JP2021510817A

JP2021510817A - 歯周疾患診断法、用途、キット

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Publication number: JP2021510817A
Application number: JP2020538825A
Authority: JP
Inventors: コーイマン，ヘルベン; フセインルマイル，アミール; グラス，カール; ヤヘル，マリニュスカレルヨーハネスデ; レスリーキャンベルチャップル，イアン; マッカイグラント，メリッサ; ハルトスカンプ，ミハエルアレックスファン; プレショー，フィリップ; ジェイテイラー，ジョン
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Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2021-04-30
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Abstract

本開示は、ヒトが歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するインビトロ法である。当該方法は、バイオマーカータンパク質を決定するための洞察に基づく。従って、患者の唾液試料において、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度が測定される。測定された濃度に基づいて、前記タンパク質の結合濃度を反映して、少なくとも１つの値が決定される。当該少なくとも１つの値は、ヒトが歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病である可能性を示す。当該少なくとも１つの値は、歯肉炎、軽度又は進行性の歯周病に関連する共同濃度を同様の方法で反映する少なくとも１つの閾値と比較することができる。この比較により、検査値が前記患者の歯周の健康状態を示すかどうかを評価することができる。

Description

本発明は、口腔医療分野において、歯周疾患の唾液に基づく診断に関連する。特に、本発明は、健常な歯茎、歯肉炎、軽度歯周病及び進行性歯周病の症状を区別するキット、用途並びに方法に関する。

歯肉炎症、すなわち歯肉炎は、主に歯の細菌性バイオフィルム、すなわち歯垢が歯の表面へ付着することで発症する非破壊的な歯周疾患である。可逆性歯肉炎は、通常、検出されず治療されなければ、歯の周囲の組織（すなわち歯周組織）の炎症、つまり歯周病と定義される状態、をおこし、これは不可逆的に組織破壊及び歯槽骨喪失を誘発し、最終的に歯の喪失につながる。歯肉疾患の進行、通常、歯茎（歯肉）の腫れ、淡紅色から暗赤色への色の変化、歯茎の出血、口臭、歯茎の圧痛や痛み等の関連する臨床的徴候や症状がある。

歯周病は、口腔微生物が原因である慢性多因子性炎症性疾患であり、硬（骨）及び軟組織（歯根膜）の破壊が進行し、最終的に歯の可動性及び喪失に至ることを特徴とする。これは、歯肉組織の可逆的な感染及び炎症である歯肉炎とは区別する必要がある。炎症性歯周病は最も一般的な慢性ヒト疾患の１つであり、成人の歯の喪失の主な原因である。口腔の健康に及ぼす実質的な悪影響に加えて、歯周病は、全身的にも影響をもたらし、心臓病（アテローム性動脈硬化症、脳卒中等）、糖尿病、妊娠合併症、関節リウマチ、呼吸器感染症等の全身性疾患の危険因子であるというエビデンスも増加している。

そこで、歯周疾患の早期かつ正確な診断は、口腔及び全身的な健康の観点から重要である。

一般的な歯科診療では、歯周疾患の診断は未だ不十分であり、その結果、治療的介入の割合が比較的低く、未治療症例がかなり多い。現在の診断は、歯科専門医による口腔組織の状態（色、腫脹、プロービング時の出血の程度、プロービングポケットの深度、及び口腔Ｘ線による骨損失）といった不正確で主観的な臨床検査に依存する。これらの従来の方法は時間がかかり、用いられる技術（ポケット深度、Ｘ線）のいくつかは、現在の疾患活動性又はさらなる疾患感受性ではなく、過去の疾患活動等の歴史的事象を反映する。従って、より客観的で、より迅速に、正確で、より簡便な診断法が、好ましくは非専門家によっても行われうるのが望ましい。そのためには、現在の疾患活動性、及び被験者のさらなる歯周疾患に対する感受性が測定されうるのが望ましい。

唾液又は口腔液は、長い間、口腔及び一般的な疾患の診断液として提唱されており、かつ、lab-on-a-chipともいう小型バイオセンサーの出現により、診察室内で迅速に検査するための診療現場用診断法は、科学的及び臨床的により大きく注目されている。特に歯周疾患検出用の、組織炎症及び破壊に関連する炎症性バイオマーカーは、その近接性のため、唾液中で容易に達成される可能性があり、唾液には歯周疾患検出の強力な可能性があることを示唆する。実際、この分野はこのように著しく注目されており、有望な結果も得られている。

例えば、非特許文献１は、歯周疾患と相関がある宿主由来及び細菌由来のバイオマーカーを同定した。しかし、まだ明確な診断検査には結びついていない。

バイオマーカーは、臨床症状を裏付ける生物学的指標であり、歯周疾患の臨床転帰を診断する客観的指標である。最終的には、実績が証明されたバイオマーカーを用いて、将来の疾患リスクを評価し、極めて早期の段階で疾患を同定し、初期治療に対する反応を同定し、予防戦略の実施を可能にすることができる。

唾液中のバイオマーカーに関する診療現場での検査の開発では、診察室での検査に応用しうる技術の欠如及び個々の試料で複数のバイオマーカーを分析できない等の制限があった。また、このような試験に含める複数のバイオマーカーの選択は、文献で十分に示されておらず、実用的試験も実施されていなかった。

さらに、歯周病は、軽度から進行性の重症度の全範囲で顕現しうる。歯科医は、症状の重症度の評価を容易にするため、歯周病患者を、軽度歯周病患者と進行性歯周病患者の２つの群に分類することが多い。しかしながら、利用可能であってもこのような評価を行う方法は、歯科医が全患者及び／又は全来院時に日常的に実施できず、かつ、消費者の実施（自己診断）が不可能な手間のかかるプロセスをともなう。

Ramseier et al(J Periodontol. 2009 Mar;80(3):436-46)

より簡易なプロセス、特に、患者から少量の唾液試料を採取すればよいプロセス、かつ、できれば患者自身が採取できるプロセスを提供することが望まれるであろう。当該試料は、測定に基づき、患者の口腔が健常である、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であると分類される可能性の指標を反映しうるように、唾液試料を分類しうる体外診断装置に入力されることが望まれる。

本発明は、上記課題により良好に対処し、一態様では、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するインビトロ方法に関する。本方法は、前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する工程；前記タンパク質について決定された共同（joint）濃度を反映した少なくとも1つの検査値を決定する工程；を含み、前記検査値が、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標であるかを評価する工程を含む。

他の態様では、本発明は、ヒト患者の唾液試料中のα−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するバイオマーカーとしての使用を提供する。場合によっては、患者の年齢もまた、バイオマーカーとして用いられる。

他の態様では、本発明は、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するシステムであって、以下の：前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出することができ、かつ、検出するように適応された検出手段；前記タンパク質について決定された濃度から、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標を決定することができ、かつ、決定するように適応されたプロセッサ、を含む、システムに存在する。

前記システムは、場合によっては、情報を提示することができ、好ましくはまた情報を入力しうる、インタフェース、特にグラフィカルユーザインタフェースへのデータ接続を備え、前記インタフェースは、前記システムの部分又はリモートインタフェースのいずれかである。

場合によっては、前記項目のうちの１又はそれ以上、特にプロセッサは、固定されたマシン上のほか、インターネットベースのアプリケーションによって、「クラウド」で機能することができる。

