JP4441622B2 - 胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー - Google Patents
胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP4441622B2 JP4441622B2 JP2003155212A JP2003155212A JP4441622B2 JP 4441622 B2 JP4441622 B2 JP 4441622B2 JP 2003155212 A JP2003155212 A JP 2003155212A JP 2003155212 A JP2003155212 A JP 2003155212A JP 4441622 B2 JP4441622 B2 JP 4441622B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ghrelin
- gastritis
- concentration
- gastric cancer
- marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー、胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断方法、並びに胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクの判別方法や識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本人の胃ガン発生率は、世界の先進国中でも非常に高く、また、胃ガンは日本人に発生するガンのなかで最も多いガンである。しかし、近年、胃ガンによる死亡率は減少し、現在、肺ガンが死亡率の第１位となっている。これは、検診の普及や内視鏡の進歩などにより、胃ガンの早期発見による早期治療が可能になったからである。
【０００３】
従来、胃がんの検診は、主にバリウムを用いたレントゲン法によって行われてきた。最近、ガンの早期発見率がレントゲン法より２倍程度高いといわれるペプシノーゲン法という新しい検査方法が導入された（例えば、非特許文献１参照）。これは、血液中の２種類のペプシノーゲン、I及びIIの濃度を測定し、Iの濃度あるいはI:IIの比率によって、胃粘膜の萎縮状態を判定する方法である。胃粘膜の萎縮度が高いほど胃ガンの発生率が高いことが知られており、ペプシノーゲン法によるIの濃度及びI:IIの比率は、胃ガンの発生と高い相関関係にある。
【０００４】
一般に、こうした胃粘膜の萎縮を伴う胃炎は萎縮性胃炎と呼ばれる。胃炎とは、粘膜表層に限局する表層性胃炎から、胃粘膜の萎縮に至る種々の段階を示すが、萎縮性胃炎では、内視鏡検査で退色、血管透見、粘膜菲薄化が認められ、容易に診断される。この内視鏡検査で観察される萎縮部と非萎縮部との境界は萎縮境界と呼ばれ、萎縮境界が小弯線上で弧を描いている比較的軽症のものは閉鎖型（closed-type）、噴門側に扇状に開いている比較的重傷のものは開放型（open-type）と呼ばれている。
【０００５】
近年、ピロリ菌（Helicobacter pylori）の胃粘膜感染が、胃炎の主な原因であることが明らかになってきた。便宜上、十二指腸潰瘍に伴うことが多く、ピロリ菌感染が幽門付近に限定され炎症が前庭部に起きる軽症の胃炎と、胃潰瘍に伴うことが多く、胃体部にまでピロリ菌感染が進行し炎症や胃粘膜の萎縮が広がった重症の胃炎とに分類すると、胃ガンの発生は重症の胃炎を持つ患者に多く発生することが明らかになってきた。このように、ピロリ菌によって生じる胃炎と胃ガンの相関関係は、明白に証明されており（例えば、非特許文献２参照）、従って、胃炎及び胃潰瘍の治療や胃ガン予防等のため、ピロリ菌の除去が行われるようになってきている。
【０００６】
【非特許文献１】
ジャパン・ジャーナル・キャンサー・リサーチ（Japan Journal Cancer Research）１９９３年 ８４巻 ｐ．１０８６−１０９０
【０００７】
【非特許文献２】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine) ２００１年 ３４５巻 ｐ．７８４−７８９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ピロリ菌除菌後はペプシノーゲンI:IIの比率が急激に上昇し、その比率は必ずしも胃粘膜の萎縮度を反映しないことが明らかになってきた。ところが、胃炎の進展を非侵襲的に診断する方法は、現在まで、ペプシノーゲン法しか知られていない。
【０００９】
そこで、本発明は、より有効な胃炎、または萎縮性胃炎の新規診断用マーカー、胃ガンのリスクの判定マーカー、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無の診断方法、及び胃ガンのリスクの判定方法を提供することを目的としてなされた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る胃炎、または萎縮性胃炎の診断用マーカー、または胃ガンのリスクの判定マーカーは、グレリンを含むことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る診断用マーカーまたは判定マーカーは、グレリンを含む診断用マーカーまたは判定マーカーであって、ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度を測定するか、あるいはモニターし、測定したグレリン濃度、あるいはモニターしたグレリン濃度から胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無を診断し、または胃ガンのリスクを判定することができる。
【００１２】
これらの診断用マーカーまたは判定マーカーは、血液から調製されることを特徴としてもよい。また、上記グレリンが血液由来であることを特徴としてもよい。
【００１３】
また、本発明に係る胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用キットは、抗グレリン抗体を含むことを特徴とする。
【００１４】
さらに、本発明に係る胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断方法は、ヒト以外の脊椎動物において、血液中のグレリン濃度を測定するステップを含むことを特徴とする。また、本発明に係る識別方法は、ヒト以外の脊椎動物において、個体から得た試料に含まれるグレリンの濃度を測定し、このグレリン濃度から胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの有無を識別するステップを含む。また、本発明に係るもう一つの識別方法は、ヒト以外の脊椎動物において、ピロリ菌除菌後の個体から得た試料に含まれるグレリンの濃度を測定するか、あるいはモニターし、測定したグレリン濃度、あるいはモニターしたグレリン濃度から胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、または胃ガンのハイリスクグループを識別するステップを含む。これらの識別方法において、個体から得た試料が血液であることを特徴としてもよい。これらの方法は、いずれもヒトにも適用可能であることは言うまでもない。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実験方法に関しては、以下の記載では、特に説明がない場合、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
