DE69030065T2

DE69030065T2 - Immunadsorbentien

Info

Publication number: DE69030065T2
Application number: DE69030065T
Authority: DE
Inventors: Mark John Berry; Paul James Davis; Winter Ronald Frank Jacobus De; Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Joseph Crosfield and Sons Ltd
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1989-12-18
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1997-09-18
Anticipated expiration: 2010-12-15
Also published as: ATE149526T1; EP0434317A1; JPH0518968A; AU6806990A; JP3007423B2; CA2032389A1; EP0434317B1; US5948894A; ES2100875T3; BR9006452A; DE69030065D1; GB8928501D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien mit spezifischen Bindungseigenschaften und insbesondere deren Anwendung in Immunoadsorptionsverfahren, insbesondere Immunoaffinitäts-Reinigungsverfahren.
Natürliche Antikörper - entweder polyklonal oder monoklonal - werden seit geraumer Zeit als spezifische Bindungsreagenzien eingesetzt. In auf Festphasen immobilisierter Form können sie in Reinigungsverfahren verwendet werden.
Antikörper sind große komplexe mehrkettige Proteinstrukturen. Obgleich es seit einiger Zeit bekannt ist, daß wesentliche Anteile dieser Strukturen keinen Zusammenhang mit den spezifischen Bindungseigenschaften der Antikörper aufzuweisen scheinen, ist der zur Ausbildung einer adäquaten spezifischen Bindung notwendige Minimalanteil umstritten. Es ist bereits gezeigt worden, daß sogenannte Fv-Fragmente, d.h. ein Antikörperfragment, das im wesentlichen nur eine einzelne variable Region einer schweren Kette und deren entsprechende variable Region einer leichten Kette umfaßt, spezifische Bindungsaktivität aufweisen können. Kürzlich ist von Ward et al. (Nature, 1989, Band 341, S. 544-546) gezeigt worden, daß eine einzelne Variable Domäne aus einem Antikörper ("Dab") signifikante spezifische Bindungsaktivität aufweisen kann. Die Herstellung von Antikörpern mit einer einzelnen Variablen Domäne (Dabs), wie sie von Ward et al. beschrieben wird, wird im Detail auch in der am 16. Mai 1990 offengelegten EP 0 368 684 A1 (Medical Research Council) beschrieben. Es gibt nun einige Anhaltspunkte, daß erheblich kürzere Peptide als die Dab, sogenannte Paraloge, so gestaltet werden können, daß sie die Bindung an einen Antikörper in gewissem Umfang nachahmen (Kauva et al., Biochromatography, 5, 1990, S. 22).
Um in Immunoadsorptionsverfahren von praktischem Nutzen zu sein, reicht spezifische Bindungsaktivität allein nicht. Das spezifische Bindungsreagenz muß außerdem in der Lage sein, an eine Festphase, z.B. ein Trägermaterial in einer Säule, angebunden zu werden. Idealerweise kann man diese Anbindung ohne signifikanten abträglichen Effekt auf die spezifische Bindungsaktivität erreichen. Solche abträglichen Effekte können leicht durch chemische oder Konformationsänderungen in der spezifischen Bindungsregion oder einfach durch physikalische (sterische) Behinderung des Zutritts zur spezifischen Bindungsregion entstehen. Im Falle herkömmlicher spezifischer Bindungsreagenzien, insbesondere ganzer Antikörpermoleküle oder großer Abschnitte derartiger Moleküle, wie Fab-Fragmente, macht (machen) die spezifische Bindungsregion(en) nur einen kleinen Anteil des Gesamtmoleküls aus. Der vergleichsweise große Rest des Moleküls, der offensichtlich nicht unmittelbar an der spezifischen Bindungsaktivität beteiligt ist, stellt ein ausreichendes Reservoir für mögliche Stellen dar, die an einer chemischen oder physikalischen Anbindung an Festphasen teilnehmen können. Diese Regionen können von den eigentlichen spezifischen Bindungsregionen vergleichsweise weit entfernt sein, so daß die erhaltenen Anbindungen nicht notwendigerweise die spezifische Bindungsaktivität beeinträchtigen.
Im Falle einer spezifischen Bindungseinheit, die im wesentlichen nur eine oder mehrere Variable Domänen umfaßt, die mit keinerlei wesentlichem Anteil des (der) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind, z.B. einem Fv-Fragment oder einer einzelnen Variablen Domäne, ist der relative Anteil des Moleküls, der an der eigentlichen spezifischen Bindungsaktivität teilnimmt, jedoch sehr viel höher. Tatsächlich könnte man erwarten, daß jeder Versuch, die kleine spezifische Bindungseinheit an eine Festphase anzubinden, ein sehr hohes Risiko nach sich ziehen würde, daß die eigentliche spezifische Bindungsaktivität abträglich beeinflußt wird.
