JP2004045421A - 生物学的結合の光学的検出に使用する試験表面の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 デバイスの必須構成成分である、光学的特性を有する表面を持った基質(a)と被検体を捕捉する受容物質の層(c)との間に、当該基質表面の光学的特性を損なうことのない、当該受容物質の結合部位を増加させた中間層(b)を設ける。
【選択図】 なし
Description
種々の中間層の材料についてここに与えられた名称を本明細書全体にわたり使用する。
中間層材料:
#1:PEI−(トリメトキシシリルプロピル)ポリエチレンイミン
#2:PEI/DMDCS−上記物質+ジメチルジクロロシラン
#3:ポリスチレン
#4:MSA−スターバースト;第5世代
#5:T−ポリマー−アミノアルキルT−構造分枝点ポリジメチルシロキサン
#6:TC7A
#7:DMDPS−ジメチルジフェニルシロキサン共重合体
#8:メルカプト−メルカプトプロピルメチルジメチル−シロキサン共重合体
#9:BAS−N−(2−アミノエチル−3−アミノプロピル)−トリメトキシシラン
#10:PBD−トリエトキシシリル修飾ポリブタジエン
#11:PAPDS−(メチルフェニル)メチルドデシル−メチル−アミノプロピル−メチルシロキサン
#1:PEI(ペトラーク;ブリストル、PA)
メタノール中保存シランの1:500希釈。当業者には自動化されたエアロゾルまたは噴霧デリバリー系が知られているが、この溶液300μlの試料をマイクロピペットにより100mmの清浄な被験シリコンウェーハー上に置き、このウェーハーをフォトレジスト回転被覆機上で7000rpmで回転させた。半導体産業において広く利用されているこの回転被覆機は、極めて均一な等角の膜を作り出す。これは多数の基質を迅速に処理でき、容易に自動化される。本明細書中、回転被覆を詳細に説明するが、本発明をこのL−被覆基質の製造の型に限定する意図はない。代わりとなる、溶媒を基礎とする沈澱(溶液または真空)は、当業者により容易に設計することができるであろう。さらに、本明細書に記載されるクラスの材料は、受容材料の基質からの保護を行なうが、本発明は、各クラスに列挙される個々の材料にまたはクラス自体によって限定されることは意図していない。むしろ、薄膜検出系に利用される試験表面の設計のための製造要件を述べることがその意図するところである。PEI被覆基質を0.1mmHgの下で100℃で60分間硬化させた。常套的偏光解析法により測定された80オングストロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他の厚さも使用することができた。
PEI被覆基質をDMDCSを用いる処理によってさらに加工することができる。これにより線状PEI鎖に沿って分枝点が作り出され、よりいっそうT−ポリマーとして挙動する表面がもたらされる。1,1,1−トリクロロメタン中2%のDMDCS保存溶液(v/v)100mlを調製する。PEI被覆基質を25℃で60分間この溶液中に浸漬する。基質をこのDMDCS被覆用溶液から取り出し95%エタノールですすぎ、最後に窒素気流の下で乾燥させる。常套的偏光解析法により測定される200オングストロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他の厚さもまた可能である。
ポリスチレンのファルコンペトリ皿およそ0.05gをトルエン2mlに溶解した。この溶液は前記の回転被覆技術により適用した。使用に先立ち基質を25℃で60分間硬化した。200オングストロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他の厚さもまた可能である。
第5世代スターバースト(0.5%固体)の1:4希釈物をメタノール中で作成した。この溶液200μlの試料を回転速度3500rpmの回転被覆法を用いて基質に適用した。L−被覆基質を25℃で120分間硬化した。40オングストロームの最終的中間層が一般に好ましいが、他の厚さもまた可能である。
T−ポリマーの1:300(v/v)希釈物を2−メチル−2−ブタノール中で作成した。この中間層を回転被覆法により基質に適用した。使用前にL−被覆基質を140℃で120分間硬化した。160オングストロームの最終的中間層が一般に好ましい。
30%保存溶液をメタノール中0.5%固形物に希釈した。試料300μlを回転被覆技術を用いて基質に適用した。使用前にL−被覆基質を37℃で120分間硬化した。この材料の最終的厚さは240オングストロームであることが好ましい。
トルエン中シロキサンの1:100(v/v)保存溶液を作成し、T−ポリマーについて述べた回転被覆技術及び硬化プロトコルを用いて適用した。好ましい最終的厚さは200オングストロームである。
シロキサンの1:300(v/v)保存溶液をトルエン中で作成した。被覆及び硬化プロトコルはPEIについて記載した通りとした。好ましい最終的厚さは200オングストロームである。
