TWI251078B

TWI251078B - Method for determining a white blood cell count of a whole blood sample, based on the concentration of myeloperoxidase

Info

Publication number: TWI251078B
Application number: TW089105987A
Authority: TW
Inventors: Yoshihiro Hatanaka; Ryo Serizawa
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2006-03-11
Also published as: EP1167970A1; DE60033380T2; DE60033380D1; AU756780B2; AU3454000A; WO2000058726A1; CN1342265A; KR100446410B1; EP1167970A4; JP4485070B2; CN1217189C; KR20010102434A; EP1167970B1; US6599713B1

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1251078 A7 _____B7 _二五、發明説明（1 ) 技術領域本發明係關於含於全血試料的白血球數之定量方法。更詳細而言，關於一種全血試料的白血球數之定量方法，其包含全血試料與表面活性劑混合所得的混合物，溶解該全血試料中之白血球，而欲釋出內生性的骨髓過氧化酶需放置充分的時間，測定出該混合物中釋出之骨髓過氧化酶濃度，由該釋出的骨髓過氧化酶濃度定量出該全血試料中白血球數。使用本發明的白血球數之定量方法，可無須分離全血中的血液細胞，可容易且迅速地定量全血試料中的白血球數以及/或嗜中性白血球。又，使用本發明的定量方法，全血試料之白血球數可同時使用相同試料而定量含於全血試料的C反應性蛋白濃度，故對於感染症的有無或炎症的受傷度可迅速、簡便且便宜地診斷。過去的技術近年來’對於患者的初期診斷，作爲判斷是否爲細菌感染症之檢查項目，有使用白血球數與C反應性蛋白（C_ reactive protein ·，以下簡稱爲” C R P ”）定量方法。此時期 ί寸種醫師爲使ί几生素的投與可適宜地處理，而能迅速、簡便且低成本得到上述結果之定量方法。通常，對白血球數的測定，使用以電阻法原理之

Coulter Counter τΜ(美國，COULTER ELECTRONICS，INC.公司製）所代表的市販自動血球測定裝置。然而，此裝置中無法定量血漿蛋白的CRP。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210'乂297公釐） -4 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251078 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 最近，如山尾泰生、奧成博、Henri CHAMPEIX: Readout，16, 11-15 (1998 )所記載’巾面上有以電阻法原理的血球測定裝置中加上膠乳免疫比濁率法的c R p測定機能之白血球數與C R P共同定量之裝置。然而’對於此裝置，作爲白血球以外的血球成分之紅血球溶血後’白血球數以電阻法測定，進一步測定c R p時’溶血後之檢體與，抗C R P抗體結合之膠乳粒子於一定時間反應後’以膠乳免疫比濁率法測定C R P。因此，因白血球數的定量與 C R P的定量的原理相異，故必須進行不同的操作。如此過去的方法爲非常繁雜的操作，且進行定量的試藥類很多故有成本高的缺點。又，裝置的維護必須花掉很多時間與成本。這些缺點成爲的障礙，對於擔任一般開業醫生等之初期診療的一般醫院，現今幾乎無導入自動血球測定裝置，成爲醫療需求的缺乏。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲上述問題點的解決方法，考慮以白血球數與 CRP相同原理爲基礎的定量方法。具體而言，考慮以一種試料下同時測定C R P與白血球數之免疫學方法。以免疫學進行白血球數的測定，僅測定存在於白血球的特異性蛋白質即可。一般引起細菌感染或炎症時，由白血球成分中存在率最大的嗜中性白血球數之增加可得知。因此，僅定量嗜中性白血球，可知道白血球數的增減，判斷出細菌感染症的有無或炎症的受傷度。作爲定量引起炎症的組織位置之嗜中性數或全血中之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 白血球數或顆粒球數之方法，例如p e t e r P . Bradley， Dennis A · Priebat, Robert D . Christensen and Gerald Rothstein: J . Invest. Dermatol .，7 8，206-209( 1 9 82)所記載的方法可舉出。此方法中，預先使用Flc〇ll試藥由全血中分離嗜中球白血球或，引起炎症的皮膚組織以含有〇 . 5 % 的 Hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB)的 5 0 m Μ之磷酸鉀緩衝液（ρ η 6 · 0 )中均質，經超音波處理後萃取出骨髓過氧化酶並測定其酵素活性。又，Rita Cramer, Maria Rosa Soranzo，Pietro Dri, Renzo Manegazzi, Anna Pitotti, Giuliano Zabucchi and Pierluigi Patriarca: Journal of immunological Methods, 70， 119- 1 25( 1 9 84)的方法中，含有作爲抗凝固劑的ACD(acid citrate dextrose)溶液的血液中加入葡聚糖（MW2 0 0， 0 0〇）溶液除去紅血球，再使用Fkoll試藥將顆粒球離心分離。再將2x 1 〇4個顆粒球與含有1 3mM guaiacol以及 0 · 0 2% cetyltrimethylammonium bromide 之 0 . 1 M 磷酸經濟部智慧財產局員工消費合作社印製緩衝液（ρ Η 7 · 0 )混合後，將此加入1 // m ο 1之 Η 2 ◦ 2並測定骨髓過氧化酶活性。 W.M . Kuebler, C . Abels, L. Schuerer and A. E. Goetz: Int . J . Microcirc .，1 6,89-97( 1 996)，預先使用 Ficoil試藥自全血中分離出的多核白血球，使用含有0 · 5 % Η T A B的5 0 m Μ磷酸鉀緩衝液（ρ Η 6 · 0 )使其溶解（1 y s e )測定含於其中的骨髓過氧化酶之酵素活性。且，對於此文獻，老鼠的腦或兔子的肺組織’冰冷後本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - 1251078 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 於1 m 1的〇 . 〇 2 M磷酸鉀緩衝液（ρ η 7 . 4 )中均質’且加入1 m 1的〇 · 〇 2 Μ磷酸鉀緩衝液（ρ Η 7 · 4 )進行4 °C，2 0 0 0 r p m，1 5分鐘的離心操作’測定含於所得之骨髓過氧化酶的酵素活性。又，對於離心分離的剩餘，進行6 〇 t下2小時的恆溫培養，再以含有0 · 5%的HTAB之5 0mM磷酸鉀緩衝液（pH 6 · 0 )均質，超音波處理後，4 °C、2 0，000 r P m進行1 5分鐘離心分離後，測定含於所得上淸液之骨髓過氧化酶的酵素活性。關於國際申請公開W〇9 3 / 0 1 3 0 6號所記載的方法中’一定量的血液置於注射筒內設定的玻璃濾片上（ glass microfiber filter)，欲事先去除阻礙顆粒球測定之成分’爲不破壞血液中顆粒球而加入水將紅血球成溶血，再將樣品血液內的溶血成分進行吸著淸洗（p r e s s u r e w a s h )。其後，乾燥含有未溶解的顆粒球之玻璃濾片，將含有 0-05%Triton™ X— 100、30mM 3 —amin〇 — l，2，4 triazole '0.0 0 0 5 % H2〇2 以及〇 . 5mg/m 1 o-tolidine 之 5 OmM 磷酸緩衝液滴入玻璃瀘片中，自顆粒球溶出的骨髓過氧化酶之作用而染色成藍色之點作爲顆粒球而測定。曰本國特開平8 - 3 0 8 5 9 3號公報（與 EP743 5 1 9號公報以及美國專利第56 39 6 30 號公報對照）所記載的方法中，將全血中的紅血球進行溶血使血紅蛋白溶出，而白血球細胞與未破壞的非離子性本抵張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） ^77 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251078 A7 B7 五、發明説明（5 ) ρ 〇 1 y e t h ο X y 1 a t e表面活性劑、陰離子性的離子性表面活性齊fj 、或兩性離子性表面活性劑、以及雖與白血球細胞成化學交聯，但不與紅血球形成交聯之甲醛或仲曱醛、以及爲使淋巴球檢測增強之糖或糖醇、以及欲使反應液的p Η約爲 Ρ Η 6 . 8至8 . 0的中性或接近中性之緩衝液等所成之溶液與全血混合。其後，所得之混合溶液包溫至6 0至 7 5艺使紅血球成溶血，且使白血球成交聯狀態。對於白血球的一部份，內在的過氧化酶活性爲基準施行染色，使用吸光度或光散亂法以電光學的方式測定與白血球相異的細胞種類。然而對於此方法有如下之問題，爲使測定存在於皮膚、腦、肺組織之嗜中性白血球中充分溶出骨髓過氧化酶之酵素活性，必須使用Η T A Β存在下的均質化處理或離心處理等極爲繁雜的操作與時間。且，爲測定全血中的白血球數，欲除去妨礙骨髓過氧化酶測定之物質，必須預先使用Ficoil試藥等將白血球自全血中分離。因此，對於此方法中，因必須有測定阻礙物質之除去操作、或欲將白血球固定化之反應等，故操作成爲繁雜，許多試藥類或專用裝置亦必須準備。又，後藤明子、內田壹夫、富田仁：臨床檢查、 40 ，859 — 863 (1996)或、日本國特開平8 —1 45 9 9 3號公報、日本國專利開平9 一 729 06 號公報 '日本國特開平9 一 1 9 6 9 1 9號公報以及日本國特開平1 1 一 3 2 7 9 3號公報中，揭示尿道感染症的本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 8 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • H· ^ >....... 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1251078 A 7 B7 _ 五、發明説明（6 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 患者之尿液檢體中所釋出的白血球數的定量方法。具體而言，揭示一種尿檢體以◦.〇5 % Triton τ M X — 1〇〇處理，由尿液檢體中釋出的白血球（9 5 %爲嗜中性白血球）溶出之骨髓過氧化酶的量，由酵素免疫測定之方法。尿檢體與全血作比較其細胞成分極爲少’含於其中的骨髓過氧化酶測定障礙物質的量較少。因此’對於上述的方法，尿液檢體僅以Triton τ M X - 1 0 0處理即可測定尿中嗜中性白血球所存在之骨髓過氧化酶，但全血中白血球以外的細胞成分之紅血球、血小版以及血漿蛋白混成極爲濃且不均勻的生物體成分之混合之系統，故不考慮適用於尿液檢體的方法可應用於全血。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製又，對於全血的溶解處理，由存在於全血中的嗜中性白血球可溶出d e f e n s i η的肽類而測定，d e f e n c i η與白血球數或嗜中性白血球的相關性進行調查其報到（參照Toshihiko Ihi, Masamitsu Nakazato, Hiroshi Mukae and Shigeru Matsukura : Clinical Infection Diseases, 25, 1 1 34- 1 140( 1 997 ))。然而，於此所使用的方法，於全血中加上1 M醋酸以 polytron homogenize!* 進行均質，再以 2000xg，4 °C下進行3 0分鐘的離心處理而萃取出肽類等繁雜的操作爲必要的。因此，對於醫療現場作爲必須迅速且簡便定量出白血球數所作的血液檢體處理法而言，幾乎無法使用。如上述，對於過去的方法，來自白血球成分的物質以免疫學方法測定時’欲自全血中分離的白血球成分的操作 ’欲白血球成分能充分溶出之極爲激烈之溶解處理條件' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）Τ〇Ί 1251078 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明说明（7 ) 長時間的處理操作等多項操作與繁雜的操作過程爲必要的。而且，有著測定値與實際白血球數無密切相關性之缺點〇又，本案的基本申請之申請後所公開的國際申請公開 W〇9 9 / 4 6 5 9 9號公報（對照日本國特開平1 1 — 2 5 8 2 3 1號公報）中，揭示使用表面活性劑釋出全血試料中的顆粒球內部之彈性蛋白酶，再經由使用作爲彈性蛋白酶抑制劑的^ 1 -反胰島素酶進行免疫測定，測定釋出之彈性蛋白酶，定量白血球數之方法。然而，對於此發明欲測定顆粒球彈性蛋白酶，必須有添加α 1 -反胰島素酶的操作，其有操作面與經濟面之缺點。又，顆粒球彈性蛋白酶與白血球數的相關性良好，且白血球數爲 1 0，0 0 0個/// 1以上的試料，即對於非常健康的人所得之全血無測定値。因此，使用過去的方法，若未由全血分離白血球成分，無法迅速、簡便且效率高以免疫學法測定白血球的內在物質，正確地定量白血球數。又，無法同時與白血球數迅速、且簡便地定量出C R Ρ。發明的槪要本發明者欲解決上述的課題而詳細硏究的結果，驚人地發現將全血試料與表面活性劑混合時可有效率溶解白血球，釋出白血球之內生性骨髓過氧化酶而測定骨髓過氧化酶的濃度，此方法與過去的電阻法白血球測定値相比較顯 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X297公釐） _ _ 1251078 A7 B7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 示有極爲良好的相關性，且發現由骨髓過氧化酶濃度可定量白血球數。且，與測定骨髓過氧化酶濃度的同時，亦發現含於全血試料的C反應性蛋白濃度亦可定量，便完成本發明。因此，本發明提供一種迅速、簡便且便宜的全血試料中的白血球數定量方法。本發明的上述以及其他各目的，各特徵以及各益處，由參照附件所示的圖面與下述詳細說明以及申請專利範圍所記載可明確。圖式簡單說明關於圖式，圖1即表示H L B與骨髓過氧化酶（Μ P 0 )溶出率 (吸光度）的關係圖；圖2 ( a )即表示，由健康人與非健康人所得之全血試料中Μ P ◦濃度與白血球數的相關圖，圖2 ( b )即表示，由健康人與非健康人所得之全血試料中乳吩嚀（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 L T F )濃度與白血球數的相關圖、圖2 ( c )則表示，由健康人與非健康人所得之全血試料中彈性蛋白酶（ E L T )濃度與白血球數之相關圖；圖3 ( a )表示，由健康人與非健康人所得之全血試料中Μ P ◦濃度與嗜中性白血球之相關圖、圖3 ( b )即表示，由健康人與非健康人所得之全血試料中L T F濃度與嗜中性白血球之相關圖、圖3 ( c )即表示，由健康人本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -11 - 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（9 ) 與非健康人所得之全血試料中E L T濃度與嗜中性白血球之相關圖。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

