KR20010102434A - 전혈 시료의 백혈구수를 정량하는 방법 - Google Patents

전혈 시료의 백혈구수를 정량하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고; 상기 혼합물을 상기 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키기에 충분한 시간 방치하고; 상기 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제 농도를 측정하고; 상기 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 상기 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는 것을 포함하는, 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법을 개시하고 있다. 또한, 본 발명은 전혈 시료의 백혈구수와 함께 전혈 시료에 포함되는 C 반응성 단백 농도도 측정하는 방법을 개시하고 있다.

Description

전혈 시료의 백혈구수를 정량하는 방법 {Method for Quantitating Leukocyte Count in Whole Blood Sample}
최근, 환자의 초기 진단에 있어서 세균 감염증인지 아닌지를 판단하는 검사 항목으로서 백혈구수와 C 반응성 단백 (C-reactive protein, 이하, 종종 CRP로 약칭함)의 정량이 행해지고 있다. 이 때, 의사가 항생 물질의 투여 등 적절한 처치를 할 수 있도록 신속, 간편하고 또한 저비용으로 이들의 결과를 얻을 수있는 정량 수법이 요망되고 있다.
통상 백혈구수의 계측에는 전기 저항법을 원리로 하는 쿨터 계측기(COULTER COUNTER(상품명), 미국, COULTER ELECTRONICS, INC.사 제품))으로 대표되는 시판의 자동 혈구 계측 장치가 사용되고 있다. 그러나 이러한 장치로는 혈장 단백인 CRP를 정량할 수는 없다．
최근에는, 문헌 [야마오 야스오, 오꾸나리 히로시, Henri CHAMPEIX; Readout, 16, 11-15 (1998)]에 기재되어 있는 것과 같은 전기 저항법을 원리로 하는 혈구계측 장치에 라텍스 면역 혼탁비율 측정법에 의한 CRP 측정 기능을 가한 백혈구수와 CRP를 함께 정량하기 위한 장치가 시판되어 있다. 그러나, 이러한 장치에 있어서는 백혈구 이외의 혈구 성분인 적혈구를 용혈시킨 후에 백혈구수를 전기 저항법에 의해 계측하고, 또한 CRP의 측정에 있어서는 용혈한 검체와 항 CRP 항체를 결합시킨 라텍스비드를 일정 시간 반응시킨 후, 라텍스 면역 혼탁비율 측정법에 의해 CRP를 계측한다. 따라서, 백혈구수의 정량과 CRP의 정량은 원리가 다르기 때문에 각각 다른 조작을 하지 않으면 안된다. 이와 같이 종래의 방법은 매우 번잡한 조작을 필요로 하고 또한 정량을 위한 시약류가 많아지기 때문에 비용이 많이 든다는 결점이 있다. 또한 장치의 유지에도 많은 시간과 비용을 필요로 한다. 이러한 결점이 장해가 되어 개인 병원 등의 초기 진료를 담당하는 일반 병원에서는 자동 혈구 계측 장치는 아직 거의 시설 면에서 도입되어 있지 않고, 의료의 요구를만족시키지 못하는 것이 현실이다.
상기 문제점을 해결하는 수단으로서, 백혈구수와 CRP를 동일 원리에 의해 정량하는 방법을 생각할 수 있다. 구체적으로는 1 개의 시료로 CRP와 함께 백혈구수를 면역학적 수법에 의해 계측하는 방법이 생각된다. 면역학적으로 백혈구수를 계측하기 위해서는 백혈구에 특이적으로 존재하는 단백질을 측정할 수 있다.
일반적으로 세균 감염증이나 염증을 일으킬 경우에는 백혈구 성분 중 존재 비율이 가장 큰 호중구의 수가 증대한다는 것이 알려져 있다. 따라서 호중구수를 정량하면 백혈구수의 증감을 알 수 있으며 세균 감염증의 유무나 염증의 중상도 판정이 가능해진다.
염증을 일으킨 조직 부위의 호중구수 또는 전혈 중의 백혈구수나 과립구수를 정량하는 방법으로서는 예를 들면 문헌 [Peter P. Bradley. Dennis A. Priebat, Robert D. Christensen and Gerald Rothstein: J. Invest. Dermatol., 78, 206-209 (1982)]에 기재된 방법을 들 수 있다. 이 방법에서는 미리 피콜(Ficoll) 시약을 사용하여 전혈로부터 분리한 호중구나, 염증을 일으킨 피부 조직을 0.5 ％의 헥사데실 트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB)를 포함하는 50 mM의 인산칼륨 완충 용액 (pH 6.0)으로 호모게나이즈하고 초음파 처리 후, 추출한 미엘로퍼옥시다아제의 효소 활성을 측정하고 있다.
또한 문헌 [Rita Cramer, Maria Rosa Soranzo, Pietro Dri, Renzo Menegazzi, Anna Pitotti, Giuliano Zabucchi and Pierluigi Patriarca: Journal of immunological Methods, 70, 119-125 (1984)]의 방법에서는 항응고제인 ACD (시트르산 덱스트로스) 용액을 포함하는 혈액에 덱스트란 (MW 20O,000) 용액을 첨가하여 적혈구를 제거하고, 계속해서 피콜 시약을 사용하여 과립구를 원심 분리한다. 다음으로 2×104개의 과립구를 13 mM 구아이아콜(guaiacol)과 0.02 ％ 세틸트리메틸암모늄 브로마이드를 포함하는 0.1 M 인산 완충 용액 (pH 7.0)을 혼합한 후, 거기에 1 ㎛ol의 H2O2를 첨가하여 퍼옥시다아제 활성을 측정하고 있다.
문헌 [W.M.Kuebler, C.Abels, L.Schuerer and A. E. Goetz : Int. J. Microcirc., 16, 89-97 (1996)]에서는 미리 피콜 시약을 사용하여 전혈로부터 분리한 다핵 백혈구를 O.5 ％ HTAB를 포함하는 50 mM의 인산칼륨 완충 용액 (pH 6.0)을 사용하여 용해 (lyse)하고, 거기에 포함되는 미엘로퍼옥시다아제의 효소 활성을 측정하고 있다. 또한, 이 문헌에서는, 쥐의 뇌나 토끼의 폐 조직을, 빙냉한 1 ㎖의 O.02 M 인산칼륨 완충 용액 (pH 7.4) 중에서 호모게나이즈하고 또한 1 ㎖의 0.02 M 인산칼륨 완충 용액 (pH 7.4)을 첨가하여 4 ℃, 200O rpm으로 15 분간의 원심조작을 행하여, 얻어진 상청(上淸)에 포함되는 미엘로퍼옥시다아제의 효소 활성을 측정하고 있다. 또한 원심 분리 잔여물에 대해서는 60 ℃에서 2 시간 인큐베이트하고 계속해서 0.5 ％의 HTAB를 포함하는 50 mM의 인산칼륨 완충 용액 (pH 6.0)으로 호모게나이즈하고 초음파 처리 후, 4 ℃, 20000 rpm으로 15 분간의 원심 처리를 하고, 얻어진 상청에 포함되는 미엘로퍼옥시다아제의 효소 활성을 측정하고 있다.
국제 출원 공개 WO93/01306호 공보에 기재된 방법에 있어서는 일정량의 혈액을 주입기 내에 셋팅된 유리 필터 (glass microfiber filter) 위에 올려 놓고 과립구 계측을 저해하는 성분을 미리 제거하기 위해서 혈액 중의 과립구를 파괴하지 않도록 물을 첨가하여 적혈구를 용혈하고, 다음으로 샘플 혈액 내의 용혈 성분을 흡인 세정 (pressure wash)한다. 그 후, 용해되지 않은 과립구를 포함하는 유리 필터를 건조시키고 0.005 ％ 트리톤(트리톤, 상품명) X-100, 30 mM 3-아미노-1,2,4 트리아졸, 0.0005 ％ H2O2및 0.5 mg/㎖ o-톨리딘을 포함하는 50 mM 인산 완충 용액을 유리 필터에 적하하고 과립구로부터 용출한 미엘로퍼옥시다아제의 작용에 의해 청색으로 염색한 스포트(spot)를 과립구로서 계측한다.
일본 특개평 8-308593호 공보 (EP 743519호 공보 및 미국 특허 제5639630호 공보에 대응)에 기재된 방법에서는 전혈 중의 적혈구를 용혈하여 헤모글로빈을 용출시키지만 백혈구 세포는 파괴하지 않는 농도의 비이온성의 폴리에톡실레이트 계면활성제, 음이온성 이온성 계면활성제, 또는 양성이온성 계면활성제와, 백혈구 세포를 화학적으로 가교하지만 적혈구는 가교하지 않는 농도의 포름알데히드 또는 파라포름알데히드와 림프구의 검출을 증강시키기 위한 당 또는 당알코올과, 반응액의 pH를 약 pH 6.8 내지 8.0의 중성 또는 중성 부근으로 하기 위한 완충 용액으로 이루어지는 용액을 전혈과 혼합한다. 그 후, 얻어진 혼합 용액을 약 60 내지 75 ℃로 따뜻하게 하여 적혈구를 용혈하고 또한 백혈구를 가교시킨다. 백혈구의 일부에 대해서, 내재하는 퍼옥시다아제 활성에 의한 염색을 실시하여 흡광도나 광산란법을 사용하여 전기 광학적으로 백혈구가 다른 세포종을 계측한다.
그러나 이 방법에 있어서는 피부, 뇌, 폐 조직에 존재하는 호중구에서 미엘로퍼옥시다아제를 충분히 용출시켜 효소 활성을 측정하기 위해 HTAB 존재하에서의 호모게나이즈 처리나 원심 처리 조작 등의 매우 번잡한 조작과 시간이 필요하다. 또한, 전혈 중의 백혈구수를 계측하기 위해서는 미엘로퍼옥시다아제의 측정을 방해하는 물질을 제거하기 위해서 미리 백혈구를 피콜 시약 등을 사용하여 전혈로부터 분리하는 조작이 필요하다. 따라서 이 방법에 있어서는 측정 저해 물질의 제거 조작이나, 백혈구를 고정화하기 위한 반응 등이 필요하기 때문에 조작이 번잡해지고, 많은 시약류나 전용 장치도 준비해야만 한다.
또한, 문헌 [고토 아끼고, 우찌다 이찌오, 도미다 히또시: 임상 검사, 40, 859-863 (1996)]나, 일본 특개평 8-145993호 공보, 일본 특개평 9-72906호 공보, 일본 특개평 9-196919호 공보 및 일본 특개평 11-32793호 공보에는, 요로 감염증 환자의 뇨 검체 중에 누설한 백혈구수를 정량하는 방법이 개시되어 있다. 구체적으로는 뇨 검체를 0.05 ％ 트리톤(상품명)X-100로써 처리하고 뇨 검체 중에 누설한 백혈구 (95 ％가 호중구)로부터 용출한 미엘로퍼옥시다아제의 양을 효소 면역적으로 측정하는 방법이 개시되어 있다.
