOVA analysis of variance
  • the screening ability of MMP-9 in saliva against OSCC was obtained through the receiver operating characteristics (ROC) curve.
  • the ROC curve generated AUC (area under the curve) by numerical integration, demonstrating the screening ability of the marker.
  • AUC area under the curve
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • the AUC value (p ⁇ 0.001) of MMP-9 was 0.96 (100% specificity, 89.6% sensitivity) with a 95% confidence interval (CI) of 0.93-0.99 (see Figure 2).
  • the present inventors evaluated MMP-9 in saliva during the study to identify and accurately diagnose the onset, recurrence and prognosis of oral cancer, and as a result, the possibility of use of MMP-9 as a diagnostic marker for oral cancer was evaluated. In addition, it was confirmed that it can also be used to determine the recurrence and prognosis after oral cancer surgery.
  • the present inventors have found that the concentration of MMP-9 in saliva in oral cancer is increased from the results of the study on the oral squamous cell carcinoma (OSCC) patient group and age, sex, and smoking. Significantly increased, salivary biomarker MMP-9 showed good discrimination in screening oral squamous cell carcinoma (OSCC).
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • MMP-9 may be a prognostic marker for oral squamous cell carcinoma (OSCC).
  • ROC curve analysis data of MMP-9 at 120.9 ng / ml cut-off value of MMP-9 revealed that the AUC value was 0.96 and the AUC value was 0.96 (p ⁇ 0.001).
  • the diagnostic method of oral cancer of the present invention is that follow-up values of MMP-9 (ng / ml) after tumor surgery were 445.89 for 3 months and 392.17, 9 for 6 months after surgery at 927 before surgery. It was confirmed that the number decreased sharply to 196.01 over the month.
  • the saliva biomarker MMP-9 identified in the present invention is an excellent screening and prognostic marker of oral cancer such as oral squamous cell carcinoma (OSCC) with sensitivity and specificity.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • MMP-9 in saliva as a biomarker, it can substantially help to screen high-risk individuals of oral cancer before or after the onset of oral cancer, which reduces the incidence of oral cancer and the survival rate. It is expected to be able to facilitate.
  • the recurrence of oral cancer can be predicted in advance, which can be usefully used for efficient treatment and management.

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Abstract

본 발명은 타액 중의 MMP-9를 바이오마커로 사용함으로써, 구강암 발병 전 및 구강암 발병 초기 단계에서 구강암의 고위험 개체를 선별하는 데 실질적으로 도움이 될 수 있으며, 구강암의 발생률을 줄이고 생존율을 촉진할 수 있는 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

타액 중의 MMP-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트
본 발명은 타액 중의 MMP-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다.
구강암, 인두암 및 후두암 등을 포함하는 두경부암(Head and Neck Cancer, HNC) 은 전세계적으로 6번째로 흔한 암이며, 이환율(morbidity rate)이 높고, 5년 생존율이 단지 50%에 불과한 것으로 알려져 있다.
두경부암 중 구강암은 90% 이상이 편평상피에서 발생하는 구강 편평세포암(OSCC; oral squamous cell carcinoma)이며, 대체로 50~60세에서 나타난다.
구강 편평세포암은 과형성(hyperplasia)에서 이형성(dysplasia), 계내 암종으로의 제어되지 않은 세포 성장으로 이어지고 침습 암종(invasive carcinoma)으로 이어지는 일련의 분자 돌연변이를 통해 발생한다.
이러한 구강 편평세포암은 육안 검사를 위해 가장 접근하기 쉬운 영역에서 발생함에도 불구하고, 명확한 조기 위험 징후가 없어서 병기 결정 및 종양진행에 영향을 미친다. 이에 따라 일반적으로 대부분 병증이 악화된 단계에서 진단되어 생존율이 낮다.
현재까지, 수술 및 방사선 치료가 주 치료법이나, 구강 편평세포암과 같은 구강암의 발생 위치가 머리와 목에 있기 때문에 일반적으로 환자의 수술 후 결함과 기능 장애를 초래한다.