グレリンは、ＧＨＳレセプター（growth hormone secretagogue receptor、成長ホルモン放出促進因子受容体）の内因性リガンドとして単離された。ＧＨＳレセプターが脳下垂体の視床下部で発現しているのに対し、グレリンは主に胃で発現している。中でも、グレリン産生細胞は胃体部の壁細胞近傍に多いため、壁細胞や胃底腺部の炎症がグレリン産生に大きく影響を与える。初期の炎症では、胃内で炎症性サイトカインの発現が亢進するため、グレリンの産生自体が増加したり、炎症等が生じるため、胃重量が増加したりして、グレリンの血中濃度も増加する。しかし、胃体部にまで進展するピロリ菌陽性胃炎の場合、グレリン産生細胞まで障害を起こしているため、グレリン産生量は減少し、従って、血中濃度も低下する。しかも、グレリン産生細胞に障害が起きるような、胃体部まで萎縮が進行している患者では、ピロリ菌除去後も直ちにはグレリン産生細胞の回復が起こらないため、グレリン濃度は低下したままであると考えられる。
【００１７】
このように、グレリンの血中濃度と胃炎の重度には相関があるため、グレリンを胃炎の診断用マーカーとして利用し、血中濃度を測定することにより、胃炎の重度、即ち萎縮性胃炎に関する診断をすることができる。また、ピロリ菌除去後のグレリンの血中濃度をトレースすることにより、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクについての診断も可能である。
【００１８】
以下の実施例において、グレリン血中濃度の測定にはＲＩＡ（radioimmunoassay、放射免疫測定法）を用いたが、それに限らず、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、等、様々な手法が可能である。
【００１９】
以下、実施例を挙げて、詳細に説明する。
【００２０】
＜実施例１＞
スナネズミ（Meriones unguiculatus）は、ピロリ菌感染のモデル動物として、ピロリ菌に容易に感染し、胃炎、胃潰瘍、さらに胃ガンを発症するという点で非常に優れている。このピロリ菌感染モデル動物に対し、グレリンの血中濃度を調べた。
【００２１】
まず、雄のスナネズミ（MGS/Sea、４週令）に１０８CFUs/mlのピロリ菌１ｍｌを経胃管的に投与して感染させた。感染１２週後、１７週後、及び２４週後に、１６時間絶食させ、その後血液と胃を摘出した。胃内のピロリ菌数を定量するためには、微好気培養法を用いた。すなわち、胃をＰＢＳ２０ｍｌ中で、ポリトロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズし、１０％ ウマ血液（Nippon Bio-Test社）、2.5μg/ml アンフォテリシンＢ（amphotericin B）、9μg/ml バンコマイシン（vancomycin）、0.32μg/ml ポリミキシンＢ（polymyxin B）、5μg/ml トリメソプリム（trimethoprim）, and 50μg/ml ２，３，５−塩化トリフェニル−テトラゾリウム（2, 3, 5-triphenyl-tetrazolium chloride）を含んだブルセラ寒天（Brucella agar）プレートにホモゲナイズした組織を希釈して播き、７日間、３７℃で、微好気的に培養した。７日間培養後、胃組織１ｇあたりのＣＦＵ（colony forming unit、コロニー形成数）として、ピロリ菌を定量した。また、胃の炎症は、胃の粘膜にあるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性で評価した。これは、好中球の蓄積を指標にした評価方法である。まず、ホモゲナイズした胃の粘膜１００μlを８０００ｇ、４℃で１５分間遠心する。沈殿を、等量の０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（hexadecyltrimethylammonium bromide）を含んだ０．０５Ｍリン酸カリウムバッファーに懸濁し、再びホモゲナイズした後、超音波処理（sonication）によって脱顆粒させ、ＭＰＯを溶媒中に放出させる。前回と同じ条件で遠心し、上清を測定サンプルとする。ＭＰＯ活性は、3,3’5,5’-テトラメチルベンジジン（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）を基質とし、Ｈ２Ｏ２存在下での酸化反応において、６５５ｎｍの吸光度が２５℃で１分間に１．０変化する活性を１ユニットとする。
【００２２】
ラット・グレリンは、２８個のアミノ酸からなるペプチドで、活性型は３番目のセリン残基の側鎖が脂肪酸のオクタン酸によって修飾されている。用いた抗体は、それぞれ１〜１１番アミノ酸残基及び１３〜２８番アミノ酸残基をもつポリペプチドに対して作製されたウサギ・ポリクローナル抗体で、前者は活性型グレリンのみ認識し、後者は活性型と不活性型の両方のグレリンを認識することが明らかになっている。これら２種類の抗体（以後、それぞれＮ抗体及びＣ抗体と略称し、それぞれを含む抗血清をＮ抗血清及びＣ抗血清と略称する。）を用いたＲＩＡによって、血液中のグレリン濃度を測定した。
【００２３】
まず、Ｎ抗血清に対するトレーサーとして、[Tyr29]-ラットグレリンを、Ｃ抗血清に対するトレーサーとして、[Tyr0]-ラットグレリン[13〜28]を合成し、ラクトペルオキシダーゼ法によって１２５Ｉラベルした後、μBondasphere C18カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって、それぞれ放射性ヨード化ペプチド（トレーサー）を精製した。０．５％正常ウサギ血清を含んだＲＩＡバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、０．５％ ＢＳＡ、０．５％ Triton-X 100、８０ｍＭ NaCl、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ NaN３）で、Ｎ抗血清及びＣ抗血清を、それぞれ６００万分の一及び２万分の一で希釈した抗血清２００μｌと、試料血液１００μｌとを混合し、１２時間、４℃でインキュベートした。その後、１００μｌの１２５Ｉでラベルされたトレーサー（15000cpm）を加え、さらに３６時間、４℃でインキュベートした。１００μｌの抗ウサギＩｇＧヤギ血清を加え、２４時間、４℃でインキュベートした後、３０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心し、上清を捨てることにより、遊離トレーサーを除去した。沈殿中の結合トレーサーを、ガンマカウンター（ＡＲＣ−６００、アロカ社製）で測定した。一方、試料血液の代わりに、既知の濃度のグレリンで標準曲線を作製し、それに基づいて、血液中のグレリン濃度を決定した。表１に示すように、血液中のグレリン濃度は、非感染群に対し、感染群では有意に増加していた。