圖4 ( a )表示，由健康人所得之全血試料中MPO 濃度與白血球數之相關圖、圖4 ( b )即表示，由健康人所得之全血試料中L T F濃度與白血球之相關圖、圖4 ( c )即表示，由健康人所得之全血試料中E L T濃度與白血球數之相關圖；圖5 ( a )表示，由健康人所得之全血試料中MP〇濃度與白血球之相關圖、圖5 ( b )即表示，由非健康人所得之全血試料中L T F濃度與白血球數之相關圖、圖5 (c )即表示，由健康人所得之全血試料中E L T濃度與白血球樹脂相關圖。圖6即表示，含有白血球數爲10 ，000個/ // 1 以上之檢體的全血試料中Μ P〇濃度與白血球數的相關圖〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製圖7即表示，含有白血球數爲10 ，000個/ //1 以上之檢體的全血試料中Μ Ρ 0濃度與嗜中性白血球數的相關圖。圖8 ( a )即表示，以Μ Ρ〇濃度爲準，白血球數與使用血球測定裝置所測定之白血球數的相關圖、圖8 ( b )即表示，使用以Μ P〇濃度爲準嗜中性白血球與血球測定裝置所測定之嗜中性白血球數的相關圖。發明的詳細說明本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） _ 12 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（10) 所謂本發明即提供一種全血試料中白血球數的定纛方法，其包含 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (a )取得全血試料與表面活性劑混合的混合物、 (b )該混合物中，溶解該全血試料中的白血球，放置充分時間使其釋出內生性的骨髓過氧化酶、 (c )測定該混合物中所釋出的骨髓過氧化酶濃度，於是 (d )由所釋出的該骨髓過氧化酶濃度可定量該全血試料中之白血球數。與更容易瞭解本發明，首先列舉出本發明的基本特徵以及較佳型態。 1 · 一種全血試料中白血球數的定量方法，其包含 (a )取得全血試料與表面活性劑混合的混合物、 (b )上述混合物中，溶解上述全血試料中的白血球，放置充分時間使其釋出內生性的骨髓過氧化酶、 (c )測定上述混合物中所釋出的骨髓過氧化酶濃度，因此經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由所釋出的上述骨髓過氧化酶濃度可定量上述全血試料中之白血球數。 2 .如上述1所記載的方法，其特徵爲上述步驟（c )中，測定上述所釋出骨髓過氧化酶濃度時，可進一步測定含於全血試料中的C反應性蛋白的濃度。 3 ·如上述1所記載的方法，其特徵爲上述步驟（c )中’測定上述所釋出骨髓過氧化酶濃度時，可使用免疫本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -13 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1251078 A7 --- B7 五、發明説明（11) 學的方法進行測定。 4 ·如上述2所_的方法’其特徵爲上述步驟（c )中，測疋上述所釋出骨髓過氧化酶濃度與c反應性蛋白濃度，使用免疫學方法進行測定。 5 .如上述3或4所記載的方法，其特徵爲上述免疫學方法爲酵素免疫測定方法。 6 .如上述3或4所記載的方法，其特徵爲上述免疫學方法爲光學免疫測定方法。. 7 .如上述1至6所記載的方法，其特徵爲上述表面活性劑係非離子性表面活性劑。 8 .如上述7所記載的方法，其特徵爲上述非離子性表面活性劑的親水性•親脂性平衡値（H L B )爲1 2至 14。 9 .如上述7所記載的方法，其特徵爲上述非離子性表面活性劑’係爲飽和或不飽和之碳氫化合物所結合之聚伸乙基氧化物。 1 0 .如上述9所記載的方法，其特徵爲上述非離子性表面活性劑，至少一種選自於具有聚氧伸乙基烷基苯醚骨架之非離子性表面活性劑、不飽和脂肪族碳氫化合物所結合之聚伸乙基氧化物之非離子性表面活性劑、以及具有聚氧伸乙基烷基醚骨架的之非離子性表面活性劑所成群的非離子性表面活性劑。 1 1 ·如上述1 0所記載的方法，其特徵爲上述非離子性表面活性劑，至少一種選自於THton τ Μ X - 1 1 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇><297公釐）「14 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251078 A7 _ B7 五、發明説明（12) Λ Triton X — 1 〇 0 、Igepal T M C A 6 3 〇、