따라서 우수한 결과로 보다 효과적인 치료를 위해서는 구강암의 조기 진단이 필수적이다.
한편, 모든 개체는 종양의 공격성으로 인해 고유한 예후를 가지므로 종양을 크기, 림프절 전이 및 원격 전이(distant metastasis)로 분류하는 TNM 병기 시스템에서 유사하게 작용하지 않는다.
관련하여, 대한민국 공개특허 제10-2015-0125030호에서는 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법에 관한 기술을 개시하고 있다.
하지만, 구강암을 조기 진단하고 예후를 판단할 수 있으며, 나아가 수술 후 재발 가능성 여부를 판단할 수 있는 진단 마커의 개발이 여전히 부족하며, 이에 대한 연구개발이 지속적으로 필요한 실정이다.
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제10-2015-0125030호
본 발명은 상술한 종래 기술적 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명자들은 구강암의 발생, 재발 및 예후를 정확하게 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커로서 MMP-9를 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 구강암의 진단을 위한 바이오마커로서 MMP-9를 적합하게 사용할 수 있음을 규명하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 MMP-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 대상체로부터 분리된 타액에서 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 구강암의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
상기 분리된 각각의 타액으로부터 MMP-9의 농도를 측정하는 단계; 및
상기 대상체의 타액 중 MMP-9의 농도가 정상 대조군의 타액 중 MMP-9의 농도 보다 높은지 측정하는 단계;를 포함하는 구강암 진단용 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MMP-9의 수치를 측정하는 제제를 포함하는, 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 타액 중의 MMP-9를 바이오마커로 사용함으로써, 구강암 발병 전 및 구강암 발병 초기 단계에서 구강암의 고위험 개체를 선별하는 데 실질적으로 도움이 될 수 있으며, 이는 구강암의 발생률을 줄이고 생존율을 촉진 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 구강암의 재발을 미리 예측할 수 있어 효율적인 치료 및 관리가 이루어지는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 타액 중의 MMP-9의 반복측정 분산분석(Repeated Measure ANOVA) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 구강 편평상피세포암에 대한 MMP-9(A) 의 수신기 조작 특성곡선(Receiver operating characteristic curve)을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 구강암 진단 및 예후를 예측할 수 있는 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자는, 구강암의 발생, 재발 및 예후를 정확하게 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커로서 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)을 사용할 수 있음을 실험적으로 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 타액 중의 MMP-9를 이용한, 구강암 진단방법, 구강암 진단용 정보제공방법, 구강암 진단용 조성물, 및 구강암 진단용 키트에 대한 것이며, MMP-9를 이용한 구강암의 진단 용도 및 이의 일체의 실시 태양을 포함한다.
<구강암 진단방법>
본 발명의 구강암 진단 방법은 대상체로부터 분리된 타액에서 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)의 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
암 진행의 중요한 특징 중 하나는 세포외기질(ECM)의 분해이며, 이는 암 세포가 주변 조직에 침입할 수 있게 한다.
본 발명에서 사용한 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)는 ECM과 기적막의 성분을 효율적으로 분해하는 단백질 분해 효소이다. 예컨데, MMP-9의 기작은, 기저막의 주요 성분인 IV형 콜라겐과, 다른 유형의 콜라겐, 예컨대 V형, VII형 및 X형 콜라겐, 엘라스틴 및 피브로넥틴을 분해하는 것이다.
MMP-9 단백질의 서열은 공지되어 있으므로 화학적 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156,1963)하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 공보 10-2017-0098338호에 정의된 단백질을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 구강암 진단 방법은 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계; 상기 분리된 각각의 타액으로부터 MMP-9의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 대상체의 타액 중 MMP-9의 농도가 정상 대조군의 타액 중 MMP-9의 농도보다 높은 경우, 상기 대상체가 구강암임을 진단하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 타액 중 MMP-9의 농도가 500ng/ml 이상으로 측정되면 구강암으로 진단할 수 있고, 바람직하게는 900ng/ml 이상인 경우에 구강암을 선별할 수 있다.