【００２４】
【表１】
【００２５】
一方、胃粘膜内グレリン濃度（胃粘膜単位重量あたりのグレリン量）を、同様にＲＩＡを用いて測定したところ、表２に示すように、非感染群に対し、感染群で有意に減少した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
しかし、感染後１２週目では、非感染群の胃重量は659.87±16.58 ｍｇ(平均値±標準偏差；以下同じ)に対し、感染群の胃重量は、1143.20±52.O8 ｍｇと有意に増加しており、単一の胃当たりの貯蔵（残存）総グレリン量に換算すると、非感染群の1918.22±191.86 pmolに比し、感染群では、2441.93±127.67 pmolと有意に増加しており、単一の胃当たりの総グレリン量と血液中のグレリン濃度との相関が認められた。しかし、感染後１７週目では、非感染群の胃重量は、619.06±16.17 mg に対し、感染群の胃湿重量は、1172.75±28.47 mgと有意に増加しており、単一の胃当たりの貯蔵（残存）総グレリン量に換算すると、非感染群の2910.15±384.87 pmolと、感染群の2143.84±478.3 pmolと有意差を認めなかった。これらの結果から、胃炎発症時における血液中への空腹時グレリン分泌の亢進が考えられた。
【００２８】
このように、ピロリ菌感染によって胃炎が発症すると、血液中のグレリン濃度が上昇することから、血液中のグレリンは胃炎または胃ガンの診断用マーカー分子として利用できる。
【００２９】
＜実施例２＞
本実施例では、ヒト患者T.M.、H.S.、M.M.、に関し、図１及び２を用いて詳細に説明する。臨床所見では、T.M.はピロリ菌陽性で、萎縮性胃炎が胃体部まで進展している。H.S.は、ピロリ菌陽性の十二指腸潰瘍を患い、ピロリ菌の除菌はされているが、前底部に限局した萎縮と炎症が観察される。これらの患者に対し、M.M.は、ピロリ菌陽性であるが、炎症や萎縮は前底部に限局した軽度なものであって、ほぼ正常とみなすことができる。
【００３０】
これらの患者の血液中のグレリン濃度を、１２時間絶食後（空腹時）と食後４時間（食後）の２度測定した結果を図１に示す。測定方法は実施例１と同じなので、記載は省略する。図１に示すように、C-RIAでもN-RIAでも、基本的に結果は同じであった。即ち、食後、グレリン濃度は減少するが、食後の低いグレリン濃度は胃の状態にかかわらず、ほぼ一致する。しかし、空腹時には、胃がほぼ正常状態であるM.M.のグレリン濃度に比べ、H.S.の値は高く、T.M.の値は低く検出された。
【００３１】
H.S.の場合のように、胃炎が生じるとグレリン濃度が増加するというのは、実施例１の場合と結果は一致する。しかし、T.M.の場合、萎縮性胃炎が胃体部まで進展しており、グレリン産生細胞が障害を受けているため、グレリンの産生自体が困難になっていると考えられる。
【００３２】
＜実施例３＞
実施例２の患者T.M.に対し、ピロリ菌の除菌を行い、その後の血液中のグレリン濃度をモニターした。結果を図２に示す。
まず、T.M.に、一週間の３剤併用（一日あたり、ランソプラゾール ６０ｍｇ、アモキシシリン １．５ｇ、クラリスロマイシン ８００ｍｇを投与）による除菌療法を２月２０日より開始し、その後約１年間、血液中のグレリン濃度をC-RIAによって計測したが、グレリン濃度は大きな変動を示さず、回復（増加）もしなかった。これは、グレリン産生細胞自体が障害を受けていることを裏付ける結果である。そして、ピロリ菌除去後、このタイプのグレリン濃度の変遷を示す患者は、胃炎が重症であり、胃ガンのハイリスクグループに属すると診断される。
【００３３】
＜実施例４＞
胃炎の患者に対し、一週間の３剤併用（一日あたり、ランソプラゾール ６０ｍｇ、アモキシシリン １．５ｇ、クラリスロマイシン ８００ｍｇを投与）によるピロリ菌の除菌を行った群（ＨＰ−群）と行っていない群（ＨＰ＋群）に分け、ＨＰ−群において３剤投与終了後１８０日目に各群において血清中のペプシノーゲンI（ＰＧＩ）をRIA法によって測定し、またグレリン濃度をC-RIAによって測定し、ＰＧが陰性（ＰＧ−即ち正常）である群と陽性（ＰＧ＋）または擬似陽性（ＰＧ＋／−）である群において、それぞれの群の患者におけるグレリン濃度の分布を調べた。
【００３４】
【表３】
【００３５】
表３に示した結果より、ＰＧ法による測定値が異常値を示す患者のほうが、正常値に戻っている患者より、概してグレリン値は低い傾向にあることがわかった。例えば、Scheffeテストを用いて、ＨＰ−群とＨＰ＋群の各群においてＰＧ−群とＰＧ＋群の間でのグレリン濃度を比較すると、有意確率は５％以下となり、それらの群の間でグレリン濃度が統計的に有意に異なることがわかる。これは、実施例３の結果と一致し、ＰＧ法によって異常と判定された患者では、ピロリ菌を除去してもグレリン濃度が回復していないことを示唆する。
【００３６】
さらに、内視鏡観察による萎縮性胃炎の重度に関し、開放型と閉鎖型に分類し、各タイプの患者間で、血液中のグレリン濃度を比較した。
【００３７】
【表４】
【００３８】
表４に示した結果より、開放型萎縮性胃炎の患者では、ピロリ菌を除去しても、血中のグレリン濃度が回復しないことがわかる。
【００３９】
これらの結果から、例えば、ピロリ菌除去後、C-RIAの値が１００fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ−の平均値またはＨＰ−、開放型の最高値）以下では重度の萎縮性胃炎の可能性が極めて高く、１２０fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ−の下限値またはＨＰ−、閉鎖型の最低値）以下では萎縮性胃炎の可能性が非常に高く、１６０fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ＋の最高値）以下では萎縮性胃炎の可能性があると診断される。萎縮性胃炎の存在は、胃炎が重度であることを示し、さらに胃ガンのリスクが高いことを示す。
【００４０】
こうした診断をＰＧなどによる従来法の診断と組み合わせることにより、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクを判定するのに、より正確な診断をすることができるようになる。
【００４１】
