JPH05506314A - 生物学的結合の光学的検出に使用する試験表面の製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生物学的結合の光学的検出に使用する試験表面の製造方法［発明の分野］ 生物学的に意味のある相互作用する種の反応の計量化において使用する薄塗膜検 出法は、視覚的に判断する場合でも、機器を使って調べる場合でも、試験表面の 十分に濃密で反応を受容する物質がないことに長く苦しんでいた。

この発明は薄塗膜検出法のための試験表面の製造に関する。この発明はさらに、 試験表面の表面特性を調べる方法にも関する。具体的に、この発明は、種々の分 析物の検出のための様々な試験が安価に製造されるような、非常に多様な受容物 質を試験表面に確保させるような試験表面の製造方法に関する。光学的検出と組 合わせて使う試験表面は、特定の分析物の検出に非常に感受性のある状態を形成 する。

この発明は、スライド、ウェファ−１または平ら、円筒状、連続した、または他 の形や構造をもつ他の台や物の表層を形成する固相基質上に固定された限定され た表面部の薄い化学膜の形で製造される特に感受性の高い表面に関する。特定反 応相は、大気または水質汚染測定、免疫分析または相互作用する種を含む他の固 相発生のような検出または測定を含むがそれに限られない種々の機能を提供する ことができ、光学、音響学、電気、電気化学またはその他の型の筐接薄塗膜測定 法を使っている。

この発明はさらに、装置の性能を最適にするために、特定の反応層を試験表面の 基質に媒介的に結合する物質の層を作る方法に関する。具体的に、この発明は、 表面に固定された反応物質の密度、安定性および生存度の調節ができる物質を最 適化する検査の中間層を利用する方法に関わる。

［発明の背景］ 周表面に固定された薄塗膜の様々な物理的化学的特性を調節する能力は、半導体 から診断産業まで種々の産業に不可決であることがわかった。例えば、半導体に おいては、シリコン・ウェファ−上の物質を絶縁、半導または伝導する薄塗膜の 厚さおよび均一性が、ウェファ−に埋め込まれた組み込み回路の性能を最適化す るよう調節されねばならない。診断産業においては、固定された受容物質（また は場合によっては酵素）の密度および安定性を分析試験表面または装置の性能を 最適化するように調節されねばならない。

開発および製造における一定の薄塗膜特性の調節が様々な製品や装置や全産業を も可能にする一方で、これらの特性の調節における限界と他の薄塗膜特性を調節 する確立された技術がないことによって、多くの重要な科学技術の発達や市場化 が遅れてきた。これらの科学技術の中には、インビトロでの診断、インビボでの 測定、または他の用途に、固相上の受容物質に特異的に結合している分析物の量 によって変わる濃度を、標識を使用せずに、直接測定する固相測定法を含むが、 それだけに限られない。これらおよび他の潜在的または発現している科学技術は 、それらが使用し得る薄い反応膜の巨視的および／または微視的表面部において 、またこれらの膜との非特異的相互作用に対する耐性において厳しい予知できな い限界をもっていることが多い。薄塗膜工学における最新技術は概して、前記で 挙げたような科学技術に要求される感受性または反応性および特異性を確保する のに適した固定化および結合計画を提供するものではない。

適切な１例は、直接固相測定のために半導体産業で用いられているような直接薄 塗膜測定システムを適用することの難しさである。例えば楕円偏光法、多角反射 法、干渉分光法、および様々な他の形態または旋光法、反射法、分光法、および 分光測光法の組合せを含む多（の光学的薄塗膜測定技法が、半導体および集積回 路産業で、研究開発、製品開発に、また、シリコンまたは他の物質から成るウェ ファ−の表面に作られる薄塗膜層の厚みおよび均質性の品質管理に、広く適用さ れてきた。適切に選択された受容物質の表面でのこのアナライトの濃度依存固定 化によってできた薄塗膜の厚み、密度、または質量における変化の検出または測 定に、この技術を適用することに対する関心が高まってきた。このような薄塗膜 分析技法は、それらがこの物質を直接検出するかまたは計量化するので、このア ナライトの濃度依存固定化の質的量的指標として放射性、酵素性、蛍光性、発光 性標識の間接測定または検出にそれらが依存する結果、要求される正確さまたは 便利さを犠牲にすることがあまりに頻繁である従来の固相分析に代わるものとし て有望である。薄塗膜分析技法の潜在的利点は評価されることが多いが、前記で 示された種類の薄塗膜工作問題は、診断または他の分析市場に適した試験道具の 開発を妨げてきた。１つの問題は、従来の固相分析に特徴的な微視的に回旋され た表面に比べて薄塗膜分析で一般に使用される試験膜の非常に限定された巨視的 および／または微視的表面部に関するものである。たいていの場合、基質を連続 固相分析で均等に被覆する必要がある。たいていの場合、受容物質を反射基質の 毒性効果から保護する物質の連続中間層で基質を被覆する必要がある。

従来の固相分析において、配位子分子固定化に利用できるより大きな微視的表面 部と結合した、微量滴定圧または管の被覆された内部表面に関するような、一般 に使用されるより大きな試験表面は、かなりの数の配位子分子が、配位子被覆の 希薄さ、その生存率の減少、その他の起こり得る受容物質の配向の欠失を補うた めに、固定化されるようにする。他方、直接薄塗膜分析においては、有効な試験 表面部での厳しい制限のために、適切な感度が得られるならば、受容物質の密度 、生存度、利用可能性、および安定性を最高、最適にするよう設計された特別な 物質と方法の利用または開発が要求される。

薄塗膜分析のもう１つの問題が、受容物質上に光学的制限のある楕円偏光法、干 渉分析法、光散乱法、全内部反射法、または他の反射測定法などの光学的分析の 特別な場合で起る。分析に使用する受容物質がこのような光学的基質に直接に付 着している場合、基質は受容物質に毒性または早春性の効果を与えることができ る。このことは、基質が、それらの生存度を縮小するかまたは破壊する多くの配 位子分子の立体配座または化学構造を変え得るということになる。配位子として 使用されることの多い生物学的物質および他の高分子は特にこのような毒性効果 を受け易い。これは、薄塗膜試験表面における表面部の制限という観点から重要 な問題である。

生物学的分子の保持のためにケイ素物質を適用する最初の作業の大部分がアフィ ニティークロマトグラフィーおよびシリカ（ＳｉＯｚ）ゲルおよびガラスなどの それに関連する支持体に集中した。

シリカの生体分子に対する最初の活性化は、シランによる処！によって達成され た。シランを適用するのに使用される方法に関係なく、シラン化は、化学的方法 によって生体分子を付着することができる官能基を導入することができる。シラ ンによって導入された官能基に生体分子を付着するのに利用できる多種の化学が ある。これらの技術は、バイオセンサーの製造に広く利用されてきた。従来の技 術により一般的に使用されるシランの１つは、Ｎ−（２−アミノエチル−（３− アミノブロピル）−トリアルコキシシランである。

それに続く生体付着の支持体または基質としてシリコンがシリカに代わる場合、 従来のシラン化過程は、目的の特性を与えるのに不適切である。シランは、表面 に付着するためにシラノールの存在を必要とする。シラノールの密度が固定化反 応に必要な官能基の水準を生むのに不十分であるとき、不十分な受容物質が試験 表面に付着されるであろう。シリカおよび多くのガラスは本質的に高いシラノー ル含有量を持つかまたは与えるように処置され得る。シリコンもまた、生体分子 に有毒なまたは有害なシリカまたはガラスで見られない表面効果を導入する。従 来のシラン化過程はまた、廃棄を必要とする有害な廃棄物質を生み出し、多くの 場合、その過程はチェックしたり調節したりするのに長くかかり困難である。