さらなる態様では、本発明は、ヒト患者の唾液試料中の歯周疾患の少なくとも3つのバイオマーカーを検出するキットであって、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質を検出する１又はそれ以上の検出試薬を含む、キットを提供する。通常、３つ以上の検出試薬が用いられ、各試薬は異なるバイオマーカーに結合する。一の実施形態では、第１検出試薬はＡｌＡＧＰに結合することができ、第２検出試薬はＰＫに結合することができ、第３の検出試薬はＳ１００Ａ８及びＭＭＰ−９の１つに結合することができる。

さらにもう１つの態様では、本発明は、第1時点tiから第2時点t2までの時間間隔にわたり、ヒト患者の歯周疾患の状態変化を決定するインビトロ方法であって、以下の：前記時点tiで前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料と、前記時点t2で前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料から、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質濃度を検出する工程、かつ、前記濃度を比較する工程を含み、前記濃度のいずれか１つ、２つ、又は３つの相違が状態変化を反映する、方法を提供する。通常、３つの濃度の差が状態の変化を反映する。

さらなる態様では、本発明は、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを診断する方法であって、以下の：前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する工程；かつ、前記検査値が、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標であるかを評価する、方法を提供する。場合によっては、当該態様の方法は、患者の歯周病を治療するさらなる工程を含む。

さらなる態様では、本発明は、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病に罹患しているヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する方法であって、以下の：
（ａ）前記ヒト患者から唾液試料を得る工程；かつ、
（ｂ）前記タンパク質を結合する１又はそれ以上の検出試薬を前記試料に接触させて、前記α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質と前記１又はそれ以上の検出試薬の結合を検出することにより、前記各タンパク質が前記試料中に存在するかを検出する工程；を含む、方法を提供する。通常、ＡｌＡＧＰと結合することができる第１検出試薬があり、第２検出試薬はＰＫと結合することができ、第３検出試薬はＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の１つと結合することができる。

本開示に記載される方法で使用するためのシステムを概略的に表す図である。歯周疾患の段階の分類スキームの一例を示す図である。歯周健康状態の分類に対する決定木アプローチの一例を示す図である。

一般的な意味で、本発明は、ヒト患者の唾液試料において、バイオマーカーとして機能するタンパク質はわずか３つであるという賢明な洞察に基づき、患者の歯周疾患の症状を以下の４つのカテゴリー：第１カテゴリーは歯周疾患でない；第２カテゴリーは歯肉炎である；第３カテゴリーは、軽度又は中等度の歯周病（すなわち、特段の場合を除き、本明細書において、以下、用語「軽度歯周病」は、中等度の歯周病を含む）；及び第４カテゴリーは進行性歯周病である；の１つに分類する。

第３カテゴリーは以下、軽度歯周病と総称する。従って、本発明は、歯周疾患治療が必要ない健常な口腔と、歯周病が進行する前にその影響を逆転させる適時介入が可能な歯肉炎と、治療が必要性な軽度歯周病と、重大な治療が緊急に必要な進行性歯周病を区別することができる。

バイオマーカータンパク質は、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のいずれか又は両方である。被験者の年齢は、場合によっては、追加のマーカーとして含まれてよい。

α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）は、主に肝臓で合成される血漿α−グロブリン糖タンパク質である。オロソムコイドとしても知られる。それは、血液中の輸送タンパク質として機能し、塩基性で中性に荷電したリポ親和性化合物の運搬体として機能する。また、血液細胞と内皮細胞との相互作用を調節すると考えられている。

ピルビン酸キナーゼは解糖の最終段階を触媒する。ピルビン酸キナーゼには４つの組織特異的アイソザイムがあり、各々に異なる組織に必要な特定の速度論的性質がある。

Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８は、炎症過程及び免疫応答の調節において重要な機能があるカルシウム及び亜鉛結合タンパク質である。好中球の走化性及び接着を誘導することができる。

ＭＭＰは、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、エラスチン、及びフィブロネクチン等の細胞外マトリクス成分の分解に関与する酵素のファミリーである。当該酵素は、生理的及び病理学的条件の両方で、歯根膜（ＰＤＬ）のリモデリングにおいて中心的な役割を果たす。ＭＭＰ−９は、９２ｋＤａタイプＩＶコラゲナーゼ、９２ｋＤａゼラチナーゼ又はゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても知られ、細胞外マトリクスの分解に関与する亜鉛メタロプロテアーゼファミリーに属する酵素の一群であるマトリクチンである。

上記の４つのタンパク質は、当該分野で公知である。当業者であれば、当該構造、及び唾液試料等の水性試料中でそれらを検出する方法を理解する。以下、上記タンパク質バイオマーカーは、「本発明のバイオマーカーパネル」という。本発明のバイオマーカーパネルは、一実施形態では、本発明において同定された４つのタンパク質バイオマーカー、すなわち、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、ＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８からなってよい。好ましくは、本発明のバイオマーカーパネルは、本発明で同定されたタンパク質バイオマーカー、すなわち、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ及びＭＭＰ−９；又はＡｌＡＧＰ、ＰＫ及びＳ１００Ａ８のうちの３つ以下からなる。本発明のバイオマーカーパネルに加えて、人口統計学的データ（例えば、年齢、性別）等の他のバイオマーカー及び／又はデータを、歯周病のタイプの決定に適用されるデータのセットに含めてよい。さらなるバイオマーカーとしては、タンパク質マトリクスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）、インターロイキン−１β、遊離軽鎖κ、遊離軽鎖λ、ヘモグロビンβ、ヘモグロビンδ、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）があげられる。

望ましい拡張バイオマーカーパネルは以下の通りである：
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+ＭＭ−８
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+ＩＬ−１β
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+遊離軽鎖κ
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+遊離軽鎖λ
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+ヘモグロビンβ
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+ＭＭ−９+ヘモグロビンδ
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+Ｓ１００Ａ８+細胞増殖因子
ＡｌＡＧＰ+ＰＫ+Ｓ１００Ａ８+ＩＬ−１β
他のバイオマーカーが場合により含まれる場合、バイオマーカーの総数（すなわち、本発明のバイオマーカーパネル＋他のバイオマーカー）は、通常、４、５又は６である。

しかしながら、本発明の好ましい利点は、患者における歯周疾患の分類が、好ましくは４つ以下のバイオマーカーを、より好ましくは３つのバイオマーカーのみを測定することにより、決定されうることであり、バイオマーカーパネルＡｌＡＧＰ、ＰＫ及びＭＭＰ−９又はＳ１００Ａ８のいずれかを測定するのが好ましい。

特に、この決定は、有利には、簡便かつ単純な診断検査を提供する他のデータを用いる必要がない。

本方法は、必要に応じて、少量の唾液試料、例えば、液滴を被験者から採取するだけでよい。当該試料量は、通常、０．１μｌ〜２ｍｌ、例えば、１〜２ｍｌの範囲であり、それより少量、例えば、０．１〜１００μｌをインビトロ装置プロセシングに用いてよく、それより多量の試料、例えば、最大２０ｍｌ、例えば、７．５〜１７ｍｌを採取してよい。