本発明によって、より有効な胃炎、または萎縮性胃炎の新規診断用マーカー、胃ガンのリスクの判定マーカー、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無の診断方法、及び胃ガンのリスクの判定方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る実施例２において、代表的な患者のグレリン濃度をC-RIA及びN-RIAを用いて計測した結果を示すグラフである。
【図２】本発明に係る実施例３において、患者 M.M.に対してピロリ菌除菌療法を行った後、血液中のグレリン濃度を１年間モニターした結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー、胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断方法、並びに胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクの判別方法や識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本人の胃ガン発生率は、世界の先進国中でも非常に高く、また、胃ガンは日本人に発生するガンのなかで最も多いガンである。しかし、近年、胃ガンによる死亡率は減少し、現在、肺ガンが死亡率の第１位となっている。これは、検診の普及や内視鏡の進歩などにより、胃ガンの早期発見による早期治療が可能になったからである。
【０００３】
従来、胃がんの検診は、主にバリウムを用いたレントゲン法によって行われてきた。最近、ガンの早期発見率がレントゲン法より２倍程度高いといわれるペプシノーゲン法という新しい検査方法が導入された（例えば、非特許文献１参照）。これは、血液中の２種類のペプシノーゲン、I及びIIの濃度を測定し、Iの濃度あるいはI:IIの比率によって、胃粘膜の萎縮状態を判定する方法である。胃粘膜の萎縮度が高いほど胃ガンの発生率が高いことが知られており、ペプシノーゲン法によるIの濃度及びI:IIの比率は、胃ガンの発生と高い相関関係にある。
【０００４】
一般に、こうした胃粘膜の萎縮を伴う胃炎は萎縮性胃炎と呼ばれる。胃炎とは、粘膜表層に限局する表層性胃炎から、胃粘膜の萎縮に至る種々の段階を示すが、萎縮性胃炎では、内視鏡検査で退色、血管透見、粘膜菲薄化が認められ、容易に診断される。この内視鏡検査で観察される萎縮部と非萎縮部との境界は萎縮境界と呼ばれ、萎縮境界が小弯線上で弧を描いている比較的軽症のものは閉鎖型（closed-type）、噴門側に扇状に開いている比較的重傷のものは開放型（open-type）と呼ばれている。
【０００５】
近年、ピロリ菌（Helicobacter pylori）の胃粘膜感染が、胃炎の主な原因であることが明らかになってきた。便宜上、十二指腸潰瘍に伴うことが多く、ピロリ菌感染が幽門付近に限定され炎症が前庭部に起きる軽症の胃炎と、胃潰瘍に伴うことが多く、胃体部にまでピロリ菌感染が進行し炎症や胃粘膜の萎縮が広がった重症の胃炎とに分類すると、胃ガンの発生は重症の胃炎を持つ患者に多く発生することが明らかになってきた。このように、ピロリ菌によって生じる胃炎と胃ガンの相関関係は、明白に証明されており（例えば、非特許文献２参照）、従って、胃炎及び胃潰瘍の治療や胃ガン予防等のため、ピロリ菌の除去が行われるようになってきている。
【０００６】
【非特許文献１】
ジャパン・ジャーナル・キャンサー・リサーチ（Japan Journal Cancer Research）１９９３年 ８４巻 ｐ．１０８６−１０９０
【０００７】
【非特許文献２】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine) ２００１年 ３４５巻 ｐ．７８４−７８９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ピロリ菌除菌後はペプシノーゲンI:IIの比率が急激に上昇し、その比率は必ずしも胃粘膜の萎縮度を反映しないことが明らかになってきた。ところが、胃炎の進展を非侵襲的に診断する方法は、現在まで、ペプシノーゲン法しか知られていない。
【０００９】
そこで、本発明は、より有効な胃炎、または萎縮性胃炎の新規診断用マーカー、胃ガンのリスクの判定マーカー、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無の診断方法、及び胃ガンのリスクの判定方法を提供することを目的としてなされた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る胃炎、または萎縮性胃炎の診断用マーカー、または胃ガンのリスクの判定マーカーは、グレリンを含むことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る診断用マーカーまたは判定マーカーは、グレリンを含む診断用マーカーまたは判定マーカーであって、ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度を測定するか、あるいはモニターし、測定したグレリン濃度、あるいはモニターしたグレリン濃度から胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無を診断し、または胃ガンのリスクを判定することができる。
【００１２】
これらの診断用マーカーまたは判定マーカーは、血液から調製されることを特徴としてもよい。また、上記グレリンが血液由来であることを特徴としてもよい。
【００１３】
また、本発明に係る胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用キットは、抗グレリン抗体を含むことを特徴とする。
【００１４】
さらに、本発明に係る胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断方法は、ヒト以外の脊椎動物において、血液中のグレリン濃度を測定するステップを含むことを特徴とする。また、本発明に係る識別方法は、ヒト以外の脊椎動物において、個体から得た試料に含まれるグレリンの濃度を測定し、このグレリン濃度から胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの有無を識別するステップを含む。また、本発明に係るもう一つの識別方法は、ヒト以外の脊椎動物において、ピロリ菌除菌後の個体から得た試料に含まれるグレリンの濃度を測定するか、あるいはモニターし、測定したグレリン濃度、あるいはモニターしたグレリン濃度から胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、または胃ガンのハイリスクグループを識別するステップを含む。これらの識別方法において、個体から得た試料が血液であることを特徴としてもよい。これらの方法は、いずれもヒトにも適用可能であることは言うまでもない。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実験方法に関しては、以下の記載では、特に説明がない場合、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