본 발명에서 상기 구강암은, 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma; OSCC)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 대상체는 구강암 진단 여부의 대상을 의미하며, 인간을 대상으로 포함한다. 이때, 인간 대상체는 구강암이 발명했을 것으로 의심되는 사람, 구강암이 발병한 사람, 구강암이 의심되지 않는 사람으로 구강암 진단 여부가 필요한 사람 또는 발명 후 회복되고 있는 사람으로 구강암 예후 측정이 필요한 사람을 포함한다.
본 발명의 구강암 진단 방법은 대상체로부터 분리된 생물학적 시료, 예를 들어, 대상체 유래 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 타액인 것이 보다 바람직하며, 이 때 상기 타액은 침일 수 있다.
본 발명의 구강암 진단 방법은 면역분석법을 통해 타액 중의 MMP-9를 검출하고, MMP-9의 농도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 면역 분석법으로는 ELISA(sensitive enzyme-linked immunosorbent assay) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 구강암 진단은 구강암의 진행(progression) 및 재발(Recurrence) 등을 포함할 수 있고, 예후는 재발, 생존, 또는 무병생존 일 수 있다.
<구강암 진단용 정보제공방법>
본 발명의 구강암 진단용 정보제공방법은, 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계; 상기 분리된 각각의 타액으로부터 MMP-9의 농도를 측정하는 단계; 및 상기 대상체의 타액 중 MMP-9의 농도가 정상 대조군의 타액 중 MMP-9의 농도 보다 높은지 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 구강암은, 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma; OSCC)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
<구강암 진단용 조성물>
본 발명의 일 구현예에 따르면, MMP-9의 수치를 측정하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 MMP-9의 수치, 즉 MMP-9의 농도는 목적하는 개체의 생물학적 시료로부터 측정될 수 있다.
상기 "생물학적 시료"는, 예를 들면, 대상체 유래 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있지만, 바람직하게는 타액인 것이 보다 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 타액은 침일 수 있다.
본 발명에서 상기 MMP-9의 수치를 측정하는 제제는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 상기 MMP-9의 단백질의 전부 또는 일부에 상보적으로 결합하는 항체, siRNA, 시약 등 상기 상기 MMP-9의 수치를 측정 가능한 모든 수단 및 물질을 포함한다.
<구강암 진단용 키트>
본 발명의 일 구현예에 있어서, MMP-9의 수치를 측정하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 타액 중의 MMP-9의 수치, 즉 MMP-9의 농도를 확인하여 구강암을 진단할 수 있다. 상기 구강암 진단용 키트는 구강암 진단에 특이적인 항체, siRNA 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 진단의 대상이 질환으로 구강암을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 구강 편평상피세포암일 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로서, 본 발명의 진단용 키트는 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 것으로 해당 분야에 알려져 있는 필수 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험방법
1-1. 실험 설계 및 윤리적 고려(Ethical consideration and study design)
본 실험은 서울대학교 치과 병원 인간 피험자 기관감사회(CRI15017)와 서울대학교 치과 대학의 승인을 받았다(S-020060000).
모든 참여자는 본 연구의 목적에 대한 설명을 듣고 자발적으로 참여하였으며, 서면 동의 하였다.
1-2. 표본 크기 추정(Sample size estimation)
10명의 참여자(각 5명의 환자군 및 대조군)를 통한 파일럿 테스트 결과, MMP-9의 농도(평균±표준편차, ng/ml)는 환자군의 경우 921.5 ± 810.2 ng/ml 였고 대조군의 농도는 40.4 ± 32.1 ng/ml 였다.