本試料は、関与する少なくとも３つのタンパク質の濃度を測定し、診断結果を返すインビトロ診断装置に入力され、歯周疾患でない、歯肉炎である、軽度歯周病である、又は進行性歯周病である可能性に基づいて被験者を分類する。本発明はその使用が容易なため、歯科患者の大部分、又は歯周疾患発症リスクの高い患者を、定期的に（例えば、定期的な歯科検査の一部として、又は自宅で）検査することができる。これにより、特に、歯肉炎の存在の検出、又は進行性歯周病へ進行する前の軽度歯周病の存在の検出が可能となり、歯周病の発症又は進行を予防する口腔ヘルスケア治療をよりタイミングよく行うことができる。また、例えば、本方法により、歯周病のリスクが高いことが知られた患者を初めて検査する場合、歯周病が軽度か進行性であるかを同定することができる。また、本方法は、以前に進行性歯周病と診断された患者の治療後、歯周疾患が軽度歯周病に改善されたかの確認に適用することができる。同様に、本方法は、以前に軽度歯周病と診断された患者の治療後、歯周病が歯肉炎に改善されたかの確認に適用することができる。患者が「健常」であること、すなわち歯周疾患、歯肉炎、軽度歯周病、進行性歯周病がないことを評価する能力は、例えば、患者の現在の日常的な口腔ヘルスケアの満足度の確認に有益である。特に、本方法は、試料を採取し、それを装置に入れる工程を、患者自身が行うことができるため、自己診断にも適する。

患者は、通常、本発明を行う場合に、歯周疾患であることが知られていてもよい。当該患者は、本発明が、歯周病の軽度か又は進行性かの決定のために行われる場合、通常、歯周病であることが知られている。従って、ある態様では、本方法は、歯周病であることが知られているヒト患者が、軽度歯周病又は進行性歯周病であるかを評価する。

本発明の方法は、通常、１つ又は複数の検出試薬を用いて、本発明のバイオマーカーパネルを構成する前記の少なくとも３つのタンパク質、及び場合によってはさらなるバイオマーカータンパク質を検出することを含む。

本発明により試験される「唾液」は、吐出又はスワビングにより獲得しうる未希釈の唾液、又は液体で口を漱いで獲得しうる希釈された唾液であってよい。当該希釈唾液は、患者が滅菌水（例えば、５ｍｌ又は１０ｍｌ）又は他の適当な流体で数秒間口をすすぎ又は揺動させ、容器に吐出することにより獲得しうる。当該希釈唾液は、口腔すすぎ液（oral rinse fluid）という場合もある。

「検出する」とは、バイオマーカータンパク質の濃度を測定、定量、スコアリング、又はアッセイすることを意味する。バイオマーカータンパク質を含む生物学的化合物の評価方法は、当技術分野で公知である。タンパク質バイオマーカーを検出する方法に直接測定及び間接測定が含まれることは認識されている。当業者であれば、特定のバイオマーカータンパク質をアッセイする適当な方法を選択することができるであろう。

タンパク質バイオマーカーに関する用語「濃度」は、その通常の意味、すなわち、体積中のタンパク質の存在量が付与される。当該タンパク質濃度は、通常体積あたりの質量で測定され、最も典型的には、ｍｇ／ｍｌ又はｐｇ／ｍｌであるが、場合によりｐｇ／ｍｌと低く測定される。他の指標は、モラリティ（又はモル濃度）、ｍｏｌ／Ｌ又は「Ｍ」である。濃度は、既知の、決定された、又は所定の容量の試料中のタンパク質量を検出して決定することができる。

濃度決定にかえて、試料中のタンパク質バイオマーカーの絶対量の決定、又は試料中のバイオマーカーの質量−分画の決定、例えば、試料中の他のすべてのタンパク質の合計に対するバイオマーカーの量の決定をすることでもよい。

「検出試薬」とは、目的のタンパク質バイオマーカーに特異的に（又は選択的）に結合し、相互作用し、又は検出する薬剤又は化合物である。当該検出試薬としては、タンパク質バイオマーカーに優先的に結合する抗体、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体があげられるが、これらに限定されない。

「歯周疾患」という用語は、歯肉炎及び歯周病（軽度及び進行性）を意味する。歯周疾患でない患者は健常であるといわれる。

用語「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「特異的に（又は選択的に）免疫反応性のある」は、検出試薬をいう場合、タンパク質及び他の生物学的に異種集団におけるタンパク質バイオマーカーの存在を決定づける結合反応をいう。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の検出試薬（例えば、抗体）は、バックグラウンドの少なくとも２倍の特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に実質的に有意な量で結合しない。当該条件下での特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性のために選択される抗体が必要な場合がある。様々な免疫アッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ（酵素免疫測定法）は、タンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体の選択に日常的に用いられる（特異的な免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイ形式及び条件の説明については、例えば、Harlow＆Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1988)を参照）通常、特異的又は選択的反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍を超える。

「抗体」とは、エピトープ（例えば、抗原）を特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子若しくは免疫グロブリン遺伝子、又はそれらの断片によって実質的にコードされるポリペプチドリガンドをいう。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ及びλ軽鎖定常領域遺伝子、α、γ、δ、ε及びｍｕ重鎖定常領域遺伝子、及び無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子があげられる。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生される多数かつ十分に特徴付けられた断片として存在する。これは、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片を含む。用語「抗体」としてはまた、本明細書中で用いられる場合、全抗体の修飾によって産生された抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法を用いて新規に合成された抗体断片があげられる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は単鎖抗体があげられる。抗体の「Ｆｃ」部分は、１又はそれ以上の重鎖定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない、免疫グロブリン重鎖の部分をいう。抗体は、二重特異性抗体、例えば、第１抗原に特異的に結合する第１可変領域及び第２の異なる抗原に特異的に結合する第２可変領域がある抗体であり得る。少なくとも１つの二重特異性抗体を用いると、必要な検出試薬の数を減らすことができる。

診断法では感度及び特異度が異なる。診断アッセイの「感度」とは、検査が陽性であった罹患者の割合（「真の陽性」の割合）であり、アッセイで検出されなかった罹患者は「偽陰性」である。未罹患であるのに検査で陰性となった被験者を「真陰性」という。診断検査の「特異度」は、１から、検査で陽性となった疾患のない被験者の割合と定義される偽陽性率を差し引いたものである。特異度は、真の陰性率ともいう。

本発明のバイオマーカータンパク質は、いかなる方法でも試料中で検出することができる。バイオマーカー検出のための好ましい方法は、抗体系アッセイ、タンパク質アレイアッセイ、質量分析（ＭＳ）系アッセイ、及び（近）赤外分光法系アッセイである。例えば、免疫アッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ"サンドイッチ "イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、蛍光イムノアッセイ等の技術を用いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系があげられるが、これらに限定されない。当該アッセイは、日常的に行われ、当技術分野で周知である。例示的なイムノアッセイは、以下に簡潔に記載される（しかし、限定を意図するものではない）。

免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）が補充された、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２で０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、１％トラシロール）等の溶解緩衝液中で細胞集団を溶解し、細胞溶解液に目的の抗体を添加し、４℃で一定期間（例えば、１〜４時間）インキュベートし、タンパク質Ａ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に添加し、約１時間以上、４℃でインキュベートし、溶解緩衝液中でビーズを洗浄し、ＳＤＳ／試料緩衝液中でビーズを再懸濁することを含む。抗体の特定抗原に対する免疫沈降能は、例えば、ウエスタンブロット分析により評価することができる。当業者であれば、抗体の抗原結合能を高め、バックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を予めクリアする）ために修飾され得るパラメータに関する知識があるであろう。

ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料の調製、ポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質試料の電気泳動（例えば、抗原の分子量に応じて８〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロン等の膜へのタンパク質試料の移動、当該膜のブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ又は脱脂乳非脂肪）でのブロッキング、当該膜の洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中での洗浄、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体（目的抗体）を用いた当該膜のブロッキング、洗浄緩衝液での当該膜の洗浄、当該膜の酵素基質（例えば、ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（例えば、３２Ｐ又は１２５１）をブロッキング緩衝液で希釈したものに共役した二次抗体（一次抗体を認識するもの、例えば、抗ヒト抗体）によるブロッキング、当該膜の洗浄緩衝液での洗浄、抗原の存在の検出を含む。当業者であれば、検出シグナルを高めて、バックグラウンドノイズを低減するためにパラメータを改変することを理解するであろう。

ＥＬＩＳＡは、通常、抗原（すなわち、目的のバイオマーカータンパク質又はその断片）を調製する工程、９６穴マイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物が共役した目的の抗体をウェルに添加し、一定期間インキュベートする工程、及び抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡでは、目的抗体を検出可能な化合物に結合させなくてよく、代わりに、検出可能な化合物に結合した第２抗体（目的の抗体を認識する）をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な化合物が共役した第２抗体を、対象抗原をコーティングされたウェルに添加した後に添加することができる。当業者であれば、当技術分野で公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーション同様、検出シグナルを高めるために変更することができるパラメータについて知識があるであろう。

複数のマーカーが用いられるため、当該バイオマーカーの結合濃度に基づいて閾値を決定することができる。当該閾値は、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを決定する。本発明は、健常状態から進行性歯周病に至る歯周健康状態の全段階が、上記バイオマーカーの組み合わせの測定に基づいて十分な精度で検出されうるという洞察を反映する。

当該洞察は、別の態様、すなわち、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質を、ヒト患者の唾液試料中のバイオマーカーとして、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するためのバイオマーカーとして使用する本発明を支持する。

本使用は、本明細書に実質的に記載された方法及び以下に記載された方法で行うことができる。

本発明の方法は、前記タンパク質について測定された共同濃度を反映した少なくとも１つの検査値を決定することを含む。共同濃度値は、決定された濃度を入力し、当該値を算術演算して得られるいかなる値であり得る。これは、例えば、濃度の単純な加算であることができる。また、各濃度に、これらの濃度の所望の重みを反映した係数を乗算し、その結果を加算することを含んでよい。また、濃度を互いに乗算すること、又は乗算、除算、減算、指数化、及び加算のいかなる組み合わせを含んでよい。それはさらに、濃度をいくつかの乗数まで上げることを含んでよい。場合によっては、当該検査値は、被験者の年齢と組み合わせて、前記タンパク質について決定された共同濃度を反映する。特定の実施形態では、検査値は、（ｉ）歯周病対健常又は歯肉炎の確率、（ｉｉ）歯肉炎対健常の確率、及び（ｉｉｉ）進行性歯周病対軽度歯周病の確率のうちの１つ、２つ又は３つについて作成され得る。

得られた共同濃度値は、歯周病の存在、進行性歯周病の存在又は歯肉炎の存在に関連する共同濃度を同様に反映する１又はそれ以上の閾値と比較され得る。当該比較により、検査値が、唾液の検査を受けた患者の健常な口腔、歯肉炎、軽度歯周病又は進行性歯周病の存在を示すか否かを評価することができる。当該閾値は、例えば、進行性歯周病の存在に関連する基準試料、すなわち、進行性歯周病と診断された患者における同じタンパク質について測定された濃度に基づいて、同様の方法で得られる結合濃度値でありうる。通常、共同濃度と同じかそれ以上であることが反映された値の場合、検査を受けた患者の進行性歯周病の存在を示す。同様に、検査を受けた歯周病患者の唾液中の共同濃度が反映された値が低い場合は、歯周病が軽度又は中等度（すなわち、進行していない）であることを示す。しかし、進行性歯周病を示す検査値が閾値を下回り、軽度歯周病を示す検査値が閾値を上回るように、（例えば、負の乗数を用いることによって）閾値を計算することも可能であることが理解されよう。

閾値はまた、すでに歯肉炎、歯周病（必要に応じて軽度／中等度）及び進行性歯周病の診断をうけた患者を含む試料セット中の現在のバイオマーカータンパク質の濃度測定に基づいて決定することもできる。それにより、測定された濃度値は、おそらく機械学習法を含む統計分析にかけることができ、望ましい感度及び特異度で、患者を、健常、歯肉炎、軽度又は中等度の歯周病、及び進行性歯周病と分類して識別することができる。これにより、所望の閾値を得ることができる。当該閾値に基づいて、検査試料は、同じ濃度測定に供し、次いで、閾値を得るのと同様の方法で濃度値を処理して、閾値と比較可能な共同濃度値を決定することができ、それにより、検査試料を軽度又は進行性歯周病に分類することができる。

興味深い実施形態では、結合濃度値は、以下のようなスコアの形式で得られる。数値（例えばｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度値）が各測定に割り当てられ、当該値は、ゼロと１の間のスコアを計算するために線形又は非線形の組み合わせで用いられる。上記のように、閾値が被験者の集合に基づいて決定される場合、通常、０と１の間のスコアは、共同濃度を入力とするシグモイド関数を用いて計算される（以下のように）。例えば、タンパク質濃度に基づいて、３つのスコア（０と１の間）を計算することができる：
●Ｓｐ：これは歯周病対健常／歯肉炎の確率と考えられる。

●Ｓ_Ｇ：これは歯肉炎対健常の確率と考えられる。

●Ｓ_ＡＰ：これは進行性歯周病対軽度歯周病の確率と考えられる。

４つの病期の確率（０〜１）は、以下のように計算される：
●健常（Ｈ）：（ｌ−Ｓｐ）・（ｌ−Ｓ_Ｇ）
●歯肉炎（Ｇ）：（ｌ−Ｓｐ）・Ｓ_Ｇ
●軽度歯周病（ＭＰ）：Ｓｐ・（ｌ−Ｓ_ＡＰ）
●進行性歯周病（ＡＰ）：Ｓｐ・（Ｓ_ＡＰ）
閾値は、所望の感度及び特異度に基づいて選択され得る。当業者であれば、上記の確率は理想的に単純化されたものであり、実際には確率的な依存性を考慮して異なる推定値が用いられうることを理解するであろう。

あるいは、決定木等のアプローチをとることもでき、最初に健常状態又は歯肉炎対歯周病の分類が行われ：患者は、Ｓｐ≧Ｔｐで、閾値Ｔｐの場合に歯周炎と分類される。その後、さらなる精緻化が行われる。歯周炎に分類された患者は、Ｓ_ＡＰ≧Ｔ_ＡＰで、閾値Ｔ_ＡＰの場合、さらに、進行性歯周病と分類される。そうでなければ、軽度歯周病と分類される。健常又は歯肉炎に分類された患者は、Ｓ_Ｇ≧Ｔ_Ｇで閾値Ｔ_Ｇの場合、さらに歯肉炎として分類され、そうでない場合は健常に分類される。閾値Ｔ_Ｐ、Ｔ_ＡＰ、Ｔ_Ｇは各々の分類工程の感度及び特異度の所望のチューニングに従って選択されてもよい。当該決定木アプローチを図3に示す。

当該技術分野で認められている臨床定義は、以下のとおりである：
歯肉指数（ＧＩ）
以下の場合、ロベン修正歯肉指数（ＭＧＩ）を０〜４の指標で評価し、それに基づいて全口腔歯肉指数を記録する：
０＝無炎症；
１＝軽度の炎症；辺縁又は乳頭状歯肉単位の全部ではなく、どの部分でも、色の質感のわずかな変化はほとんど変化しない；
２＝軽度の炎症；ただし、辺縁部又は乳頭部全体に及ぶ；
３＝中等度の炎症；開窓、発赤、浮腫、及び／又は辺縁部又は乳頭部の肥大；
４＝重度の炎症；著明な発赤、辺縁又は乳頭状歯肉単位の浮腫及び／又は肥厚、自然出血、うっ血、潰瘍形成。

プロービング深度（ＰＤ）
手動式歯周プローブＵＮＣ−１５を使用して、最小ｍｍ単位で記録する。プロービング深度とは、プローブ先端（ポケット基部と仮定）から遊離歯肉縁までの距離をいう
歯肉後退（ＲＥＣ）
歯肉後退は、手動式歯周プローブＵＮＣ−１５を用いて、最小ｍｍ単位で記録する。歯肉後退とは、有利歯肉縁からセメントエナメル質接合部までの距離である。歯肉後退は正の数値、歯肉過成長は負の数値で示される。

臨床的付着欠損（ＣＡＬ）
臨床的付着欠損は、各部位におけるプロービング深度＋後退の和として計算する。

イロビン上のブリードイン（ＢＯＰ）
プロービング後、各部位の出血をプロービングで評価し、プロービング後３０秒以内に出血が発生した場合には、その部位のスコアを１とし、そうでない場合にはスコアを０と割り当てる。

結果として得られる被験者群（患者群）の定義は以下の通りである：
健常群（Ｈ）：すべての部位でＰＤ＜３ｍｍ（ただし、最終立位大臼歯の遠位部では４ｍｍのポケットを４つまで許容）、近位部付着欠損がある部位はなく、１０％未満の部位でＧＩが２．０以上、％ＢＯＰスコアが１０％未満である。

歯肉炎群（Ｇ）：３０％以上の部位でＧＩ＞３．０、近位部付着欠損がある部位はなく、ＰＤが４ｍｍを超える部位がなく、％ＢＯＰスコアが１０％を超える。

軽度〜中等度の歯周病群（ＭＰ）：８本以上の歯に５〜７ｍｍの歯間ＰＤ（約２〜４ｍｍのＣＡＬに等しい）があり、％ＢＯＰスコアが３０％を超える。

進行性歯周病群（ＡＰ）：歯列間ＰＤが７ｍｍを超える（ＣＡＬが約５ｍｍを超える）歯列が１２本を超える、％ＢＯＰスコアが３０％を超える。

ある実施形態では、本発明の方法は、図１に概略的に示すシステムを用いる。当該システムは、その中に一体化された様々な装置構成要素（ユニット）を備える単一の装置であってよい。また、当該システムは、その様々な構成要素、又は当該構成要素の部分を、別個の装置として備えることができる。図１に示す構成要素は、測定装置（Ａ）、グラフィカルユーザインタフェース（Ｂ）、及びコンピュータ処理ユニット（Ｃ）である。

上記のように、本発明のシステムは、インタフェースへのデータ接続を含み、それによって、インタフェース自体は、システムの一部であっても、遠隔インタフェースであってもよい。後者では、別の装置、好ましくはスマートフォン又はタブレットコンピュータ等のハンドヘルド装置を用いて、実際のインタフェースを提供することができる。このような場合のデータ接続は、好ましくは、Ｗｉ−Ｆｉ又はＢｌｕｅｔｏｏｔｈ等による、又は他の技術又は標準による無線データ転送を含む。

測定装置（Ａ）は、唾液試料を受領するように構成されており、例えば、装置（Ａ）に挿入可能なカートリッジ（Ａｌ）上に唾液を滴下することにより唾液試料を受領するように構成される。当該装置は、同一の唾液試料から、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質の濃度を決定できる既存の装置であってよい。

測定装置（Ａ）は、例えば、装置（Ａ）に挿入可能なカートリッジ（Ａｌ）に唾液を滴下することにより唾液試料を受領することができることが好ましい。当該装置は、同一の唾液試料から、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質の濃度を決定することができる既存の装置であってよい。

処理ユニット（Ｃ）は、部分（Ａ）からタンパク質濃度の数値を受け取る。処理ユニット（Ｃ）は、病期を分類することを可能にするソフトウェア（典型的には組み込みソフトウェア）を提供する。例えば、分類は、図２に示されるようなものであってもよい。タンパク質濃度に基づいて、３つのスコア（０から１の間）を計算することができる。
処理ユニット（Ｃ）は、部品（Ａ）からのタンパク質濃度の数値を受け取る。当該ユニット（Ｃ）には、病期分類を可能にするソフトウェア（通常組込みソフトウェア）が備えられる。例えば、分類は図２に示すように行うことができ、タンパク質濃度に基づいて以下の３つのスコア（０〜１）を算出することができる：
●ＳＰ：これは歯周病対健常／歯肉炎の確率と考えられる。

●ＳＧ：これは歯肉炎対健常の確率と考えられる。

●ＳＡＰ：これは進行歯周病対軽度歯周病の確率と考えることができる。

４つの病期の確率（０から１の間）は、次のように計算される（上記のように、確率依存性を考慮に入れて実際には異なる推定値が用いられることに注意）：
●健常（Ｈ）：（ｌ−Ｓｐ）・（ｌ−Ｓ_Ｇ）
●歯肉炎（Ｇ）：（ｌ−Ｓｐ）・Ｓ_Ｇ
●軽度歯周病（ＭＰ）：Ｓｐ・（１−Ｓ_ＡＰ）
●進行性歯周病（ＡＰ）：Ｓｐ・（Ｓ_ＡＰ）
単位（Ｃ）は、当該確率を直接単位（Ｂ）に出力することができ、例えば、健常の確率が０．８であれば、８０％の確率で健常を示す。あるいは，ユニット（Ｃ）はＧＵＩ（Ｂ）に病態の指標（Ｉ）を出力することができ，示された病態は最も確率の高い病態を示す。

他の実施形態では、ソフトウェアは、閾値（Ｔ_Ｐ、Ｔ_Ｇ、Ｔ_ＡＰ）の数値をさらに含むことができる。次に、例えば、算出されたスコアがＴｐを超える場合、被験者は歯周病とみなされる（したがって、Ｓｐ≧ＴｐではＳｐ：＝１、Ｓｐ＜ＴｐではＳｐ＝０）。その後、Ｓ_ＡＰに基づいて、軽度及び進行性歯周病のさらなる精緻化が行われる。例えば、Ｓ_ＡＰ≧０．５は「進行性歯周病」、又はあるいは、Ｓ_ＡＰが閾値Ｔ_ＡＰを超える場合は「進行性歯周病」の指標である。特定の閾値を用いると、疾患状態の分類の感度及び特異度を所望のレベルに調整することができる。例えば、歯周病の指標である閾値Ｔｐを低くすると、特異度が低くなる（偽陽性が多くなる）が、歯周病の検出感度が高くなる（偽陰性が少なくなる）。

指標の確実性は、（ａ）Ｒｌ−Ｒ２又は（一般）閾値Ｔ範囲の特定によっても達成される。例えば、Ｒｌ＜Ｓｐ＜Ｒ２の場合、歯周病の分類は決定的ではないとみなされ、それ以上の分類は行われない。その後、指標（Ｉ）は「決定的でない」と読み替える。あるいは、健常、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病のいずれの確率の計算値も閾値Ｔを超えなければ、指標（Ｉ）は「不確定」となる。

スコアの特異的計算は、例えば、以下の式：

（式中、Ｎは用いたタンパク質／バイオマーカーの数であり、ｃｏ、ｃｉ等は係数（数値）であり、ＢＪ、Ｂ２等は各々タンパク質濃度である）
を適用するシグモイド関数によって実行することができる。

当該係数の決定は、３つの分類段階（Ｈ／Ｇ対Ｐ、resp.Ｈ対Ｇ、resp.ＭＰ対ＡＰ）の各々以下の訓練手順によって行うことができる：
●各Ｎｐ、各Ｎ_Ｇ、各Ｎ_ＡＰを、各歯周病患者、各歯肉炎患者、各進行歯周病患者（現行基準で歯科医により同定された）に選択し、各Ｎ_ＮＰ、Ｎ_Ｈ、Ｎ_ＡＰを、非歯周病患者、健常歯茎、軽度歯周病患者と選択する工程であって、被験者が１つの試験の部分である場合、Ｎ_Ｐ＝Ｎ_ＭＰ＋Ｎ_ＡＰ、Ｎ_ＮＰ＝Ｎ_Ｈ＋Ｎ_Ｇであることに注意する；
●各被験者から唾液試料を採取し、上記のようにバイオマーカーの組み合わせのタンパク質濃度を測定する工程；
●スコアＳｐ、各Ｓ_Ｇ、各Ｓ_ＡＰを各々歯周病、歯肉炎、進行性歯周病で１とし、各々歯周病がない、健常歯茎、及び軽度歯周病の場合は０と特定する工程；
●当該スコアとタンパク質濃度値にシグモイド関数を適用する工程。

他の回帰又は機械学習法（線形回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン）を用いて、タンパク質濃度に基づいて口腔ヘルスケア状態を予測する分類器を訓練することができるが、この場合、歯周病患者、歯肉炎患者、進行性歯周病患者では各々スコアＳｐ、Ｓ_Ｇ、Ｓ_ＡＰが高く、非歯周病患者、健常者、軽度歯周病患者コントロールでは各々スコアＳｐ、Ｓ_Ｇ、Ｓ_ＡＰが低い。

特に、健常な口腔状態、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病（現行基準（例えば、米国歯周病学会基準）に基づき、歯科専門家による臨床評価により特定される）の被験者を対象とした臨床研究を用いて、当該方法が適用される。様々なバイオマーカーの組み合わせの性能を、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）を用いたロジスティック回帰により評価した結果、本発明の好ましいバイオマーカーの組み合わせが得られた。

上記システムに関し、さらなる態様では、本発明はまた、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するシステムであって、以下の：前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出することができ、かつ、検出するように適応された検出手段；かつ前記タンパク質について決定された濃度から、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標を決定することができ、かつ、決定するように適応されたプロセッサ、を含む、システムを提供する。

−場合によっては、当該システムは、ユーザインタフェース（又はリモートインタフェースへのデータ接続）、特に情報を提示することができるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）を備え；当該ＧＵＩは、テキストベースのユーザインタフェース、タイプされたコマンドラベル又はテキストナビゲーションの代わりに、グラフィカルアイコン及び二次表記法等の視覚的インジケータを介してユーザが電子デバイスと対話できるようになるユーザインタフェースであり（そのようなインタフェースタイプはいずれも本発明では除外されていない）；当該ＧＵＩは一般的に公知であり、通常、ＭＰ３プレーヤ、ポータブルメディアプレーヤ、ゲーム装置、スマートフォン、並びにより小型の家庭用、業務用及び産業用制御装置等のハンドヘルドモバイル装置で用いられる。上記のように、当該インタフェースはまた、場合によっては、例えば、対象者の年齢、性別、ＢＭＩ（ＢｏｄｙＭａｓｓＩｎｄｅｘ）等の情報を入力できるように選択することができる。

本発明はまた、別個に又は上記システムの部分として、ヒト患者の唾液試料中の歯周病の少なくとも3つのバイオマーカーを検出するキットであって、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）の一方又は両方のタンパク質を検出する1又はそれ以上の検出試薬を含む、キットを提供する。通常、当該キットは、各々が異なるバイオマーカーを指向する３つの検出試薬を含み、ここで、第１検出試薬はＡｌＡＧＰに結合することができ、第２検出試薬はＰＫに結合することができ、第３検出試薬はＳ１００Ａ８及びＭＭＰ−９の一方又は両方に結合することができる。本発明の方法に関して上記のように、当該キットは、特にＭＭＰ−８、インターロイキン−１ｂ、ヘモグロビン−β、ヘモグロビン−δ、肝細胞増殖因子、遊離軽鎖κ又は遊離軽鎖λ、及び／又は他のタンパク質のための検出試薬をさらに含んでいてもよい。好ましい態様では、当該キットにて利用可能な検出試薬は、上記のように、本発明の３−バイオマーカーパネルを構成する３つのタンパク質を選択する検出試薬からなる。

好ましくは、当該キットは、チップ、マイクロタイタープレート、又は当該検出試薬を含むビーズ若しくは樹脂等の固体支持体を含む。いくつかの態様では、キットは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（商標）等の質量分析プローブを含む。

当該キットはまた、非結合検出試薬又は前記バイオマーカー（サンドイッチ型アッセイ）のいずれかに特異的な洗浄溶液及び／又は検出試薬を提供することができる。

興味深い態様では、本発明のバイオマーカーパネルの認識は、ヒト患者における歯周疾患の状態の経時的監視に適用される。

従って、本発明はまた、第1時点tiから第2時点t2までの時間間隔にわたり、ヒト患者の歯周疾患の状態変化を決定するインビトロ方法であって、以下の：前記時点tiで前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料と、前記時点t2で前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料から、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の一方又は両方のタンパク質濃度を検出する工程、かつ、前記濃度を比較する工程を含み、好ましくは、少なくとも２つの、より好ましくは前記３つの濃度の相違が状態変化を反映する、方法を提供する。当該相違は、濃度の差として検討することができ、このようにして、最初に０と１の間の数字、又は他のいかなる分類を作成せずに、直接比較することができる。両方の時点で受信した測定値は、上記のように患者の状態の決定に行われるのと同様の方法で処理することもできることが理解されるであろう。

本発明はまた、ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを診断する方法を提供し、前記方法は、患者の唾液中のＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の一方又は両方のタンパク質の存在を検出する工程を含む。患者における健常な口腔、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病の存在は、前記試料中の前記タンパク質の濃度に基づいて評価される。場合によっては、本態様の方法は、さらに、患者の歯周病を治療する工程を含む。この場合の治療工程は、既知の治療剤の投与又は歯科処置、又は治療剤と歯科処置の組み合わせを含んでよい。公知の治療剤は、マウスウォッシュ、チップ、ゲル又はマイクロスフィア等の抗菌剤含有剤の投与を含む。歯肉炎及び歯周炎の治療に用いる通常の抗菌剤は、クロルヘキシジンである。他の治療剤としては、抗生物質、通常、経口投与される抗生物質、及びドキシサイクリン等の酵素抑制剤があげられる。公知の非外科的治療処置としては、スケーリング及びルートプレーニング（ＳＲＰ）があげられる。公知の外科的処置としては、外科的ポケット整復、フラップ手術、歯肉移植又は骨移植があげられる。

本発明はさらに、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病に罹患した患者の、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、及びＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の一方又は両方を検出する方法であって、以下の：
（ａ）前記ヒト患者から唾液試料を得る工程；かつ、
（ｂ）ＡｌＡＧＰに結合することができる第１検出試薬、ＰＫを結合することができる第２検出試薬、及びＳ１００Ａ８及びＭＭＰ-９のいずれか一方又は両方を結合することができる第３検出試薬を前記唾液試料に接触させて、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、及びＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の一方又は両方の各タンパク質と前記検出試薬の結合を検出することにより、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、及びＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の一方又は両方が前記唾液試料中に存在するかを検出する工程；を含む、方法を提供する。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明される。

被験者１５３例を対象とした臨床試験では、３９例が健常歯茎（Ｈ）、３５例が歯肉炎（Ｇ）、４１例が軽度歯周病（ＭＰ）、３８例が進行性歯周病（ＡＰ）と診断され、Receiver-Operator-Characteristic Area Under-the Curve（ＲＯＣＡＵＣ）値が得られた。ＲＯＣＡＵＣ値は歯周病の検出で＞０．９、その後、健常歯歯茎と歯肉炎を区別し、かつ、軽度歯周病と進行性歯周病を区別する値で＞０．７５であった。

統計学では、受信者機動作特性曲線（ROC曲線）は、識別閾値を変化させたときのバイナリ分類器システムの性能を示すグラフィカルなプロットである。この曲線は、様々な閾値設定における偽陽性率（ＦＰＲ）に対して真陽性率（ＴＰＲ）をプロットすることで作成される。真陽性率は、機械学習では、感度、想起又は検出の確率としても知られる。偽陽性率は、フォールアウト又は誤警報の確率としても知られ、（１−特異度）として計算することができる。したがって、ＲＯＣ曲線は、フォールアウトの関数としての感度である。一般に、検出と誤警報の両方の確率分布が既知である場合、ROC曲線は、検出確率の累積分布関数（∞から判別しきい値までの確率分布の下の面積）をｙ軸に、誤警報確率の累積分布関数をｘ軸にプロットすることで生成することができる。検査の精度は、検査対象群を、問題の疾患のある群とない群とにどれだけうまく分けるかに依存する。精度は、ＲＯＣ曲線下面積で測定する。面積が１の場合は完全な検査を表し、面積が０．５の場合は価値のない検査を表す。診断検査の精度を分類するガイドは、以下の伝統的な学術的ポイント制である：
０．９０−１＝優良（Ａ）
０．８０−０．９０＝良好（Ｂ）
０．７０−０．８０＝公正（Ｃ）
０．６０−０．７０＝不良（Ｄ）
０．５０−０．６０＝失敗（Ｆ）
様々なバイオマーカーの組み合わせを、一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）によるロジスティック回帰によって評価した結果、本発明のバイオマーカーの組み合わせが得られた。本発明のタンパク質バイオマーカーの組み合わせのＡＵＣは、３つの分類（健常／歯肉炎対歯周病、健常対歯肉炎、及び軽度歯周病対進行性歯周病）のすべてについて＞０．７５であることがわかる。

以上より、上記の臨床試験の結果において、ＲＯＣＡＵＣ値が０．７５を超えることは、本発明に係る診断検査を提供するために望ましい精度を表すと考えられる。

以下の表１は、決定されたすべてのバイオマーカー及びバイオマーカーパネルのうち、ＲＯＣＡＵＣが０．７５を超えるデータをまとめたものである。

表に示されたバイオマーカータンパク質は、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、マトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）並びにＭＭＰ−８、インターロイキン１β、ヘモグロビン−β、ヘモグロビン−δ、肝細胞増殖因子、遊離軽鎖κ及び遊離軽鎖λである。

ROC AUCが0.75以上であれば、できるだけ少ないマーカーを適用することができるという、最適な結果から、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）の一方若しくは両方からなるバイオマーカーパネルの選択に依存するか、又は示されるようにさらなるマーカーを加えることに依存することが分かってきた。

これらの１４パネルのタンパク質バイオマーカーは、多くて４つであり、すべての分類、すなわち、Ｈ／Ｇ対Ｐ、Ｈ対Ｇ、及びＭＰ対ＡＰに対してＡＵＣＬＯＯＣＶ＞０．７５を提供することが示され：
以下の１４のタンパク質マーカーが考えられる：
ＭＭＰ８
ＩＬ−ｌβ
ＭＭＰ９
ＨＧＦ
遊離軽鎖（ＦＬＣ）κ（カッパ）
遊離軽鎖（ＦＬＣ）λ（ラムダ）
Ａ１ＡＧＰ
ヘモグロビンβ
ヘモグロビンδ
ケラチン４
プロフィリン
ピルビン酸キナーゼ
Ｓ１００Ａ８
Ｓ１００Ａ９
さらに、領域知識に基づいて、ロジスティック回帰において、他の予測因子κ＋λ、κ−λ、κ／λを考慮した。

１４個のプロテイン・マーカーに加えて、場合によっては、年齢をマーカーとして加えると、最大４つのプロテイン・マーカーがある２９４０個のパネルが可能である（年齢のみのパネルは考慮せず）。上記３つの他の予測変数を考慮すると、最大で４つのタンパク質マーカーがある４２０４個の非重複可能なパネルがある（年齢のみのパネルは考慮せず）。ここでの非重複とは、ロジスティック回帰では、予測因子としてκとλを含む対応するパネルと同じ結果を与えるので、例えば、κ＋λとκ−λを予測因子として含むパネルは考慮されないことを意味する。パネル内のタンパク質マーカーの数を制限せず、１４個のタンパク質マーカー、年齢、及び上記他の３つの予測変数を考慮すると、９８３０２個の非重複可能なパネル（年齢のみのパネルは考慮せず）が得られる。

本発明は、図面及び上記説明において詳細に図示及び説明されるが、当該図示及び説明は、理解の一助となるものであり、又は例示的であり、限定的ではなく、本発明は、開示された実施形態に限定されない。例えば、異なるバイオマーカーについて異なる単位で検出試薬を提示することが可能である。又は、便利には、本発明のキットは、全ての態様、即ち、ＭＭＰ−９及びＩＬ１β、並びにさらなるバイオマーカー、すなわち、ＭＭＰ−８又はＭＭＰ−３のいずれかの検出試薬を含む可撓性モジュールにおいて用いられるタンパク質バイオマーカー用固定セットの検出試薬を含むことができる。

当業者であれば、特許請求の範囲に記載された発明を実施する場合に、開示された実施形態に対する他の変形例を、図面、開示、及び添付の請求の範囲の研究から、理解し、実施することができる。特許請求の範囲において、用語「含む」は、他の要素又は工程を除外せず、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」（原文）は、複数を除外しない。本発明の特定の特徴が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、当該特徴の組み合わせが有利に用いられないことを示すものではない。請求項中の引用符号は、その範囲の限定と解釈してはならない。

要すれば、ヒト患者の歯周組織が健常であるか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するインビトロ方法を開示する。当該方法は、わずか３種類のバイオマーカータンパク質の選択を決定するための洞察に基づく。従って、患者由来の唾液試料において、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質の濃度が測定される。測定された濃度に基づいて、当該値が、当該タンパク質の結合濃度を反映して決定される。この値は、通常、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病を有する確率を計算するために用いられ、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病に関連する共同濃度を同様の方法で反映する各閾値と比較される。比較により、検査値が、前記患者における健常、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病の存在を示すかどうかを評価することができる。

さらなる態様では、本発明は、ヒト患者の唾液試料中の歯周疾患の少なくとも3つのバイオマーカーを検出するキットであって、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質からなるタンパク質を検出する１又はそれ以上の検出試薬を含む、キットを提供する。通常、３つ以上の検出試薬が用いられ、各試薬は異なるバイオマーカーに結合する。一の実施形態では、第１検出試薬はＡｌＡＧＰに結合することができ、第２検出試薬はＰＫに結合することができ、第３の検出試薬はＳ１００Ａ８及びＭＭＰ−９の１つに結合することができる。

本発明はまた、別個に又は上記システムの部分として、ヒト患者の唾液試料中の歯周病の少なくとも3つのバイオマーカーを検出するキットであって、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）の一方又は両方のタンパク質からなるタンパク質を検出する1又はそれ以上の検出試薬を含む、キットを提供する。通常、当該キットは、各々が異なるバイオマーカーを指向する３つの検出試薬を含み、ここで、第１検出試薬はＡｌＡＧＰに結合することができ、第２検出試薬はＰＫに結合することができ、第３検出試薬はＳ１００Ａ８及びＭＭＰ−９の一方又は両方に結合することができる。好ましい態様では、当該キットにて利用可能な検出試薬は、上記のように、本発明の３−バイオマーカーパネルを構成する３つのタンパク質を選択する検出試薬からなる。

本発明は、図面及び上記説明において詳細に図示及び説明されるが、当該図示及び説明は、理解の一助となるものであり、又は例示的であり、限定的ではなく、本発明は、開示された実施形態に限定されない。例えば、異なるバイオマーカーについて異なる単位で検出試薬を提示することが可能である。

Claims

ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するインビトロ方法であって、以下の：
前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する工程；
前記タンパク質について決定された共同（joint）濃度を反映した少なくとも1つの検査値を決定する工程；を含み、
−前記検査値が、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標であるかを評価する、方法。
検査値が、（ｉ）歯周病対健常又は歯肉炎の確率、（ｉｉ）歯肉炎対健常の確率、及び（ｉｉｉ）進行性歯周病対軽度歯周病の確率のうちの１、２又は３についてもたらされる、請求項1に記載のインビトロ方法。
前記少なくとも1つの検査値を、歯肉炎、歯周病又は進行性歯周病に関連する共同濃度を同様に反映する少なくとも1つの閾値と比較する工程を含む、請求項1又は２に記載のインビトロ方法。
前記閾値が、歯茎が健常である被験者由来の試料、歯肉炎である被験者由来の試料、軽度又は中等度の歯周病の被験者由来の試料、及び進行性歯周病の被験者由来の試料を含む、試料セット中のタンパク質の濃度に基づく、請求項３に記載のインビトロ方法。
ヒト患者が歯周病であることが知られている場合、前記患者が歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病であるかを評価する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記被験者の年齢が決定された場合、前記検査値は、前記被験者の年齢と組み合わせて、前記タンパク質について決定された共同濃度を反映する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記閾値が、健常歯茎、歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病の存在に関連する、1又は複数の基準試料中のタンパク質について決定された濃度に基づく、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質が、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８のうちの１つからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記タンパク質が、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、及びＭＭＰ−９、又はＡ１ＡＧＰ、ＰＫ、及びＳ１００Ａ８からなる、請求項８に記載の方法。
前記決定された濃度値が、0から1の間の数に算術処理される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
ヒト患者の唾液試料中のα−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するバイオマーカーとしての使用。
ヒト患者の年齢もまた、バイオマーカーとして用いられる、請求項１１に記載の使用。
ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを評価するシステムであって、以下の：
前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出することができ、かつ、検出するように適応された検出手段；かつ
前記タンパク質について決定された濃度から、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標を決定することができ、かつ、決定するように適応されたプロセッサ、
を含む、システム。
さらに、口腔液試料受領用容器をさらに含み、前記容器は前記検出手段を含む、請求項１３に記載のシステム。
さらに、以下の：
ユーザに前記指標を提示するユーザインタフェース；かつ
前記プロセッサから前記ユーザインタフェースに前記指標を転送する、前記プロセッサと前記ユーザインタフェースとの間のデータ接続
を含む、請求項１３又は１４に記載のシステム。
前記プロセッサが、インターネット系アプリケーションの手段により機能しうる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のシステム。
前記インタフェースが、被験者の年齢情報を入力することができ、かつ、前記プロセッサが、前記決定されたタンパク質濃度から、患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを示す指標を決定することができ、及び決定するように適合される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
ヒト患者の唾液試料中の歯周病の少なくとも3つのバイオマーカーを検出するキットであって、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質を検出する1又はそれ以上の検出試薬を含む、キット。
前記1又はそれ以上の検出試薬が、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質を検出する、少なくとも３つの検出試薬を含む、請求項１８に記載のキット。
前記1又はそれ以上の検出試薬が、固体支持体に包含されている、請求項１８又は１９に記載のキット。
１又はそれ以上の検出試薬が、
ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、及びＭＭＰ−９、又は
ＡｌＡＧＰ、ＰＫ及び、Ｓ１００Ａ８
のための検出試薬からなる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。
第1時点tiから第2時点t2までの時間間隔にわたり、ヒト患者の歯周疾患の状態変化を決定するインビトロ方法であって、以下の：前記時点tiで前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料と、前記時点t2で前記患者から得られた唾液の少なくとも1の試料から、ＡｌＡＧＰ、ＰＫ、並びにＭＭＰ−９及びＳ１００Ａ８の少なくとも１つのタンパク質濃度を検出する工程、かつ、前記濃度を比較する工程を含み、前記３つの濃度の相違が状態変化を反映する、方法。
ヒト患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかを診断する方法であって、以下の：前記ヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する工程；かつ、前記検査値が、前記患者が歯周疾患でないか、歯肉炎であるか、軽度歯周病であるか、又は進行性歯周病であるかの指標であるかを評価する、方法。
歯肉炎、軽度歯周病、又は進行性歯周病に罹患したヒト患者の唾液試料中の、α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質の濃度を検出する方法であって、以下の：
（ａ）前記ヒト患者から唾液試料を得る工程；かつ、
（ｂ）前記タンパク質を結合する１又はそれ以上の検出試薬を前記試料に接触させて、前記α−ｌ−酸糖タンパク質（ＡｌＡＧＰ）及び、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、並びにマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８（Ｓ１００Ａ８）のうちの少なくとも１つのタンパク質と前記１又はそれ以上の検出試薬の結合を検出することにより、前記各タンパク質が前記試料中に存在するかを検出する工程；
を含む、方法。