グレリンは、ＧＨＳレセプター（growth hormone secretagogue receptor、成長ホルモン放出促進因子受容体）の内因性リガンドとして単離された。ＧＨＳレセプターが脳下垂体の視床下部で発現しているのに対し、グレリンは主に胃で発現している。中でも、グレリン産生細胞は胃体部の壁細胞近傍に多いため、壁細胞や胃底腺部の炎症がグレリン産生に大きく影響を与える。初期の炎症では、胃内で炎症性サイトカインの発現が亢進するため、グレリンの産生自体が増加したり、炎症等が生じるため、胃重量が増加したりして、グレリンの血中濃度も増加する。しかし、胃体部にまで進展するピロリ菌陽性胃炎の場合、グレリン産生細胞まで障害を起こしているため、グレリン産生量は減少し、従って、血中濃度も低下する。しかも、グレリン産生細胞に障害が起きるような、胃体部まで萎縮が進行している患者では、ピロリ菌除去後も直ちにはグレリン産生細胞の回復が起こらないため、グレリン濃度は低下したままであると考えられる。
【００１７】
このように、グレリンの血中濃度と胃炎の重度には相関があるため、グレリンを胃炎の診断用マーカーとして利用し、血中濃度を測定することにより、胃炎の重度、即ち萎縮性胃炎に関する診断をすることができる。また、ピロリ菌除去後のグレリンの血中濃度をトレースすることにより、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクについての診断も可能である。
【００１８】
以下の実施例において、グレリン血中濃度の測定にはＲＩＡ（radioimmunoassay、放射免疫測定法）を用いたが、それに限らず、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッティング、等、様々な手法が可能である。
【００１９】
以下、実施例を挙げて、詳細に説明する。
【００２０】
＜実施例１＞
スナネズミ（Meriones unguiculatus）は、ピロリ菌感染のモデル動物として、ピロリ菌に容易に感染し、胃炎、胃潰瘍、さらに胃ガンを発症するという点で非常に優れている。このピロリ菌感染モデル動物に対し、グレリンの血中濃度を調べた。
【００２１】
まず、雄のスナネズミ（MGS/Sea、４週令）に１０８CFUs/mlのピロリ菌１ｍｌを経胃管的に投与して感染させた。感染１２週後、１７週後、及び２４週後に、１６時間絶食させ、その後血液と胃を摘出した。胃内のピロリ菌数を定量するためには、微好気培養法を用いた。すなわち、胃をＰＢＳ２０ｍｌ中で、ポリトロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズし、１０％ ウマ血液（Nippon Bio-Test社）、2.5μg/ml アンフォテリシンＢ（amphotericin B）、9μg/ml バンコマイシン（vancomycin）、0.32μg/ml ポリミキシンＢ（polymyxin B）、5μg/ml トリメソプリム（trimethoprim）, and 50μg/ml ２，３，５−塩化トリフェニル−テトラゾリウム（2, 3, 5-triphenyl-tetrazolium chloride）を含んだブルセラ寒天（Brucella agar）プレートにホモゲナイズした組織を希釈して播き、７日間、３７℃で、微好気的に培養した。７日間培養後、胃組織１ｇあたりのＣＦＵ（colony forming unit、コロニー形成数）として、ピロリ菌を定量した。また、胃の炎症は、胃の粘膜にあるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性で評価した。これは、好中球の蓄積を指標にした評価方法である。まず、ホモゲナイズした胃の粘膜１００μlを８０００ｇ、４℃で１５分間遠心する。沈殿を、等量の０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（hexadecyltrimethylammonium bromide）を含んだ０．０５Ｍリン酸カリウムバッファーに懸濁し、再びホモゲナイズした後、超音波処理（sonication）によって脱顆粒させ、ＭＰＯを溶媒中に放出させる。前回と同じ条件で遠心し、上清を測定サンプルとする。ＭＰＯ活性は、3,3’5,5’-テトラメチルベンジジン（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）を基質とし、Ｈ２Ｏ２存在下での酸化反応において、６５５ｎｍの吸光度が２５℃で１分間に１．０変化する活性を１ユニットとする。
【００２２】
ラット・グレリンは、２８個のアミノ酸からなるペプチドで、活性型は３番目のセリン残基の側鎖が脂肪酸のオクタン酸によって修飾されている。用いた抗体は、それぞれ１〜１１番アミノ酸残基及び１３〜２８番アミノ酸残基をもつポリペプチドに対して作製されたウサギ・ポリクローナル抗体で、前者は活性型グレリンのみ認識し、後者は活性型と不活性型の両方のグレリンを認識することが明らかになっている。これら２種類の抗体（以後、それぞれＮ抗体及びＣ抗体と略称し、それぞれを含む抗血清をＮ抗血清及びＣ抗血清と略称する。）を用いたＲＩＡによって、血液中のグレリン濃度を測定した。
【００２３】
まず、Ｎ抗血清に対するトレーサーとして、[Tyr29]-ラットグレリンを、Ｃ抗血清に対するトレーサーとして、[Tyr0]-ラットグレリン[13〜28]を合成し、ラクトペルオキシダーゼ法によって１２５Ｉラベルした後、μBondasphere C18カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって、それぞれ放射性ヨード化ペプチド（トレーサー）を精製した。０．５％正常ウサギ血清を含んだＲＩＡバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、０．５％ ＢＳＡ、０．５％ Triton-X 100、８０ｍＭ NaCl、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ NaN３）で、Ｎ抗血清及びＣ抗血清を、それぞれ６００万分の一及び２万分の一で希釈した抗血清２００μｌと、試料血液１００μｌとを混合し、１２時間、４℃でインキュベートした。その後、１００μｌの１２５Ｉでラベルされたトレーサー（15000cpm）を加え、さらに３６時間、４℃でインキュベートした。１００μｌの抗ウサギＩｇＧヤギ血清を加え、２４時間、４℃でインキュベートした後、３０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心し、上清を捨てることにより、遊離トレーサーを除去した。沈殿中の結合トレーサーを、ガンマカウンター（ＡＲＣ−６００、アロカ社製）で測定した。一方、試料血液の代わりに、既知の濃度のグレリンで標準曲線を作製し、それに基づいて、血液中のグレリン濃度を決定した。表１に示すように、血液中のグレリン濃度は、非感染群に対し、感染群では有意に増加していた。
【００２４】
【表１】