I 형 오류가 0.05, II 형 오류가 0.8이고, 환자군과 대조군 사이의 2 비율 조건 하에서 76 명의 환자군과 152 명의 대조군이 평가되었다. 또한, 50 %의 감손율(attrition rate)을 포함한 4회 후속 연구는 106 명의 환자군이 필요하다. 따라서, MMP-9는 318명(환자군 106명 및 대조군 212명) 으로 설계되었다.
1-3. 참여자 선택 (Selection of participants)
구강 편평상피세포암(OSCC) 환자군은 2015년부터 2018년까지 서울 대학교 치과 병원(SNUDH) 구강악안면외과(Oral and Maxillofacial Surgery)의 외래 환자 진료소를 방문한 참여자를 대상으로 하였다.
최종적으로, OSCC가 있는 환자군은 다음과 같은 기준을 적용하여 선정하였다:
i) 자발적으로 참여하기로 합의한 참가자,
ii) 분석 및 검증을 위한 충분한 타액 샘플(30ul 이상의 타액 샘플)을 제공할 수 있는 참가자,
iii) 항암 화학요법(chemotherapy) 및/또는 방사선 치료의 이력이 없는 참가자,
iv) 본 연구에 포함된 공변량의 누락 정보가 없는 참가자,
v) 임신상태가 아닌 참가자, 및
vi) 구강 악안면 부위의 염증성 질환뿐만 아니라, 자가면역질환(auto-immune disorders) 및/또는 암 부위 이외의 감염이 없는 참가자.
대조군은 2010년부터 2014년까지 한국 질병 통제 예방 센터가 지원하는 한국 유전체 및 역학 조사(Korean Genome and Epidemiologic Study, KoGES) 집단의 일부인 양평의 심혈관 및 치주 건강 코호트에서 무작위로 선택하였다.
본 프로젝트에 등록한 3090명의 기본 참여자 중 암환자의 연령, 성별 및 흡연 여부에 따라 대조군을 무작위로 선택하였다. 최종 진단으로, OSCC를 가진 등록된 156 명의 OSCC 환자 중에서, 분석을 위한 불충분 한 타액 샘플로 인해 106명의 환자군만이 MMP-9에 대한 포함 기준을 충족 시켰다.
대조군은 연령, 성별 및 흡연 여부에 따라 환자군과 일치하였다. 마지막으로, MMP-9의 최종 분석을 위해 총 318명의 참가자(환자군 106명 및 대조군 212명)가 포함되었다.
1-4. 구강 편평상피세포암의 평가 (Assessment of oral squamous cell carcinoma)
첫 방문시, 구강외과 전문의가 구강 검사를 실시한 후 의심되는 병변에 대한 임상 및 방사선 사진을 주의깊게 관찰한 뒤, 절개생검(incisional biopsy)을 실시하였다.
구강 편평상피세포암(OSCC)의 최종 진단은 서울 대학교 치과 병원(SNUDH)의 두 부서에서 확인하였다:
구강 병리과(Oral and Maxillofacial Pathology)의 전문의가 조직학적으로 표본을 검사하였고, 구강 및 상악안면외과의 전문의가 파노라마식 방사선 사진(panoramic radiograph), CT(enhanced computed tomography), MRI(enhanced computed tomography) 및 PET-CT(positron emission tomography-computed tomography)를 이용하여 종양 유형 및 위치를 검사하였다.
두 기록을 검토 한 후 수술을 받은 환자가 본 연구에 포함되었다. 수술 후, 종양의 위치 및 TNM 병기에 대한 정보는 국제 종양학 코드 분류법[ICD-0] C02.0-C06.9을 사용하여 종양의 생검(gross biopsy)으로부터 얻어졌다. TNM 병기 결정에 관해서는, 본 연구는 0기으로 알려진 계내에서 암종을 포함하였다.
1-5. 교란요인들의 평가 (Assessment of confounders)
모든 참가자는 연령 및 성별, 건강 관련 행동 변수 및 전신 질환(systemic diseases)의 병력과 같은 인구 통계학 정보를 제공하였다.