バイオアッセイ試験表面の製造によって起るシラン化とそれに続く化学過程を避 けるために色々な方法が取り入れられてきた。例えば、米国特許第４１６９１３ ８号は、抗体官能性、即ち支持体または基質を抗体密度（質量）を改善する生体 高分子で被覆することによって反応密度を改善することを試みているが、それは 明かに分析性能を改善することができる。この技法は、試験表面の製造において 非常に限られた有用性をもつ。

アビジンおよびビオチンの使用を含む様々なスペーシングおよび／または連結法 が、表面に関する抗体の分離および／または部位特異的結合によって抗体配位子 の利用可能性を増進することが知られている。（例えば、ジャーナル・オブ・イ ムノロジカル・メンズ、７１巻（１９８４年）、１３３−１４０頁、ジャーナル ・オブ・イムノアッセイ、６号、１＆２巻（１９８５年）　、６フ一７７頁、ジ ャーナル・オブ・イムノロジカル・メンズ、８２巻（１９８５年）　、２１５− ２２４頁、バイオクロマトグラフィー、３．４巻（１９８８年）、１５６−１６ ０頁、に書かれているようなものである。） 高分子での固体基質の被覆はまた、配位子または受容物質のそれに続（付着にも 利用されてきた。この方法において最も強調されることは、生体分子をプラスチ ックまたはガラスと共有的に結合することのできる表面を製造することであった 。代表的な従来の技術は、米国特許第４３５４８８４号、米国特許第４３５７１ ４２号、米国特許４４４４８７９号、米国特許４４１５６６５号、米国特許４６ ２３６２９号、米国特許４７２４２０７号、または米国特許４３６３６３４号を 含む。これらの高分子は、生物学的または合成的由来である。代表的な物質には コポリマー、光活性化高分子、タンパク質、多糖類、ポリアミドが含まれる。

米国特許第４５９１５５０号および米国特許４８４９３３０号、は、ドープ処理 したシリコン基質を、後の電気化学またはインピーダンス酵素低下検出法におけ る生体分子の共有固定化のために脂質二重層で被覆することを記載している。

これらの方法のいずれもが分析物に適合する直接光学的検出試験表面または表面 の製造を適切に述べていなかった。直接光学的検出は、光学的干渉効果（反射測 光により視覚的に調べられるかまたは測定される。）、楕円偏光法、干渉分光法 、プロフィロメトリー、吸着、または透過測定法などの薄塗膜測定法、および表 面プラスモン共鴨方法を含む。

理想的には、光学的検出方法には表面活性技術が、安定性のために表面の共有結 合修飾を与え、基質の表面に非常に濃密で均一または調和した膜をもたらす。

場合によっては共有付着のない強力に吸着した立体配座の膜が適切であり得る。

シリコンなどの適当な基質、巨視的な平面、均一な光学ガラス、金属ガラスおよ びプラスチック、または光学的な層で被覆されているまたはいないプラスチック （即ち、５ｉＯ１Ｓｉ０２、ＳｉＮ、など）は、共有付着に利用できる反応基の 欠点を共有する。一度遍用された表面修飾層は、濃密で機能的で安定した生体分 子層の共有または吸収付着を支える環境を提供する。中間層として作られたこの 表面修飾層または障壁は基質の毒性効果から生体分子層を隔絶するのに十分な厚 みまたは密度をもたねばならない。配位子または受容物質は、抗原／抗体、酵素 ／基質、オリゴヌクレオチド／ＤＮＡ、キレータ−／金属、酵素／阻害剤、細菌 ／受容体、ウィルス／受容体、ホルモン／受容体、ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはＲＮ Ａ／ＲＮＡを含み得るがそれに限られない相互作用する種の基の１つおよびこれ らの種のいずれかと別の種との結合および他の非生物学的種の相互作用として定 義される。

物質の３つの新規な型をこの試験表面の製造に使用することができる。非線形分 枝高分子シロキサンは基質の共有付着の要求を満たし、濃密で反応性のある、安 定した膜中の受容物質を付着させる。これらの高分子は、典型的に、多（の異な る機能性を提供し得る２−３の分枝点を含む。その中にはアミノアルキル、カル ボキシプロピル、クロロプロピル、メルカプトプロピル、フェネチル、フエネチ ルスルフォナート、ビニル、およびメタクリルオキシプロピルが含まれている。

これらの物質の代表的な適用は、織物の防水処置、ナイロン製造のための内部か び除外剤、皮仕上げ、洗剤耐性研磨製剤、コンタクトレンズ製造（米国特許第４ ２０８５０６号）、ポリウレタンフォーム製造製剤（米国特許再３５３０１５９ 号）、および用具の遊離被覆（米国特許第４３６９２６８号）を含む。シランの 複合もまた、線形シラン上に分枝点を作るのに使用され得る。しかし、このよう な多くの段階方法は製造にとってあまり魅力をもつものではない。シランが、１ つの方法中で分枝点を生み出すのに使用され得ることは考えられることである。

これらの物質は受容物質の共有または受動付着に使用され得る。

これらの試験表面の製造に有用性を示す物質の第二の群は、一般にスチレン／ポ リブタジェン混合物から成るコポリマー、立体配座または表面賦活剤粒子である 。これらの調剤は、溶液では大規模な架橋の不足が表面または乾燥時のそれらの 微粒子の性質の保持を妨げるので、粒子の形である。これらの膜形成微粒子は、 接着剤および塗料の製造に広く使用されてきた。代表的な従来の技術は、米国特 許第３８３６３３７号、米国特許第４６９３７７２号、米国特許第４８３５２１ １号、米国特許第４６８３２６９号、米国特許４３９１９２８号、米国特許４９ ２５８９３号、米Ｓ特許４９０２７３３号、米Ｃｉｌ特許４６８３２６０号、米 国特許３９６２１６７号、米国特許４８０６４５１号、米国特許４７８１９４８ 号、米国特許４６５２６０３号、米国特許４６３６４３７号、米国特許４５３７ ９２６号、米国特許４５１０２０４号、米国特許４３６１６６９号、米国特許４ ２６８５４９号、および米国特許４１５６６６４号である。

この型の表面の製造に使用できることがわかった化合物の別の部類は、デンドリ マー、またはＭ型ポリマー、または分子自己集合ポリマーである。これらのポリ マーは、解乳化剤、湿潤剤、電子顕微鏡の分析標準、プロトン捕捉剤として、お よび塗料の粘着性を変調させるのに多くの有用性をもってきた。代表的なこれま での技術は、 米国特許第４４３５５４８号、米国特許第４５０７４６６号、米国特許第４５５ ８１２０号、米国特許第４５６８７３７号、米国特許第４５８７３２９号を含む 。

［発明の要約］ この発明の目的の１つは、直接薄！？膜検出法における用途の広い試験表面を提 供することである。

この発明の別の目的は、受容物質の結合に都合のよい環境を提供する一方で光相 互作用物質から形成され得る試験表面を提供することである。

この発明の別の目的は、受容物質の濃密で生存可能な層で容易に有効に組み立て られ得る試験表面を提供することである。

この発明の別の目的は、受容物質が様々な固定化化学物質によって試験表面に受 動的に吸着されるかまたは共有的に付着されるようにすることである。

この発明の別の目的は、試験表面の製造をより容易により費用効率的にすること である。

この発明の１つの目的は、高い感受性をもつ試験表面を光学的に測定され得る低 水準のアナライトにすることである。

この発明のさらに別の目的は、受容物質の機能性および安定性を改善することで ある。

この発明のさらに別の目的は、薄塗膜検出または測定技術の光学的またはその他 の発見を用いる相互作用活性析での使用のために受容物質の試験表面への仲介結 合の全般的な方法を教えることである。

前記の目的は、この分析物と相互作用し、その際質量の変化が検出可能な信号に なる、受容物質がそれに固着している付着中間層を含む多層を支持する光反射基 質を含む薄塗膜可視検出装置の形のこの発明の具体例によって満たされる。別の 具体例において、この発明は、免疫学的活性物質の付着層を支えるプラナ−反射 物質の基質を含む免疫分析装置の形をとり、この付着層は様々な水準の相互作用 活性をもつ。