Nissan Nonion N S — 2 0 8 . 5、Nissan Dispanol TOC、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Bnj T M 9 7、以及Brij T M 5 6所成群的非離子性表面活性劑。 1 2 ·如上述1至6所記載的方法，其特徵爲上述表面活性劑，至少一種選自於溴化十六烷基三甲基銨、氯化十六院基三甲基銨、氯化聯二苯乙酮二甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、氯化十八烷基三甲基銨、溴化十四烷基銨、氯化十二烷基吡啶鏺、氯化十六院基吼陡鏺、溴化十六院基吼D定鑰、1 一月桂基氯化吼啶鑰、以及溴化十四烷基三甲基銨所成群之陽離子性表面活性劑。 1 3 ·如前述1至1 2所記載的方法，其特徵爲與上述全血試料混合之前述表面活性劑的量，作爲上述混合物中的濃度爲0.2至10% (w/v)的範圍者。 1 4 .如前述1至1 3所記載的方法，其特徵爲對上述步驟（b )而言，上述混合物的放置時間爲1小時以內〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 5 .如前述1至1 4所記載的方法，其特徵爲上述白血球數爲嗜中性白血球數。以下爲本發明的詳細說明本發明所謂的「全血」，即指紅血球、白血球、血小板、血漿等含所有的血液成分之血液而言，所謂「白血球」即指嗜中性白血球、單球、好鹽基球、好氧球、淋巴球本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 15 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（13) 。又，所謂「白血球溶解」意味白血球的細胞膜遭破壞時，細胞內容物溶出細胞外。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先，欲更明確說明本發明的基本特徵，依本發明完成的過程說明包含於本發明的技術特徵。作爲存在於嗜中性白血球之物質，如 Borregaard, N . et al . “Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes”： Blood, 89，3503-3251(1997)所記載，可舉出存在於azure (—次）顆粒、特殊（二次）顆粒、明膠酶（三次 )顆粒、以及分泌小胞的物質。具體而言，作爲azure (—次）顆粒中所存在的物質， CD6 3、CD6 8、V型H + ATP酶、酸性/3 —甘油磷酸酶、酸性粘多醣、a i -反胰蛋白酶、a i -甘露糖苷酶、azurosizme/ C A P 3 7 /肝素結合蛋白、殺菌性/膜透過性亢進蛋白（B P I ) 、/3 -甘油磷酸酶、yS -葡萄苷酶、組織蛋白酶、defesin、嗜中性彈性蛋白酶、溶菌酶、骨髓過氧化酶、N -乙醯基- /3 -胺基葡萄苷酶、蛋白酶、唾液酵素、ubiquitin蛋白等可舉出。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲特殊（二次）顆粒中所存在的物質，C D 1 1 b 、CD1 5 抗原、CD66、CD67、細胞色素 b558 、f ML P受體、fibronektin受體、G蛋白質α亞單位、 laminin受體、ΝΒ — 1抗原、19 — kD蛋白質、 155 — kD 蛋白質、Rapl 、Rap2、SCAMP 、試钍寧磷酸錠受體、T N F受體、尿刊酸酶型血纖維蛋白溶酶原活性劑受體、V A Μ P - 2、氫化nectin受體、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（Η) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 冷2 —微球蛋白、膠原酶、明膠酶、h C A Ρ — 1 8、組胺酸酶、肝素酶、乳菲林、溶菌酶、N G A L、尿刊酸酶型血纖維蛋白溶酶原活性劑受體唾液酶、S G P 2 8、維他命B : 2結合蛋白質等可舉出。作爲存在於明膠酶（三次）顆粒中的物質， C D 1 1 b、細胞色素b 5 5 8、二醯基甘油脫醯基酵素、 f M L P受體、S C A Μ P、尿刊酸酶型血纖維蛋白溶酶原活性劑受體、V A Μ Ρ — 2、V型H + A Τ Ρ酶、乙醯基轉化酶、Θ 2 -微球蛋白、明膠酶、溶菌酶等可舉出。作爲存在於分泌小胞中的物質，鹼性磷酸酶、互補體受體、細胞色素b558、CD1 lb、CD14、 CD16、fMLP受體、SCAMP、尿刊酸酶型血纖 .維蛋白溶酶原活性劑受體、V A Μ P - 2、V型H + A T P 酶、〇〇1〇、〇〇13、〇〇45、〇1(1受體、 D A F (互補體崩壞促進因子）、血漿蛋白（含四nectin ) 等可舉出。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明者，以定量白血球數爲目的所測定的物質，係將全血以表面活性劑處理後，可以酵素免疫法測定的充分量溶出物質，且，考慮到感染症以外的病症則其存在量不會產生大變化爲佳。檢討如此觀點的結果，存在於azure ( 一次）顆粒或特殊（二次）顆粒中的物質較佳，其中特別考慮以骨髓過氧化酶（以下皆以「Μ P 0」簡稱）以及乳飛林（以下皆以「L T F」簡稱）爲佳。本發明者，對於白血球數爲1 0，0 0 0個/// 1未本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -17 - 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（15) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 滿的健康人（健康人群）之全血與，白血球數爲 1〇，0 0 0 e個/ // 1以上的非健康人的全血（非健康人群），MP〇、ELT、LTF的個別濃度與白血球數之相關係數作調查的結果，對於健康人群，Μ P ◦與白血球數之相關係數即極爲高的R = 0 . 9 3 3 6 ，可判斷比 L 丁 F或E L Τ與白血球的相關係數高。因此，對於欲正確地定量健康人群的白血球數，發現Μ Ρ ◦的測定最爲正確。進一步地，對於非健康人群其Μ Ρ ◦、L T F以及 E L Τ之個別濃度，與白血球數相關所示噁的回歸線之斜率作比較。其結果，表示Μ Ρ ◦與白血球數之相關的回歸線之斜率爲0 . 0 0 1 9，與對健康人群之回歸線的斜率 (0 . 0 0 2 1 )相比無太大的變化。另一方面，對於表示非健康人群其L T F與白血球數相關之回歸線的斜率爲〇.0 0 0 7，對於此判斷出，對於健康人的回歸線之斜率爲0 . 00 1 6 ，爲非健康人群的斜率之2 · 3倍程度經濟部智慧財產局員工消費合作社印製。又，對於非健康人群表示E L Τ與白血球數之相關的回歸線斜率爲〇 . 〇〇 3 1 ，對於此健康人群的回歸線斜率爲0 . 0 0 1 7，此爲非健康人群之斜率約上昇1 . 8倍程度。且，急性胰臟炎患者的狀況，E L Τ的測定値與 Μ Ρ ◦或L T F相比較顯示極端高的値，明顯脫離表不 E L Τ濃度與白血球數相關的回歸線。造成此結果的原因不明，但因某種原因白血球數增爲1 0 ，〇〇〇個/ β 1 以上的疾病時，有者白血球內部所存在的Μ Ρ ◦量無太大本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -18 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（16) 變化，且內生性L T F的量會減少，而內生性E L T的量會增大之傾向。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 欲獲得正確的白血球數，回歸線的斜率不管於白血球數爲未滿1 0，0 0 0個/// 1的健康人血液或，白血球數爲1 0 ，0 0 0個/// 1以上的非健康人血液，其無變化爲最重藥的事。因此，考慮上述測定値的結果，欲正確定量白血球數，而測定全血試料中骨髓過氧化酶係最爲適當的。如上述詳細研究結果，本發明者，發現以骨髓過氧化酶的量作爲白血球數的指標爲有用的，便完成本發明。本發明提供一種白血球數的定量法，其包含將全血試料與表面活性劑混合，溶解出白血球，而測定所釋出的內生性骨髓過氧化酶的濃度。具體而言，包含 (a )取得全血試料與表面活性劑混合的混合物、 (b )上述混合物中，溶解上述全血試料中的白血球，放置充分時間使其釋出內生性的骨髓過氧化酶、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (c )測定上述混合物中所釋出的骨髓過氧化酶濃度，因此 (d)由所釋出的上述骨髓過氧化酶濃度可定量上述全血試料中之白血球數。的全血試料的白血球數定量方法。關於本發明，取得全血試料與表面活性劑混合的混合物，放置所得的混合物，使得全血試料中的白血球、紅血球、血小板等的溶出。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公羞） 1251078 A7 B7 五、發明説明（17) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 關於本發明的「表面活性劑」，意味者一分子中親7jc 性部分與親油性部分共存之化合物，若無特別限定則表示水溶性表面活性劑。一般性的表面活性劑，可大致分爲離子性表面活性劑與非離子性表面活性劑。對於本發明與全血試料混合後欲使白血球溶解所使用的表面活性劑，可使用任一種離子性表面活性劑與非離子性表面活性劑。離子性表面活性劑，進一步地可大致分爲陰離子性表面活性劑、陽離子表面活性劑與兩性表面活性劑。作爲陰離子性表面活性劑，有十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基- N -肌胺酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、脫氧牛磺膽酸鈉等可舉出。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲陽離子性表面活性劑，溴化十六烷基三甲基銨、氯化十六烷基三甲基銨、氯化聯二苯乙酮二曱基銨、溴化聯二苯乙酮二甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、氯化十八烷基三甲基銨、溴化十八烷基三甲基銨、溴化十四烷基銨、氯化十二烷基吡啶鑰、氯化十六烷基吡啶鑰、溴化十六烷基吡啶鑰、1 一月桂基氯化吡啶鏺、溴化十四烷基三甲基銨等可舉出。作爲兩性表面活性劑，有3 -〔（ 3 -膽胺丙基）二甲基銨〕一 1 一丙磺酸、3 - 〔（3 -膽胺丙基）二甲基銨〕- 2 -羥基- 1 -丙磺酸、棕櫚醯基溶血卵磷脂、十二烷基一 N -甜菜鹼、十二烷基一 /3 -丙胺酸等可舉出。作爲非離子性表面活性劑，辛基葡糖苷、庚基硫代葡本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -20 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（18) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 糖苷、癸醯基- N -甲基葡聚胺、聚氧伸乙基十二烷基醚、聚氧伸乙基庚甲基己基醚、聚氧伸乙基異辛基苯基醚、聚氧伸乙基壬基本基醚、聚氧伸乙基脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧伸乙基山梨糖醇酯等可舉出。本發明所使用的表面活性劑，由盡可能不使存在白血球內部的Μ P〇發生變性而溶出之觀點，與其使用表面活性劑作用較強的離子性表面活性劑，不如使用非離子性表面活性劑較爲佳。顯示表面活性劑性質的參數之一爲親水性•親脂性平衡（Hydrophile-Lipophile Balance ; H L Β )。所謂 H L Β値，係表示表面活性劑的分子中親水基與親油基的平衡指標，此槪念爲G r i f f i η所揭示的。H L Β値 .爲比較表面活性劑的乳化力下實驗所定出的，可求得簡單的計算式（例如，參照吉田時行、進藤信一、大垣忠義、山中樹好編「新版表面活性劑手冊」日本國、工學圖書股份有限公司（1 9 8 7 ))。可使用於本發明的表面活性劑之H L B値如以下所示。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ 297讀）.21 - 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（19) 表面活性劑經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Nissan Nonion NS-204.5 Triton X-45 Triton X-207 Nissan Nonion NS-206 Nissan Non ion HS-206 Nissan Dispanol TOC Triton X-l 14 Brij 97 Nissan Nonion NS-208.5 Brij 56 Igepal CA630 Nonidet P-40 Nissan Nonion HS-210 Triton X -1 0 0 Nissan Nonion NS-212 Igepal CA720 Nissan Non ion HS-215 Nissan Nonion NS-215 10.4 10.7 10.9Π.2 12 12 0 4 12.4 12.6 12.9 13.0 13.0 13.3 13.514.1 14.6 15.0 使用於本發明的非離子性表面活性劑，H L β fg胃 1 2至1 4者爲佳。H L B値爲1 2至1 4的非離子丨生^ 面活性劑，其存在於全血試料中白血球內在的Μ P ◦之溶 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -22 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（20) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 出效率咼。另一方面，非離子性表面活性劑的H L B比 1 4高時’存在於全血試料中白血球內在的ΜΡ〇之溶出效率則顯者下降。又’ H L Β値比1 2小時，表面活性劑本身則難溶於水中，不僅溶出效率低下且不易處理。且，本說明書所記載的H L Β値於無特定限定下，使用Michael and Irene Ash ，編"HANDBOOK OF INDOUSTRIAL SURFACTANTS 桌 2 版、英極、Gower Publishing Limited ( 1997)所記載的數値。欲將作爲測定對象的白血球內生性Μ P 0能高效率地溶出，非離子性表面活性劑中，以與飽和或不飽和的碳氫化合物結合之聚伸乙基氧化物的非離子性表面活性劑爲佳。進一步地，具有聚氧伸乙基烷基苯基醚骨架的非離子性表面活性劑使用（例如，Triton ΤΜΧ - 114 (日本國、 Nakalitesk 股份有限公司製造）、（Triton τ Μ X — 1 〇〇 ( 美國、S I G M A ) 、Igepal TM CA630 (美國' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 S I G M A )或 Nissan Nonion NS — 2 0 8.5 (日本國、日本油脂公司製））；與不飽和脂肪族碳氫化合物結合之聚伸乙基氧化物（例如，Brij τ M 9 7 (美國、 S I G Μ A ))或具有聚氧伸乙基烷基醚骨架的非離子性表面活性劑（例如，Nissan Dispanol T0C (日本國、日本油脂公司製造）或Brij TM 56(美國、SIGMA))較佳。又，由全血試料中的白血球溶出內在性的Μ P ◦之效果高’可高感度地測定Μ Ρ ◦的點來看，以使用 TritonTMX— 114 更佳。 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（21 ) 且，對於記載商品名的表面活性劑，其c T F A ( The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Assoc .)戶斤言己以及 / 或