체질량 지수(Body mass index, BMI), 수축 및 이완 혈압은 신체 검사를 통해 얻었고, 수술 전 공복혈당(pre-operative fasting plasma glucose, FPG) 및 공복 총 콜레스테롤(fasting total cholesterol, FTC)은 혈청 실험실 테스트 결과로부터 얻었다.
변수는 다음과 같이 분리하였다.
- 성별: 남성(Male) 및 여성(Female)
- 교육수준: 중학교 이하 및 고등학교 이상
- 흡연 여부: 흡연자("yes") 및 비흡연자 ("no")
- 음주 여부: 음주자("yes") 및 비음주자 ("no")
- 운동 여부: 매일 최소 30분 동안 신체활동을 하는 참가자 및 신체활동을 하지 않는 참가자
- 비만여부: BMI를 이용하여 체중(kg)을 키(height)의 제곱으로 나누었을 때, <25.0 kg/m2 인 경우 비만이 아닌 참가자("no") 및 ≥25.0 kg/m2 인 경우 비만인 참가자("yes")
생화학적 변수의 경우, 12시간동안 공복 상태에서 참가자로부터 혈액 샘플을 채취하였고, 본 실험에 포함된 혈청 바이오마커는 공복혈당(fasting plasma glucose, FPG)(mg/dl) 및 공복 총 콜레스테롤(fasting total cholesterol, FTC)(mg/dl) 이였다.
- 당뇨병 여부: 당뇨병은 미국 당뇨병학회(American Diabetes Association, ADA)의 진단 기준에 따라 FPG를 2개의 그룹으로 분류함으로써 검증되었다.
FPG <126mg/dl 인 경우 당뇨병이 없는 참가자("no") 및 FPG ≥126mg/dl이거나, 인슐린 주사를 맞거나 당뇨병 치료제를 복용하거나 및/또는 의사가 당뇨병으로 진단한 참가자("yes")
- 고콜레스테롤혈증(Hypercholesterolemia) 여부: 미국 콜레스테롤 교육프로그램(National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III, NCEP-ATP III)의 기준에 따라 2개의 그룹으로 분류되었다.
FTC <240 mg/dl 인 경우, 고콜레스테롤혈증이 없는 참가자("no") 및 FTC ≥240mg/dl 이거나 항 콜레스테롤제를 복용하는 참가자("yes")
- 고혈압 여부: 혈압은 대상체의 수축기 혈압(systolic blood pressure, SBP)(mmHg) 및 이완기 혈압(diastolic blood pressure, DBP) (mmHg)을 앉은 자세에서 15분 간격으로 수은 압력계를 사용하여 2회 측정하였고, 2회 측정한 값의 평균값을 실험에 분석에 사용하였다.
고혈압의 예방, 검출, 평가 및 치료에 대한 JNC(Joint National Committee)의 기준(2004, 7th)에 따라 2 개의 그룹으로 분류하여 고혈압을 평가 하였다.
SBP <140 mmHg 또는 DBP <90mmHg 인 경우 고혈압이 없는 참가자("no") 및 SBP≥140mmHg 또는 DBP≥90mmHg이거나 고혈압 치료제를 복용하고 있는 참가자("yes")
- 치주염 여부: 각 자연치아에 대해 방사선 촬영한 치조골 소실(radiographic alveolar bone loss, RABL)은 파노라마식 방사선 사진(panoramic radiograph)(Orthopantomograph OP100, GE Healthcare, Finland )을 사용하여 훈련된 치과의사에 의해 평가되었다.
치주염은 치아의 백악법랑경계(CEJ, cemento-enamel junction)에서 인접하는 치조골 크레스트(alveolar bone crest)의 가장 높은 지점까지 남은 치아의 중간(mesial) 및 말단(distal) 부분에서 RABL을 측정함으로써 진단되었고, 이때 3번재 어금니를 제외한 모든 자연치의 중간(mesial) 및 말단(distal) 부분을 측정하였다.