基質はプラナ−反射物質から成り得、付着層とともに反射により楕円偏光法的に 放射を分極することができる。

相互作用活性の水準は変化し得る。

この発明の別の具体例において、その上の第二の層への親和力をもつ第一の層を 支える光反射基質を含む、楕円偏光法で分極された光を反射することができる薄 塗膜分析装置が提供されているが、この第二の層は、この分析物と相互作用する ことができる物質から成り、この第二の層の相対的な厚みは、この第一の層の厚 みより少ない。

記載された分析装！は楕円偏光計および前記の装置を含む楕円偏光免疫分析法で 使用され得ることは理解されるだろう。

この発明のさらに別の目的は、この第二の層の相互作用のあとの相対的な厚みが 第一の層の厚みより少ないようなこのアナライトと反応することができる物質を 含む第二の層に親和力をもつ第一の層を支える光反射基質をもつ薄塗膜検出法を 提供する段階を含む、培地中のこのアナライトを検出する方法に関する。

この発明は、同定化、計量化、または分離のための、血清または他の体液、水、 空気、土壌などを含む様々な組成物の固体、液体または気体の試料からのアナラ イトの、どんな機構によるのであれ、直接選択結合、または付着のための新規組 成物、新規方法、物を含む。この発明は、広義に、中間層で被覆された基質およ び、その中でそれに付着した高水準の生存可能な受容物質をもつ分析装置が形成 されている中間層に固着している受容物質を利用している。受容物質は、従来の 技術で既知の標識の使用なしに薄塗膜変化がもたらされている試料からのアナラ イトと直接相互作用するように適用されている。薄塗膜または光学的厚み（質量 ）における変化は、分析の感受性を増す光学的検出法によって検出され得る。

この発明は、基質から成る装置または視覚的検出装置である。この基質は光反射 物質から形成されねばならない。基質は、受容物質を基質にとって好ましくない 環境から分離し、その上に受容物質が付着され得る好環境を形成するように機能 する物質の層で被覆されている。受容物質はこの層の表面に、多種の固定化化学 物質または層の組成物の機能としての受動付着によって、固定化され得る。この 中間層によってもたらされた好環境によって受容物質は反応性、安定性、および 相互作用活性を増進した。受容物質は、高度の特異性をもつ試料における特異的 アナライトと相互作用するよう選択される。

試験表面を形成するために、所望により抗反射物質で被覆されていてもよい基質 （視覚的試験表面の場合）、物質の中間層、および受容物質が選択されなければ ならない。機器分析において、使用される検出法の型が、基質が反射、透過、ま たは吸着性であるかどうかを決定する。好ましい具体例において、機器検出法は 、楕円偏光計、干渉計、または他の薄塗膜測定法を用いる。これらの機器は基質 が反射性であることを要求する。遍切な基質物質が選択された後、基質を中間物 質の層および受容物質の層で被覆する。中間層は基質に、選択された受容物質の 生存率と定着に好適なミクロ環境を与える。

物質の中間層の表面に固着された受容物質はアナライトまたはこの発明のアナラ イトに相互作用する能力を特徴とする。受容物質として使用され得る物質の種類 は、二番目のパートナ−と選択的に相互作用するであろう物質の型によってのみ 限定される。受容物質の全部類に含まれ得る物質のサブクラスは、毒素、抗体、 抗原、ホルモン受容体、寄生体、細胞、ハプテン、代謝物、アレルゲン、核酸、 核物質、自己抗体、血液タンパク質、細胞破片、酵素、組織タンパク質、酵素基 質、補酵素、および神経伝達物質、ウィルス、ウィルス粒子、微生物、金属、お よび様々な化学品を含む。このリストは、薄塗膜分析法を生み出す中間層上に被 覆され得る多種の物質の１部のみを含んでいる。この発明の選択されたアナライ トが何であれ、受容物質はこの発明のアナライトと特異的に相互作用するように 作られる。この発明のアナライトのマトリックスは、それが液体、固体、または 気体、粘液、唾液、尿、排泄物などの体液、組織、骨髄、大脳液、または汗であ っても、受容物質が試料内のこの特異なアナライトとのみ相互作用し、残りの試 料マトリックスは試験表面から分離されるので、この発明の有用性を制限しない 。

受容物質を付着した物質の中間層で被覆された基質から形成される試験表面は、 この発明のアナライトを含むと思われる試料と接触する。試料が表面と接触した 後、機器をアナライトの相互作用を検出するのに使用することができる。使用さ れ得る１つのこのような機器はサガックス楕円偏光計である（米国特許第４３３ ２４７６号、米国特許第４６５５５９５号、４６４７２０７号および４５５８０ １２号であるが、この開示は、この明細書に全部含まれており、この明細書の１ 部を成す）。

この発明は薄塗膜測定法、主に光学的検出法中で使用される試験表面の製造に焦 点を合わせている。この発明は、このような試験表面を製造するのに使用される 物質および製造方法を記載している。

［図の簡単な説明コ 図１は製造された試験表面を表わし、基質、中間層、および受容物質を示す。

図２はアナライトと反応させた、製造された試験表面を表わす。

図３は、抗反射物質で被覆された試験表面および受容物質の添加の前の物質の中 間層を表わす。

図４は、アナライトと反応させたものと反応させていない試験表面の部分を示す 製造された試験表面の反応した部分を表わす。

図５は、アナライトが二番目の要素に結合した反応していない部分を含む製造さ れた試験表面の反応部分の２つの視点を表わす。

図６は図５の最高視点である。

［発明の詳細な説明コ 下記は、予備被覆された装置６０を形成するための物質２０の中間層および受容 物質５０で基質１０を被覆する方法を含むこの発明の説明である。試料中にみら れるアナライト７０を分析する方法、および試験表面６０に結合したアナライト の量を検出し測定する方法も示している。（また、高い感受性をもった正確な結 果を与えるよう変形され改善された機器も示されている。）装置を製造する方法 は、提示された例の中で選択された特異的な物質に限られていない。装置の要素 のそれぞれに挙げられる特異的な規準に合うものであればどんな化合物でも、こ の明細書で次に記す方法を少し修正することによって利用することができる。

基質１０および受容物質５０の間の中間層物質の使用は試料と反応し得る新規の 高い感受性をもつ分析をもたらす。試料アナライト濃度は薄塗膜機器によってま たは視覚的に検出することができる。楕円偏光計、干渉計、反射計、比色計、旋 光計、などとともに試験表面を使用することによって、結合アナライト７０の微 量の検出をすることができる。中間層物質２０の試験表面６０への添加により、 試験表面実施が改良される。中間層物質２０によってもたらされた特異的利点は 、生存可能な受容物質の高密度の被覆、相互作用活性の増大、受容物質とアナラ イト間の反応性の増進および受容物質の安定性の増大である。

基質物質、中間層物質および受容物質の無数の組合せを、多くのアナライトに対 する試験表面を作るのに使用することができる。各アナライト特異的試験表面は 、多くの別のマトリックス依存分析法に使用することができる。基質と中間層の 間に抗反射層を組み込むことによって、試験表面を直接視覚検出の干渉色法に合 わせることができる。この発明の機器を使用しない好ましい具体例において、サ ガックス・インターフィアレンス・スライド米国特許第４５５８０１２号を、色 干渉試験に利用することができる。調整された抗反射層の必要性なしに、試験表 面は、様々に異なる光学機器とともに、質的、半数量的、または数量的分析装置 の基を与えることができる。好ましいこの発明の機器の具体例において、試験表 面はサガックス楕円偏光計で読み取られる。