下以如記所納歸表 C A P U (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（22) 商品名 CTFA表記 TUPAC表記 Triton™ X-114 辛苯聚醇-8 α - [4-(l，l，3,3-四甲基丁基)苯基]-ω-經基聚（氧-1,2-乙烷二基） Triton™ X-100 辛苯聚醇-9 α - [4-(1，1，3,3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚（氧-1，2-乙烷二基） Igepal™ CA630 辛苯聚醇-9 α - [4-(1，1，3,3-四甲基丁基)苯基]-ω-羥基聚(氧-1,2-乙烷二基） Nissan Nonion 辛苯聚醇-8.5 ^-(4-壬基苯基)-〇-經基聚（氧-1，2-乙烷二 NS-208.5 基） Nissan Dispanol聚氧伸乙基院基醚 TOC — Brij™ 97 聚氧伸乙基油醇 (01eth-10) — Brij™ 56 聚氧伸乙基臟油醇 (01eth-10) — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --- n I- n τ _ _ . 、言經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 - 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（23) 關於本發明欲溶解全血試料中的白血球將內生性的 Μ P 0溶出，可使用陽離子性表面活性劑。本發明們由實驗結果發現，溴化十六烷基三甲基銨 '氯化十六烷基三甲基銨、氯化聯二苯乙酮二甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、氯化十八烷基三甲基銨、溴化十四烷基銨、氯化十二烷基吡啶鏺、氯化十六烷基吡啶鑰、溴化十六烷基吡啶鏺、1 -月桂基氯化吡啶鏺以及溴化十四院基三甲基銨可適用於ΜΡ◦由白血球中溶出。對於本發明的方法，與全血試料混合時所用的表面活性劑之量，作爲混合物中的濃度以〇 . 2 % ( w / ν )以上爲佳。若表面活性劑的濃度未滿〇 . 2 % ( w / ν )時，存在於白血球內在的ΜΡ ◦未能充分溶出。又，若表面活性劑的濃度高時，隨著表面活性劑的使用量提高其成本亦隨之提高，且，混合物等處理性亦降低。考慮到這些條件，所使用的表面活性劑之量，作爲混合物的濃度爲〇.2至1 0 % ( w / ν )的範圍內爲佳，較佳爲〇 . 2 至 0 · 5 % ( w/ y )，更佳爲〇 . 2 至 2 . 0 % ( w / ν )。關於本發明，全血試料與表面活性劑混合的方法雖無特別限制，但全血試料與表面活性劑混合所得混合物必需於放置下溶解全血試料中的白血球而將內生性的骨髓過氧化酶釋出。例如製作表面活性劑的水溶液，此表面活性劑的水溶液可添加於全血試料中。此時，添加表面活性劑後可進行攪拌操作，或不攪拌亦可。又，重新於混合槽中塗抹微粒子狀的表面活性劑，此時可舉出添加全血試本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -26 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1251078 A7 B7 五、發明説明（24) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 料方法。對於此方法，於表面活性劑與全血試料進行混合的過程，可釋出內生性骨髓過氧化酶。又，對於此方法，可進行或不進行表面活性劑與全血試料所成混合物之攪拌操作。全血試料與表面活性劑混合所得之混合物放置時間，僅充分時間能溶解全血試料中的白血球釋出內生性骨髓過氧化酶即無須加以限定。然而，對於本發明，放置混合物的時間以1小時以內爲佳，通常放置時間爲1分鐘至1小時範圍內。對感染或者作初期診斷時，服藥等適當處理必須盡可能早些進行，因此要求白血球數（以及C R P )的定量之迅速性。故欲縮短定量所需的時間與放置混合物的時間爲佳。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製又，對於本發明，放置全血試料與表面活性劑所成的混合物溫度雖無特別限制。然而，白血球的溶解以及內生性骨髓過氧化酶的釋出於含有水的分散系（乳化狀）下進行，故不期待於凍結的溫度下冷卻。又，不期待使Μ P〇的抗原性變形的高溫而阻礙免疫反應。因此，對於本發明，放置混合物於0 °C至室溫（約2 5 °C )的範圍，溶解白血球釋出內生性骨髓過氧化酶爲佳。且，考慮到感染症等的診斷一般於診所中進行，故放置於室溫下更優。對於本發明，以表面活性劑處理後使用全血試料，測定由白血球釋出的Μ P ◦濃度，同時可測定C反應性蛋白濃度。對於健康者的C R Ρ値（基準範圍），有如以下的各報告，6 0 . 3 /// d 1以下（山岸保子們：臨床病理本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） _ 27 _ 1251078 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（25) 32； 1389-1394^1984) ； 3 0 0 /z/dl以下（西田陽；北里醫學: 393一 401 ，1986);以及 4 .〇至 235 . 3///dl (谷直人們：北里醫學24 : 97 - 1 03，1 994) 。又’有關臨床檢查値的手冊，例如「對於臨床有用的檢查値之讀法•思考方法」（河野均也、西崎統監修、綜合醫學社、236頁、1997年）中記載，基準値爲〇 · 3mg / d 1 ( = 3//g/d 1 )以下（依定量法相異有若干不同）。依炎症或癌等的組織障礙，被活性化的單球/小吞噬細胞分泌間白素6、間白素1或T N F α等，其結果，誘導對肝細胞的C R Ρ爲主之急性期反應蛋白 (acutephase protein)之產生，血中濃度會上昇。血淸C R P濃度的上昇雖爲非特異性反應，由對組織損傷的敏感有所反應的事看來，係爲最被廣用的炎症標識體。又，因亦隨著癌進展的上昇，可作爲廣義腫瘤標識體使用。又，對於感染症的狀況，細菌感染症的狀況比病毒感染症的狀況檢測出其C R P濃度更高，可知因與白血球數同時測定C R P故其可達到更高精度的診斷。例如，對於C R P値與病態的關係已知有如下所示： CRP( β g/ml)_病態_ 0至20 妊娠、抽煙、急性盲腸炎等 0至100 惡性腫瘤、病毒感染症、全身性紅斑等 20至200 細菌感染症、慢性關節痛風等 20至200以上壞血症、肺炎、血管炎 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251078 Α7 Β7 五、發明説明（26) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於本發明，測定由白血球釋出的Μ P〇濃度之方法並無特別限定，可以種種的方法測定。具體而言，可使用測定Μ Ρ ◦的酵素活性，液體色譜法、免疫學測定法等方法，求得ΜΡ ◦濃度。然而，由需具有高定量感度或特異性，且可測定C R Ρ濃度的事看來，使用免疫學的方法爲佳。對於本發明的「免疫學方法」，包含以酵素活性或放射活性作爲標識物測定抗原或抗體量的方法；檢測出因抗原抗體反應所形成的免疫複合體而測定抗原或抗體量的方法；乳膠粒子或金膠體等的載體與使抗原或抗體結合者進行凝集反應，得知抗原抗體反應的程度，而測定抗原或抗體量之方法。使用於本發明方法的免疫學方法雖無特別限定，但由安全面著眼，不期待使用放射活性作爲標識的方法。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲具體方法，斯業者使用於蛋白質等測定之免疫色譜法、使用9 6洞培養皿的酵素免疫測定法、或國際申請公開W〇9 1/0449 1號公報、W〇92/ 14136號公報、W〇92/14147號公報、 W092/16826號公報、以及W〇94/ 〇3 7 7 4號公報等所記載的測定法（美國、BloStar公司的光學免疫測定法）等可舉出。對使用免疫色譜法的Μ P ◦濃度測定法作具體說明。纖維、硝化纖維或表面以化學修飾之纖維（如具有胺基、, &氏張尺度適用中國國家標準（〇叫八4規格（21(^ 297公釐)「29 - ' 1251078 A7 ___B7 五、發明説明（負7 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 二乙基胺基乙基的陽離子性之官能基或如羧基陰離子性的官能基之經化學修飾纖維）所成膜等基材中，以吸著抗人 Μ P 0抗體或化學方法固定化。將抗體固定化的基材浸漬於含有牛雪淸白蛋白等緩衝溶液中進行遮蔽反應。其後，因使其乾燥製成Μ Ρ〇測定用的免疫色譜法用t i ρ。製作上述免疫色譜用t i p時，與抗人MP ◦抗體同時與抗人C R P抗體固定化於基材時（此時，二個抗體於一個基材上改變位置而固定化，或並列的二個基材上固定化各個抗體），可製得與Μ P ◦同時測定C R P的免疫色譜法用t i ρ。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ P 0 (以及C R P )的檢測，可使用金膠體或乳膠粒子等作爲標識的抗人ΜΡΟ抗體（以及抗人CRP抗體）進行檢測。具體而言，經標識的抗體與溶血後的全血試料溶液混合滴入上述的免疫色譜法用tip之基材中，於此添加適當的展開用緩衝液，使得所滴下的液體經過免疫色譜法用 Up之基材而展開並移動。全血試料溶液可因應需要程度稀釋使用。展開移動之間標識後的抗體與MPO(以及CRP)的抗原抗體複合體被固相化抗體捕捉而發色。此發色程度的評估，可使用光學測定器進行MPO(以及CRP)的定量測定。再說明使用9 6洞培養皿的酵素免疫測定法的Μ P〇濃度與C R Ρ濃度的測定方法。首先於市販的9 6洞培養皿的基材上作爲一次抗體將抗人Μ Ρ 0抗體以及抗人 C R Ρ抗體固定化，此培養皿中添加經表面活性劑處理的全血試料經稀釋至2 0 0 0倍或4 0 0 0倍者，於基材上 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（荬 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 固定化的抗體與含經稀釋的試料之Μ P ◦或與c R P的抗體抗原反應。再以西洋芥末過氧化酶（H R Ρ )或鹼性磷酸酶等的酵素標識之抗人Μ Ρ ◦抗體溶液以及抗人C r ρ 抗體（2次抗體）溶液，添加於培養皿中以2次抗體進行抗原抗體反應。其後，添加作爲HRP的基質之含四甲基聯苯胺（Τ Μ B )與Η 2 ◦ 2的溶液，或作爲鹼性磷酸酶的基質之含Ρ -硝基酚磷酸的溶液使其發色，一定時間後添加1 Ν的硫酸或氫氧化鈉溶液使反應停止。藉由測定經發色的溶液之吸光度，可測定含於試料的Μ Ρ〇以及C R Ρ 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製又，關於藉由光學免疫測定的Μ Ρ〇濃度與c R Ρ濃度的測定方法，可使用 Covalciuc KA . Webb KH and Carlson CA: Journal of Clinical Microbiology 12:3971-3 974( 1 999 )所記載的方法進行。具體而言，矽基板的表面上，形成具有與矽基板相異折射率之聚矽氧烷等聚合物或金鋼石碳等薄膜，於此固定化作爲1次抗體的抗人Μ P〇抗體以及抗人C R Ρ抗體。再以表面活性劑處理過的全血試料稀釋至1 0 0倍或2 0 0倍者，與以H R Ρ標識的抗人骨髓過氧化酶抗體或抗人C R Ρ抗體溶液混合添加於上述基板上，基板上進行含於固定化的抗體與稀釋後的試料之ΜΡ 0或CRP之抗原抗體反應。其後，添加作爲 ΤΜ Β 沈潑基質之”TMB fast”（美國、Kirkegaad & Perry Laboratories Inc .公司製），經一定時間後，基板表面上形成沈澱層。藉由引起基板表面上所形成的沈澱層厚度之干 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（芩 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 擾色變化，可定性檢測出含於試料中Μ P〇或C R P。又 ’薄膜上所形成的沈澱層之厚度使用橢圓檢測器測定時，可定量出含於試料的Μ Ρ〇以及C R Ρ。關於本發明的方法，由如上述所測定的Μ Ρ〇濃度定量全血試料中的白血球數。欲定量白血球數的方法無特別限制，可採用一般斯業者者所使用的方法。具體爲進行本發明說明書中的實施例1 0 ，由表不白血球數與Μ Ρ〇濃度的相關之回歸線求出。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製更進一步地，對於本發明，以本發明的方法求得之全血試料中的白血球數爲嗜中性白血球爲佳。所謂「嗜中性白血球」，係於白血球中存在比例最大之細胞，已知會因炎症或感染而增加其數。因此，於診斷時欲判斷是否爲細菌感染症或炎症之受傷度，以測定嗜中性白血球數爲佳。如本發明的說明書之實施例7、9或1 〇所記載，藉由全血試料與表面活性劑混合，使白血球中的釋出Μ Ρ ◦之濃度，不僅爲白血球數，亦顯示與嗜中性白血球有者高柑關性。因此，以本發明的方法，與全血試料中的白血球數同樣地定量出嗜中性白血球數。實施本發明的最佳型態再詳細說明實施本發明的型態，但不僅限制於這些實施例以及比較例。實施例1 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（本對白血球的溶解所需時間之討論 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 健康人血液1 〇ml以含有1 OmgEDTA— 2K (曰本國，（有）同仁化學硏究所製）的試管採取，充分攪拌後由此分出1 m 1 。所分出的全血中加入1 0 0 // 1 的 1 1 % 的 Tdton TM X— 1〇〇(美國，SIGMA) 的水溶液充分混合，室溫下放置1分鐘、5分鐘、3 0分鐘或6 0分鐘溶解白血球。所定的時間後，使用附於BIOXYTEC T M MPO Enzyme Immunoassay 組套（美國、〇XIS International, Inc .公司製）的含有Sample diluting buffer( 〇 _ 1°/。牛血淸白蛋白以及〇.2 %迭氮化鈉之2 0 m M磷酸緩衝液p Η 7 . 4 )，稀釋溶解白血球之全血試料爲2 0 0 0倍，作爲Μ P ◦測定用的樣品。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲樣品以及測量線用的標準Μ P ◦溶液（市販 Μ Ρ ◦溶解於上述的緩衝液者）所含有的Μ Ρ ◦濃度以使用 BIOXYTEC tmMP〇 Enzyme Immunoassay 組套（美國、〇xis International，Inc ·公司製），依照附加的操作方法測定。又，對於樣品中的Μ P ◦量，樣品中最終濃度能成5 ng/ml與l〇ng/ml而添加ΜΡΟ (美國， Elastin Products Co .，INC .公司製），測定各個Μ P〇濃度。由所得的測定値求得樣品之測量線，以與標準Μ ρ〇的測量線關係修正，求得全血中的Μ Ρ ◦濃度。且，測定數爲3，求得平均±標準差。結果如表1所示。 33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） 1251078 A7 _________ B7 五、發明説明（¥ 表1