一方、胃粘膜内グレリン濃度（胃粘膜単位重量あたりのグレリン量）を、同様にＲＩＡを用いて測定したところ、表２に示すように、非感染群に対し、感染群で有意に減少した。
【００２６】
【表２】
しかし、感染後１２週目では、非感染群の胃重量は659.87±16.58 ｍｇ(平均値±標準偏差；以下同じ)に対し、感染群の胃重量は、1143.20±52.O8 ｍｇと有意に増加しており、単一の胃当たりの貯蔵（残存）総グレリン量に換算すると、非感染群の1918.22±191.86 pmolに比し、感染群では、2441.93±127.67 pmolと有意に増加しており、単一の胃当たりの総グレリン量と血液中のグレリン濃度との相関が認められた。しかし、感染後１７週目では、非感染群の胃重量は、619.06±16.17 mg に対し、感染群の胃湿重量は、1172.75±28.47 mgと有意に増加しており、単一の胃当たりの貯蔵（残存）総グレリン量に換算すると、非感染群の2910.15±384.87 pmolと、感染群の2143.84±478.3 pmolと有意差を認めなかった。これらの結果から、胃炎発症時における血液中への空腹時グレリン分泌の亢進が考えられた。
【００２８】
このように、ピロリ菌感染によって胃炎が発症すると、血液中のグレリン濃度が上昇することから、血液中のグレリンは胃炎または胃ガンの診断用マーカー分子として利用できる。
【００２９】
＜実施例２＞
本実施例では、ヒト患者T.M.、H.S.、M.M.、に関し、図１及び２を用いて詳細に説明する。臨床所見では、T.M.はピロリ菌陽性で、萎縮性胃炎が胃体部まで進展している。H.S.は、ピロリ菌陽性の十二指腸潰瘍を患い、ピロリ菌の除菌はされているが、前底部に限局した萎縮と炎症が観察される。これらの患者に対し、M.M.は、ピロリ菌陽性であるが、炎症や萎縮は前底部に限局した軽度なものであって、ほぼ正常とみなすことができる。
【００３０】
これらの患者の血液中のグレリン濃度を、１２時間絶食後（空腹時）と食後４時間（食後）の２度測定した結果を図１に示す。測定方法は実施例１と同じなので、記載は省略する。図１に示すように、C-RIAでもN-RIAでも、基本的に結果は同じであった。即ち、食後、グレリン濃度は減少するが、食後の低いグレリン濃度は胃の状態にかかわらず、ほぼ一致する。しかし、空腹時には、胃がほぼ正常状態であるM.M.のグレリン濃度に比べ、H.S.の値は高く、T.M.の値は低く検出された。
【００３１】
H.S.の場合のように、胃炎が生じるとグレリン濃度が増加するというのは、実施例１の場合と結果は一致する。しかし、T.M.の場合、萎縮性胃炎が胃体部まで進展しており、グレリン産生細胞が障害を受けているため、グレリンの産生自体が困難になっていると考えられる。
【００３２】
＜実施例３＞
実施例２の患者T.M.に対し、ピロリ菌の除菌を行い、その後の血液中のグレリン濃度をモニターした。結果を図２に示す。
まず、T.M.に、一週間の３剤併用（一日あたり、ランソプラゾール ６０ｍｇ、アモキシシリン １．５ｇ、クラリスロマイシン ８００ｍｇを投与）による除菌療法を２月２０日より開始し、その後約１年間、血液中のグレリン濃度をC-RIAによって計測したが、グレリン濃度は大きな変動を示さず、回復（増加）もしなかった。これは、グレリン産生細胞自体が障害を受けていることを裏付ける結果である。そして、ピロリ菌除去後、このタイプのグレリン濃度の変遷を示す患者は、胃炎が重症であり、胃ガンのハイリスクグループに属すると診断される。
【００３３】
＜実施例４＞
胃炎の患者に対し、一週間の３剤併用（一日あたり、ランソプラゾール ６０ｍｇ、アモキシシリン １．５ｇ、クラリスロマイシン ８００ｍｇを投与）によるピロリ菌の除菌を行った群（ＨＰ−群）と行っていない群（ＨＰ＋群）に分け、ＨＰ−群において３剤投与終了後１８０日目に各群において血清中のペプシノーゲンI（ＰＧＩ）をRIA法によって測定し、またグレリン濃度をC-RIAによって測定し、ＰＧが陰性（ＰＧ−即ち正常）である群と陽性（ＰＧ＋）または擬似陽性（ＰＧ＋／−）である群において、それぞれの群の患者におけるグレリン濃度の分布を調べた。
【００３４】
【表３】
表３に示した結果より、ＰＧ法による測定値が異常値を示す患者のほうが、正常値に戻っている患者より、概してグレリン値は低い傾向にあることがわかった。例えば、Scheffeテストを用いて、ＨＰ−群とＨＰ＋群の各群においてＰＧ−群とＰＧ＋群の間でのグレリン濃度を比較すると、有意確率は５％以下となり、それらの群の間でグレリン濃度が統計的に有意に異なることがわかる。これは、実施例３の結果と一致し、ＰＧ法によって異常と判定された患者では、ピロリ菌を除去してもグレリン濃度が回復していないことを示唆する。
【００３６】
さらに、内視鏡観察による萎縮性胃炎の重度に関し、開放型と閉鎖型に分類し、各タイプの患者間で、血液中のグレリン濃度を比較した。
【００３７】
【表４】
表４に示した結果より、開放型萎縮性胃炎の患者では、ピロリ菌を除去しても、血中のグレリン濃度が回復しないことがわかる。
【００３９】
これらの結果から、例えば、ピロリ菌除去後、C-RIAの値が１００fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ−の平均値またはＨＰ−、開放型の最高値）以下では重度の萎縮性胃炎の可能性が極めて高く、１２０fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ−の下限値またはＨＰ−、閉鎖型の最低値）以下では萎縮性胃炎の可能性が非常に高く、１６０fmol/ml（ＨＰ−、ＰＧＩ＋の最高値）以下では萎縮性胃炎の可能性があると診断される。萎縮性胃炎の存在は、胃炎が重度であることを示し、さらに胃ガンのリスクが高いことを示す。
【００４０】
こうした診断をＰＧなどによる従来法の診断と組み合わせることにより、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無、及び胃ガンのリスクを判定するのに、より正確な診断をすることができるようになる。
【００４１】
本発明によって、より有効な胃炎、または萎縮性胃炎の新規診断用マーカー、胃ガンのリスクの判定マーカー、胃炎の重度、萎縮性胃炎の有無の診断方法、及び胃ガンのリスクの判定方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る実施例２において、代表的な患者のグレリン濃度をC-RIA及びN-RIAを用いて計測した結果を示すグラフである。
【図２】本発明に係る実施例３において、患者 M.M.に対してピロリ菌除菌療法を行った後、血液中のグレリン濃度を１年間モニターした結果を示すグラフである。
Claims (13)
- グレリンを含むことを特徴とする胃炎の診断用マーカー。
- グレリンを含むことを特徴とする萎縮性胃炎の診断用マーカー。
- グレリンを含む診断用マーカーであって、
ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度をモニターし、