シランの1:100(v/v)溶液をトルエン中で作成した。試料200μlを回転被覆プロトコルに使用した。このウェーハーを0.1mmHgの下で140℃で2時間硬化する。好ましい最終的厚さは30オングストロームである。
シラン保存溶液27.5μl容をトルエン3275μlと混合した。回転被覆容量はこの混合液300μlであり、ウェーハーは120℃で60分間硬化した。好ましい最終的厚さは100オングストロームである。
1:100(v/v)のトルエン中シロキサン200μlの回転被覆容量を使用し、ウェーハーは使用前に100℃で120分間硬化した。好ましい最終的厚さは200オングストロームである。
受容材料としての抗体をシリコン基質に結合させる中間層材料の効率の分析のための系を設計した。抗体の稠密な反応性の層の達成は、より厳しい方向性が必要であるために他の型の受容材料よりずっと困難であることが先行文献で証明されている。ELISA系がこの評価のために設計されたが、この系では、モノクローナル抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を被験受容材料としてのL−被覆基質に結合させ、次いで異なったレベルの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HR))を表面に施し標準曲線を作成した。L−被覆基質と同じ条件下で微量定量用ウェルを抗体被覆した。L−被覆基質または微量定量用ウェルをモノクローナル抗HRP(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)20mg/mlを含有する0.05mPBS、pH=7.4を用いて25℃で146時間抗体被覆した。L−被覆基質は被覆用溶液に浸漬した。ペルオキシダーゼ(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)濃厚液をR−被覆基質または微量定量用ウェルと37℃で30分間反応させ、脱イオン水ですすぐことにより僅かな非結合ペルオキシダーゼを除去した。次に、反応したR−被覆基質または微量定量用ウェルにTMB(カークガード・アンド・ペリー)基質を加え、発色のために25℃で2分間反応させた。被験表面上の各場所からの流体を停止試薬を入れた非被覆微量定量用ウェルに移し、450nmにおける光学密度を記録した。比較板の微量定量用ウェルに停止試薬を直接加え、これを同様に読み取った。
b T−ポリマーを最終的な厚さが55オングストロームとなるよう基質に適用した。
c TC7Aを最終的な厚さが246オングストロームとなるよう適用した。
d これらの材料は先行文献において詳細に論じられている。
* L−被覆光学基質との比較のためにこれら供給者からの微量定量用ウェルを使用した。
この分析のために、0.05M PBS、pH=7.4中のウサギlgG(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)20mg/mlの溶液に25℃で16時間浸漬することにより、相異なるL−被覆基質を被覆した。異なったレベルのHRP標識ヤギ抗−(そして分子)ウサギlgG抗体(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)をR−被覆基質と37℃で15分間インキュベートした。結合していない材料を脱イオン水ですすぐことにより除去した。TMB基質溶液を表面に適用し、25℃で2分間反応させ、次いでこの溶液を停止溶液の入った非被覆微量定量用ウェルに移した。これらの試料の光学密度を450nmで測定した。下に示されるデータは450nmにおける光学密度によるものである。
単結晶シリコン塊からダイヤモンドで挽き切ったウェーハーに、当業者に研磨(ラッピング)として知られる一連の処理を行なうことにより、シリコン基質を調製した。挽き切ったウェーハーを研磨剤で研磨し、酸またはカセイ溶液で腐食してより均一な表面輪郭とし、次いでさらに研磨して徐々に表面のざらざらをより滑らかな面とした。これは、最終的な所望の表面が高度に磨き上げられた二次元表面である、当業者にとっての慣行ではない。しかしながらこれに適用するため、15ミクロンの平均サイズを有する12−21ミクロンの酸化アルミニウム粒子の研磨剤を用いて拡散性反射基質が生成された。記載のように研磨された修飾シリコンウェーハーはコスト上の著しい有利さという面でも有用である。特にこの研究のためには、上記のように調製された基質は窒化珪素で最終的な厚さが550オングストロームとなるよう被覆した。これは記載された材料の組合せであるが、この発明の範囲内で種々の厚さの任意の抗反射材料を使用することができる。次いで実施例1に記載の幾つかの中間層材料でこの干渉スライド基質を処理してL−被覆基質を生成させた。
この実施例で使用されるシリコン基質は、磨き上げられたウェーハー表面である。ドパントレベル及び型はこの型の光学的検出計画に影響を及ぼさない。L−被覆基質を実施例1の通りに適用し、抗体を実施例4の通りに適用した。この検定は実施例4に記載のように実施した。使用される正の対照にはStrepA群抗原の希釈液を入れた。乾燥後、反応した被験表面をサガックス・コンパリスン・エリプソメーターで調べ、反射光強度の光度的分析をミリボルトの読みで記録した。