뇨 검체는 전혈과 비교하여 매우 세포 성분이 적기 때문에 거기에 포함되는 미엘로퍼옥시다아제의 측정을 방해하는 물질의 양은 적다. 따라서 상기 방법에서는, 뇨 검체를 트리톤(상품명) X-1OO으로 처리하는 것만으로 뇨 중의 호중구에 내재하는 미엘로퍼옥시다아제를 측정하고 있지만, 전혈은 백혈구 이외의 세포 성분인 것의 적혈구, 혈소판 및 혈장 단백이 혼합한 매우 농후 또한 불균질한 생체 성분이 혼재한 계이고, 뇨 검체에 알맞는 방법을 전혈에도 응용할 수 있다고는 생각할 수없었다.
또한, 전혈을 용해 처리하고 전혈 중에 존재하는 호중구에서 데펜신 (defencin)이라는 팹티드를 용출시켜 정량하고 데펜신과 백혈구수나 호중구수의 상관성을 조사한 보고도 있다 (Toshihiko Ihi, Masamitsu Nakazato Hiroshi Mukae and Shigeru Matsukura: Clinical Infection Diseases, 25, 1134-1140 (1997)를 참조). 그러나 여기서 사용되는 방법으로서는 전혈을 1M 아세트산에 더하여 폴리트론 호모게나이저(polytron homogenizer)로 호모게나이즈하고, 다음에 2000×g, 4 ℃에서 30 분간 원심 처리하여 팹티드를 추출하는 번잡한 조작이 필요하다. 따라서 이 방법은 의료 현장에서 신속하고 또한 간편하게 백혈구수를 정량하기 위한 혈액 검체 처리법으로서는 전혀 사용할 수 없다.
상기와 같이 종래의 방법에 있어서는, 백혈구 성분 유래 물질을 면역학적으로 측정하기 위해서는 전혈 중에서 백혈구 성분을 분리하기 위한 조작, 백혈구 성분을 충분히 용출시키기 위한 매우 과격한 용해 처리 조건, 장시간 처리 조작 등의 다량의 조작과 번잡한 조작 순서가 필요하다. 또한 측정치와 실제의 백혈구수와의 상관성이 반드시 좋지 않다는 결점이 있다.
또한 본원의 기초 출원의 출원 후에 공개된 국제 출원 공개 W0 99/46599호 공보 (일본 특개평 11-258231호 공보에 대응)에는 계면활성제를 사용하여 전혈시료 중의 과립구 내부의 엘라스타제를 방출시킨 다음, 엘라스타제의 억제제인 α1-안티트립신 억제제를 사용한 면역 측정에 의해서 방출된 엘라스타제를 측정하여 백혈구수를 정량하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에 있어서도 과립구 엘라스타제를 측정하기 위해서 α1-안티트립신 억제제를 첨가하는 조작이 필요하기 때문에 조작성 및 경제성의 면에서 결점이 있다. 또한 과립구 엘라스타제와 백혈구수와의 상관성은 양호하지만 백혈구수가 10,000 개/㎕ 이상의 시료, 즉, 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료에 관한 측정 결과는 없다.
따라서 종래 사용되고 있는 방법으로는 전혈로부터 백혈구 성분을 분리하는 일 없이 신속 간편하고 또한 효율적으로 백혈구에 내재하는 물질을 면역학적으로 측정하고 백혈구수를 정확하게 정량할 수 없다. 또한 백혈구수와 같이 CRP를 신속, 또한 간편히 정량할 수도 없다.
<발명의 개요>
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 놀랍게도 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 효율적으로 백혈구를 용해하고 백혈구로부터 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시켜 측정한 미엘로퍼옥시다아제 농도는, 종래의 전기 저항법에 의한 백혈구 계측값과 매우 양호한 상관성을 나타낸다는 것을 지견하고 미엘로퍼옥시다아제 농도로부터 백혈구수를 정량할 수 있음을 발견하였다. 또한 미엘로퍼옥시다아제 농도의 측정을 행함과 동시에 전혈 시료에 포함되는 C 반응성 단백의 농도도 정량할 수 있다는 것을 지견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 신속, 간편하고 또한 저비용으로 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 상기 및 그 밖의 여러가지 목적, 여러가지 특징 및 여러가지 이익은 첨부 도면을 참조하면서 행하는 이하의 상세한 설명 및 청구의 범위의 기재로부터 밝혀진다.
본 발명은 전혈(全血) 시료에 포함되는 백혈구수의 정량 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고, 상기 혼합물을 상기 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제 (meyloperoxidase)를 방출시키는데 충분한 시간 방치하고, 상기 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하고, 상기 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 상기 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는 것을 포함하는 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법에 관한 것이다. 본 발명의 백혈구수의 정량 방법을 사용하면 전혈 중의 혈액 세포를 분리할 필요가 없고, 용이하고 신속하게 전혈 시료 중의 백혈구수 및(또는) 호중구수를 정량할 수 있다. 또한 본 발명의 정량 방법을 사용하면 전혈 시료의 백혈구수와 함께 전혈 시료에 포함되는 C 반응성 단백 농도도 동일한 시료를 사용하여 정량할 수 있기 때문에, 감염증의 유무나 염증의 중상도를 신속, 간편하고 또한 저비용으로 진단하는 것이 가능해진다.
도면에 있어서,
도 1은 HLB값와 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 용출도 (흡광도)와의 관계를 나타낸 도면이며,
도 2a는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 MPO 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 2b는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 락토페린 (LTF) 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 2c는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 엘라스타제 (ELT) 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 3a는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 MPO 농도와 호중구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 3b는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 LTF 농도와 호중수구의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 3c는 건강인과 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 ELT 농도와 호중구수와의 상관성을 나타낸 도면이고
도 4a는 건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 MPO 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 4b는 건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 LTF 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 4c는 건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 ELT 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 5a는 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 MPO 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 5b는 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 LTF 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 5c는 비건강인으로부터 얻은 전혈 시료 중의 ELT 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 6은 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료 중의 MPO 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 7은 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료 중의 MP0농도와 호중구수의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 8a는 MPO 농도에 의한 백혈구수와 혈구 계수 장치를 사용하여 계측한 백혈구수와의 상관성을 나타낸 도면이고,
도 8b는 MP0 농도에 의한 호중구수와 혈구 계수 장치를 사용하여 계측한 호중구수와의 상관성을 나타낸 도면이다.
본 발명에 의하면 (a) 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고,
(b) 상기 혼합물을, 상기 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키기에 충분한 시간 방치하고,
(c) 상기 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하고,
(d) 상기 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는
것을 포함하는 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법이 제공된다.
다음으로 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서, 우선 본 발명의 기본적 특징 및 바람직한 형태를 열거한다.
1. (a) 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고,
(b) 혼합물을 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키기에 충분한 시간 방치하고,
(c) 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하고,
(d) 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는
것을 포함하는 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법.
2. 제1항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정할 때, 또한 전혈 시료에 포함되는 C 반응성 단백 농도도 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를, 면역학적 수법을 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도와 C 반응성 단백 농도를, 면역학적 수법을 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 면역학적 수법이 효소 면역 측정법인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 면역학적 수법이 광학적 면역 측정법인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 비이온성 계면활성제의 친수성ㆍ친지성 밸런스 (HLB)값이 12 내지 14인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 포화 또는 불포화 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 골격을 갖는 비이온성 계면활성제, 불포화 지방족 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물인 비이온성 계면활성제, 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르 골격을 갖는 비이온성 계면활성제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 트리톤(Triton, 상품명) X-114, 트리톤(상품명) X-100, 이게팔(Igepal, 상품명) CA630, 닛산 비이온(Nissan Nonion) NS-208.5, 닛산 디스판올(Nissan Dispanol) TOC, 브리즈(Brij, 상품명)97 및 브리즈(상품명) 56으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실암모늄브로마이드, 도데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄브로마이드, 1-라우릴피리디늄클로라이드 및 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 양이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전혈 시료와 혼합하는 계면활성제의 양이 혼합물 중의 농도로서 0.2 내지 10 ％ (w/v)의 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (b)에 있어서, 혼합물을 방치하는 시간이 1 시간 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구수가 호중구수인 것을 특징으로 하는 방법.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 「전혈」이란 적혈구, 백혈구, 혈소판, 혈장 등의 모든 혈액 성분을 포함한 혈액을 의미하고, 「백혈구」란 호중구, 단구, 호염기구, 호산구, 림프구를 의미한다. 또한 「백혈구의 용해」란 백혈구의 세포막을 파괴하고 세포 내용물을 세포 밖으로 용출시키는 것을 의미한다.
우선 본 발명의 기본적 특징을 더욱 명확히 하기 위해서 본 발명의 완성에 이르는 경위를 따르면서 본 발명에 포함되는 기술적 특징에 관하여 설명한다.
호중구에 존재하는 물질로서는, 문헌 [Borregaard. N. et a1. "Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes": Blood 89, 3503-3251 (1997)]에 기재된 것과 같이 아주루(azuru) (1차) 과립, 특수 (2차) 과립, 젤라티나아제 (3차) 과립 및 분비 소포에 존재하는 물질을 들 수 있다.
구체적으로는 아주루 (1차) 과립 중에 존재하는 물질로서는 CD63, CD68, V형 H+ATP 아제, 산성β-글리세로포스파타아제, 산성 뮤코 다당, α1-안티트립신, α1-만노시타아제, 아주로사이진/CAP37/헤파린 결합 단백, 살균성/막 투과성 항진 단백 (BPⅠ), β-글리세로포스파타아제, β-굴루크로니다제, 카텝신, 데펜신, 호중구엘라스타제, 리소자임, 미엘로퍼옥시다아제, N-아세틸-β-글루코스아미니다제, 프로테이나아제, 시알리다제, 유비퀴틴 단백 등을 들 수 있다.
특수 (2차) 과립에 존재하는 물질로서는 CD11b, CD15 항원, CD66, CD67, 시트크롬b558, fMLP 수용체, 피브로넥틴 수용체, G단백질α서브유니트, 라미닌 수용체, NB-1항원, 19-kD단백질, 155-kD단백질, Rap 1, Rap 2, SCAMP, 트롬보스폰딘 수용체, TNF 수용체, 우로키나아제형 플라즈미노겐 활성화 수용체, VAMP-2, 비트로넥틴 수용체, β2-미크로글로불린, 콜라게나아제, 젤라티나아제, hCAP-18, 히스타미나아제, 헤파리나아제, 락토페린, 리소자임, NGAL, 우로키나아제형 플라즈미노겐 활성화 수용체 시알리다제, SGP28, 비타민 B12결합 단백질 등을 들 수 있다.
젤라티나아제 (3차) 과립에 존재하는 물질로서는 CD 11b, 시토크롬 b558, 디아실글리세롤-탈아실 효소, fMLP 수용체, SCAMP, 우로키나아제형 플라즈미노겐 활성화 수용체, VAMP-2, V형 H+ATP아제, 아세틸트란스페라제, β2-미크로글로불린, 젤라티나아제, 리소자임 등을 들 수 있다.