EU 지침(5th European workshop in Periodontology)에 따라, 세가지 카테고리로 참가자를 분류하였고, 구체적으로, 2개 미만의 인접하지 않은 치아에서 가까운쪽의 뼈 손실이 <3mm 인 경우 "정상", 2개 이상의 인접하지 않은 치아에서 가까운쪽의 뼈 손실이 ≥3mm 이 경우 "초기(incipient) 치주염", 치아의 30% 이상에서 가까운쪽의 뼈 손실이 ≥5mm 인 경우 "심각한(severe) 치주염"으로 분류하였다.
본 실험에서, 초기 치주염 또는 심각한 치주염으로 진단된 참가자는 치주염이 없는 정상인 참가자 ("no")와 비교하여 치주염 ("yes") 그룹으로 간주하였다.
1-6. 타액 샘플링 (Saliva sampling)
샘플링 프로토콜에 대해 참가자에게 통지 한 후 각 참가자로부터 자극되지 않은 전체 타액, 즉 침을 채취하였다. 타액 채취 1 시간 전에 참가자에게 음식을 먹거나 마시거나 양치하지 말라고 지시하였으며, 채취한 타액의 일관성을 유지하기 위해 50ml 원추형 튜브에서 10 분 동안 수동적으로 침을 흘리거나(passive drool) 또는 침을 뱉는(spitting) 방법을 사용하여 타액을 채취하였다.
타액 분비율을 기록한 다음, 타액이 담긴 바이알을 4℃에서 15 분 동안 2600 rpm에서 원심 분리 한 후, 고압멸균 처리된 1.5ml 에펜도르프 튜브에 상청액 1ml을 분취(aliquot)하였다. 이후 분취된 바이알을 -80℃의 냉동고에 보관 하였고, 필요한 침 샘플을 분석에 사용하기 위해 해동시켰다. 동일한 타액 수집방법을 대조군에도 사용하였다.
1-7. MMP-9의 평가 (Assessment of MMP-9)
타액 바이오 마커, 즉 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)은 ELISA(sensitive enzyme-linked immunosorbent assay) 키트로 검출하였다.
타액 중의 MMP-9 검출을 위해 Quantikine® human MMP-9 immunoassay (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)를 사용하였다. 모든 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
1-8. 통계 분석 (Statistical Analysis)
모든 통계 분석의 통계적 유의성은 p-value <0.05로 설정하였다.
연구 대상자의 환자와 대조군 별 특성의 차이는 연속형 변수(continuous variables)에서 평균값 및 표준 편차 (평균 ± SD)로 나타낸 t-검정(t-test)을 사용하고, 범주형 변수(categorical variables)에서 빈도 분포로 나타낸 카이-제곱 검정을 사용하여 비교하였다 (표 1 참조).
공분산 분석(Analysis of variance, ANOVA )을 적용하여 OSCC인 경우와 연령, 성별 및 흡연여부가 일치하는 대조군 사이의 타액 중의 MMP-9 양을 평가하였다. 또한, 3개월, 6개월 및 9개월의 투병기간 동안의 차이를 평가하기 위해 대응표본 T-검정(paired-T test) 및 반복 측정 공분산 분석(repeated measure ANOVA)을 적용하였다.
MMP-9의 값이 정규 분포를 따르지 않기 때문에(Kolmogorov-Smirnov 테스트, p<0.001), 모수 분석(parametric analysis)을 위해 log10(MMP-9+1)의 방정식을 사용하여 자연 로그로 값을 변환하였다. 이로부터 자연로그 값으로 변환된 MMP-9의 값 역시 정규분포를 나타내는 것은 아니지만, 더 나은 분포를 나타내는 것을 확인하였다. 공분산 분석 (ANCOVA)은 혼란 변수를 제어 한 후 log10 MMP-9의 보정된 양 (평균 ± 표준 오차 (SE))을 추정하기 위해 적용되었다. 수술 전후의 MMP-9의 변화 측정을 위해, 쌍체 및 반복 측정 ANOVA가 적용되었다.