TC7A被験表面を実施例1に従って作成した。この被験表面を、ヒトコラーゲンタイプ1(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)4.9ug/mlを含有する0.1MトリスHCl、pH=9.0の溶液中に浸漬した。この被験表面を25℃で60分間被覆した。被験表面は使用前に脱イオン水ですすぎ、窒素気流の下で乾燥した。143オングストロームの固定されたコラーゲン層が生成された。相異なる活性のコラゲナーゼ希釈液(ベーリング−マンハイム、インディアナポリス、IN)を0.005MCaCl2及び0.1Mトリス−HCl、pH=7.6を含有する緩衝液中に希釈した。5μlの異なった濃度のコラゲナーゼのスポットをR−被覆表面に適用し、室温で5分間インキュベートした。反応した表面を脱イオン水ですすぎ、窒素気流下で乾燥した。反応した表面をサガックス・コンパリスン・エリプソメーターで調べ、反射光強度を記録した。この実施例において受容材料層は適用された相互作用を行なう種により分解し、受容材料に生成した穴はコラゲナーゼの増加する活性または濃度の関数として徐々により陰性となる信号を与える。コラゲナーゼ活性は単位x103/mlで報告する。活性は光の強度としてミリボルトで測定した。
15.上部表面
18.下部表面
20.中間層物質
35.上部高分子表面
40.L−被覆試験表面
50.受容物質
60.R−被覆試験表面
70.アナライト
80.第2の試薬
100.前景
Claims (16)
- (a)光学薄膜アッセイに適合した光学的特性を与える表面を有する基質と、
(b)当該基質表面によって支持されている、当該基質表面に適合した中間層と、
(c)当該中間層に固定された、被検体と結合する受容物質とを有し、
上記中間層は、上記基質表面の表面像を本質的に変化させることのない均一の厚みを有する膜として形成されており、かつ、上記基質表面の結合サイトの数に比較して相対的に増加した数の結合サイトを上記受容物質に対して提供するものである、
上記被検体の存在または量を検出するための薄膜デバイスにおいて、
上記被検体が上記受容物質に結合したとき、その結果として薄膜または光学的厚みに生ずる変化から、当該被検体の存在または量が直接に検出できるように、上記受容物質が濃密に上記中間層に固定されている、デバイス。 - 光学薄膜アッセイが光干渉法または楕円偏光法により行われる、請求項1記載のデバイス。
- 基質と抽出感想の間に、抗反射層が設けられている、請求項1または2記載のデバイス。
- 基質が単結晶性シリコン、ガラス、プラスチック、金属、セラミックおよび多結晶性シリコンならびにそれらの複合物から選択された材料で形成されている、請求項1−3のいずれかに記載のデバイス。
- 抗反射層がシリコンナイトライドを含むものである、請求項3または4記載のデバイス。
- 中間層が、デンドリマー、スターポリマー、分子状自己集合性ポリマー、ポリマー性シロキサン、線状シランに分枝点を創るシランおよびフィルム形成性ラテックスからなる群から選択された化学物質を含む、請求項1−5のいずれかに記載のデバイス。
- 中間層がアミノアルキル−T−構造分枝状シロキサンを含む、請求項1−5のいずれかに記載のデバイス。
- 中間層がポリマー性シランとジクロロジメチルシランを順次適用して形成されたものである、請求項1−5のいずれかに記載のデバイス。
- 中間層がスピンコーティング法で形成されたものである、請求項1−8のいずれかに記載のデバイス。
- 中間層がディップコーティング法で形成されたものである、請求項1−8のいずれかに記載のデバイス。
- 中間層が5−500Åの厚さを有するものである、請求項1−10のいずれかに記載のデバイス。
- 受容物質が、抗原、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、キレータ、酵素、酵素基質、酵素阻止剤、補酵素、微生物、細菌、寄生虫、毒素、細胞、核酸、核物質、細胞破砕物、血液蛋白質、組織蛋白質、アレルゲン、代謝産物、神経伝達物質、金属、ウイルス、ウイルス性粒子、ホルモンおよびそれらの物質に対する受容体から選択されたものである、請求項1−11のいずれかに記載のデバイス。
- 受容物質が中間層にスピンコートされたものである、請求項1−12のいずれかに記載のデバイス。
- 被検体が抗体、抗原、酵素、ホルモン、医薬および核酸から選択されたものである、請求項1−13のいずれかに記載のデバイス。
- 被検体がStrepグループA抗原である、請求項14記載のデバイス。
- 被検体がガス、粘液、唾液、尿、糞便抽出物、組織抽出物、骨髄、脳脊髄液、汗、血液、血漿および血清から選択された試料中に含まれている、請求項1−15のいずれかに記載のデバイス。
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