분비 소포에 존재하는 물질로서는 알칼리포스파타제, 보체 수용체, 시토크롬 b558,CDllb, CD14, CD16, fMLP 수용체, SCAMP, 우로키나아제형 플라즈미노겐 활성화 수용체, VAMP-2, V형 H+ATP아제, CDl0, CD13, CD45, Clq 수용체, DAF (보체 붕괴 촉진 인자), 혈장 단백 (테트라넥틴 포함)등을 들 수 있다.
본 발명자들은 백혈구수의 정량을 목적으로 측정하는 물질은, 전혈을 계면활성제로 처리하였을 때 효소 면역적으로 측정할 수 있는 충분한 양이 용출되는 물질이고 또한 감염증 이외의 원질환에 의해서 그 존재량이 크게 변화하지 않는 것이 바람직하다고 생각하였다. 이러한 관점에서 검토한 결과, 아주루 (1차) 과립이나 특수 (2차) 과립 중에 존재하는 물질이 바람직하고, 그 중에서도 특히 미엘로퍼옥시다아제 (이하, 종종 "MPO"라 함), 호중구 엘라스타제 (이하, 종종 "ELT"라 함) 및 락토페린 (이하, 종종 "LTF"라 함)가 바람직하다고 생각하였다.
본 발명자들이 백혈구수가 10,000 개/㎕ 미만인 건강인 (건강인군)의 전혈과 백혈구수가 10,000 개/㎕ 이상의 비건강인의 전혈 (비건강인군)에 대하여 MPO, ELT, LTF의 각각의 농도와 백혈구수와의 상관 관계를 조사한 결과, 건강인군에 있어서는 MPO와 백혈구수와의 상관 계수는 R=0.9336으로 매우 높고, LTF나 ELT와 백혈구수와의 상관계수보다 높다는 것이 판명되었다. 따라서, 비건강인군에 있어서 백혈구수를 정확하게 정량하기 위해서는, MP0의 측정이 가장 정확하다는 것을 발견하였다.
또한, 비건강인군 있어서도 MPO, LTF 및 ELT의 각각의 농도에 대하여 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기를 비교하였다. 그 결과 MP0와 백혈구수의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기는 0.0019으로, 건강인군에 있어서의 회귀식의 기울기 (0.0021)와 그다지 큰 변화는 없었다. 한편 비건강인군에 있어서의 LTF와 백혈구수와의 상관성을 표시하는 회귀식의 기울기는 0.0007인데 대하여, 건강인에 있어서의 회귀식의 기울기는 0.0016이고, 비건강인군에 있어서의 기울기는 약 2.3 배 정도 저하하고 있는 것이 판명되었다. 또한 비건강인군에 있어서의 ELT와 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기는 0.0031인데 대하여 건강인군에 있어서의 회귀식의 기울기는 0.0017이고, 비건강인군에 있어서의 기울기는 약 1.8배 정도 상승하고 있었다. 또한 급성 췌장염 환자의 경우에는 ELT의 측정치는 MPO나 LTF와 비교하여 극단적으로 높은 값을 나타내고, ELT 농도와 백혈구수의 상관성을 나타내는 회귀 직선으로부터 크게 벗어나고 있었다. 이러한 결과의 이유는 불명확하지만 어떠한 원인에 의해서 백혈구수가 10,000 개/㎕ 이상이 될 것 같은 질환의 경우에 백혈구에 내재하는 MPO의 양에 큰 변화는 없지만 내인성 LTF의 양은 감소하고 내인성 ELT의 양은 증대하는 경향이 확인되었다.
정확한 백혈구수를 얻기 위해서는 회귀식의 기울기가 백혈구수가 10,000 개/㎕ 미만인 건강인의 혈액이라도, 백혈구수가 10,O00 개/㎕ 이상인 비건강인의 혈액이라도 변화하지 않은 것이 중요하다. 따라서 상기 측정치를 고려한 결과 백혈구수를 정확하게 정량하기 위해서는 전혈 시료 중의 미엘로퍼옥시다아제를 측정하는 것이 가장 적절하다고 결론지어진다.
이상과 같이 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 미엘로퍼옥시다아제의 양이 백혈구수의 지표로서 유용하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 백혈구를 용해하고 방출한 내인성의 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하는 것을 포함하는 백혈구수의 정량 방법을 제공한다. 구체적으로는
(a) 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고,
(b) 상기 혼합물을, 상기 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키는기에 충분한 시간 방치하고,
(c) 상기 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하고,
(d) 상기 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 상기 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는
것을 포함하는 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법이다.
본 발명에서는 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고, 얻어진 혼합물을 방치함으로써 전혈 시료 중의 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 용해한다.
본 발명에 있어서 「계면활성제」란 1 분자 중에 친수성 부분과 친유성 부분을 공유하고 있는 화합물을 의미하고, 특히 한정하지 않는 한 수용성 계면활성제를 나타낸다.
일반적으로 계면활성제는 이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제로 크게 구별된다. 본 발명에 있어서 전혈 시료와 혼합하여 백혈구를 용해하기 위해서 사용하는 계면활성제는, 이온성 계면활성제와 비이온성 계면활성제 모두 사용할 수 있다.
이온성 계면활성제는 또한 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제와 양성 계면활성제로 크게 구별할 수 있다.
음이온성 계면활성제로서는 도데실황산나트륨, 도데실술폰산나트륨, 도데실-N-사르코신산나트륨, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 타우로데옥시콜산나트륨 등을 들 수 있다.
양이온성 계면활성제로서는, 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 옥타데실트리메틸암모늄브로마이드, 테트라데실암모늄브로마이드, 도데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄브로마이드, 1-라우릴피리디늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드 등을 들 수 있다.
양성 계면활성제로서는, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산, 팔미토일리졸레시틴, 도데실-N-베타인, 도데실-β-알라닌 등을 들 수 있다.
비이온성 계면활성제로서는, 옥틸글루코시드, 헵틸티오글루코시드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 폴리옥시에틸렌도데실에테르, 폴리옥시에틸렌헵타메틸헥실에테르, 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌지방산에스테르, 수크로스지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 계면활성제는, 백혈구에 내재하는 MPO를 되도록 변성시키지 않고 용출시킨다는 관점에서, 계면활성 작용이 강한 이온성 계면활성제보다 비이온성 계면활성제가 바람직하다.
계면활성제의 성질을 나타내는 파라미터의 하나에 친수성ㆍ친지성 밸런스 (Hydrophile-Lipophile Balance; HLB)가 있다. HLB값이란 계면활성제의 분자 중의 친수기와 친유기의 밸런스를 나타내는 지표이고, 이 개념은 그리핀(Griffin)에 의해서 제창된 것이다. HLB 값은 계면활성제의 유화력을 비교하여 실험적으로 정해지는 것이지만 간단한 계산식으로 구할 수 있다 (예를 들면 [요시다 도끼유끼, 신도 신이찌, 오가끼 다다요시, 야마나까 미끼요시 편 「신판 계면활성제 핸드북」일본, 고가꾸도쇼 가부시끼가이샤 (1987)]를 참조). 본 발명에 사용할 수 있는 계면활성제의 HLB값을 이하에 예시한다.
계면활성제 HLB값
닛산 비이온(Nissan Nonion) NS-204.5 9.5
트리톤(Triton) X-405 10.4
트리톤 X-207 10.7
닛산 비이온 NS-206 10.9
닛산 비이온 HS-206 11.2
닛산 디스판올(Nissan Dispanol) TOC 12.0
트리톤 X-114 12.4
브리즈(Brij) 97 12.4
닛산 비이온 NS-208.5 12.6
브리즈 56 12.9
이게팔(Igeapal) CA630 13.0
노니뎃(Nonidet) P-40 13.0
닛산 비이온 HS-210 13.3
트리톤 X-100 13.5
닛산 비이온 NS-212 14.1
이게팔 CA720 14.6
닛산 비이온 HS-215 15.0
닛산 비이온 NS-215 15.0
본 발명에 사용하는 비이온성 계면활성제는, HLB값이 12 내지 14인 것이 바람직하다. HLB값이 12 내지 14인 비이온성 계면활성제는, 전혈 시료 중의 백혈구에 내재하는 MPO의 용출 효율이 높다. 한편, 비이온성 계면활성제의 HLB가 14보다 크면, 전혈 시료 중의 백혈구에 내재하는 MP0의 용출 효율이 현저히 저하한다. 또한, HLB값이 12보다 작으면 계면활성제 자신이 물에 녹기 어려워지며 용출 효율의 저하와 함께 취급이 어려워진다. 또한 본 명세서 중에 기재된 HLB값은, 특히 한정되지 않는 한, 문헌 [Michael and Irene Ash 편 "HANDBOOK OF INDUSTRIAL SURFACTANTS" 제2판, 영국, Gower Publishing Limited (1997)]에 기재된 수치를 사용하였다.
측정의 대상인 백혈구 내인성 MP0를 효율적으로 용출시키기 위해서는 비이온성 계면활성제 중에서도, 포화 및 불포화 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물인 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 또한 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르골격을 갖는 비이온성 계면활성제 (예를 들면 트리톤(상품명) X-114 (일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품), 트리톤(상품명) X-100 (미국, SIGMA(등록상표)), 이게팔(상품명) CA630 (미국, SIGMA(등록상표))이나 닛산 비이온(Nissan Nonion) NS-208.5 (일본, 니혼 유시사 제품)); 불포화 지방족 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물 (예를 들면 브리즈(상품명) 97 (미국, SIGMA(등록상표))이나 폴리옥시에틸렌알킬에테르 골격을 갖는 비이온성 계면활성제 (예를 들면, 닛산 디스판올(Nissan Dispanol) TOC (일본, 니혼 유시사 제품)나 브리즈(상품명)56 (미국, SIGMA(등록상표))의 사용이 바람직하다. 또한 전혈 시료 중의 백혈구로부터 내인성의 MPO를 용출시키는 효과가 높고, 감도가 높은 MPO 측정이 가능해진다는 점에서는, 트리톤(상품명) X-114가 더욱 바람직하다.
또한 상품명으로 기재한 계면활성제에 대해서 그 CTFA (The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Assoc.) 표기 및(또는) IUPAC 표기를 이하의 표에 통합하였다.