下記は、パラメーターおよび中間層物質２０と受容物質５０で被覆された試験表 面６０を形成するのに必要な情報である。話を簡単にするために、被覆されてい ない支持体を基質１０と呼ぶ。中間層物質２０で被覆された基質１０をＬ−被覆 基質４０と呼ぶ。受容物質５０が付着したし一被覆基質４０をＲ−被覆基質６０ または試験表面６０と呼ぶ。

この発明は多様な基質型を提供する。基質は、末端使用者がめる分析の性質に依 って、固体の支持体、柔軟な、または半柔軟な支持体、薄塗膜またはゲルであり 得る。さらに、ガラスまたはプラスチックなどの支持体物質に基質物質を被覆す ることによって、分析試験表面を製造するコストを減らし得る。基質は、それが 適当な反射特性をもつために光学的属性と、適当な中間層２０で被覆される可能 性とで選択される。視覚的に読まれた薄！！！腹千渉効果は、基質が反射的であ ることを要求し、抗反射中間層物質２０で被覆されたものは、障壁付着として働 くので従来の技術より有利である。薄塗膜金属用に十分反射する表面をもつ多く の基質は、鉄、スティンレススチール、ニッケル、コバルト、亜鉛、金、銅、ア ルミニウム、銀、チタニウム、ビスマス、およびその合金を含むがこれらに限ら れない。非金属の例は、シリコン、ゲルマニウム、亜ヒ酸塩、炭素、ケイ酸塩、 アルミン酸塩などである。これらの型の物質は、受容物質、特に抗体、抗原、酵 素などの生物学的受容物質に毒性のある表面環境をもつことが多い。

これらの例はシリコンウェファ−基質として使用するが、様々な基質物質を使用 することができること予期される。例中の基質は、ウェファ−を作るようダイア モンド裁断され、次にＫＯＨ中でＡ帯エツチングに処された後より滑らかな表面 を作るために■帯エツチングされる、シリコン結晶から形成される。ウェファ− の１表面は、正反射表面をもつ滑らかな鏡のような仕上がりになるよう磨かれる 。逆表面は、高さ２００−３００ｎｍのわずかな凸凹があり、それが散乱する反 射表面を作っている。ウェファ−のどちらの面も、平らな側の方が機器での検出 には好まれるが、使用することができる。半導体産業には拒まれるシリコンウェ ファ−は、この発明において使用され得、それによって分析製造コストを減らす ことができる。シリコンウェファ−中のドパントの水準と型はこの発明には無関 係である。

基質物質は、それが機器が検出するシグナルを生み出すのに十分反射的で均一で あるか、また高分子受容物質を支持することができるかによって選択される。

透過基質が様々な型の機器で使用され得ることは予期される。さらに、エツチン グされたグリッド線をもつ基質を光分散系で使用することができる。いくつかの 基質それ自体が高分子物質から形成され得る場合があることが注目されてきた。

これらの高分子物質は、選択された機器中でシグナルを作るのに十分に反射的な かなり均一の表面をもたねばならない。

図１に示されているように、基質１０は、別の物質を支持するのに適用される上 部表面１５をもつ。この上部表面１５は、シグナルの製造に必要な光学的特徴を もつ。上部表面１５は、金属および合金またはシリコンなどによって生まれる光 反射表面を持たねばならない。上部表面１５に固着されるのは物質２０の中間層 である。中間層物質２０は、受容物質にとって都合のよいミクロ環境をもたらし 、受容物質の濃密な生存可能な層を作らせる物質であればどんな物質も使用でき るが、通常高分子物質である。

中間層２０を前記の３部類の物質の１つ以上を適用することによって製造するこ とができる。即ち、分枝シロキサン、デンドリマー、または膜形成コポリマー（ 表面活性剤）である。これらの物質の各々は、様々な機構によって基質１０に付 着する。シロキサンは、共有的に基質１０を変形し、他の物質は薄い層に裂ける ことなく表面に簡単に付着し、大部分の機械操作に対して安定している。高分子 を基質に被覆する方法は、半導体の技術者にはよ（知られている。しかし、診断 ビジネスではあまり知られていない。実施例中に示されている高分子被覆法は、 実証のために提示されているのであって、発明の範囲を制限するものではない。

高分子物質がスピン被覆、エーロゾル散布、浸漬、などによって付着され得るこ とは考えられる。被覆の方法は、使用される中間層物質２０の型に合わせること 必要ではないが、目的とする属性をもつ別の物質をＬ−被覆基質４０に固着させ ることができる。この層は、抗体を適応させるのにプロティンＡまたはプロティ ンＧを使用する場合のように、受容物質５０の適応性を増進することができた。

使用され得る他の物質は、アビジン−ビオチン、合成または組み替えプロティン Ａ／プロティンＧフラグメントまたはペプチドまたは結合Ａ／Ｇペプチドなどを 好ましい具体例において、中間物質は同じ方法でスピン被覆されるかまたはエー ロゾル被覆される。様々な中間物質が、５オングストロームから５００オングス トロームの間の厚みで基質に被覆されるとき（より厚い量も使用できる）、分析 試験表面に先に挙げた利点を与える。層は下記の機能をもち、下記の特性をもつ 物質で形成され得る。即ち、受容物質に好適な環境を作る、受容物質を費用効果 的な方法によって作用部分に密接に結合させる、低い非特異的相互作用を示す、 基質１０に共有的または緊密に付着する、および基質に均一ではあるが必ずしも 連続的ではなく被覆され得る、というものである。中間層２０を型の中の基質上 におくことができる。型取りは光散乱検出法で使用され得るかまたは、プラス／ マイナスフグナルを作るのにもちいられ得るかまたは、情報を与えるバーコード などとして作られ得る。基質を高分子物質で型取る方法は半導体分野の技術者に 知られている。

図１−３に示されているように、中間層物質２０は上部基質表面１５に付着され た下部表面１８をもつ。下部表面１８は基質１０ど適合するよう変えられる。

高分子物質２０もまた、受容物質５０に付着するよう適用される上部高分子表面 ３５をもつ。基質１０上に被覆された層物質２０は、Ｌ−被覆試験表面４０を形 成する。Ｌ−被覆試験表面４０は通常安定性があり、受容物質５０で被覆する前 に貯蔵され得る。

中間層物質が、Ｌ−被覆基質を形成する基質に被覆された後で、硬化期間を要す る。選択された受容物質の適用の前に硬化する期間が与えられた場合、Ｔ−高分 子シロキサンは最もよく働くということは注目されてきた。受容物質は相互作用 する種の中の１パートナ−である。先に述べたように、相互作用する種は、２つ の化学官能基、抗原−抗体、ホルモン−受容体、毒素−受容体、酵素−基質、Ｄ Ｎ、Ａ−ＤＮＡ、ウィルス−受容体、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどであ 受容物質を層物質に付着する固定化化学はＬ−被覆基質および受容物質の両方の 属性をもとに選択される。受容物質は共有的にまたは受動的に中間層物質に付着 され得る。中間層物質を共有付着に特異的に適用するとき、固定化の１段階は活 性化化学によって中間層物質を活性化することである。様々な活性化および連結 方法を使用することができる。しかし、通常、受容物質を受動的にＬ−被覆試験 表面に吸着するには十分であり、固定化化学法の時間と費用を避けることになる 。受容物質が受動的にまたは共有的に中間層物質に付着されるかどうかには関係 なく、受容物質の厚みは通常中間層物置の厚みより少ない。

パートナ−と相互作用する受容物質の能力（即ちその相互作用活性）は、通常、 受容物質が、基質それ自体に付着するかわりにＬ−被覆基質に付着したときに増 す。ンラン化されたシリコンウェファ−上に被覆された受容物質の密度。動的範 囲における増加は、試験表面上により多（の受容物質結合部位をもつことによっ てもたらされる。

いくつかの分析試験表面において、受容物質が結合された後、Ｒ−被覆試験表面 が完成する。しかし、遮断法を行なうことが望ましい。遮断法は２つの機能を助 ける。即ち、Ｒ−被覆試験表面の安定性を増大し、非特異的相互作用を減少させ る。二番目の特徴は、Ｒ−被覆試験表面を遮断する主な理由である。カゼイン、 ポルチンまたはウシまたはヒト血清アルブミン、ミルク、減成ゼラチン等の当技 術の熟練者に知られた様々な遮断剤が非特異的相互作用を妨げるのに使用される 。

遮断剤は、通常遮断剤を選択するときに言われる様々な他の要因とともに、使用 される受容物質および試料マトリックスに基づいて選択される。

Ｒ被覆試験表面は遮断された後、アナライト検出試験キットで使用され得る。

試験キットはＲ被覆試験表面、検量針、正負の対照（定量キットのための）必要 な機器の検量説明書、および（所望により）試料調剤および／または希釈液を含 む。最も薄い膜の分析を行なうためのプロトコルは、ＲＩＡまたはＥＩＡなどの 従来の固相分析のそれよりずっと簡単である。マトリックス、血液、尿、血漿、 血清、水溶液、大脳液、髄液、粘液などの中の試料を試験表面との接触のために （必要ならば）製造する。この製造段階は、細胞分離のような方法、第二の試薬 の添加、試料希釈剤の添加などであり得る。次に製造または非製造試料を試験表 面と接触させる。

図１−５の受容物質５０およびアナライト７０の大きさは測っていない。これら ２つの要素は、この説明を分かりやすくするために拡大している。実際の大きさ では、受容物質およびアナライト賀の厚みは、通常被覆２０より薄い。アナライ ト７０と反応する試験表面６０の部分は前景１００と呼ばれ、試料と接触しない 試験表面の部分は背景と呼ばれる。図２は、前景１００のみを描いている。試験 表面に確保された受容物質５０は相互作用種の１部分である。相互作用種の他の 部分、アナライト７０は、図４で示される試料中にあると思われる。試料を、Ｒ 被覆試験表面６０と接触させ、アナライト７０を受容物質５０上の活性部分に相 互作用する。相互作用は、Ｒ被覆試験表面６０の表面の質量中に変化を起こす。

この光学的質量変化は光干渉効果によって視覚的に検出されるかまたは機器によ つ０を形成する基質１０に付着している。Ｌ被覆試験表面４０は、Ｒ被覆試験表 面６０を形成する受容物質５０の受動的に吸着するかまたは共有的に付着した層 をもつ。図５に描かれている試験表面６０の部分は前景１００または反応部分で ある。受容物質５０はこのアナライト７０を結合した。試料溶液が製造されたと き、アナライト７０は第二試薬８０と結合した。したがって、より大きな質量変 化がアナライト７０および第二試薬８０によって試験表面６０上に生ずる。使用 される増幅勧賞は受容物質５０およびアナライト７０の間の相互作用に逆に影響 してはならないし、検出可能なシグナルを生み出すのに十分に表面の質量変化を 増加させねばならない。

必要な製造の後、試料を試験表面の表面と接触させ、アナライトの試験表面上の 受容物質への相互作用をさせる短いインキュベーン３ン期間を与える。試料を離 れた粒子を除去するためにすすぎ、圧縮空気または窒素のような気体流の下で（ 所望により）乾燥する。すすぎ、乾燥する段階は手、または試験表面装置ホルダ ーまたはこれらの機能をはだすために適用された機器の一部により行なわれ得る 。

実施例Ｉ　Ｌ−被覆基質の製造 種々の中間層の材料についてここに与えられた名称を全編にわたり使用する。

中間層材料： ＃１：ＰＥＩ　−（トリメトキシシリルプロピル）ポリエチレンイミン＃２　： 　ＰＥＩ／ＤＭＤＣ５−上記物質↓ジメチルジクロロシラン＃３：ポリスチレン ＄ｔ４：ＭＳＡ　−スターバースト：第５世代＃５：Ｔ−ポリマー　−アミノア ルキル　Ｔ−構造分枝点ポリジメチルシロキサン ＃６：ＴＣ７Ａ ＄７：ＤＭＤＰＳ　−ジメチルジフェニル　シロキサン共重合体＃８：メルカブ ト　−　メルカプトプロピルメチルジメチル−シロキサン共重合体 ＃９：ＢＡＳ　−Ｎ−（２−アミノエチル−３−アミノプロピル）−トリメトキ シシラン ＃１０：ＰＢＤ　−トリエトキシシリル修飾ポリブタジェン＃１１：ＰＡＰＤＳ 　−（メチルフェニル）メチルドデシル−メチル−アミノプロピル−メチル　シ ロキサン 基質への中間層材料の適用： ＃１：ＰＥＩ（ベトラーク：ブリストル、ＰＡ）メタノール中保存ンランの１： ５００希釈。当業者には自動化されたエアロゾルまたは噴霧デリバリ−系が知ら れているが、この溶液３００μｍの試料をマイクロピペットにより１００ｍｍの 清浄な被験ソリコンウェーッ１−上に置き、このウェーハーをフォトレジスト回 転被覆機上で７０００ｒｐｍで回転させた。半導体産業において広く利用されて いるこの回転被覆機は、極めて均一な等角の膜を作り出す。これは多数の基質を 迅速に処理でき、容易に自動化される。本明細書中、回転被覆を詳細に説明する が、本発明をこのし一被覆基質の製造の型に限定する意図はない。代わりとなる 、溶媒を基礎とする沈澱（溶液または真空）は、当業者により容易に設計するこ とができるであろう。さらに、本明細書に記載されるクラスの材料は、受容材料 の基質からの保護を行なうが、本発明は、各クラスに列挙される個々の材料にま たはクラス自体によって限定されることは意図していない。むしろ、薄膜検出系 に利用される被験表面の設計のための製造要件を述べることがその意図するとこ ろである。ＰＥＩ被覆基質を０．ｌｍｍＨｇの下で１００℃で６０分間硬化させ た。常套的偏光解析法により測定された最終的中間層８０オングストロームが一 般に好ましいが、他の厚さも使用することができた。

＃２　：ＰＥＩ／ＤＭＤＣ５：ＤＭＤＣＳ　（ジグ７−ケミカル−Ｃｏ、、セン トルイス、ＭＯ） ＰＥＩ被覆基買をＤＭＤＣＳを用いる処理によってさらに加工することができる 。これにより線状ＰＥＩ鎖に沿って分枝点が作り出され、よりいっそうＴ−ポリ マーとして挙動する表面がもたらされる。１．　１．　１−トリクロロメタン中 ２％のＤＭＤＣＳ保存溶液（ｖ／ｖ）１００ｍｌｆ−調製する。ＰＥＩ被覆基質 を２５℃で６０分間この溶液中に浸漬する。基質をこのＤＭＤＣ８被覆用溶液か ら取り出し９５％エタノールですすぎ、最後に窒素気流の下で乾燥させる。常套 的偏光解析法により測定される２００オングストロームの最終的中間層が一般に 好ましいが、他の厚さもまた可能である。

＃３：ポリスチレン（ベクトン・ディッキシラン、オクスナード、ＣＡ）ポリス チレンのファルコンベトリ皿およそ０．０５ｇをトルエン２ｍｌに溶解した。こ の溶液は前記の回転被覆技術により適用した。使用に先立ち基質を２５℃で６０ 分間硬化した。２００オングストロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他 の厚さもまた可能である。

＃４：ＭＳＡ−スターバーストポリマー（ポリサイエンシズ、ワーリングトン、 ＰＡ） 第５世代スターバースト（領　５％固体）の１：４希釈物をメタノール中で作成 した。この溶液２００μｌの試料を回転速度３５００ｒｐｍの回転被覆法を用い て基質に適用した。Ｌ−被覆基質を２５℃で１２０分間硬化した。４０オングス トロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他の厚さもまた可能である。

＃５：Ｔ−ポリマー−（ペトラーク、ブリストル、ＰＡ）Ｔ−ポリマーの１　： 　３００　（ｖ／ｖ）希釈物を２−メチル−２−ブタノール中で作成した。この 中間層を回転被覆法により基質に適用した。使用前にＬ−被覆基質を１４０℃で １２０分間硬化した。１６０オングストロームの最終的中間層が一般に好ましい 。

＃６：ＴＣ７，Ａ（セラディン、インディアナポリス、ＩＮ）３０％保存溶液を メタノール中０．５％固形物に希釈した。試料３００μｌを回転被覆技術を用い て基質に適用した。使用前にＬ−被覆基質を３７℃で１２０分間硬化した。この 材料の最終的厚さは２４０オングストロームであることが好ましい。

＃７：ＤＭＤＰＳ（ペトラーク） トルエン中ンロキサンの１　＋　１００　（ｖ／ｖ）保存溶液を作成し、Ｔ−ポ リマーについて述べた回転被覆技術及び硬化プロトコルを用いて適用した。好ま しＬ）最終的厚さは２００オングストロームである。

＃８：メルカブト（ペトラーク） シロキサンの１　＋　３００　（ｖ／ｖ）保存溶液をトルエン中で作成した。被 覆及び硬化プロトコルはＰＥＩについて記載した通りとした。好ましい最終的厚 さは２００オングストロームである。

＃９：ＲＡＳ（ベトラーク） シランの１・１００（ｖ／ｖ）溶液をトルエン中で作成した。試料２００μｌを 回転被覆プロトコルに使用した。このウェー１１−を０．ｌｍｍＨｇの下で１４ ０℃で２時間硬化する。好ましい最終的厚さは３０オングストロームである。

＃１０　：　ＰＢＤ　（ベトラーク） シラン保存溶液２７．５μ】容をトルエン３２７５μｍと混合した。回転被覆容 量はこの混合液３００μｌであり、ウェーハーは１２０℃で６０分間硬化した。

好ましい最終的厚さは１００オングストロームである。

＃１１　：　ＰＡＰＤＳ　（ベトラーク）１　：　１００　（ｖ／ｖ）のトルエ ン中ソロキサン２００μｌの回転被覆容量を使用し、ウェーハーは使用前に１０ ０℃で１２０分間硬化した。好ましい最終的厚さは２００オングストロームであ る。

これらの実施例の全体にわたり記載されている濃度、容量、重量、回転被覆の速 さ、緩衝剤、インキュベーション時間及び条件、並びに他の全ての試薬または工 程は、好ましい態様の記載のみを意図している。本発明はこれら詳細な態様に限 定されることを意図するものではない。

実施例２　稠密な反応性受容層の生成における中間層材料の有用性の比較：抗原 捕捉の測定 受容材料としての抗体をシリコン基質に結合させる中間層材料の効率の分析のた めの系を設計した。抗体の稠密な反応性の層の達成は、より厳しい方向性が必要 であるために他の型の受容材料よりずっと困難であることが先行文献で証明され ている。ＥＬＩＳＡ系がこの評価のために設計されたが、この系では、モノクロ ーナル抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を被験受容材料としてのＬ−被 覆基質に結合させ、次いで異なったレベルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ ））を表面に施し標準曲線を作成した。Ｌ−被覆基質と同じ条件下で微量定量用 ウェルを抗体被覆した。Ｌ−被覆基質または微量定量用ウェルをモノクローナル 抗ＨＲＰ　（ジグ？−ケミカル−Ｃｏ、、セントルイス、ＭＯ）２０ｍｇ／ｍ１ を含有する０、０５ｍＰＢＳ、ｐＨ−７，４を用いて２５℃で１４６時間抗体被 覆した。Ｌ−被覆基質は被覆用溶液に浸漬した。ペルオキシダーゼ（シグマ・ケ ミカル・Ｃｏ、　、セントルイス、ＭＯ）濃厚液をＲ−被覆基質または微量定量 用ウェルと３７℃で３０分間反応させ、脱イオン水ですすぐことにより僅かな非 結合ペルオキシダーゼを除去した。次に、反応したＲ−被覆基質または微量定量 用ウェルにＴＭＢ　（カークガード・アンド・ぺり−）基質を加え、発色のため に２５℃で２分間反応させた。被験表面上の各場所からの流体を停止試薬を入れ た非被覆微量定量用ウェルに移し、４５０ｎｍにおける光学密度を記録した。比 較板の微量定量用ウェルに停止試薬を直接加え、これを同様に読み取った。

この研究の結果を以下の表に示す。表面は感度（負の対照に比較した低濃度の分 割）及び動的範囲の点で評価した。対照の目的のため、各々のＬ−被覆基質をウ サギＩｇＧでも被覆し、しかる後ペルオキシダーゼ検定で評価した。ペルオキシ ダーゼと全てのウサギＩｇＧ被覆し一被覆基質との有意でない相互作用が観察さ れた。未処理のシリコン基質もまた同様の条件の下で調べたが、表面に結合して いる活性な受容材料が殆ど無いことを示していることがわかった。データは４５ Ｑｎｍにおいて測定された光学密度として報告した。

１部１表 ペルオキシダーゼ濃度（ｎｇ／ｍｌ） 被験表面　０．０　１５．６　３１．２５　６２．５　１２５．０　２５０．０ 　５００．０　１０００．０スンク零　０．００５　０．６３４　０．６４６　 ０．８６３　０．８？６　１．２５２　１．５６１　１．４１３り゛イナテク零 　〇、０１７　０．１６１　０．１５０　０．２７９　０．６６２　１．１７３ 　１．４６５　１．５９８ＰＥＩ／ＤＭＤＣ３Ｏ，００７０，１３６０，２６４ ０，３７１０，４２８０，７１４１，１１８１，４９５Ｔ−ネ°リマー”　０． ０３０　０．０７６　０．１０７　０．１１１　０．２７６　０．４９８　０． ７３０　０．８５０Ｔ一本°リマーゝ　０．０１５　０．１３７　０．３２８　 ０．３６５　０．４７３　０．６ｇ２　０．９４６　０．８１０Ｍ５Ａ　Ｏ，０ ０３０，０３７０，１０００，１６６０，３０５０，３７３０，５１１０，４２ ８ＰＥＩ’　０．ＯｒＭ　Ｏ，１７５０，２３８０，６３６０，６５１０，７０ ２０Ｊ１７０．７４３ＴＣ７＾’　０．０１６　０．０６５　０．１０９０．１ ５９　０．１７９　０．３９９０．３２４０．２１５メルカ７°）　０．０００ 　０．２５９　０．５１４　０．６５ｇ　０．８８１　０．９５７　１．１４３ 　１．５５８ＤＭＤＰＳ　Ｏ，０１５０，０３９０，０３６０，１６６０，１０ （１０，１５２Ｑ、２５９０．４４２本°リスチレン　０．０００　０．２４ｇ 　０．３４３　０．４４４　０．６３１　０．７５６　０．７９５　０．８７８ ＲＡＳ’　０．００２　０．００ｇ　０．０１２　０．０２６　０．０５５　０ ．１００　０．１２０　０．２１０ＰＢＤ　Ｏ，００１０，０１３０，０４７０ ，０４１０，０？２０．１０ｇ　０．１２４　０．１４３ＰＡＰＤＳ　Ｏ，００ ４０，３１４０，５５９０，５１５０，７９００，８２２１，２５９１，１８６ ａＴ−ポリマーを最終的な厚さが２４０オングストロームとなるよう基質に適用 した。

ｂＴ−ポリマーを最終的な厚さが５５オングストロームとなるよう基質に適用し た。

ｃ　ＴＣ７Ａを最終的な厚さが２４６オングストロームとなるよう適用した。

ｄ　これらの材料は先行文献において詳細に論じられている。

本　Ｌ−被覆光学基質との比較のためにこれら供給者からの微量定量用ウェルを 使用した。

この研究は、薄膜基質をＰＥＩまたはＢＡＳで処理する先行技術と比較した場合 の係る基質上への中間層としてのシロキサンの有用性を明白に立証している。

さらに、個々のシロキサン類の有用性は異なっており、これはそのシロキサンの 官能基が受容材料の反応性に影響を及ぼし得ることを示唆している。分子自己集 合ポリマーもまたＢＡＳと比較して中間層としての優れた挙動を示すが、シロキ サン材料はど有用ではない。ＴＣ７Ａ表面活性剤はこの検定系においては劣った 挙動をするが、次の実施例においては著しい有用性を有する。この研究はさらに 、抗体が受容材料であり抗原が捕捉される被験表面の構造におけるこれら中間材 料の有用性を立証するために計画された。

実施例３　稠密な反応性受容層の生成における中間層材料の有用性の比較：抗体 捕捉の測定 この分析のために、０．０５Ｍ　ＰＢＳ、スＨ＝７．４中のウサギＩｇＧ（シグ マ・ケミカル・Ｃｏ、　、セントルイス、ＭＯ）２０ｍｇ／ｍｌの溶液に２５℃ で１６時間浸漬することにより、相異なるし一被覆基質を被覆した。異なったレ ベルのＨＲＰ標識ヤギ抗−（そして分子）ウサギＩｇＧ抗体（シグマ・ケミカル ・Ｃｏ、、セントルイス、ＭＯ）をＲ−被覆基質と３７℃で１５分間インキュベ ートした。結合していない材料を脱イオン水ですすぐことにより除去した。ＴＭ Ｂ基質溶液を表面に適用し、２５℃で２分間反応させ、次いでこの溶液を停止溶 液の入った非被覆微量定量用ウェルに移した。これらの試料の光学密度を４５０ ０ｍで測定した。下に示されるデータは４５０ｎｍにおける光学密度によるもの である。

第２表 ヤギ抗−ウサギーＨＲＰ濃度（ｎｇ／ｍｌ）被験表面　０．０　１５．６　３１ ．２５　６２．５　１２５．０　２５０．０　５００．０　１０００．０ＰＥＩ ／ＤＭＤＣＳ　Ｏ，０１００，０３５０，０８５０，１２３０，２９００，２８ ９０，４６９０，５７２丁一本°リマー”　０．０１５　０．０６０　０．０６ １　０．１３６　０．４２４　０．４３７　０．５８５　０．７１５ＩＳＡ　Ｏ ，０７３０，０１９０，０３３０，０ｇ５　０．１５３　０．２２７　０．６１ ６　０．７９９未処理ノリコン”　０．０００　０．０００　０．００１　０． ０１２　０．０２６　０．０３７　０．１２８　０．２８０ａＴ−ポリマーを最 終的な厚さが５３オングストロームとなるよう基質に被覆した。

ｂ　未処理シリコンは基質材料１０である。

この研究において、抗体捕捉検定の検出における系の有用性を立証するため、様 々な被験表面を使用した。この場合、シロキサン中間層及び分子自己集合性中間 層は共に良好に挙動した。中間層の添加されなかった基質は殆ど利用性が無０か または反応性受容材料であることが立証され、この事は中間層材料の使用が必要 であることを支持している。

実施例４　連鎖球菌Ａ群抗原に対する目視検出検定における中間材料の評価単結 晶シリコシ塊からダイヤモンドで挽き切ったウェー７八−に、当業者に研磨（ラ ッピング）として知られる一連の処理を行なうことにより、シリコン基質を調製 した。挽き切ったウェーッ１−を研磨剤で研磨し、酸またはカセイ溶液で腐食し てより均一な表面輪郭とし、次いでさらに研磨して徐々に表面のざらざらをより 滑らかな面とした。これは、最終的な所望の表面が高度に磨き上げられた二次元 表面である、当業者にとっての慣行ではない。しかしながらこれに適用するため 、１５ミクロンの平均サイズを有する１２−２１ミクロンの酸化アルミニウム粒 子の研磨剤を用いて拡散性反射基質が生成された。記載のように研磨された修飾 シリコンウェーハーはコスト上の著しい有利さという面でも有用である。特にこ の研究のためには、上記のように調製された基質は窒化珪素で最終的な厚さが５ ５０オングストロームとなるよう被覆した。これは記載された材料の組合せであ るが、この発明の範囲内で種々の厚さの任意の抗反射材料を使用することができ る。次いで実施例１に記載の幾つかの中間層材料でこの干渉スライド基質を処理 してＬ−被覆基質を生成させた。

これらのＬ−被覆基質を、領　１ｍ　ＨＥＰＥＳＳｐＨ＝６．０中のウサギ抗一 連鎖球菌Ａ群（Ｓｔｒｅｐ　Ａ）抗体（メデイックス・バイオチク、フォスター ンティー、ＣＡ）２０ｍｇ／ｍｌの溶液中で２５℃で６０分間被覆した。５ｔｒ ｅｐ　Ａ抗原を含むまたは含まない対照溶液１０μｌのスポットをＲ−被覆基質 上に！き、室温で２分間インキュベートすることによりＲ−被覆基質を反応させ た。次いで被験表面を脱イオン水ですすぎ、窒素気流下で乾燥した。

２Ｍ　ＮａＮＯｘ１部を２ｍ酢酸１部と混合し、０．６６Ｎ　Ｎａ０ＨＴ中和す ることにより、負の対照を調製した。正の対照である、市販の培養５ｔｒｅｐＡ 細胞から抽出された抗原の緩衝剤を基礎とする製剤（メデイツクス・バイオチク 、フォスターシティ−１ＣＡ）を、使用前に抽出媒質中に希釈した。被験表面に 適用する前に試料を第二の試薬と１：２で混合した。負の対照と異なっているこ とが目視できる最も高希釈の正の対照として第３表に結果を報告する。

第３表 被験表面　検出し得る最高希釈 Ｔ−ポリマー　１：２５６ ＴＣ７Ａ　１　：　８ ＲＡＳ　目視できる応答無し ＰＥＩ　目視できる応答無し ＰＥＩ／ＤＭＤＣ３１：１６ ＤＰｈＤＭＳ　目視できる応答無し ＭＳＡ　Ｉ＋６４ この研究は、結果が目に見える信号である抗原捕捉検定において中間材料の有用 性を立証するために計画された。この場合、先行文献中の物質であるＢＡＳ及び ＰＥＩは、目視検定系において使用される受容材料を基質から隔離する能力は示 さない。シロキサン類は受容材料の所望の反応性を提供する極めて可変的な能力 を示すが、最も良好な検定の達成はＴ−ポリマーシロキサンで得られる。分子自 己集合中間層及び表面活性剤ＴＣ７Ａの両者はこの検定系において幾らかの有用 性を示す。

実施例５　連鎖球菌群Ａ抗原検出用の機器検定系における中間材料の評価この実 施例で使用されるシリコン基質は、磨き上げられたウェーハー表面である。ドバ ントレベル及び型はこの型の光学的検出計画に影響を及ぼさない。Ｌ〜被覆基質 を実施例１の通りに適用し、抗体を実施例４の通りに適用した。この検定は実施 例４に記載のように実施した。使用される正の対照には５ｔｒｅｐＡ群抗原の希 釈液を入れた。乾燥後、反応した被験表面をサガックス・コンパリスン・エリプ ソメーターで調べ、反射光強度の光度的分析をミリボルトの読みで記録した。