OSCC에 대한 타액 중의 MMP-9의 스크리닝 능력은 ROC (receiver operating characteristics) 곡선을 통해 얻었다. ROC 곡선은 수치 적분에 의해 AUC(area under the curve)를 생성하였으며, 이는 마커의 스크리닝 능력을 보여 주었다. 이 때, 0.5에서 1.0 사이의 AUC 값이 높을수록 예측 값의 더 높은 성능을 반영하므로 1.0에 가까운 AUC 값은 완벽한 예측을 나타낸다.
실시예 2: 구강암을 진단할 수 있는 바이오마커로서 타액 중의 MMP-9 평가
2-1. 참가자 특성(Characteristics of participants)
MMP-9의 경우, 총 318 명 중 106 명이 구강 편평상피세포암(OSCC)이 있는 환자군(평균 63.14세의 남성 62명 및 여성 44명)이며 212 명은 대조군(평균 63.07세의 남성 124명 및 여성 88명) (표 1 참조). 대조군은 구강 편평상피세포암(OSCC)이 있는 사람의 연령, 성별, 흡연 여부와 일치시켰다.
하기 표 1을 참조하면, MMP-9 참가자에 대하여, 구강 편평상피세포암(OSCC)이 있는 환자군(즉, cancer case)과 대조군(즉, cohort control)은 알코올 섭취, 교육 수준, 신체 활동, 치주염, 당뇨병 및 고콜레스테롤혈중에서 유의한 차이(p<0.05)가 있는 반면, 비만 차이는 영향이 없는 것을 확인하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2019010797-appb-I000001
2-2. 보정된 MMP-9 값(Adjusted MMP-9 values)
수술 전후의 구강 편평 세포 암종에서의 MMP-9의 양이 기재된 표 2를 참조하면, 타액 중의 MMP-9(ng/ml)의 초기 값(crude value) (평균± SD)은 대조군보다 구강 편평상피세포암(OSCC)의 환자군 경우에 유의하게 더 높은 것을 확인할 수 있었다(927.76±809.26 vs. 41.60±33.13, p<0.001). 또한, 공변량을 조정 한 후에도 여전히 유의미한 것을 확인할 수 있었다(평균 ± 표준오차[SE]: 511.86±0.12 vs. 29.20±0.08, p<0.001).
[표 2]
Figure PCTKR2019010797-appb-I000002
2-3. 수술 전 후 MMP-9 변화 (Changes in MMP-9 before and after surgery)
표 2 및 도 1을 참조하면, 종양 수술 후 MMP-9(ng/ml)의 추적 관찰 수치(follow-up values)는 수술 전 927에서 수술한 후에 3 개월 간 445.89, 6 개월 간 392.17, 9 개월 간 196.01로 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
2-4. 스크리닝 능력(Screening ability)
타액 중의 MMP-9에 대해 ROC 곡선 분석을 수행하였고 AUC를 계산 하였다.
본 연구에서, MMP-9의 AUC 값(p<0.001)은 0.93-0.99의 95% 신뢰구간(CI)을 갖는 0.96(100% 특이도, 89.6% 민감도) 이었다(도 2 참조).
2-5. 구강 편평상피세포암에 대한 바이오마커로서 MMP-9 의 적합성 규명
본 발명자들은 구강암의 발병, 재발 및 예후를 예측하고 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구하던 중, 타액 중의 MMP-9를 평가하였고, 그 결과 MMP-9의 구강암 진단 마커로서의 사용 가능성을 확인하였으며, 나아가 구강암 수술 후 재발여부 및 예후를 판단할 수 있는 용도로도 사용 가능함을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 상기한 구강 편평상피세포암(OSCC) 환자군에 관한 연구 결과들과 나이, 성별 및 흡연 여부가 부합하는 대조군 연구의 결과들로부터, 구강암에 있어 타액 중의 MMP-9의 농도가 유의미하게 증가한 것을 보여 타액 바이오마커인 MMP-9가 구강 편평상피세포암(OSCC)를 선별함에 있어 우수한 분별력을 보임을 확인하였다.