상품명 CTFA 표기 IUPAC 표기
트리톤(상품명)X-114 옥톡시놀-8 α-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐]-ω-히드록시폴리(옥시-1,2-에탄디일)
트리톤(상품명)X-100 옥톡시놀-9 α-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐]-ω-히드록시폴리(옥시-1,2-에탄디일)
이게팔(상품명)CA630 옥톡시놀-9 α-[4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐]-ω-히드록시폴리(옥시-1,2-에탄디일)
닛산 비이온 NS-208.5 노녹시놀-8.5 α-(4-노닐페닐)-ω-히드록시폴리(옥시-1,2-에탄디일)
닛산 디스판올 TOC 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 -
브리즈(상품명) 97 폴리옥시에틸렌 올레일알콜(올레트-10) -
브리즈(상품명) 56 폴리옥시에틸렌 세틸알콜(세테트-10) -
본 발명에 있어서는 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 MP0를 용출시키기 위해서 양이온성 계면활성제를 사용할 수 있다. 본 발명자들은 실험 결과로부터 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실암모늄브로마이드, 도데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄브로마이드, 1-라우릴피리디늄클로라이드 및 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드는 MP0을 백혈구로부터 용출시키는데 적합하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 방법에 있어서, 전혈 시료와 혼합하는 계면활성제의 양은 혼합물중의 농도로서 0.2 ％ (w/v) 이상인 것이 바람직하다. 계면활성제의 농도가 0.2 ％ (w/v) 미만이면 백혈구에 내재하는 MPO의 충분한 용출을 바랄 수 없다. 또한 계면활성제의 농도가 높으면 계면활성제의 사용량의 증가에 따르는 비용의 증가가 생기고 또한 혼합물 등의 취급성도 저하된다. 이러한 조건을 고려하면 사용하는계면활성제의 양은, 혼합물 중의 농도로서 0.2 내지 10 ％ (w/v)의 범위 내인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5.0 ％ (w/v), 더욱 바람직하게는 0.2 내지 2.0 ％ (w/v)이다. 본 발명에 있어서는, 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하는 방법은 특별히 한정되지 않지만 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고, 얻어진 혼합물을 방치함으로써 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시킬 수 있어야 한다. 예를 들면 계면활성제의 수용액을 제작하고 이 계면활성제의 수용액을 전혈 시료에 첨가할 수가 있다. 이 경우 계면활성제의 첨가 후에 교반 조작을 행할 수 있으며 교반을 행하지 않을 수도 있다. 또한, 미리 혼합조에 미립자상의 계면활성제를 도포해두고, 거기에 전혈 시료를 첨가하는 방법도 들 수 있다. 이 방법에 있어서도 계면활성제가 전혈 시료와 혼합해 가는 과정에서 백혈구가 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제가 방출된다. 또한, 이 방법에 있어서도 계면활성제와 전혈 시료로 이루어지는 혼합물의 교반 조작은 행할 수도 행하지 않을 수도 있다.
전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 얻은 혼합물을 방치하는 시간은, 전혈시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키기에 충분한 시간이면 특별히 한정되지 않는다. 그러나 본 발명에 있어서는 혼합물을 방치하는 시간이 1 시간 이내인 것이 바람직하고, 통상 방치 시간은 약 1 분 내지 1 시간의 범위 내이다. 감염증 환자의 초기 진단에 있어서는 투약 등의 적절한 처치를 가능한 한 빠르게 행할 필요가 있기 때문에 백혈구수 (및 CRP)의 정량에는 신속성이 요구된다. 따라서 정량에 요하는 시간을 단축하기 위해서도 혼합물을 방치하는 시간은 짧은 쪽이 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서는 전혈 시료와 계면활성제로 이루어지는 혼합물을 방치하는 온도는 특별히 한정되지 않는다. 그러나 백혈구의 용해 및 내인성의 미엘로퍼옥시다아제의 방출이 물을 포함하는 분산계 (에멀젼)로 행하여지기 때문에 동결하는 온도로 냉각시키는 것은 바람직하지 않다. 또한 MPO의 항원성이 변성하여 버리는 것과 같은 고온도 면역 반응을 저해하기 때문에 바람직하지 않다. 따라서 본 발명에 있어서는 혼합물을 0 ℃에서 실온 (약 25 ℃)의 범위에 방치하고, 백혈구가 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키는 것이 바람직하다. 또한, 감염증 등의 진단이 통상의 진료소에서 행하여지는 것을 고려하면 실온에 방치하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 사용하여 백혈구로부터 방출된 MP0의 농도를 측정함과 동시에 C 반응성 단백 농도도 측정할 수가 있다. 건강인의 CRP값 (기준 범위)에 대해서는 이하에 나타낸 것과 같이 여러 사람에 의해 보고되어 있다: 60.3 ㎍/㎗ 이하 (야마기시 야스꼬 등: 임상 병리 32: 1389-1394, 1984); 300 ㎍/㎗ 이하 (니시다 아끼라: 북리 의학 16: 393-401, 1986), 및 4.0 내지 235.3 ㎍/㎗ (시메따니 나오또 등: 북리 의학 24 : 97-103, 1994). 또한 임상 검사치에 관한 핸드북, 예를 들면 [「임상에 도움이 되는 검사치 읽는 법ㆍ사고 방식」 가와노 긴야, 니시자끼 오사무 감수, 종합 의학사, 236 페이지, 1997 년)]에는 기준치는 0.3 ㎎/㎗ (=3 ㎍/㎖) 이하 (정량법에 따라 약간 다름)라고 기재되어 있다. 염증이나 암 등의 조직 장해에 의해서 활성화된 단구/매크로파아지는 인터루킨 6, 인터루킨 1 이나 TNF α 등을 분비하고 그 결과, 간세포에 있어서의 CRP를 비롯한 급성기 반응 단백 (acute phase protein)의 산생이 유도되어, 혈중 농도가 상승한다. 혈청 CRP 농도의 상승은 비특이적인 반응이기는 하지만, 조직 손상에 대하여 민감하게 반응하는 것으로부터 가장 넓게 이용되고 있는 염증 마커이다. 또한 암의 진전에 따라서도 상승하기 때문에 광의의 종양 마커로서도 유용하다. 또한 감염증의 경우에 있어서는 세균 감염증의 경우 쪽이 바이러스 감염증의 경우보다 높은 CRP 농도가 검출되는 것으로부터 백혈구수와 함께 CRP도 측정함으로써 보다 고정밀도의 진단이 가능해진다. 예를 들면 CRP의 값과 병태에 대해서는 이하의 관계가 알려져 있다.
CRP (㎍/㎖) 병태
0 내지 20 임신, 흡연, 급성 맹장염 등
0 내지 100 악성 종양, 바이러스 감염증, 전신성 에리테마토서스 등
20 내지 200 세균 감염증, 만성 관절 류마티즘 등
20 내지 200 이상 패혈증, 폐렴, 혈관염
본 발명에 있어서 백혈구로부터 방출된 MP0의 농도를 측정하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 여러가지 방법으로 측정할 수가 있다. 구체적으로는, MPO의 효소 활성의 측정, 액체 크로마토그래피, 면역학적 측정법 등의 수법을 사용하여 MPO 농도를 구할 수 있다. 그러나 높은 정량의 감도나 특이성을 갖고 또한 CRP 농도의 측정도 가능하다는 점에서, 면역학적 수법을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 「면역학적 수법」이란 효소 활성이나 방사 활성을 마커로서 항원 또는 항체의 양을 측정하는 방법; 항원 항체 반응에 의해서 형성한 면역복합체를 검출하여 항원 또는 항체의 양을 측정하는 방법; 라텍스 비드나 금 콜로이드 등의 담체에 항원이나 항체를 결합시킨 것과의 응집 반응으로부터 항원 항체 반응의 정도를 알고, 그로부터 항원 또는 항체의 양을 측정하는 방법 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하는 면역학적 수법은 특별히 한정되지 않지만 안전성의 면에서 방사 활성을 마커로 하는 방법은 바람직하지 않다.
구체적인 방법으로서는 당업자가 단백질 등의 측정에 사용하는 이뮤노크로마토그래피법, 96 구멍 플레이트를 이용한 효소 면역 측정법이나 국제 출원 공개 WO91/04491호 공보, WO92/14136호 공보, WO92/14147호 공보, WO92/16826호 공보 및 WO94/03774호 공보 등에 기재된 측정법 (미국, BioStar사의 광학적 면역측정법)등을 들 수 있다.
이뮤노크로마토그래피법을 사용한 MP0 농도의 측정법에 관해서 구체적으로 설명한다. 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 또는 표면을 화학 수식한 셀룰로오스 (아미노기, 디에틸아미노에틸기와 같은 양이온성의 관능기나 카르복실기와 같은 음이온성의 관능기를 갖도록 화학 수식한 셀룰로오스)로 이루어지는 막 등의 기재에, 항 인간 MPO 항체를 흡착이나 화학적인 수법에 의해 고정화한다. 항체를 고정화한 기재를 소 혈청 알부민 등을 포함하는 완충 용액에 침지하여 블러킹 반응을 하여 그 후 건조시킴으로써 MP0 측정용의 이뮤노크로마토그래피용 칩을 제작한다.
상기 이뮤노크로마토그래피용 칩의 제작시에, 항 인간 MP0 항체와 함께 항 인간 CRP 항체를 기재에 고정화 (이 때, 2개의 항체를 하나의 기재상에 위치를 바꿔 고정화하거나 또는 병렬한 2개의 기재상에 항체를 각각 고정화함)하면, CRP를 MPO와 함께 측정하기 위한 이뮤노크로마토그래피용 칩을 제작할 수 있다.
MPO (및 CRP)의 검출은 금 콜로이드나 라텍스 비드 등으로 표지한 항 인간 MPO 항체 (및 항 인간 CRP 항체)를 사용하여 검출할 수가 있다. 구체적으로는 표지한 항체와 용출한 전혈 시료 용액을 혼합하여 상기 기재에 적하하고, 거기에 적당한 전개용 완충액을 첨가하면 적하한 액이 기재에 전해져 전개 이동한다. 전혈 시료 용액은 필요한 정도로 희석하여 사용할 수도 있다. 전개 이동 동안에 표지한 항체와 MP0 (및 CRP)의 항원 항체 복합체가 고상화항체에 포착되어 발색한다. 그 발색 정도의 평가라든지 광학 측정기기 등을 사용한 MPO (및 CRP)의 정량을 행할 수 있다.
다음으로 96 구멍 플레이트를 사용한 효소 면역 측정법에 의한 MPO 농도와 CRP 농도의 측정 방법을 설명한다. 우선 시판의 96 구멍 플레이트의 기재상에 1차항체로서 항 인간 MPO 항체 및 항 인간 CRP 항체를 고정화하고 이 플레이트에 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 2000 배 또는 400O 배로 희석한 것을 첨가하고 기재상에 고정한 항체와 희석한 시료에 포함되는 MPO 또는 CRP와의 항원 항체 반응을 행한다. 다음으로 서양 고추 냉이 (와사비) 퍼옥시다아제 (HRP)나 알칼리 포스파타아제 등의 효소로 표지한 항 인간 MPO 항체 용액 및 항 인간 CRP 항체 (2차 항체) 용액을 플레이트에 첨가하여 2차 항체에 의한 항원 항체 반응을 행한다. 그 후, HRP의 기질인 테트라메틸벤지딘 (TMB)과 H2O2를 포함하는 용액, 또는 알칼리 포스파타제의 기질인 p-니트로페놀인산을 포함하는 용액을 첨가하여 발색시켜 일정 시간 후에 1N의 황산이나 수산화나트륨 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 발색한 용액의 흡광도를 측정함으로써 시료에 포함되는 MPO 및 CRP을 측정할 수가 있다.