Tnt〇nTM X-100的處埋時間全血中的MP0濃度 (// g / ) 1分鐘 9.88± 0.50 5分鐘 10.17± 0.63 3 0分鐘 9.94± 0.72 60分鐘 10·01± 0-22 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以Triton TM X—l 〇〇處理確定6 0分鐘內有充分的Μ P ◦溶出。實施例2 表面活性劑濃度與Μ Ρ 〇溶出量採健康人血液1 0 m 1 ，此血液每1 m 1與1 m g的 E D T A - 2 K (日本國，（有）同仁化學硏究所製）混合，採血後1小時內提供於如下述各種測定。骨髓過氧化酶濃度如下述方法求得。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以2 m 1的微量吸管取出5 〇〇从1的血液，於此等量添加濃度爲 0 . 1、0 · 2、0 _ 4、0 . 6、1、2 、4、1 0或2 0 % (. w / ν )的表面活性劑水溶液得到混合i谷液’以均質機擾拌2秒。再放置於冰上6 0分鐘溶解白血球。表面活性劑使用T r i t ο η τ M X - 1 1 4 (日本國、Nakaritesk股份有限公司製）、Triton τ M X -1〇〇、Igepal TM CA630 (任一種皆爲美國、 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1251078 A7 _______B7 五、發明説明（莽 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) s I G Μ A )的三種。白血球溶解後，取出1 〇〇 # 1的混合溶液，添加溶解1 % B S A (商品名：，，Sigma fracti〇n V”）（美國、S I G M A )的 P B S 溶液 9 〇〇 # 1 。將此以均質機攪拌後，於此取出1 〇 // 1 ，以i % B s Α / P B S溶液稀釋2 Ο Ο 0倍，提供於E L I s Α測定。 E L I S A的槪要如以下所示。溶解於p b s的5 β g / m 1兔子抗人骨髓過氧化酶抗體（美國， Calbiochem-Novabiochem Corporation 公司製）（以下通稱「抗Μ P〇抗體」）以1 〇〇// 1分別注入Nunc ImmunoPlate (丹麥、Nalge Nunc International 公司製）的各 weu 中，封住後，4 °C下進行1 8小時的反應使1次抗體固定化。 Well 以洗淨液（〇 . 〇 5 % Tween τ M 2 0 / P B S )洗淨後，使用2 0 0 // 1的遮蔽溶液（ 1 % B S A / 1 % P B S )於室溫下進行1小時的遮蔽過程，再使用洗淨液洗淨2次。繼續以表面活性劑處理後稀釋之血液樣品分別注入1 0 0 // 1 ，於室溫下反應2小時經濟部智慧財產局員工消費合作社印製。使用洗淨液洗淨3次後，添加以5 // g / m 1濃度的西洋芥末過氧化酶（以下稱Η R P )標識的抗Μ P ◦抗體 1 0 0 // 1添加於各well中，於室溫下反應1小時。作爲 H R P標識抗Μ P ◦抗體，使用以HRP Grade IV(美國，Sigma公司製）標識的抗人MP〇抗體（美國，0&11^0(：1^111-Novabiochem Corporation 公司製）。標識的方法依照 Analytical Biochemistry . 132，68-73(1983)所記載的方法進行。Well以洗淨液洗淨5次後，調製後馬上添加1 〇〇 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 _B7 五、發明説明（妇 // 1 的 Τ Μ B 溶液（美國，Kirkegaad & Perry Laboratou 公司製）使其發色。2分鐘後添加1 〇〇 // 1的1 N硫酸溶液（日本國，Nakaraistesk股份有限公司製）使反應停止， 4 5 0 n m 吸光度以 plate reader (美國，Bio-Red

Laboratories公司製）。且，測定數爲3，求得平均±標準差。結果如表2所示。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表2 表面活性全血中的MP0之溶出度（Abs.450nm) 劑的濃度 (%(W/V)) Triton" M X-100 TritonT M X-114 IgepalT M CA630 0.00 0·082土 0.002 0.101土 0.014 0.082土 0.006 0.05 0.104土 0.005 0.120土 0.026 0.103土 0.005 0.10 0.161 土 0.009 0.131土 0.016 0.156土 0.009 0.20 0.202土 0.006 0.207土 0.004 0.205土 0.007 0.30 0.228土 0.009 0.198土 0.003 0.211土 0.008 0.50 0.262土 0.005 0.259土 0.007 0.249土 0.002 1.00 0.245土 0.011 0.240土 0.006 0.220土 0.008 2.00 0.216土 0.004 0.245土 0.015 0.208土 0.003 5.00 0.228土 0.007 0.239土 0.002 0.199土 0.018 10.00 0.227土 0.007 0.243土 0.005 0.227土 0.006 Triton τ Μ X - 1〇〇、Triton τ M X - 114、 Igepal τ Μ C A 6 3〇任一種其濃度於〇 .2至 10.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36- 1251078 A7 ___ B7 五、發明説明（扣 % ( w / v )的範圍內，判斷內生性的μ p ◦由全血試料中充分溶出。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例3 各種表面活性劑的Μ Ρ〇溶出效果使用2 8 G的翼付靜脈注射針（日本國，teru公司製）’ ί未健康人血液1 〇m 1 ，此血液每1m 1與lmg 的E D T A — 2 K (日本國，（有）同仁化學硏究所製）混合，採血後1小時內提供於如下述各種測定。骨髓過氧化酶濃度如下述所示方法求得。以2 m 1的微量吸管取出5 0 〇 // 1的血液，於此等量添加濃度爲1 % ( w / v )的表面活性劑水溶液得到混合溶液，以均質機攪拌2秒。再放置於冰上6 0分鐘溶解白血球。白血球溶解後取出1 〇〇 // 1的混合溶液，添加溶解 1 % B S A (商品名：”Sigma fraction V”）（美國、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 S I G Μ A )的P B S溶液9 0 0 // 1 。將此以均質機攪拌後，於此取出1 0 // 1 ，以1 % B S A / P B S溶液稀釋2 0 0 0倍，提供於E L I S A測定。 E L I S A的槪要如以下所示。溶解於p b S的5 // g / 111 1抗Μ P〇抗體以1 〇〇 // 1分別注入Nunc

ImmunoPlate (丹麥、Nalge Nunc International 公司製）的各 well中，封住後，4 °C下進行1 8小時的反應使1次抗體固定化。Well 以洗淨液（〇 . 〇 5 °/〇 Tween 2 0 / P B S )洗淨後，使用2 0 0 // 1的遮蔽溶液（1 % B S A / 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 - 1251078 A7 _____ B7 __ 五、發明説明（衿 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) P B S )於室溫下進行1小時的遮蔽過程，再使用洗淨液洗淨2次。繼續以表面活性劑處理後稀釋之血液樣品分別注入1 0 0 // 1 ，於室溫下反應2小時。使用洗淨液洗淨 3次後，添加以5 // g / m 1濃度的H R P標識抗Μ P〇抗體（與實施例2同樣地做成H R Ρ標識抗Μ Ρ〇抗體） 1〇0 // 1添加於各w e 1 1中，於室溫下反應1小時。以洗淨液淸洗5次後，調製後馬上添加1 〇 0 // 1的 TMB 溶液（美國，Kirkegaad & Perry Laboratou 公司製）使其發色。2分鐘後添加1 〇〇 // 1的1 N硫酸溶液（日本國，Nakaraistesk股份有限公司製）使反應停止，4 5〇 n m 吸光度以 plate reader (美國，Bio-Red Laboratories 公司製）測定。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製又，對於樣品中Μ P〇量，欲使樣品的最終濃度爲5 ng/ml 與 10ng/ml 添加 ΜΡ〇（美國，Elastin Products Co .，INC .公司製），分別測定這些Μ P〇濃度。由所得之測定値求得樣品的測定線，與標準Μ Ρ〇的測定線關係進行修正，求得全血中的Μ Ρ〇濃度。且，測定數爲3，求得平均±標準差。試驗的表面活性劑如以下m*°Hexadecyltrimethyl-ammonium Bromide ( Η Τ A Β )(日本國，和光純藥工業製）、Triton TM X — 1 1 4 (日本國、Nakaraitesk 股份有限公司製）、Triton τ M X — 1 0 〇、Triton T M D F -1 2、Brij T M 5 6、Bnj T M 9 7、Igepal T M C A 6 3 0 (任一種皆爲美國，S I G M A ) 、Nissan -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 7 Β 五、發明説明（筘