前記モニターしたグレリン濃度から胃炎の重度、または萎縮性胃炎の有無を診断することができる診断用マーカー。 - グレリンを含む診断用マーカーであって、
ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度を測定し、
前記測定したグレリン濃度から胃炎の重度、または萎縮性胃炎の有無を診断することができる診断用マーカー。 - 血液から調製されることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の診断用マーカー。
- グレリンが血液由来であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の診断用マーカー。
- 抗グレリン抗体を含むことを特徴とする胃炎、または萎縮性胃炎の診断用キット。
- グレリンを含むことを特徴とする胃ガンのリスクの判定マーカー。
- グレリンを含む、胃ガンのリスクの判定マーカーであって、
ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度をモニターし、
前記モニターしたグレリン濃度から胃ガンのリスクを判定することができる判定マーカー。 - グレリンを含む胃ガンのリスクの判定マーカーであって、
ピロリ菌除去後の動物個体から得た試料に含まれる前記グレリンの濃度を測定し、
前記測定したグレリン濃度から胃ガンのリスクを判定することができる判定マーカー。 - 血液から調製されることを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載の判定マーカー。
- グレリンが血液由来であることを特徴とする請求項８から１０のいずれかに記載の判定マーカー。
- 抗グレリン抗体を含むことを特徴とする胃ガンのリスク判定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003155212A JP4441622B2 (ja) | 2002-09-27 | 2003-05-30 | 胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002282883 | 2002-09-27 | ||
| JP2003155212A JP4441622B2 (ja) | 2002-09-27 | 2003-05-30 | 胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004163397A JP2004163397A (ja) | 2004-06-10 |
| JP4441622B2 true JP4441622B2 (ja) | 2010-03-31 |
Family
ID=32827824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003155212A Expired - Fee Related JP4441622B2 (ja) | 2002-09-27 | 2003-05-30 | 胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4441622B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014181970A (ja) * | 2013-03-18 | 2014-09-29 | Jichi Medical Univ | イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ |
| RU2628812C1 (ru) * | 2016-08-01 | 2017-08-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" | Способ консервативного лечения резидуальных предраковых заболеваний желудка |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1996934B1 (en) * | 2006-02-03 | 2010-03-24 | Hill's Pet Nutrition Inc. | Method for evaluating kidney function in a feline by measuring ghrelin hormone levels |
| RU2519646C2 (ru) * | 2007-10-26 | 2014-06-20 | Биохит Оий | Способы и продукты для диагностики аутоиммунных заболеваний и рака желудка, связанного с атрофическим гастритом |
| RU2474824C1 (ru) * | 2011-11-17 | 2013-02-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" | Способ диагностики атрофического гастрита |
-
2003
- 2003-05-30 JP JP2003155212A patent/JP4441622B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014181970A (ja) * | 2013-03-18 | 2014-09-29 | Jichi Medical Univ | イソクエン酸脱水素酵素変異検出用マーカ |
| RU2628812C1 (ru) * | 2016-08-01 | 2017-08-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва" | Способ консервативного лечения резидуальных предраковых заболеваний желудка |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004163397A (ja) | 2004-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ylitalo et al. | Symptoms, laryngeal findings, and 24‐hour pH monitoring in patients with suspected gastroesophago‐pharyngeal reflux | |
| Mukoubayashi et al. | Serum pepsinogen and gastric cancer screening | |
| Ozturan et al. | Photographic objective alterations for laryngopharyngeal reflux diagnosis | |