특히, 건강한 대조군 참여자 그 누구도 컷 오프 MMP-9 보고 수치를 초과하는 타액 MMP-9 수치를 보이지 않았다. 또한, MMP-9는 수술 후 극적으로 감소하였는데, 이 점은 MMP-9가 구강 편평상피세포암(OSCC)에 대한 예후 마커일 수 있음을 의미한다.
도 2를 참조하면, MMP-9의 컷-오프 값 120.9ng/ml에서 MMP-9의 ROC 곡선 분석 데이터는 AUC 수치가 0.96임을 AUC 수치가 0.96임을 규명하였다(p<0.001).
0.5에서 1.0사이의 AUC 값이 높을수록 더 높은 성능을 반영하며, 1.0에 가까울수록 AUC값은 완벽한 예측을 나타내므로, 0.96을 나타내는 MMP-9는 구강암에 대한 우수한 진단 마커임이 확인되었다.
또한, 본 발명의 구강암의 진단방법은 종양 수술 후 MMP-9(ng/ml)의 추적 관찰 수치(follow-up values)는 수술 전 927에서 수술한 후에 3 개월 간 445.89, 6 개월 간 392.17, 9 개월 간 196.01로 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이로부터 미리 선정된 값 또는 미리 선정된 범위의 값, 예를 들어 수술 전의 MMP-9의 수치에 기초하여 구강암의 예후를 측정하는 것이 가능하다.
결론적으로 본 발명에서 확인된 타액 바이오마커 MMP-9는 감도 및 특이성을 갖는 구강 편평상피세포암(OSCC)과 같은 구강암의 뛰어난 선별 및 예후 마커임을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 타액 중의 MMP-9를 바이오마커로 사용함으로써, 구강암 발병 전 및 구강암 발병 초기 단계에서 구강암의 고위험 개체를 선별하는 데 실질적으로 도움이 될 수 있으며, 이는 구강암의 발생률을 줄이고 생존율을 촉진 할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 구강암의 재발을 미리 예측할 수 있어 효율적인 치료 및 관리가 이루어지는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 대상체로부터 분리된 타액에서 MMP-9(Matrix-metalloproteinase-9)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 구강암의 진단방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
    상기 분리된 각각의 타액으로부터 MMP-9의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 대상체의 타액 중 MMP-9의 농도가 정상 대조군의 타액 중 MMP-9의 농도보다 높은 경우, 상기 대상체가 구강암임을 진단하는 단계;를 포함하는 구강암 진단 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 타액은 침인 것을 특징으로 하는, 구강암의 진단 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 구강암은 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma; OSCC)인 것을 특징으로 하는, 구강암의 진단 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 MMP-9의 농도는 면역분석법을 통해 얻을 수 있는 것인, 구강암의 진단 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 MMP-9의 농도가 500ng/ml 이상 이면, 구감암인 것을 특징으로 하는, 구강암의 진단 방법.
  7. 대상체 및 정상 대조군으로부터 각각 타액을 채취하여 분리하는 단계;
    상기 분리된 각각의 타액으로부터 MMP-9의 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 대상체의 타액 중 MMP-9의 농도가 정상 대조군의 타액 중 MMP-9의 농도 보다 높은지 측정하는 단계;를 포함하는 구강암 진단용 정보제공방법.
  8. MMP-9의 수치를 측정하는 제제를 포함하는, 구강암 진단용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 구강암은 구강 편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma; OSCC)인 것을 특징으로 하는, 구강암 진단용 조성물.
  10. 청구항 8의 조성물을 포함하는, 구강암 진단용 키트.
PCT/KR2019/010797 2018-08-23 2019-08-23 타액 중의 mmp-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 WO2020040612A1 (ko)

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