Nonion NS-208· 5、Nissan Dispanol TOC (任一種皆爲日本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 國，日本油脂製）。這些表面活性劑溶解於純水（日本國，共榮製藥公司製）中調製成1 〇%或 2 % ( w / v )的水溶液’使用於試驗的1 5小時內使用其調製成1 % ( w / v )溶液。又’作爲對照組’使用純水（日本國，共榮製藥公司製）° 結果如表3所示。表3 表面活性劑全血中的MPO之溶出度 (// g / ) T ri ton7 ，M X-114 7.44土 1.81 Nissan Dispanol TOC 7‘00土 1.64 Triton7 M X-100 6.43土 1.25 Igepal1 M CA630 6.23土 1.42 Nissan Nonion NS-208.5 6.20土 1.51 Bnj 97 6.08土 1.44 Bnj 5 6 6.02土 1.38 HTAB 5.08土 1-41 純水 2.02± 0.87 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製任一種6·08± 1 ·44表面活性劑皆顯示內生性Μ P〇由本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -39 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（全血試料中有效率地溶出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例4 各種表面活性劑的Μ P ◦溶出效果使用如實施例3相同的方法，求得對以下表面活性劑的全血試料之Μ Ρ ◦溶出度。試驗上所使用的表面活性劑， Hexadecylpyridinium Chloride Monohydrate(HPC) 、 Hexadecylpyridinium Bromide Monohydrate(HPB) 、 H e x a d e c y 11 r i m e t h y 1 a m m ο n i u m C h 1 o r i d e (Η T A C) 、 n-

Dodecyltrimethylammonium Bromide(DTAB) 、

Hexadecyltrimethylammonium Bromide(HTAB) 、 1-

Laury lpyridinium Chloride(LPC) 、 Tetradecy ltri- methylammonium Bromide(TTAB)(以上爲日本國’和光純藥工業製）。這些表面活性劑溶解於純水（日本國’共榮製藥公司製）調製成1 0 %或2 % ( w / V )的水溶液，使用於試驗的1 5小時內使用其調製成1 % ( w / v )溶液。又，作爲對照組’使用純水（日本國，共条製樂公司製 )。結果如表4所示。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇x297公釐） 1251078 A7 五、發明説明（非 __ 表面活性劑全血中的MPO之溶出度 HPC \ μ, τηλ, j 12·〇5± 1·18 HPB 10.96土 0·46 HTAC 10.93土 0.82 DTAC 9·95± 0·71 HTAB 9.58± 0.53 LPC 9·58± 1.39 TTAB 9·33± 1·30 水 1·65± 〇·81 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製任一種陽離子表面活性劑皆顯示內生性Μ P 0由全血試料中充分地溶出。實施例5 各種表面活性劑的Μ Ρ ◦溶出效果與實施例3使用相同的方法，求得對以下表面活性齊[J 的全血試料之Μ P〇溶出度。使用於試驗的表面活性劑， Hexadecylpyridinium Chloride Monohydrate(HPC) 、

Hexadecylpyridinium Bromide Monohydrate(HPB) 、

Hexadecyltrimethylammonium Chloride(HTAC) 、 n· D o d e c y 11 r i m e t h y 1 a m m ο n i u m B r o m i d e (D T A B) 、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -41 - 1251078 A7 B7 五、發明説明（衿 H e X a d e c y 11 r i m e t h y 1 a m m ο n i u m Bromide(HTAB)

Laurylpyridinium Chloride(LPC) 、 Tetradecyltri- m e t h y 1 a m m ο n i u m B r o m i d e (T T A B)(以上爲日本國，和光純藥工業製) 、 Didecyldimethylammonium Chloride(DDAC)、

Octadecyltrimethylammonium Chloride(OTAC)(以上，曰本國，日本油脂製），這些表面活性劑溶解於純水（日本國，共榮製藥公司製）調製成1 0 %或2 % ( w/ v )的水溶液，使用於試驗的1 5小時內使用其調製成1 % ( w / v ) 溶液。又，作爲對照組，使用純水（日本國，共榮製藥公司製）。結果如表5所示。 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 _____B7 五、發明説明（今〇表5 表面活性劑全血中的ΜΡΟ之溶出度 (β g/mi ) HPC 10.60土 1.44 DTAC 9·28 土 0.60 HPB 9·07土 1.14 TTAB 8·08土 0.11 DTAB 8.05 + 0.64 DDAC 7.88土 0.46 LPC 7.57土 0.60 OTAC 7.47土 0.38 HTAC 7.35土 0.28 HTAB 7.15± 2.69 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 純水 1.58± 0.97 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製任一種陽離子表面活性劑皆顯示內生性Μ P 0由全血試料中充分地溶出。實施例6 Μ Ρ ◦溶出度與H L Β値的關係與實施例3相同，進行採血、表面活性劑的處理以及 E L· I S Α測定，對各種表面活性劑的Μ Ρ ◦溶出效果作檢討。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） -43- 1251078 A7 ____B7 __ 五、發明説明（今1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 作爲非離子性表面活性劑，使用NonidetTM — P 4〇、 Triton™ χ 一 ii4 (任一皆爲日本國，Nakalitask 股份有限公司）、TntonTM X - 1 〇 0 . Triton™ X - 2 0 7 、Triton™ X - 3 0 5、Brij™ 3 5、Brij™ 56、 Brij™ 5 8 . Brij™ 9 7 . Brij™ 9 8 . Igepal™ C A 6 3 0 , Tween™ 6 5 . Tween™ 8 5 (任一留美國，SIGMA®)、Tween1M 2 〇（美國，Bio-Rad Laboratories 公司製）、TritonTM X - 4 5 (瑞士國、Fluka公司製）各表面活性劑溶解於純水（日本國，共榮製藥公司製）調製成1 0 %或2 % ( w / v )的水溶液，使用於試驗的1 5 小時內使用其調製成1 % ( w / v )溶液。又，作爲對照組，使用純水（日本國，共榮製藥公司製）。如圖1所示，全血中的Μ P〇的溶出度依表面活性劑的HLB値而不同，顯示HL Β値爲1 2至1 4的範圍內之表面活性劑爲最適合之Μ Ρ ◦溶出條件。實施例7以及比較例1與2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製全血中的骨髓過氧化酶、lactopherin、彈性蛋白酶與白血球數以及嗜中性白血球的關係對於實施例7以及比較例1與2，使用自1 3個健康人所得之血液（A群）與已知疾病名的1 4個非健康人所得之血液（B群）。全血試料1 〇 m 1以含有].〇 m g EDTA - 2K (日本國，（有）同仁化學硏究所製）之試驗管採血，充分攪拌後。對於加入E D Τ Α的全血的一 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 B7 __ _ 五、發明説明（伞 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 部份，白血球數與嗜中性白血球數分別以c E L L -DYNETM3500 (美國，DAINABOT 公司製）測定。且取出1 m 1的已添加E D T A的全血，於此加入 100//1 的 11% (w/v)之 Triton τ M X — 1 〇〇 (美國，S I G M A )水溶液充分混合後，於室溫下放置 1小時，溶解白血球。 (1 )骨髓過氧化酶的測定（實施例7 ) 骨髓過氧化酶（Μ P〇）的測定爲，將上述的經表面活性劑處理之全血試料以 BI〇XYTECtm MPO Enzyme Immunoassay 組套（美國，〇XIS International, Inc. 公司製）所附的Sample diluting buffer (含〇 . 1%牛血淸白蛋白以及0 · 2 %迭氮化鈉的2 0 m Μ磷酸緩衝液，ρ η 7 . 4 )稀釋至2 0 0 0倍，作爲Μ Ρ〇測定用樣品。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製作爲樣品以及測量線用的標準Μ Ρ 0溶液（市販 Μ Ρ〇溶解於上述的緩衝液者）所含有的Μ Ρ 〇濃度以使用 BI〇XYTECtmMP〇 Enzyme Immunoassay 組套（美國、 International，Inc .公司製），依照附加的操作方法測定。又，對於樣品中的Μ P ◦量，樣品中最終濃度能成5 n g /ml與l〇ng/ml而添加MP〇（美_ ϋΊ . 八 _ ，Elastin