第４表 被験表面　負の対＠　（ｍＶ）　正の対照（ｍＶ）ＰＥＩ　３６．　０　１３３ ．　Ｏ Ｔ−ポリマー　１５．　５　２８６．　４Ｍ５Ａ　０．０　１３６．０ この研究は、機器検出系及び抗原捕捉検定における中間層の有用性の指標を提供 するために計画された。機器検定については、目標は、正の対照に対しては最大 の信号の生成を、そして負の対照に対しては最小信号の非特異結合を提供する被 験表面を得ることであった。この場合、先行文献中の材料であるＰＥＩは充分な 反応性を示すが、最高レベルの非特異結合を導入する。先行文献中やはり頻繁に 使用されるＰＢＤはこの検定系では有用性を示さない。最良の総合的性能はＴ− ポリマーシロキサンまたはＭＳＡポリマー類で得られる。

実施例６　酵素的分解検定による中間材料の評価・コラゲナーゼ活性ＴＣ７Ａ被 験表面を実施例１に従って作成した。この被験表面を、ヒトコラーゲンタイプ］ 　（シグマ・ケミカル・Ｃｏ、　、セントルイス、ＭＯ）４．９ｕｇ／ｍ１を含 有するＯ、ＩＭトリスＨＣＩ、ｐＨ＝９．０の溶液中に浸漬した。この被験表面 を２５℃で６０分間被覆した。被験表面は使用前に脱イオン水ですすぎ、窒素気 流の下で乾燥した。１４３オングストロームの固定されたコラーゲン層が生成さ れた。相異なる活性のコラゲナーゼ希釈液（ベーリングーマンハイム、インディ アナポリス、ＩＮ）を０．００５ＭＣａＣ１，及びＯ，ＬＭトＩＪス−ＨＣｌ、 ｐＨ＝７．６を含有する緩衝液中に希釈した。５μＪの異なった濃度のコラゲナ ーゼのスポットをＲ−被覆表面に適用し、室温で５分間インキュベートした。

反応した表面を脱イオン水ですすぎ、窒素気流下で乾燥した。反応した表面をサ ガックス・コンバリスン・エリプソメーターで調べ、反射光強度を記録した。こ の実施例において受容材料層は適用された相互作用を行なう種により分解し、受 容材料に生成した穴はコラゲナーゼの増加する活性または濃度の関数として徐々 により陰性となる信号を与える。コラゲナーゼ活性は単位ｘｌｏ’／ｍｌで報告 する。活性は光の強度としてミリボルトで測定した。

第５表 コラケ°＋−ｔ”　実施＃１　実施＃２　実施＃３　平均　Ｓ、Ｄ、　％ＣＶＯ ，０−１５−１２−４，７９，０２００１００，０６０５５６８６１，０９，６ １０Ｊ２００．０　１２５　９３　１０８　１０ｇ、７　１６．０　１４．７３ ００．０　１８１　１１８　１８ｇ　１６２，３　３８．６　２３．４５００． ０　２７１　２２８　２２８　２４０．０　２７．１　１１．３この研究は酵素 活性の検出のための被験表面の生成を証明するために計画された。この場合、証 明された活性は減衰してゆ（が、酵素活性を合成活性によって測定する系を作り 出すことを構想することもできる。この場合、この表面活性剤はＴ−ポリマーシ ロキサンに対し受容材料の受け入れにおいてほぼ３倍の増加を示した。

前記実施例は、基質、中間材料（複数もあり）、及び、被検体（複数もあり）の 付着の尺度としての被験表面上の巨視的変化を生み出す受容材料で構成される装 置を用いて種々の被検体を検出するこの技術の可動性および有用性を例示する役 割を有する。

前記実施例で使用される基質の構成または材料に対する数行として、ポリマー材 料をそれらの表面に結合させることのできる機能的に等価な代替物である、基質 構成および基質材料の種々の組合せを使用することが可能である。

中間材料（複数もあり）は、受容材料をいかなる機作にせよ装置に結合または付 着させるよう活性化し得る層（複数もあり）を提供する。この発明に使用される 中間材料は様々な手法で被覆される。中間層の材料組成物は、選択された受容材 料および基質材料並びに受容材料を付着させる方法を基に選択する。

基質は、様々な形、即ち試験管、ウェーハー、ガラス被験表面、マイクロウェル 等、及び構成、即ち固体担体、可撓性担体、ゲル、薄膜、のいずれであってもよ く、そして様々な好適な物質、即ちガラス、シリコン、プラスチック等でできて いてよく、そして非鏡面または鏡面反射性、透過性、または吸収性材料でだきて いてよく、これを前述の技術により処理して、被検体の検出のための多くの有用 な手段を提供することができる。反応した装置はエリプソメーターにより、また はなんらかの機作により被検体の相互作用を検出できる他の任意の機器により、 定性的または定量的に分析することができる。

本明細書に記載される発明の概念は異なった態様を有し得ることが予期され、付 記されている請求項は先行技術により限定される範囲を除き本発明のこれら全て の択一的態様を包含するものと解釈されることを意図している。

その最も一般的な態様において本発明は、特別に設計された中間層材料を使用す ることにより、機器を使用もしくは使用しない、または光学的もしくは非光学的 であるとに拘らず、被検表面、ウェーハー、または台を、薄膜検定における使用 のための被検体の固定、密度生存性、安定性、方向、及び特異性に関して最適な ものとする一般的方法を教示するものである。上に概説した本発明の好ましいま たは好ましくない、機器を使用するまたは使用しない具体的態様に付随する中間 層に関する全ての考察は、本発明の一般的態様に等しく適用され、これは上記に 個別的に考察されていない非光学的並びに光学的薄膜検出もしくは測定系、また は光学的な機器的もしくは非機器的検出もしくは測定系を使用することができる 。

ＦＩＧＵＲＥｌ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＦＩＧＵＲＥ３ ＦＩＧＵＲＥ４ ＦＩＧＵ日Ｅ５　側面視点 最高視点 要約書 多様な光学的検出及び検定方法および系に有用な多重層の薄膜要素を製造する方 法が開示される。さらに、該方法により製造される要素は、その多重層が少なく とも一つの光反射層または基質、これに付着した障壁層、および相互作用する目 的の被検体とは異なった測定可能な被覆の厚さを有する反応層をその上に含む、 改善された被験表面を示す。この要素は、化学的、免疫学的並びに光学的及び非 光学的測定を含む系を包含する多数の薄膜検定系、とりわけ偏光解析的免疫検定 に用途を見いだすものである。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．目的とする被検体と相互作用する受容材料上に添付された付着している中間 層を該基質の上表面に隣接する第一層に含む多重層をその上表面に支持している 光反射性基質を含み、それにより巨視的変化が検出可能な信号をもたらす、薄膜 可視検出装置。
2. ２．その上表面に免疫学的に活性な材料の付着層を支持している、二次元的反射 性材料の基質を含む免疫検定装置であって、該付着層は多くの相互作用活性レベ ルを有する。
3. ３．基質が二次元的反射性材料で構成される請求項２に記載の装置。
4. ４．基質および付着層が、反射時に偏光解析的に放射を偏光させる、請求項２に 記載の装置。
5. ５．相互作用活性のレベルが弁別可能である、請求項２に記載の装置。
6. ６．第一層に接触する第二層に対する親和性を有する第一層をその上表面に支持 している光反射性基質を含む、偏光解析的に偏光させた光を反射することのでき る薄膜検定装置であって、該第二層は目的とする被検体と相互作用することので きる材料からなり、相互作用後の該第二層の相対的厚さは該第一層の厚さより薄 い。
7. ７．エリプソメーター及び請求項６に記載の検定装置からなる偏光解析的免疫検 定系。
8. ８．相互作用後の該第二層の相対的厚さが該第一層の厚さより薄くなるよう目的 とする被検体と反応することのできる材料を含む、第一層に接触する第二層に対 する親和性を有する第一層を上表面に支持している光反射性基質を有する薄膜検 出部材を提供する工程を含む、媒質中の目的とする被検体を検出する方法。