또한 광학적 면역측정법에 의한 MPO 농도와 CRP 농도의 측정 방법에 관해서는 문헌 [Covalciuc KA, Webb KH and Carlson CA: Journal of Clinical Microbiology 12: 3971-3974 (1999)]에 기재된 방법으로 행할 수 있다. 구체적으로는 실리콘 기판의 표면에 실리콘 기판과는 다른 굴절율을 갖는 폴리실록산 등의 폴리머나 다이아몬드형 카본 등의 박막을 형성하고 거기에 1차 항체로서 항 인간 MPO 항체 및 항 인간 CRP 항체를 고정화한다. 다음으로 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 100 배 또는 200 배로 희석한 것과 HRP로 표지한 항 인간 미엘로퍼옥시다아제 항체 또는 항 인간 CRP 항체 용액을 혼합하여 상기 기판의 표면에 첨가하고 기판상에 고정한 항체와 희석한 시료에 포함되는 MPO나 CRP와의 항원 항체 반응을 행한다. 그 후, TMB 침전 기질인 「TMB fast」(미국, Kirkegaad ＆ Perry Laboratories, Inc.사 제품)를 첨가하여 일정 시간을 두면 기판 표면상에 침전층이 형성된다. 기판 표면상에 형성된 침전층의 두께에 기인하는 간섭색의 변화에 의해서 시료에 포함되는 MPO 또는 CRP의 농도를 평가할 수가 있다. 또한 박막상에 형성된 침전층의 두께를 엘립소 미터를 사용하여 계측하면 시료에 포함되는 MPO 및 CRP을 정량할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서는, 상기와 같이 측정한 MP0 농도로부터 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량한다. 백혈구수를 정량하기 위한 방법은 특별히 한정되지 않고 일반적으로 당업자가 사용하는 방법을 채용할 수가 있다. 구체적으로는 본 명세서의 실시예 10에서 행한 것 같이 백혈구수와 MP0 농도의 상관성을 나타내는 회귀식으로부터 구할 수 있다.
또한 본 발명에 있어서는 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 전혈 시료 중의 백혈구수가 호중구수인 것이 바람직하다. 「호중구」란 백혈구에 있어서 가장 존재 비율이 큰 세포이고, 염증이나 감염시에는 그 수가 증가하는 것이 알려져 있다. 따라서, 진단시에 세균 감염증인지 아닌지 또는 염증의 중상도를 판정하기 위해서는 호중구수를 측정하는 것이 바람직하다. 본 명세서의 실시예 7, 9나 10에 기재한 것 같이 전혈 시료와 계면활성제를 혼합함으로써 백혈구로부터 방출되는 MPO의 농도는 백혈구수 뿐만 아니라 호중구수와도 높은 상관성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 방법에 의해서 전혈 시료중의 백혈구수와 마찬가지로 호중구수를 정량할 수가 있다.
이어서 본 발명의 실시의 형태를 상세히 설명하지만 이들 실시예 및 비교예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
백혈구의 용해에 필요한 시간의 검토
건강인의 혈액 10 ㎖을 10 ㎎의 EDTA-2K (일본, (주) 도진 가가꾸 깽큐쇼제품)를 포함하는 시험관에 채취하고 충분히 교반한 후에 거기에서 1 ㎖를 분취하였다. 분취한 전혈에 11 ％의 트리톤(상품명) X-1OO (미국, SlGMA(등록상표))의 수용액을 1OO ㎕ 첨가하여 충분히 혼화하고 실온에서 1 분, 5 분, 30 분 또는 60 분방치하여 백혈구를 용해하였다.
소정의 시간 후, BIOXYTEC(상품명) MPO 효로 면역측정 킷트 (미국, OXIS International, Inc.사 제품)에 첨부된 샘플 희석 완충액 (0.1 ％ 소혈청 알부민 및 0.2 ％ 아지화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.4)를 사용하여 백혈구를 용해한 전혈 시료를 2000 배로 희석하여, 미엘로퍼옥시다아제 (MPO) 측정용 샘플로 하였다.
샘플 및 검량선용으로 준비한 표준 MPO 용액 (상기 완충액에 시판의 MP0를 용해한 것)에 포함되는 MP0의 농도는 BIOXYTEC(상품명) MPO 효소 면역 측정 킷트 (미국, OXIS International, Inc.사 제품)를 사용하여 첨부한 조작 순서에 따라 측정하였다.
또한 샘플 중의 MP0양에 대해서는 샘플에 최종 농도가 5 ng/㎖와 10 ng/㎖이 되도록 MPO (미국, Elastin Products Co., INC.사 제품)를 첨가하고 이들 MP0 농도를 각각 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 샘플마다의 검량선을 구하고 표준 MP0의 검량선과의 관계로부터 보정하여 전혈 중의 MPO 농도를 구하였다. 또한 측정수는 3으로 하고 평균 ±표준 편차를 구하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
트리톤(상품명) X-100에 의한처리시간 전혈중의 MPO 농도(㎍/㎖)
1분 9.88 ±0.50
5분 10.17 ±0.63
30분 9.94 ±0.72
60분 10.01 ±0.22
트리톤(상품명) X-100에의한 처리는 60 분 이내라도 충분히 MP0를 용출시키는 것이 확인되었다.
<실시예 2>
계면활성제 농도와 MPO 용출량
건강인에게서 1O ㎖의 혈액을 채취하고 바로 혈액 1 ㎖당 1 mg의 EDTA-2K (일본, (주)도진 가가꾸 깽큐쇼 제품)와 혼합하여 채혈 후 1 시간 이내에 하기에 표시하는 각종 측정에 제공하였다.
미엘로퍼옥시다아제 농도는 다음에 표시하는 방법으로 구하였다.
500 ㎕의 혈액을 2 ㎖의 에펜도르프 튜브에 측정하여 취하고, 거기에 농도가 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 1, 2, 4, 10 또는 20 ％ (w/v)의 계면활성제 수용액을 등량 첨가하여 혼합 용액을 얻어 볼텍스(Vortex) 믹서로 2 초간 교반하였다. 이어서, 빙상에서 60 분간 방치하여 백혈구를 용해하였다. 계면활성제에는 트리톤(상품명) X-114 (일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품), 트리톤(상품명) X-100, 이게팔(상품명) CA630 (모두 미국, SIGMA(등록상표))의 3종을 사용하였다. 백혈구의 용해 후에, 100 ㎕의 혼합 용액을 측정하여 취하고, 1 ％ BSA (상품명 : 「Sigma fraction V」) (미국, SIGMA(등록상표))를 용해한 PBS 용액 900 ㎕에 첨가하였다. 이것을 볼텍스 믹서로 교반 후, 거기에서 10 ㎕를 측정하여 취하고, 1 ％ BSA/PBS 용액으로 2000 배로 희석하여 ELISA에 제공하였다.
ELISA의 개요를 이하에 나타낸다. PBS에 용해한 5 ㎍/㎖의 토끼 항 인간 미엘로퍼옥시다아제 항체 (미국, Calbiochem-Novabiochem Corporation사 제품) (이하, 종종 「항 MPO 항체」라 함)를 100 ㎕씩 눈크 이뮤노 플레이트(Nunc Immuno Plate, 덴마크, Nalge Nunc International사 제품)의 각 웰에 분주하고 밀봉한 후, 4 ℃에서 18 시간 반응시켜 1차 항체를 고정화하였다. 웰을 세정액 (0.05 ％ 트윈(상품명) 20/PBS)으로 세정 후, 200 ㎕의 블로킹 용액 (1 ％ BSA/1 ％ PBS)을 사용하여 실온에서 1 시간 블로킹하고 또한 세정액을 사용하여 2회 세정하였다. 계속해서 계면활성제로 처리한 후에 희석한 혈액 샘플을 100 ㎕씩 분주하고, 실온에서 2 시간 반응시켰다. 세정액으로써 3회 세정 후, 5 ㎍/㎖의 농도의 서양 고추 냉이 퍼옥시다아제 (이하, HRP) 표지 항 MP0 항체 100 ㎕을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간 반응시켰다. HRP 표지 항 MPO 항체로서는, HRP 그레이드 Ⅳ (미국, Sigma(등록상표)사 제품)를 사용하여 표지한 항 인간 MP0 항체 (미국, Calbiochem-Novabiochem Corporation사 제품)를 사용하였다. 표지의 방법은 [Analytical Biochemistry. 132, 68-73 (1983)]에 기재된 방법에 따른다. 웰을 세정액으로 5회 세정 후, 조제한 직후의 TMB 용액 (미국, Kirkegaad ＆ Perry Laboratories사 제품)를 100 ㎕ 첨가하여 발색시켰다. 2 분 후에 1N 황산 용액 일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품) 100 ㎕을 첨가하여 반응을 정지시켜 450 nm의 흡광도를 플레이트 리더 (미국, Bio-Rad Laboratories사 제품)로써 측정하였다. 또한 측정수는 3으로 하고, 평균 ±표준 편차를 구하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
계면활성제의농도 (％(w/v)) 전혈 중의 MPO 용출도(Abs.450 nm)
트리톤(상품명)X=100 트리톤(상품명)X-114 이게팔(상품명)CA630
0.00 0.082 ±0.002 0.101 ±0.014 0.082 ±0.006
0.05 0.104 ±0.005 0.120 ±0.026 0.103 ±0.005
0.10 0.161 ±0.009 0.131 ±0.016 0.156 ±0.009
0.20 0.202 ±0.006 0.207 ±0.004 0.205 ±0.007
0.30 0.228 ±0.009 0.198 ±0.003 0.211 ±0.008
0.50 0.262 ±0.005 0.259 ±0.007 0.249 ±0.002
1.00 0.245 ±0.011 0.240 ±0.006 0.220 ±0.008
2.00 0.216 ±0.004 0.245 ±0.015 0.208 ±0.003
5.00 0.228 ±0.007 0.239 ±0.002 0.199 ±0.018
10.00 0.227 ±0.007 0.243 ±0.005 0.277 ±0.006
트리톤(상품명) X-100, 트리톤(상품명) X-114, 이게팔(상품명) CA630 모두 그 농도가 0.2 내지 10.0 ％ (w/v)의 범위 내에 있어서, 내인성의 MP0는 전혈 시료 중에 충분히 용출된다는 것이 판명되었다.
<실시예 3>
각종 계면활성제의 MPO 용출 효과
28 G의 날개 달린 정맥 주사 바늘 (일본, 데루모사 제품)를 사용하여, 건강인으로부터 1O ㎖의 혈액을 채혈하고 바로 혈액 1 ㎖당 1 mg의 EDTA-2K (일본, (주) 도진 가가꾸 깽큐쇼 제품)와 혼합하여, 1 시간 이내에 각종 측정에 제공하였다.
미엘로퍼옥시다아제 농도는 다음에 나타내는 방법으로 구하였다.
500 ㎕의 혈액을 2 ㎖의 에펜도르프 튜브에 측정하여 취하고, 거기에 등량의 1 ％ (w/v) 계면활성제 수용액을 첨가하여 혼합 용액을 얻고, 볼텍스 믹서로 2 초간 교반하였다. 계속해서 그 후, 빙상에서 60 분간 방치하여 백혈구를 용해하였다. 백혈구를 용해한 후에 100 ㎕의 혼합 용액을 측정하여 취하고, 1 ％ BSA (상품명: 「Sigma fraction V」) (미국, SIGMA(등록상표))를 용해한 PBS 용액 900 ㎕에 첨가하였다. 이것을 볼텍스 믹서로 교반 후, 거기에서 10 ㎕을 측정하여 취하고, 1 ％ BSA/PBS 용액으로 2000 배로 희석하여, ELISA에 제공하였다.
ELISA의 개요를 이하에 나타낸다. PBS에 용해한 5 ㎍/㎖의 항 MP0 항체를 100 ㎕씩 눈크 이뮤노 플레이트 (덴마크, Nalge Nunc Internationa1사 제품)의 각 웰에 분주하고 밀봉한 후 4 ℃에서 18 시간 반응시켜 1 차 항체를 고정화하였다. 웰을 세정액 (0.05 ％ 트윈 20/PBS)으로 세정 후, 200 ㎕의 블로킹 용액 (1％ BSA/1 ％ PBS)을 사용하여 실온에서 1 시간 블로킹하고 또한 세정액을 사용하여 2회 세정하였다. 계속해서 계면활성제로 처리한 후에 희석한 혈액 샘플을 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 세정액으로 3회 세정 후, 5 ㎍/㎖의 HRP 표지 항 MPO 항체 (실시예 2와 마찬가지로 작성한 HRP 표지 항 MPO 항체) 100 ㎕을 각 웰에 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 웰을 세정액으로 5회 세정 후, 조제한 직후의 TMB 용액 (미국, Kirkegaad ＆ Perry Laboratories사 제품)을 100 ㎕첨가하여 발색시켰다. 2 분 후에 1N 황산 용액 (일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품) 100 ㎕을 첨가하여 반응을 정지시켜, 450 nm의 흡광도를 플레이트 리더 (미국, Bio-Rad Laboratories사 제품)로 측정하였다.
또한 샘플 중의 MP0량에 대해서는 샘플에 최종 농도가 5 ng/㎖와 10 ng/㎖이 되도록 MPO (미국, Elastin Products Co., INC사 제품)를 첨가하고 이들의 MP0 농도를 각각 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 샘플마다의 검량선을 구하고 표준 MP0의 검량선과의 관계로부터 보정하고, 전혈 중의 MPO 농도를 구하였다. 또한 측정수는 3으로 하여 평균 ±표준 편차를 구하였다.
시험한 계면활성제를 이하에 나타낸다. 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB) (일본, 와코쥰야꾸고교 제품), 트리톤(상품명) X-114 (일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품) 트리톤(상품명)X-100, 트리톤(상품명)DF-12, 브리즈(상품명) 56, 브리즈(상품명) 97, 이게팔(상품명) CA630 (모두 미국, SIGMA(등록상표)), 닛산 비이온(Nissan Nonion) NS-208.5, 닛산 디스판올(Nissan Dispanol) TOC (모두 일본, 니혼 유시 제품). 이들 계면활성제를 정제수 (일본, 교에이 세이야꾸사 제품)에 용해하여 10 ％ 또는 2 ％ (w/v)의 수용액을 조제하여 시험에 사용하는 15 시간 이내에 그것을 사용하여 1 ％ (w/v) 용액을 조제하였다. 또한 대조로서는 정제수 (일본, 교에이 세이야꾸 제품)를 사용하였다.
결과를 표 3에 나타낸다.
계면활성제 전혈 중의 MPO의 용출도 (㎍/㎖)
트리톤(상품명) X-114 7.44 ±1.81
닛산 디스판올 TOC 7.00 ±1.64
트리톤(상품명) X-100 6.43 ±1.25
이게팔(상품명) CA630 6.23 ±1.42
닛산 비이온 NS-208.5 6.20 ±1.51
브리즈(상품명) 97 6.08 ±1.44
브리즈(상품명) 56 6.02 ±1.38
HTAB 5.80 ±1.41
정제수 2.02 ±0.87
어떤 계면활성제도 내인성의 MP0를 전혈 시료 중에 효율적으로 용출시킨다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 4>
각종 계면활성제의 MP0 용출 효과
실시예 3과 같은 방법을 사용하여, 이하의 계면활성제의 전혈 시료에 있어서의 MP0 용출도를 구하였다. 시험한 계면활성제는, 헥사데실피리디늄 클로라이드 1수화물 (HPC), 헥사데실피리디늄 브로마이드 1수화물 (HPB), 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드 (HTAC), n-도데실트리메틸암모늄 브로마이드 (DTAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB), 1-라우릴피리디늄 클로라이드 (LPC), 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드 (TTAB) (이상, 일본, 와코쥰야꾸고교 제품)이다. 이들 계면활성제를 정제수 (일본, 교에이세이야꾸사 제품)에 용해하여 10 ％ 또는 2 ％ (w/v)의 수용액을 조제하여 시험에 사용하는 15 시간 이내에 그것을 사용하여 1 ％ (w/v) 용액을 조제하였다. 또한 대조로서는 정제수 (일본, 교에이세이야꾸사 제품)를 사용하였다. 결과를 표 4에 나타냈다.
계면활성제 전혈 중의 MPO의 용출도 (㎍/㎖)
HPC 12.05 ±1.18
HPB 10.96 ±0.46
HTAC 10.93 ±0.82
DTAC 9.95 ±0.71
HTAB 9.58 ±0.53
LPC 9.58 ±1.39
TTAB 9.33 ±1.30
정제수 1.65 ±0.81
어떤 양이온 계면활성제도, 전혈 시료 중에 내인성의 MP0를 충분히 용출시키는 것이 밝혀졌다.
<실시예 5>
각종 계면활성제의 MPO 용출 효과
실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 이하의 계면활성제의 전혈에 있어서의 MPO 용출도를 구하였다. 시험한 계면활성제는, 헥사데실피리디늄 클로라이드 1수화물 (HPC), 헥사데실피리디늄 브로마이드 1수화물 (HPB), 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드 (HTAC), n-도데실트리메틸암모늄 브로마이드 (DTAB), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB), 1-라우릴피리디늄 클로라이드 (LPC), 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드 (TTAB) (이상, 일본, 와코쥰야꾸고교 제품), 디데실디메틸암모늄 클로라이드 (DDAC), 옥타데실트리메틸암모늄 클로라이드 (OTAC) (이상, 일본, 니혼 유시 제품)이다. 이러한 계면활성제를 정제수 (일본, 교에이 세이야꾸사 제품)에 용해하여 10 ％ 또는 2 ％ (w/v)의 수용액을 조제하고 시험에 사용하기 15 시간 이내에 그것을 사용하여 1 ％ (w/v)용액을 조제하였다. 또한 대조로서는 정제수 (일본, 교에이 세이야꾸사 제품)를 사용하였다. 결과를 표 5에 나타냈다.
계면활성제 전혈중의 MPO의 용출도 (㎍/㎖)
HPC 10.96 ±1.44
DTAC 9.28 ±0.60
HPB 9.07 ±1.14
TTAB 8.08 ±0.11
DTAB 8.05 ±0.64
DTAC 7.88 ±0.46
LPC 7.57 ±0.60
OTAC 7.47 ±0.38
HTAC 7.35 ±0.28
HTAB 7.15 ±2.69
정제수 1.58 ±0.97
어떤 양이온 계면활성제도 전혈 시료 중에 내인성의 MPO를 충분히 용출시킨다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 6>
MPO 용출도와 HLB값과의 관계
실시예 3과 마찬가지로 채혈, 계면활성제 처리 및 ELISA를 행하고, 각종 계면활성제의 MP0 용출 효과를 검토하였다.
비이온성 계면활성제로서, 노니뎃(Nonidet, 상품명)-P40, 트리톤(상품명)X-114 (모두 일본, 나카라이테스크 가부시끼가이샤 제품), 트리톤(상품명)X-100, 트리톤(상품명)X-207, 트리톤(상품명)X-305, 브리즈(상품명)35, 브리즈(상품명)56, 브리즈(상품명)58, 브리즈(상품명)97, 브리즈(상품명)98, 이게팔(상품명)CA630, 트윈(Tween, 상품명) 65, 트윈(상품명) 85 (모두 미국, 시그마(등록상표)), 트윈(상품명)20 (미국, Bio-Rad Laboratories사 제품), 트리톤(상품명)X-45 (스위스, Fluka사 제품)를 사용하였다. 각 계면활성제를 정제수 (일본, 교에이 세이야꾸사제품)에 용해하여 10 ％ 또는 2 ％ (w/v)의 수용액을 조제하고, 시험에 사용하기 15 시간 이내에 그것을 사용하여 1 ％ (w/v) 용액을 조제하였다. 또한 대조로서는, 정제수 (일본, 교에이세이야꾸사 제품)를 사용하였다.
도 1에 나타낸 것과 같이, 전혈 중의 MP0의 용출도는 계면활성제의 HLB값에에 따라 다르고, HLB값이 12 내지 14의 범위 내에 있는 계면활성제가 적당한 MP0의 용출 조건인 것이 표시되었다.
<실시예 7 및 비교예 1과 2>
전혈 중의 미엘로퍼옥시다아제, 락토페린, 엘라스타제와 백혈구수 및 호중구수와의 관계
실시예 7 및 비교예 1과 2에 있어서는, 13명의 건강인으로부터 얻은 혈액 (A군)과, 질환명을 알고 있는 14명의 비건강인으부터 얻은 혈액 (B군)을 사용하였다. 전혈 시료 10 ㎖를 10 mg의 EDTA-2K (일본, (주)도진 가가꾸 깽큐쇼 제품)를 포함하는 시험관에 채취하고 충분히 교반하였다. EDTA를 가한 전혈의 일부에 대해서, 백혈구수와 호중구의 수가 각각 CELL-DYNE(상품명)3500 (미국, DAINAB0T사 제품)로 계측하였다. 또한, EDTA를 가한 전혈을 1 ㎖ 분취하고, 거기에 11 ％ (w/v)의 트리톤(상품명)X-1OO (미국, SIGMA(등록상표))의 수용액 1OO ㎕을 첨가하여 충분히 혼화한 후, 실온에서 1 시간 방치하여 백혈구를 용해하였다.
(1) 미엘로퍼옥시다아제의 측정 (실시예 7)
미엘로퍼옥시다아제 (MP0)의 측정은, 상기 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 BI0XYTEC(상품명) MPO 효소 면역 측정 킷트 (미국, OXIS International, Inc.사 제품)에 첨부된 샘플 희석 완충액 (O.1 ％ 소혈청 알부민 및 0.2 ％ 아지화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.4)로 2000 배로 희석하고, MPO 측정용 샘플로 하였다.
샘플 및 검량선용으로 준비한 표준 MP0 용액 (상기 완충액에 시판의 MP0를 용해한 것)에 포함되는 미엘로퍼옥시다아제의 농도는 BIOXYTEC(상품명)MPO 효소 면역 측정 킷트 (미국, 0XIS International, Inc.사 제품)에 첨부한 조작 순서에 따라 측정하였다. 또한 샘플 중의 MPO량에 대해서는 샘플에 최종 농도가 5 ng/㎖와 10 ng/㎖이 되도록 MP0 (미국, Elastin Products Co., INC.사 제품)를 첨가하고 이들의 MP0 농도를 각각 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 샘플마다의 검량선을 구하고 표준 MP0의 검량선과의 관계로부터 보정하여, 전혈 중의 MP0 농도를 구하였다. 또한, 측정수는 3으로 하여 평균치를 구하였다.
(2) 락토페린의 측정 (비교예 1)
락토페린 (LTF)의 측정은 상기 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 BlOXYTEC(상품명) Lactof 효소 면역 측정 킷트 (미국, OXIS International, Inc.사 제품)에 첨부한 샘플 희석 완충액 (150 mM NaCl, 2 mg/㎖ 소혈청 알부민, O.1 ％ 트윈(상품명)-20 및 O.O1 ％ 메르티올레이트를 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.4)로 2000배로 희석하고, LTF 측정용 샘플로 하였다.
샘플 및 검량선용에 준비한 표준 LTF 용액 (상기 완충액에 시판 LTF를 용해한 것)에 포함되는 LTF의 농도는 BIOXYTEC(상품명) Lactof 효소 면역 측정 킷트 (미국, OXIS International, Inc.사 제품)를 사용하고, 그 첨부의 조작 순서에 따라서 측정하였다. 또한 샘플 중의 LTF량에 관하여는 샘플에 최종 농도가 5 ng/㎖와 10 ng/㎖가 되도록 LTF (미국, ICN Pharmaceuticals, Inc사 제품)를 첨가하고, 이들의 LTF 농도를 각각 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 샘플마다의 검량선을 구하고, 표준 LTF의 검량선과의 관계로부터 보정하고 전혈 중의 LTF 농도를 구하였다. 또한 측정수는 3으로 하여 평균치를 구하였다.
(3) 엘라스타제의 측정 (비교예 2)
엘라스타제 (ELT)의 측정은, 상기 계면활성제로 처리한 전혈 시료를 PMN 엘라스타제 킷트 (미국, MERCK사 제품)에 첨부한 샘플 희석 완충액 (O.1 ％ 소혈청 알부민 및 0.2 ％ 아지화나트륨을 포함하는 20 mM 인산 완충액, pH 7.4)로 2000 배로 희석하여, ELT 측정용 샘플로 하였다.
샘플 및 검량선용으로 준비한 표준 ELT 용액 (상기 완충액에 시판의 ELT를 용해한 것)에 포함되는 과립구 엘라스타제 농도는, PMN 엘라스타제 킷트 (미국, MERCK사 제품)를 사용하여, 첨부의 조작 순서에 따라 측정하였다. 또한 샘플 중의 ELT량에 관하여는 샘플에 최종 농도가 5 ng/㎖와 10 ng/㎖가 되도록 킷트 첨부의 ELT를 첨가하여, 이들의 ELT 농도를 각각 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 샘플마다의 검량선을 구하여 표준 ELT의 검량선과의 관계에서 보정하고, 전혈 중의 ELT 농도를 구하였다. 또한 측정수는 3으로 하여 평균치를 구하였다.
실시예 7, 비교예 1 및 비교예 2의 결과 (건강인의 혈액 및 비건강인의 혈액에 있어서의 MPO 농도, LTF 농도와 ELT 농도)를 혈액에 포함되는 백혈구수와 호중구수를 같이 표 6에 나타내었다.
샘플번호 백혈구수(개/㎕) 호중구수(개/㎕) 실시예 7MPO농도(㎍/㎖) 비교예 1LTF농도(㎍/㎖) 비교예 2ELT농도(㎍/㎖) 질환명
A군:건강인의 혈액
1 2600 1100 6.08 4.22 3.64
2 3100 1000 4.60 5.32 3.12
3 5400 2300 9.72 7.69 6.73
4 7600 4900 16.02 14.54 14.79
5 2700 1100 4.77 3.77 3.62
6 6900 4100 12.85 8.99 10.75
7 4600 2400 9.72 5.75 9.46
8 7700 5400 14.01 15.74 10.45
9 3200 1400 7.75 5.70 3.91
10 5100 2300 11.02 5.30 6.20
11 4800 1800 8.56 5.81 4.92
12 6100 3800 15.49 9.55 10.79
13 7100 3700 16.37 5.71 7.95
B군:비건강인의 혈액
1 13000 10400 25.99 15.17 16.22 간경변, 전이성간암
2 11000 6600 19.10 18.20 13.44 당뇨병
3 13300 11000 38.87 28.51 31.13 간경변, 간암
4 11100 8600 20.28 28.30 21.64 골반내종양, 소장대장부분절개
5 19900 18900 51.70 37.17 109.21 폐색성황달, 급성췌염, 급성담낭염
6 23500 20500 31.17 41.66 56.65 기관지천식
7 12000 10100 29.06 13.83 44.83 폐색성황달, 급성췌염, 급성담낭염
8 13900 11100 18.08 22.26 28.66 담석, 담낭염
9 18000 16300 39.35 19.70 46.18 대장암, 일레우스
10 19700 18300 45.67 23.74 32.94 총담관결석, 폐색성황달
11 16100 14600 19.62 36.11 50.93 간암
12 14400 13700 21.41 18.46 79.88 일레우스, 대장암
13 15900 14500 28.52 33.48 29.45 골반내종양, 소장대장부분절개
14 27000 25800 54.64 22.08 66.87 대장암, 일레우스
또한, 건강인 혈액군 (A군)과 비건강인 혈액군 (B군)을 종합한 결과에 관해서 백혈구수와 각 내인성 물질 농도와의 상관성을 나타내는 그래프를 도 2a 내지 2c에 나타내고 호중구수와 각 내인성 물질 농도와의 상관성을 나타내는 그래프를 도 3a 내지 3c에 나타냈다.
도 2와 3에 나타낸 것과 같이, 각 내인성 물질과 백혈구수 또는 호중구수는이하와 같은 상관 관계를 나타내었다.
MP0 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0019x+0.6981 (r=0.9034)이고,
MP0 농도와 호중구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0018x+5.5395 (r=0.9088)이었다.
LTF 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0014x+1.6278 (r=0.8275)이고,
LTF 농도와 호중구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0013x+5.3757 (r=0.8190)이었다.
ELT 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0032x-8.4464 (r=0.8076)이고,
ELT 농도와 호중구수와의 상관성을 나타내는 회귀식은, y=0.0032x-1.0451 (r=0.8367)이었다.
따라서, 백혈구수와 호중구수 모두, MPO와 가장 높은 상관 관계를 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 8 및 비교예 3과 4>
건강인 혈액군 및 비건강인 혈액군에 있어서의 MPO, LTF, ELT와 백혈구수와의 상관성의 해석
실시예 7 및 비교예 1과 2에서 얻어진 데이터에 관해서, 백혈구수가 10,000 개/㎕ 미만인 건강인 혈액군 (A 군)과 백혈구수가 10,000 개/㎕ 이상인 비건강인혈액군 (B 군)으로 층별하여 각각의 MPO, LTF, ELT와 백혈구수와의 상관성을 해석하였다. 결과를 도 4a 내지 4c와 도 5a 내지 5c에 나타냈다.
해석의 결과, A군에 있어서, MPO와 백혈구수의 상관 계수는 R=0.9336 (y=0.0021x-0.2414)로 매우 높고, LTF와 백혈구수와의 상관 계수 (R=0.7929; y=0.0016x-0.7488) 및 ELT와 백혈구수와의 상관 계수 (R=0.8676; y=0.0017x-1.33) 의 어느 것 보다 높다는 것이 판명되었다. 따라서, 건강인 혈액의 백혈구수를 정량할 경우에는 전혈 중의 MP0를 측정함으로써 가장 정확한 정량치가 얻어진다는 것이 확인되었다.
또한 B군에 있어서도 MPO와 백혈구수의 상관 계수가 R=0.7318로 가장 높았다. 또한 B군에 있어서의 MPO, LTF와 ELT의 각각과 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기를 비교하면 MPO와 백혈구수의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기는 0.0019 (y=0.0019x+0.5678)이고, A군에 있어서의 회귀식의 기울기인 0.0021과 그다지 큰 변화는 보이지 않았다. 한편, B군에 있어서의 LTF와 백혈구수의 상관성을 나타내는 회귀식의 기울기는 O.0OO7 (y=0.0007x+13.447)인데 대하여, A군에 있어서의 회귀식의 기울기는 0.0016이며 B군에 있어서의 기울기는 건강인의 약 2.3 배 정도로 저하되어 있다는 것이 표시되었다. 한편 B군에 있어서의 ELT와 백혈구수의 상관성을 표시하는 회귀식의 기울기는 0.0031 (y=0.0031x-5.4788)인데 대하여 A군에 있어서의 회귀식의 기울기는 0.0017이고, B군에 있어서의 기울기는 약 1.8 배 정도 상승되어 있었다. 또한 폐색성 황달, 급성 췌장염, 급성 담낭염에 걸린 환자에 있어서는 ELT의 측정치는 MPO나 LTF에 비하여 극단적으로 높은 값을 나타내고, ELT 농도와 백혈구수의 상관성을 나타내는 회귀 직선으로부터 크게 벗어나는 경우가 있다는 것이 판명되었다.
따라서, 비건강인 혈액군에 대해서도 백혈구수의 정량은 전혈 중에 용출된 MP0를 측정함으로써 가장 정확한 정량치가 얻어진다는 것이 확인되었다.
<실시예 9>
백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료에 있어서의 MPO 농도와 백혈구수 또는 호중구수와의 상관 관계
외래 환자로부터 얻은 전혈 시료 46 예를 시험의 대상으로 하였다. 백혈구의 용해에 사용하는 계면활성제로서는 트리톤(상품명)X-1OO, 트리톤(상품명)X-114 및 이게팔(상품명)CA630의 3종을 사용하여 실시예 1과 마찬가지로 계면활성제 처리를 하여, MPO 농도는 실시예 2와 동일하게 하여 구하였다. 백혈구수 및 호중구수는 쿨터 GENㆍS 장치 (미국, COULTER ELECTRONICS, INC.사 제품)에 의해 계측하고 MPO 농도와의 상관 계수를 구하였다. 또한 측정수는 3으로 하고 평균 ±표준 편차를 구하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. MPO 농도와 백혈구수와의 상관 계수는 트리톤(상품명)X-114로 r=0.8430 (p＜0.0001) (y=0.0022x+3.324), 트리톤(상품명)X-100로 r=0.9066 (p＜0.0001) (y=0.002x+2.1757), 이게팔(상품명) CA630으로 r=0.9O61 (p＜0.0001) (y=0.0019x+2.4259)이며 매우 양호한 상관 관계가 확인되었다. 따라서 백혈구수 10,O00 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료로 이루어지는 군에 있어서도, MP0농도는 백혈구수를 표시하는 정확한 지표가 된다는 것이 판명되었다.
또한 MPO 농도와 호중구수와의 상관 관계를 도 7에 나타내었다. 상관 계수는 트리톤(상품명)X-114으로 r=0.8789 (p＜0.0001) (y=0.0025x+7.4089), 트리톤(상품명)X-100로 r=O.9364 (p＜0.0001) (y=0.0023x+5.9748), 이게팔(상품명)CA630으로 r=0.9405 (p＜0.0001) (y=0.0022x+6.0951)로 매우 양호한 상관 관계를 나타내고, 모든 상관계수는 백혈구수와의 상관 계수보다 높은 값을 나타낸다. 도 7에 나타내는 것과 같이, 백혈구수가 l0,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료로 이루어지는 군에 있어서도 MPO 농도는 호중구수와 매우 양호한 상관 관계를 나타내고 MPO 농도는 호중구수를 나타내는 정확한 지표가 된다는 것이 판명되었다.
<실시예 10>
MP0농도에 의한 백혈구수/호중구수와, 혈구 계수 장치에 의해 계측되는 백혈구수/호중구수와의 상관 관계
실시예 9에서 사용한 외래 환자로부터 얻은 전혈 시료 46 예를 시험의 대상으로 하였다. 각 전혈 시료의 MPO 농도를 실시예 9와 마찬가지로 측정하였다. 백혈구의 용해에는 트리톤(상품명)X-1OO을 사용하고 MP0 농도는 실시예 2와 동일하게 하여 구하였다. 얻어진 MPO 농도를 실시예 7에서 얻은 백혈구수와 전혈 중의 MPO 농도의 상관성을 나타내는 회귀식 (y=0.0019x+0.6981) (도 2a)에 대입하여 백혈구수를 산출하였다. MP0 농도에 의한 백혈구수와, 쿨터 GENㆍS 장치 (미국, COULTER ELECTRONICS, INC.사 제품)를 사용하여 계측한 백혈구수와의 상관성을 도 8a에 나타내었다.
도 8a로부터 밝혀진 것과 같이, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 백혈구수와혈구 계수 장치에 의해서 계측된 백혈구수는 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료로 이루어지는 군에 있어서도 양호한 상관성(y=1.0333x+777.69; R=0.907)을 나타낸다는 것이 확인되었다. 따라서 전혈 중의 MPO 농도와 백혈구수와의 상관성을 나타내는 회귀식을 미리 구해 두면, 전혈 시료 중의 MPO 농도를 측정하는 것만으로 혈구 계수 장치에 의해 계측되는 백혈구수와 양호한 상관성을 나타내는 백혈구수를 얻을 수 있으며 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는 경우에 있어서도 정확한 값을 얻을 수 있다.
또한 각 전혈 시료의 MPO 농도에 관해서 실시예 7에서 얻은 호중구수와 전혈 중의 MP0 농도의 상관성을 나타내는 회귀식 (y=0.0018x+5.5395) (도 3a)에 대입하여, 호중구수를 산출하였다. MP0 농도에 의한 호중구수와, 쿨터 GENㆍS 장치 (미국, COULTER ELECTRONICS, INC.사 제품)를 사용하여 계측된 호중구수와의 상관성을 도 8b에 나타낸다.
마찬가지로, 도 8b로부터 분명한 것과 같이 본 발명의 방법에 의해서 얻어진 호중구수와 혈구 계수 장치에 의해서 계측되는 호중구수는 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료로 이루어지는 군에 있어서도 양호한 상관 (y=1.2542x+241.85; R=0.936)을 나타낸다는 것이 확인되었다. 따라서 전혈 중의 MP0 농도와 호중구수와의 상관성을 나타내는 회귀식을 미리 구해 두면 전혈 시료 중의 MP0 농도의 측정만으로 혈구 계수 장치에 의해서 계측되는 호중구수와 양호한 상관성을 나타내는 호중구수를 얻을 수 있으며 백혈구수 10,000 개/㎕ 이상의 검체를 포함하는 전혈 시료 중의 호중구수를 정량하는 경우에 있어서도 정확한 값을 얻을 수 있다.
<실시예 11>
동일 시료를 사용한 MPO와 CRP의 측정
백혈구수가 4800인 건강인 혈액 10 ㎖에 11 ％ (w/v)의 트리톤(상품명) X-1OO (미국, SIGMA(등록상표))의 수용액을 1 ㎖ 첨가하여 충분히 혼화한 후, 실온에서 60 분간 방치하여 백혈구를 용해하였다. 얻어진 전혈 시료를 샘플 A라 하였다. 샘플 A의 일부를 취하고, 거기에 MP0 (미국, Elastin Products Co., lNC.사 제품)와 CRP (일본, Oriental 효모사 제품)를 각각의 최종 농도가 l0 ㎍/㎖과 2 ㎍/㎖이 되도록 첨가하여 샘플 B로 하였다. 또한 샘플 A의 일부에 MPO와 CRP를 각각의 최종 농도가 20 ㎍/㎖과 10 ㎍/㎖이 되도록 첨가하여 샘플 C로 하였다. 또한 샘플 A의 일부에 MPO와 CRP를 각각의 최종 농도가 30 ㎍/㎖와 50 ㎍/㎖이 되도록 첨가하여 샘플 D로 하였다.
국제 출원 공개 WO94/03774호 공보에 기재된 표면이 폴리실록산폴리머로 코팅된 실리콘 기판 (미국, Bio Star사 제품)을 10 ㎍/㎖의 토끼 항 인간 MP0 항체 (미국, Calbiochem-Novabiochem Corporation사 제품)의 0.1M HEPES (pH 8.0) 용액, 또는 10 ㎍/㎖의 토끼 항 인간 CRP 항체 (일본, Oriental 효모사 제품)의 0.1 M HEPES (pH 8.0) 용액에 24 시간, 4 ℃로 침지시켜, 항 MPO 항체와 항 CRP 항체를 폴리실록산으로 코팅된 실리콘 기판 표면상에 흡착시켰다. 항체를 흡착한 실리콘 기판을 수세하고 질소 가스를 사용하여 물방울을 제거하여, 그 후 풍건하였다.
상기에서 조제한 샘플 A, B, C, D를 각각 0.1 M HEPES (pH 8.0) 용액으로100배 희석하고, 희석한 용액으로부터 10 ㎕씩 추출하여 30 ㎕의 HRP 결합 항 MPO 항체 용액 또는 30 ㎕의 HRP 결합 항 CRP 항체 용액 (HRP에 의한 항체의 표지는 실시예 2와 마찬가지로 행함)과 에펜도르프 튜브 안에서 혼합하고 10 분간 실온에서 반응시켰다.
각 반응 용액을 30 ㎕ 취하고 상기 항 MPO 항체 또는 항 CRP 항체를 흡착한 실리콘 기판상에 올려, 10 분간 실온에서 방치하였다. 이어서 이 실리콘 기판을 수세하고 질소 가스로써 물방울을 제거한 후에 풍건하여, 바로 TMB fast (미국, Kirkegaard ＆ Perry Laboratories Inc.사 제품) 30 ㎕를 상기 실리콘 기판상에 올려 5 분간 반응시켜 침전층을 형성하였다. 반응 후에 실리콘 기판을 수세하고 질소 가스로써 물방울을 제거한 후에 풍건하여 기판상의 항체에 결합한 단백질을 시각화한 실리콘 기판을 얻었다. 시각화된 단백질의 염색의 정도를, 육안으로 확인하여 약한 순으로 "_", "±", "+", "++", "+++"라고 평가하였다. 그 결과를 표 7에 나타냈다.
샘플(100배 희석) 육안판정결과
MPO 검출 CRP 검출
A - -
B ± +
C + ++
D ++ +++
표 7로부터 밝혀진 것과 같이 전혈 시료를 계면활성제로 처리한 샘플을 사용하여 MPO와 CRP 모두의 측정이 가능하다.
<실시예 12>
실시예 11에서 얻어진 기판상에 침전층을 형성한 실리콘 기판에 대해서 침전층의 두께를 편광판이 고정된 엘립소미터 (입사 각도 70°, 입사측 편광판 각도 20°, 검출측 편광판 각도 10°, He/Ne 레이저) (일본, 시그마 광기사 제품)를 사용하여 측정하고 샘플 중에 포함되는 단백질의 양을 정량하였다. 또한 측정은 10회 하여 평균치를 구하였다. 결과를 표 8에 표시하였다.
샘플(100배 희석) 엘립소미터에 의한 결과 (μW)
MPO 검출 CRP 검출
A 39.10 40.31
B 50.46 70.45
C 66.37 176.74
D 71.36 315.29
표 8로부터 밝혀진 것과 같이, 전혈 시료를 계면활성제로 처리한 샘플을 사용하여 MPO와 CRP 모두의 측정이 가능하다.
본 발명의 백혈구수의 정량 방법을 사용하면, 전혈 시료로부터 혈액 세포를 분리할 필요가 없고, 용이하고 신속하게 전혈 시료 중의 백혈구수 및(또는) 호중구수를 정량하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명의 방법을 사용하면 전혈 시료의 백혈구수와 함께 C 반응성 단백도 동일 시료를 사용하여 정량할 수가 있다. 따라서 본 발명의 방법에 의해서 감염증의 유무나 염증의 중상도를 신속, 간편하고 또한 저비용으로 진단하는 것이 가능해진다.

Claims (15)

  1. (a) 전혈 시료와 계면활성제를 혼합하여 혼합물을 얻고,
    (b) 혼합물을 전혈 시료 중의 백혈구를 용해하여 내인성의 미엘로퍼옥시다아제를 방출시키기에 충분한 시간 방치하고,
    (c) 혼합물 중의 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정하고,
    (d) 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도로부터 전혈 시료 중의 백혈구수를 정량하는
    것을 포함하는 전혈 시료의 백혈구수의 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 측정할 때, 또한 전혈 시료에 포함되는 C 반응성 단백 농도도 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도를 면역학적 수법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 공정 (c)에 있어서, 방출한 미엘로퍼옥시다아제의 농도와 C 반응성 단백 농도를 면역학적 수법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 면역학적 수법이 효소 면역 측정법인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 면역학적 수법이 광학적 면역 측정법인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 비이온성 계면활성제의 친수성ㆍ친지성 밸런스 (HLB) 값이 12 내지 14인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 포화 또는 불포화 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 골격을 갖는 비이온성 계면활성제, 불포화 지방족 탄화수소가 결합한 폴리에틸렌옥시드 화합물인 비이온성 계면활성제 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르 골격을 갖는 비이온성 계면활성제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 비이온성 계면활성제가, 트리톤(Triton, 상품명)X-114, 트리톤(상품명)X-100, 이게팔(Igepal, 상품명) CA630, 닛산 비이온(Nissan Nonion) NS-208.5, 닛산 디스판올(Nissan Dispanol) TOC, 브리즈(Brij, 상품명)97 및 브리즈(상품명) 56으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 디데실디메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 옥타데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실암모늄브로마이드, 도데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄클로라이드, 헥사데실피리디늄브로마이드, 1-라우릴피리디늄클로라이드 및 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 양이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전혈 시료와 혼합하는 계면활성제의 양이 혼합물 중의 농도로서 0.2 내지 10 ％ (w/v)의 범위내인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (b)에 있어서, 혼합물을방치하는 시간이 1 시간 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구수가 호중구수인 것을 특징으로 하는 방법.
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