Products Co .，INC .公司製），測定各個 Μ P ◦濃度。由所得的測定値求得樣品之測量線，以與標準Μ Ρ〇的測量線關係修正，求得全血中的Μ ρ 〇濃卢。且，測定數爲3，求得平均値。 (2 )乳菲林的測定（比較例1 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 745 - ------ 1251078 A7 __B7 五、發明説明（私 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乳菲林（L T F )的測定，經上述的表面活性劑處理之全血 g式料以 BI〇XYTECTvl MP〇 Enzyme Immunoassay 組套（美國、〇XIS International, Inc. 公司製）所附的 Sample dilutingbuffer (含有 1 5 OmM N a C 1 ，2 mg/ml牛血淸白蛋白，〇 · 1% Twe e nTM 2〇以及0 . 〇 1% merthiolate之2 OmM磷酸緩衝液， P Η 7 · 4 )稀釋2 0 0 0倍，作爲L T F測定用樣品。作爲樣品以及測量線用的標準L T F溶液（市販 L T F溶解於上述的緩衝液者）所含有的L T F濃度以使用 BIOXYTEC TM Lactof Enzyme Immunoassay 組套（美國、〇XIS International，Inc .公司製），依照附加的操作方法測定。又，對於樣品中的L T F量，樣品中最終濃度能成5 ng/ml 與 l〇ng/ml 而添加 LTF (美國，ICN Pharmaceuticals，Inc ·公司製），測定各個L T F濃度。由所得的測定値求得樣品之測量線，以與標準L T F的測量線關係修正，求得全血中的L T F濃度。且，測定數爲3 ，求得平均値。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3 )彈性蛋白酶的測定（比較例2 ) 彈性蛋白酶（E L T )的測定，經上述表面活性劑處理的全血試料以PMN Elastase套組（美國，MERCK公司製）所附的Sample diluting buffer (含0.1%牛血淸白蛋白以及0 . 2 %迭氮化鈉之2 0 m Μ磷酸緩衝液，p Η 7 · 4 )稀釋2 0 0 0倍，作爲E L Τ測定用樣品。作爲樣品以及測量線用的標準E L Τ溶液（市販 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1251078 Α7 Β7 五、發明説明（今4 E L T溶解於上述的緩衝液者）所含有的顆粒球E L T濃度以使用PMN Elastase組套（美國、MERCK公司製），依照附加的操作方法測定。又，對於樣品中的E L 丁量，樣品中最終濃度能成5 n g / m 1與1 〇 n g / m 1而添加E L T，測定各個E L T濃度。由所得的測定値求得樣品之測量線，以與標準E L Τ的測量線關係修正，求得全血中的E L Τ濃度。且，測定數爲3，求得平均値。實施例7、比較例1以及比較例2的結果（對於健康人血液以及非健康人血液的Μ Ρ ◦濃度、L T F濃度與 E L Τ濃度）與含於血液的白血球數以及嗜中性白血球數同時於表示於表6。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - 47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（4^) 表6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製樣白血球品數 No.嗰///1) 嗜中性白血球數嗰//il) 實施例7 MPO濃度 (β g/m£) 比較例1比較例2 LTF濃度ELT濃度 (β g/m£) ( β g/m£) 疾病名 A群:健常人血液 1. 2600 1100 6.08 4.22 3.64 2. 3100 1000 4.60 5.32 3.12 3. 5400 2300 9.72 7.69 6.73 4. 7600 4900 16.02 14.54 14.79 5. 2700 1100 4.77 3.77 3.62 6. 6900 4100 12.85 8.99 10.75 7. 4600 2400 9.72 5.75 9.46 — 8. 7700 5400 14.01 15.74 10.45 9. 3200 1400 7.75 5.70 3.91 10. 5100 2300 11.02 5.30 6.20 11. 4800 1800 8.56 5.81 4.92 12. 6100 3800 15.49 9.55 10.79 13. 7100 3700 16.37 5.71 7.95 B群:非健常人血液 1. 13000 10400 25.99 15.17 16.22 肝硬化、轉移性肝癌 2. 1酬 6600 19.10 18.20 13.44 糖尿病 3. 13300 11000 38.87 28.51 31.13 肝硬變、肝癌 4. 11100 8600 20.28 28.30 21.64 骨盤內腫瘤、小腸大腸部分切 5. 19900 18900 51.70 37.17 109.21 除閉塞性黃膽、急性脾炎、急性 6. 23500 20500 31.17 41.66 56.65 贍囊炎支氣管氣喘 7. 12000 10100 29.06 13.83 44.83 閉塞性黃膽、急性脾炎、急性 8. 13900 11100 18.08 22.26 28.66 膽囊炎膽石、膽囊炎 9. 18000 16300 39.35 19.70 46.18 大腸癌·腸閉塞 10. 19700 18300 45.67 23.74 32.94 總膽管結石、閉塞性黃膽 11. 16100 14600 19.62 36.11 50.93 肝癌 12. 14400 13700 21.41 18.46 79,88 腸閉塞·大腸癌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1251078 A7 ____________ 五、發明説明（今6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 且綜合健康人血液群（A群）與非健康人血液群（b 群）的結果，顯示白血球數與各內生性物質濃度的相關性之圖，如圖2 ( a )至（c )所示，顯示嗜中性白血球與各內生性物質濃度的相關性之圖，如圖3 ( a )至（b ) 所示。如圖2與圖3所示各內生性物質與白血球數或嗜中性球數如以下相關性。表示Μ P 0濃度與白血球數的相關性回歸式子爲， y = 0.001 9x + 0.698 1 (r = 0.9034)、表示Μ P ◦濃度與好中球數的相關性回歸式子爲， y = 0.00 1 8x + 5.5395(r = 0.9088)、表示L T F濃度與白血球數的相關性回歸式子爲， y = 0.0014x+1.6278(r二0.8275)、表示L T F濃度與好中球數的相關性回歸式子爲， y-0.001 3x + 5.3757(r = 0.8190). 表示E L T濃度與白血球數的相關性回歸式子爲， y = 0.0032x-8.4464(r = 0.8076). 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表示E L T濃度與好中球數的相關性回歸式子爲， y = 0.0032x+1.045 1(r 二 0.8367)、因此，對於任一白血球數與嗜中性白血球數，顯示與 Μ Ρ Ο有著較高相關關係。實施例8以及比較例3與4

健康人血液群以及非健康人血液群之ΜΡ〇、L T F -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210、〆297公釐） Ϊ251078 A7

___BL 五、發明説明（〒 ' E L T與白血球數的關係解析 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 關於實施例7以及比較例1與2所得之數據，白血球數爲1 0，0 0 0個1未滿之健康人血液群（Α群）與白血球爲1 0 ，0 0 0個/ A 1以上的非健康人血液群 (B群）形成層次之差異，分別解析μ P〇' L T F、 E L Τ與白血球數的相關性。結果如圖4 ( a )至（c ) 與圖5 ( a )至（c )。解析的結果，對於A群判斷出，Μ P〇與白血球數的相關係數尺=0.9336 (5/" = 0.〇〇21又— 〇 . 2 4 1 4 )極爲高，L T F與白血球數的相關係數（ R = 〇 · 7929 ; y = 0 · 0 0 1 6 x — 0 · 7 4 8 8 )以及ELT與白血球數的相關係數（R=〇 . 8676 ;y = 0 . 0017x - 1 · 33)皆顯示較高値。因此，確認定量健康人血液的白血球數時，藉測定全血中的 Μ P ◦可得到最爲正確的定量値。又，對於Β群，Μ Ρ〇與白血球數的相關係數爲R = 0 . 73 1 8係爲最高。且，表示對於Β群ΜΡ〇、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 L T F與E L Τ分別與白血球數的相關回歸線之斜率作比較，即表示Μ Ρ〇與白血球數的相關回歸線之斜率爲 0.0019 (υ = 0.0019χ + 0·5678) ’ Α群的回歸線斜率爲0 . 0 0 2 1並無明顯的變化。另一方面，顯示對於B群的L T F與白血球數之相關回歸線的斜率爲0 · 0007 (y = 〇 · 〇〇〇 7x + 1 3 . 4 4 7 )而言，對於A群的回歸線斜率爲 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（今8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇 . 0 0 1 6，對於B群的斜率顯示爲健康人的約2 . 3 倍程度的降低。另一方面，顯示對於B群的E L T與白血球數之相關回歸線的斜率爲0 · 0 0 3 1 ( y = 〇· 〇03lx — 5 · 4788)而言，對於A群的回歸線斜率爲〇 _ 〇〇 1 7，對於B群的斜率約1 · 8倍程度的上昇。且，對於患有閉塞性黃膽、急性腎炎、急性膽囊炎之患者，E L T的測定値與Μ P〇或L T F相比顯示極端的高，判斷有脫離E L Τ濃度與白血球數的相關回歸直線的案例。因此，確認對於非健康人血液群而言，白血球數的定量以測定全血中所溶出的Μ Ρ ◦而得到最正確的定量値。實施例9 對於含有白血球數1 0，0 0 0個/// 1以上檢體的全血試料之Μ Ρ 0濃度與白血球數或嗜中性白血球的相關關係經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以門診病人所得之全血試料4 6個例子作爲試驗對象。作爲使用於白血球的溶解之表面活性劑，使用Triton τ Μ x - 1 0 0、Triton τ Μ X — 1 1 4 以及 Igepal τ Μ C A 6 3 〇三種，與實施例1相同不以表面活性劑處理， Μ P 0濃度與實施例2相同方法求得。白血球數以及嗜中性白血球數以 Coulter GEN，S System (美國、COULTER ELECTRONICS . INC ·公司製）測定，求得與Μ P ◦濃度的相關係數。且，測定數爲3，求得平均±標準差。 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ 297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（49 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其結果如圖6所示。Μ P ◦濃度與白血球數的相關係數爲，TntonTM X—114TR=0.8430 (P< 0.0 0 0 1 ) (γ 二 0_0022χ + 3·324)、 Triton™ X— 10〇下 R = 0 · 9066 (P< 0.001) (y = 0_002x + 2.1757)、 Igepal™ CA630 下 R=〇.9061 (P< 0.0 0 0 1 ) (y 二〇.0〇19x + 2.4259) ，認定爲具非常良好的相關關係。因此，亦對於含有白血球數爲1 0，0 0 0個/// 1以上的檢體之全血試料所成群，判斷Μ P ◦濃度可作爲表示白血球數之正確指標。又，Μ Ρ〇濃與嗜中性白血球的相關關係如圖7所示。相關係數爲，TritonTM X—114 下 R=0.8789 (P< 0.0001 ) (y = 0 . 0025X + 7 . 4 0 8 9 ) . Triton™ X—l〇〇下 R = 0 · 9364 (p<0 . 0001) ( y = 0·0023χ + 5·9748)、IgepalTM C A 6 3 0 下 R=0. 9450 (p<0. 0001 ) (y = 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〇.〇〇22x+6.〇951)顯示有著非常良好的相關關係，顯示所有的相關係數比與白血球數的相關係數高。如圖7所示，亦對於含有白血球數爲1 〇，〇〇〇個/ // 1以上的檢體之全血試料所成群，顯示Μ P ◦濃度與嗜中性白血球數有著非常良好的相關關係，判斷Μ Ρ ◦濃度可作爲表示嗜中性白血球數之正確指標。 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1251078 A7 五、發明説明（今0 實施例1〇 Μ P〇濃度爲準的白血球數/嗜中性白血球數、與以 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 血球3十星裝置所測定出的白血球數/嗜中性白血球之相關關係由使用於實施例9的門診病患所得之全血試料4 6例子作爲試驗對象。各全血試料的Μ Ρ 0濃度以與實施例9 相同的方法測定。對於白血球的溶解使用Triton τ Μ χ -1 〇 0 ’ Μ Ρ〇濃度以與實施例2相同方法測得。所得之 Μ Ρ ◦濃度代入實施例7所得之表示白血球數與全血中之 Μ Ρ 〇濃度相關回歸線（y = 〇 · 〇〇 1 9 χ + 0 · 6981)(圖2 (a))，算出白血球數。MP〇濃度爲準的白血球數，與使用Coulter GEN，S System(美國，C〇ULTER ELECTRONICS, INC ·公司製）湏!l出的與白血球數相關關係表示於圖8 ( a )。由圖8 ( a )明顯得知，以本發明方法所得之白血球經濟部智慧財產局員工消費合作社印製數，與以血球計量裝置所測定出的白血球數，亦對於含有白血球數爲1 0，0 〇 0個/// 1以上的檢體之全血試料所成群，亦可確認顯示良好的相關（y二1 . 0 3 3 3 χ + 777 . 69 ;R二0 . 907)。因此，僅預先求得全血中的Μ P ◦濃度與白血球數的相關表不回歸線，再測定全血試料中的Μ Ρ 0濃度，即可得到顯示與由血球計量裝置所測定的白血球數成良好相關的白血球數，亦對於定量含有白血球數爲1 〇，0 0 0個/// 1以上的檢體之全血試料中的白血球數時，可得到正確値。 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1251078 A7 ___B7 五、發明説明（今1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 且’對於各全血試料的Μ P 0濃度，於實施例7所得之嗜中性白血球與全血中之Μ Ρ〇濃度相關表示回歸線（ y=〇.〇〇18x+5.5395)(代入圖3 (a) ，算出嗜中性白血球數。Μ P〇濃度爲準的嗜中性白血球數，與使用 Coulter GEN · S System(美國，COULTER E L E C T R〇NIC S，IN C .公司製）測出的嗜中性白血球數之相關表示於圖8 ( b )。同樣地，亦由圖8 ( b )顯示，以本發明的方法所得之嗜中性白血球數，與由血球計量裝置所測定的嗜中性白血球數，亦對於定量含有白血球數爲1 〇，〇〇〇個/ // 1以上的檢體之全血試料所成群亦顯示良好的關係（y = 1.2542x + 241.85;R = 0.936)。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製因此，僅預先求得全血中的Μ P 0濃度與嗜中性白血球數的相關表示回歸線，再測定全血試料中的Μ Ρ〇濃度，即可得到顯示與由血球計量裝置所測定的白血球數成良好相關的白血球數，亦對於定量含有白血球數爲1 0，〇〇〇個/// 1以上的檢體之全血試料中的白血球數時，可得到正確値。實施例1 1 使用同一種試料的Μ Ρ〇與c R Ρ之測定白血球數爲4 8 0 0個1的健康人血液1 0m 1 中加入 1 1 % ( w / v )的 T r i t 〇 η τ M X — 1 〇〇 (美國、S I G Μ A )的水溶液1 m 1充分混合後，於室本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 54 - 1251078 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（$2 溫下放置6 0分鐘溶解白血球。所得的全血試料作爲樣品 A。取出養品A的一部份，於此添加Μ P〇（美國， Elastin Products Co ·，INC ·公司製）與 C R Ρ (曰本國， Oriental酵母公司製）至分別的濃度爲1 0 // g/m 1與2 // g / m 1 ，作爲樣品B。又，樣品A的一部份，於此添加MP0與CRP至分別的濃度爲2 0 // g/m 1與 1 0 // g / m 1 ，作爲樣品C。又，樣品A的一部份，於此添加MP0與CRP至分別的濃度爲3 0//g/m 1與 50//g:/ml ，作爲樣品D。國際申請公開W〇9 4 / 0 3 7 7號公報所記載，將表面以聚矽氧烷聚合物塗佈的矽基板（美國，BioStar公司製），以10//g/ml的兔子抗人MP ◦抗體（美國，〇811^0(：116111-]^0¥&1^0(：116111〇0巧0^1^011公司製）的0 .1]\4 HEPES (pH8 .〇）溶液中，或 10//g/ml 的兔子抗人CRP抗體（日本國，Oriental酵母公司製）的〇 . 1 Μ Η E P E S ( ρ Η 8 . 0 )溶液中以2 4小時 4 t下浸漬，抗Μ Ρ〇抗體與抗C R Ρ抗體分別吸著於以聚矽氧烷塗佈的矽基板表面上。吸著抗體的矽基板以水淸洗，使用氮氣取除水滴，其後風乾。如上述所調製出的樣品A、Β、C、D Ρ分別以 0 . 1 M HEPES(pH8.0)溶液稀釋至 100 倍，由稀釋的溶液中分別取出1 0 // 1 ，與3 0 // 1的 H R T結合抗Μ P〇抗體溶液或3 0 // 1的H R P結合抗 C R Ρ抗體溶液（藉H R Ρ的抗體之標識如實施例2 —般 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -55- 1251078 A7 Β7 五、發明説明（§3 進行）於微量試管中混合，室溫下反應1 〇分鐘。取出各反應溶液3 0 // 1 ，放置於如上述吸著抗 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ P 〇抗體或抗C R P抗體之矽基板上，於室溫下放置 1 0分鐘。再將此矽基板以水洗淨，以氮氣取除水滴後風乾’直接將30//1 TMB fast (美國， Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.公司製）放置於砂基板上使其反應5分鐘，形成沈澱層。反應後將矽基板以水洗淨，以氮氣取除水滴後風乾，得到與基板上的抗體結合的蛋白質成視覺化的矽基板。視覺化的蛋白質之染色程度，依目視所見強度以” ”” ± ” ”” ”” + + + ”作評估。其結果如表7所示。表7 樣品目視判定結果 (100倍烯釋） MP0檢出 CRP檢出 A — — B 土 + C + + + D + + + + + 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如表7中顯示，使用以表面活性劑處理全血試料的樣品，可測定Μ P〇與C R P雙方。實施例1 2 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1251078 A7 B7 五、發明説明（§4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實對於實施例1 1所得之基板上形成沈澱層的矽基板 ’將沈澱層厚度使用偏光板固定之橢圓測定器（入射角度 7 0° 、入射側偏光板角度2 0 ° 、檢出側偏光板角度 10。、He/Ne激光）（日本國，Sigma光機公司製）測定，定量含於樣品中的蛋白質量。且，進行1〇次測定，求得平均値。結果如表8所示。樣品橢圓測定器所檢出結果 (100倍稀釋） MPO檢測出 (# W) CRP檢測出 A 39.10 40.31 B 50.46 70.45 C 66.37 176.74 D 71.36 315.29 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製如表8中顯示，使用以表面活性劑處理全血試料的樣品，可測定Μ P ◦與C R P雙方。產業上可利用性使用本發明的白血球數定量方法，可無須由全血試料中分離血液細胞，可容易且迅速地定量出全血試料中的白血球數以及/或嗜中性白血球數。又，使用本發明的方法，與定量全血試料的白血球數同時，可使用相同試料而定本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） - 57: " 1251078 A7 B7 五、發明説明（今5 量C反應性蛋白。因此，藉由本發明的方法，對於感染症的有無或炎症的受傷程度可迅速、簡便且便宜地診斷出。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