| Wagner et al. | Helicobacter pylori infection and serum pepsinogen A, pepsinogen C, and gastrin in gastritis and peptic ulcer: significance of inflammation and effect of bacterial eradication. | |
| Mengatto et al. | Association between sleep bruxism and gastroesophageal reflux disease | |
| White et al. | Gastroesophageal reflux and posterior laryngitis | |
| Hayat et al. | Objective detection of esophagopharyngeal reflux in patients with hoarseness and endoscopic signs of laryngeal inflammation | |
| Napierkowski et al. | Extraesophageal manifestations of GERD | |
| EP1173770A1 (en) | Method for assessing the risk of peptic ulcer, comprising the steps of determining quantitatively the concentrations of pepsinogen i (pgi) and gastrin-17 in a serum sample | |
| Guo et al. | The role of salivary pepsin in the diagnosis of gastroesophageal reflux disease (GERD) evaluated using high-resolution manometry and 24-hour multichannel intraluminal impedance-pH monitoring | |
| JP4441622B2 (ja) | 胃炎、萎縮性胃炎、または胃ガンの診断用マーカー | |
| Tenca et al. | Esophageal chemical clearance and baseline impedance values in patients with chronic autoimmune atrophic gastritis and gastro-esophageal reflux disease | |
| You et al. | Serum pepsinogens in relation to precancerous gastric lesions in a population at high risk for gastric cancer. | |
| Chan et al. | Diagnostic evaluation of bronchiectasis | |
| Zhang et al. | Optimal timing of the salivary pepsin test for the diagnosis of laryngopharyngeal reflux | |
| Konturek et al. | Eradication of Helicobacter pylori and gastrin-somatostatin link in duodenal ulcer patients | |
| Costa et al. | Is there a relationship between the pH and volume of saliva and esophageal pH-metry results? | |
| JP5437062B2 (ja) | 糞便中ヘリコバクター・ピロリ抗原の定量的測定により胃粘膜の状態を判断する方法 | |
| Tokashiki et al. | The relationship between esophagoscopic findings and total acid reflux time below pH 4 and pH 5 in the upper esophagus in patients with laryngopharyngeal reflux disease (LPRD) | |
| Nord | Extraesophageal symptoms: what role for the proton pump inhibitors? | |
| RU2474824C1 (ru) | Способ диагностики атрофического гастрита | |
| Kalimo et al. | Mast cells and IgE in intestinal mucosa in adult atopic dermatitis patients | |
| Joo et al. | Association between obesity and chronic laryngitis in women-Data from the Korea National Health and Nutrition Examination Survey | |
| LAMMERS | Comparison of thin versus standard esophagogastroduodenoscopy | |
| WO2020040612A1 (ko) | 타액 중의 mmp-9를 이용한 구강암의 진단 방법, 정보제공방법, 조성물 및 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060508 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060508 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080409 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090331 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090601 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091124 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091207 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4441622 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130122 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |