JP2004129584A - 歯周病の検査方法及び検査診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】歯周病の進行予測を的確に行うことができる歯周病の検査方法及び検査診断薬を提供すること。
【解決手段】歯周病によって流出量が増加することが知られている歯肉溝滲出液に発現することが判明した破骨細胞の分化誘導に関与するγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性を測定する歯周病の検査方法を提供するとともに、とともに、前記γ−グルタミルトランスペプチダーゼと反応する物質、例えば抗γ−ＧＴＰ抗体を少なくとも含有する歯周病の検査診断試薬を提供する。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病の検査方法及び検査診断薬に関する。より詳細には、γ−グルタミルトランスペプチダーゼをマーカーとする歯周病の生化学的な検査方法及び歯周病の検査試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
歯周病は、歯のまわりの歯周組織が徐々に壊されていく慢性の病気である。一般には、根端性歯周炎や歯周組織にできた腫瘍を除いて、それ以外の歯周組織に係わる病気を一括して歯周病（又は歯周疾患）と呼んでいる。
【０００３】
現在、６０歳以上の８０％が歯周病であるという知見があり、今後、高齢化の進行に伴い患者数が増大することが予測される。近年は、中年の患者も増加し、国民病の様相を呈し、現在、医療機関で治療を受けている患者は３，０００万人以上、潜在患者も同数以上存在すると考えられ、歯周病の医療費は、約５，０００億円に達し、歯科医療費の２割に相当する。
【０００４】
現在までの研究によって、歯周病の原因が細菌であることや症状の進行過程等について明らかにされている。歯周病の症状としては、歯肉が腫れたり、食事の時や歯を磨く時に歯肉から出血したり、口臭が増したり、歯肉を押すと歯のまわりから膿が出たりすることが挙げられる。だが、殆どの歯周病は、痛み等の自覚症状がないままに静かに経過するため、歯がぐらつく等の異常に気付いた時には、既に手遅れの状態で、歯を支える歯槽骨の大半が失われている場合も少なくない。
【０００５】
また、歯周病は、ゆっくり進行するが周期性があり、ほとんど症状を示さない静止期とその後に続く激しい急性炎症と破壊によって、歯と歯肉の間に亀裂（一般に、「歯周ポケット」と称される。）が生じ、更に、歯のまわりの結合組織が壊され、歯槽骨が吸収される。外部から観察すると、歯肉が痩せて退宿し、歯根が現れるようになって、やがては歯がぐらついて、最終的には歯が抜け落ちてしまう。
【０００６】
ここで、現在普及している歯周病の検査診断法としては、レントゲン写真を撮って骨の吸収の度合いを目視で判断する方法、歯周ポケットの深さや細菌の付着レベルを測る方法、また、プロービング時の出血（歯周ポケットにプローブという器具を入れた時に出血があるかどうか）や歯の揺動度を調べる方法、プラーク（歯垢）中の細菌数を測定し、菌の種類を同定する方法等がある。
【０００７】
また、酵素活性測定を利用する歯周病検査方法として、口腔から採取した検体をアルカリフォスファターゼ活性測定用基質と反応させ、その発色の程度を肉眼で観察して、歯肉炎、歯周炎等の歯周疾患の程度を予測する方法（特許文献１参照）、歯肉溝滲出液に含まれるコラゲナーゼの酵素活性を測定する方法（特許文献２参照）等が提案されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平５−１７６７９６号公報。
【特許文献２】
特開昭６１−７１０００号公報。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前掲した従来の歯周病の検査診断法では、歯周病の発症を把握することはできても、病気の進行を的確に予測することは難しかった。このため、依然として、歯周病の進行を客観的に予測することができる有力な検査方法の開発が望まれている。
【００１０】
自覚症状がないままに進行する歯周病への対策は、発症の早期発見と病気の進行予測が特に重要である。炎症の初期に歯槽骨の破壊の程度が予測できれば、即ち、歯槽骨破壊の早期診断ができれば、患者の早期治療への取り組みを促し、歯周病の的確な治療を行うことができる。
【００１１】
そこで、本発明は、歯周病の炎症に伴って発生する歯槽骨破壊の程度を、破骨細胞を分化誘導する活性がある酵素、即ちγ−グルタミルトランスペプチダーゼの活性を調べることによって把握し、歯周病の進行予測を的確に行うことができる歯周病の検査方法及び検査診断薬を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成して技術的課題を解決するために、本発明では、以下の手段を採用する。
【００１３】
まず、本発明では、本願発明者らが、歯周病患者の歯肉溝滲出液に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ酵素（慣用名。以下「γ−ＧＴＰ」と略称する。）が発現しているという事実を新規に見出したことに基づいて、このγ−ＧＴＰの活性を測定する歯周病の検査方法を提供する。
【００１４】
なお、歯肉溝滲出液（ｇｉｎｇｉｖａｌ　ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ　ｆｌｕｉｄ）は、歯肉に炎症が起こるとその流出量が増加することが知られており、γ−ＧＴＰは、グルタチオンをはじめとするγ−グルタミルペプチドを加水分解するとともに、γ−グルタミル基を他のアミノ酸やペプチドに転移させる酵素として知られている。
【００１５】
本発明において検査マーカーとして用いるγ−ＧＴＰは、現在、肝疾患等の検査診断で一般的に用いられているγ−ＧＴＰ活性測定法、抗γ−ＧＴＰ抗体（γ−ＧＴＰと特異的に結合する抗体）とγ−ＧＴＰ蛋白質との反応を活用した直接検出法、又はＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：合成酵素連鎖反応）法によってγ−ＧＴＰをコードするｍＲＮＡの発現を確認する方法等から選択される公知の手法に基づいて、簡易かつ確実に検出することが可能である。即ち、γ−ＧＴＰの検出又は測定は確立された公知の手段で簡易かつ確実に行うことができるという利点がある。
【００１６】
また、本発明では、γ−ＧＴＰと反応する物質を少なくとも含有する歯周病の検査診断試薬を提供する。
【００１７】
γ−ＧＴＰと反応する物質は、例えば、抗γ−ＧＴＰ抗体（γ−ＧＴＰと特異的に結合する抗体）である。これによって、歯周病進行に伴う炎症によって進行する歯槽骨破壊（破骨細胞の分化誘導）のマーカーとなるγ−ＧＴＰの発現を簡便にかつ速やかに確認することが可能となる。なお、前記検査診断薬を備える歯周病の検査診断専用の検査キットも提供できる。
【００１８】
以上のように、γ−ＧＴＰを歯周病のマーカーとして用いれば、歯周病の検査、診断、進行予測が可能な歯周病の生化学的検査診断手法を提供できるという第１の技術的意義、そして、γ−ＧＴＰの測定方法又は検出方法は既に医療分野等において確立されている技術があるので、歯周病の生化学的な検査診断方法を医療分野に容易かつ迅速に普及させることができるという第２の技術的意義を有する。
【００１９】
【実施例】
まず、本発明に係る歯周病の検査方法の好適な実施例としては、歯周病患者の歯肉溝滲出液を患者から採取し、この歯肉溝滲出液中のγ−ＧＴＰの活性を、例えば、現在肝疾患等の検査診断で一般的に用いられている公知のγ−ＧＴＰ活性測定法によって確認する方法を挙げることができる。
【００２０】
この測定値が高い場合には、歯周病疾患であるとの検査及び診断を行うことができる。なお、γ−ＧＴＰ活性測定法の原理は、例えば、Ｎ−（ＤＬ−γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ（Ｉ）を基質にし、アクセプターとしてアミノ酸（ＩＩ）を加え、反応生成物のアゾ色素を比色するというもので、市販キットを適宜利用して実施することができる。
【００２１】
また、本発明では、γ−ＧＴＰ活性が同じでも蛋白質が異なるものも存在し得ることから、抗γ−ＧＴＰ抗体と特定のγ−ＧＴＰ蛋白質との特異的な抗原抗体反応を利用した直接検出法（免疫学的手法）によって、直接このγ−ＧＴＰ蛋白質の発現を確認し、歯周病の検査及び診断を確実に行うという実施形態を採用することもできる。
【００２２】
ここで、γ−ＧＴＰ蛋白質は、破骨細胞の形成活性や骨破壊との関連で発現するものが、歯周病検査のためのマーカーとして好適と考えられる。抗γ−ＧＴＰ抗体は、このγ−ＧＴＰ蛋白質と特異的に結合するものであればよく、特に限定されない。歯周病患者から特異的に発現される特定のγ−ＧＴＰ蛋白質を直接検出することにより、歯周病の診断を確実に行うことができる。