A8 B8 C8 D8 1251078 六、申請專利範圍 1 1 . 一種定量全血試料中白血球數之方法，其特徵爲包含 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (a )混合全血試料與表面活性劑製得混合物、 (b )放置該混合物至，足以溶解該全血試料中的白血球，並能釋出內生性的骨髓過氧化酶爲止。 (c )以使用免疫學的方法測定該混合物中所釋出的骨髓過氧化酶濃度，於是 (d )由釋出的該骨髓過氧化酶濃度可定量出該全血言式料中之白血球數。 2 .如申請專利範圍第1項的方法，其中該步驟（c )中，測定該釋出骨髓過氧化酶濃度時，可進一步測定含於全血試料中的C反應性蛋白的濃度。 3 .如申請專利範圍第2項的方法，其中該步驟（c )中，該釋出骨髓過氧化酶濃度與C反應性蛋白濃度，可使用免疫學方法測定。 4 ·如申請專利範圍第1項的方法，其中該免疫學方法爲酵素免疫測定方法。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 .如申請專利範圍第3項的方法，其中該免疫學方法爲酵素免疫測定方法。 6 ·如申請專利範圍第1項的方法，其中該免疫學方法爲光學免疫測定方法。 7 ·如申請專利範圍第3項的方法，其中該免疫學方法爲光學免疫測定方法。 ____8 ·如申請專利範圍第1項至第7項中任一項的方法本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（2ι0χ297公着） A8 B8 C8 D8 1251078 六、申請專利範圍 2 ’其中該表面活性劑爲非離子性表面活性劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 ·如申請專利範圍第8項的方法，其中該非離子性表面活性劑的親水性•親脂性平衡値（H L B )爲1 2至 14° 1 0 ·如申請專利範圍第8項的方法，其中該非離子性表面活性劑，係爲飽和或不飽和之碳氫化合物所鍵結之聚氧乙烯化合物。 1 1 ·如申請專利範圍第1 〇項的方法，其中該非離子性表面活性劑’至少一種選自具有聚氧化乙烯烷基苯醚骨架之非離子性表面活性劑、不飽和脂肪族碳氫化合物所鍵結之聚氧化乙烯化合物之非離子性表面活性劑、以及具有聚氧化乙;I：希院基醚骨架之非離子性表面活性劑所成群的非離子性表面活性劑。 1 2 ·如申請專利範圍第1 1項的方法，其中該非離子性表面活性劑，至少一種選自TritonTM X-1 14、TritonTM X-100、Igepal TM CA630、Nissan Nonion NS-208 · 5、Nissan Dispanol TOC、Brij TM 97、以及 Brij TM 56 所成群的非離子經濟部智慧財產局員工消費合作社印製性表面活性劑。 1 3 .如申請專利範圍第1項至第7項中任一項的方法，其中該表面活性劑，至少一種選自於溴化十六烷基三曱基銨、氯化十六烷基三甲基銨、氯化聯二苯乙酮二甲基銨、氯化十二烷基三甲.基銨、溴化十二烷基三甲基銨、氯化十八烷基三甲基銨、溴化十四烷基銨、氯化十二烷基吡啶鑰、氯化十六烷基吡啶鐺、溴化十六烷基吡啶鏺、1 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ' 1251078 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局消費合作社印製六、申請專利範圍 3 月桂基氯化吡啶鑰 '以及溴化十四烷基三甲基陽離子性表面活性劑。 1 4 ·如申請專利範圍第1〜7、9〜1 項的方法，其中與該全血試料混合之該表面活作爲該混合物中的濃度時爲〇 . 2至1 〇 % ( 範圍內者。 1 5 .如申請專利範圍第8項的方法，其試料混合之該表面活性劑的量.，作爲該混合物爲0.2至10% (w/v)的範圍內者。 1 6 ·如申請專利範圍第1 3項的方法，血試料混合之前述表面活性劑的量，作爲該混度時爲0.2至10% (w/v)的範圍內者。 1 7 ·如申g靑專利範圍第1〜7、9〜1 1 6項中任一項的方法，其中對該步驟（b ) 合物的放置時間爲1小時以內。 1 8 ·如申請專利範圍第8項的方·法，其 (b )而言，該混合物的放置時間爲1小時以內 1 9 .如申請專利範圍第1 3項的方法，驟（b )而言，該混合物的放置時間爲1小時以 2 0 ·如申請專利範圍第1 4項的方法，驟（b )而言，該混合物的放置時間爲1小時以 2 1 .如申目靑專利車g圍第1〜7、9〜1 1 6、1 8〜2 0項中任一項的方法，其中該嗜中性白血球數。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公董）銨所成群t 2項中任— 性劑的量’ w 的中與該全血中的濃度時其中與該全合物中的濃 2、1 5、而言，該混中對該步驟〇其中對該步內。其中對該步內。 2、1 5、白血球數爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -61 - 1251078 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 2 2 .如申請專利範圍第8項的方法，其中該白血球數爲嗜中性白血球數。 2 3 .如申請專利範圍第1 3項的方法，其中該白血球數爲嗜中性白血球數。 2 4 .如申請專利範圍第1 4項的方法，其中該白血球數爲嗜中性白血球數。 2 5 .如申請專利範圍第1 7項的方法，其中該白血球數爲嗜中性白血球數。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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