【００２３】
更には、公知のＲＴ−ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：合成酵素連鎖反応）法によりγ−ＧＴＰ蛋白質をコードするｍＲＮＡ発現を確認する方法に基づいて、γ−ＧＴＰの発現を確認し、慢性関節リウマチ疾患であるとの検査及び診断を行う実施形態も採用することができる。
【００２４】
なお、上記以外の方法でも、γ−ＧＴＰ蛋白質を確実に検出できる方法であれば、本発明の実施例の一つとして採用できる。例えば、抗体を用いたイムノアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）並びに酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオアイソトープを使わない競合的酵素抗体法（ＥＩＡ）などを挙げることができる。また、ビアコア等のバイオセンサー装置を用いたγ−ＧＴＰ蛋白質の検出も可能である。
【００２５】
次に、本発明に係る歯周病の検査診断試薬の好適な実施形態としては、例えばγ−ＧＴＰと特異的に結合する抗γ−ＧＴＰ抗体を少なくとも含有する構成を備える試薬が考えられる。なお、この試薬の具他的形態は広く解釈されるものであり、更には、この試薬を備える検査診断キットや抗γ−ＧＴＰ抗体等をリガンドに備える検出表面を持つバイオセンサーチップ等も提供することができる。
【００２６】
【実験例】
歯周病患者１０名から抜歯した抜去歯を提供してもらい、この抜去歯を洗浄せずにチューブに入れて、抜去歯が浸るように１ｍｌの生理食塩水（ＰＢＳ）を入れて、４℃、２４時間放置し、前記抜去歯に付いた歯周組織のγ−ＧＴＰを溶出させた。その後、得られた溶出液をフィルターでろ過して滅菌し、測定用の溶出液を得た。この溶出液中のγ−ＧＴＰ活性は、協和メデックス（株）社製・デタミナーＬ（登録商標）キットを用いて測定した。なお、この測定は、前記溶出液１ｍｌ中の６０μｌを用いた。
【００２７】
なお、比較検体は、歯周病ではない虫歯患者からの抜去歯（検体番号１１）、歯が健康で歯矯正の際に抜歯した抜去歯（検体番号１２〜１４）をそれぞれ用いて、上記同様の方法でγ−ＧＴＰ活性を測定した。測定結果を次の表１に示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
上記表１に示されているように、歯周病を発症した患者１０名（検体番号１〜１０）の抜去歯の溶出液中のγ−ＧＴＰ活性は高く（平均１７．９Ｕ）、一方、歯周病ではない虫歯患者からの抜去歯の溶出液（検体番号１１）のγ−ＧＴＰ活性は０であり、また、歯が健康で歯矯正の際に抜歯した抜去歯の溶出液（検体番号１２〜１４）においては、γ−ＧＴＰ活性は、平均０．２Ｕであった。
【００３０】
なお、上記実験例では、歯周病を発症した患者１０名の唾液中に含まれるγ−ＧＴＰ活性を測定したところ、約１Ｕ程度であることが確認できた。このことから、検体番号１〜１０から得られた溶出液中のγ−ＧＴＰの大部分は、歯肉溝滲出液由来のものであることが確認できた。
【００３１】
以上の実験結果から、歯周病を発症した患者の歯肉溝滲出液中にはγ−ＧＴＰが発現し、その活性が高まることを検証できたことから、本発明の有効性を確認することができた。
【００３２】
本発明は、歯周病の炎症に伴う歯槽骨破壊を進行させる破骨細胞の分化誘導に係わるγ−ＧＴＰの活性を測定する方法又は同γ−ＧＴＰの発現を確認できる検査診断試薬であるから、歯槽骨破壊の早期発見、歯槽骨破壊の進行段階の把握、歯槽骨破壊の進行予測に役立てることができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によって、γ−ＧＴＰに関し、歯周病のマーカーとしての全く新規な用途を提案できる。そして、γ−ＧＴＰの測定方法又は検出方法は、既に医療分野等において確立されている技術を用いて、歯周病の生化学的な検査方法及び検査診断試薬を医療分野に容易かつ迅速に普及させることができる。更には、歯周病の決定的な生化学的検査診断技術を提供できるので、歯周病の早期診断、早期治療に役立てることができる。

Claims (2)

1. 歯肉溝滲出液に含まれるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする歯周病の検査方法。
2. γ−グルタミルトランスペプチダーゼと反応する物質を少なくとも含有する歯周病の検査診断試薬。