Klausner, Biotechnology, Band 4, Dezember 1986, S. 1041-1043 beschreibt "einkettige Antikörper", die in immobilisierter Form eingesetzt werden können, schlägt aber nicht vor, daß diese Antikörper auf mikroporösen Trägermaterialien immobilisiert werden sollten. Genausowenig schlägt Klausner vor, daß natürliche Fv-Fragmente ohne Verlust an spezifischer Bindungsaktivität immobilisiert werden können.
Wir haben hingegen überraschenderweise gefunden, daß die Immobilisierung kleiner spezifischer Bindungsmittel, insbesondere solcher, die aus entsprechenden VH- und VL-Domänenproteinen bestehen, die allein durch ihre natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden, auf Festphasenträgermaterialien, insbesondere porösen Trägermaterialien, möglich ist. Dies ist tatsächlich nicht nur möglich, sondern das erhaltene Immunoadsorbens kann verbesserte Eigenschaften aufweisen, insbesondere weil die Verwendung des kleinen spezifischen Bindungsmittel die vorteilhafte Verwendung von verbesserten Trägermaterialien gestattet. Mit der Erfindung ist es möglich, die Immunoaffinität von einer Labortechnik im Laborbankmaßstab in eine Technik zu verwandeln, die in einem Maßstab ökonomisch und effizient eingesetzt werden kann, der zur industriellen Gewinnung oder Reinigung eines weiten Bereichs an kommerziell wichtigen Materialien geeignet ist.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem porösen Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 25000 umfaßt, das aus einem oder mehreren Variable-Domäne-Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden) besteht.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Immunoadsorptionsmaterial bereit, das ein auf einem Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, das aus einer Vielzahl von Variable-Domäne- Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden) besteht, welche mit keinerlei wesentlichem Anteile der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind. Das spezifische Bindungsmittel ist vorzugsweise ein natürliches Fv-Fragment.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Immunoadsorptionsmaterial bereit, das ein einkettiges Fv umfaßt, das auf einem porösen Festphasenträgermaterial mit einer nominalen Porengröße von weniger als 1000 A, vorzugs weise weniger als etwa 500 A und insbesondere weniger als etwa 300 A, immobilisiert ist. Vorzugsweise weist das Trägermaterial eine nominale Porengröße von mindestens etwa 30 A, insbesondere mindestens etwa 60 A, auf.
Die Erfindung stellt insbesondere ein Immunoadsorptionsmaterial bereit, das ein auf einem Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, wobei das spezifische Bindungsreagenz aus einem oder mehreren Variable-Domäne-Proteinen (VH und/oder VL) besteht, die mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind. Das spezifische Bindungsreagenz kann ein einzelnes Variable-Domäne-Protein (Dab) oder eine Kombination von Variablen Domänen, insbesondere ein Fv- Fragment, z.B. ein "natürliches" Fv sein (worin VH und VL durch hydrophobe Kräfte zusammengehalten werden).
Es können herkömmliche poröse Festphasenträgermaterialien eingesetzt werden, z.B. Agarose, Polystyrol, poröses Glas mit kontrollierter Porenverteilung (CPG), Cellulosen, Dextrane, Agarose-gefüllter Kieselgur und synthetische Polymere und Copolymere, wie die von Tosoh hergestellten hydrophilen "PW"- Polymere, hydrophil gemachtes Polytetrafluorethylen (PTFE), Polymere von N-Acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (wahlweise mit anderen Monomeren) und Copolymere von 2- Hydroxymethacrylat mit Ethylendimethacrylat (HEMA). Ein besonders bevorzugtes Trägermaterial ist poröse amorphe Kieselsäure. Diese Trägermaterialien können teilchenförmig sein (z.B. Perlen ("beads") oder Granulat, die/das in Extraktionssäulen allgemein verwendet werden/wird) oder in Folienform vorliegen, z.B. Membranen oder Filter, die flach, plissiert, oder hohle Fasern oder Schläuche sein können.
Vergleichsweise inkompressible Träger sind bevorzugt, insbesondere Kieselsäure. Diese weisen wichtige Vorteile für die Anwendung bei der Chromatographie im industriellen Maßstab auf, weil sie in Säulen gepackt werden können, die bei einem wesentlich höheren Druck betrieben werden können, als auf weichere Trägermaterialien, z.B. Agarose, ausgeübt werden kann. Darüber hinaus besitzen Kieselsäure, Glas und synthetische Polymere und Copolymere, wie die "PW"-Polymere, besonders geeignete Dichten zur Anwendung in Rührbehältern und Wirbelschichtbetten. Diese Medien sind auch für analytische Hochgeschwindigkeitstrennung bevorzugt.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf poröse Kieselsäure oder dergleichen immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, wobei das spezifische Bindungsreagenz ein oder mehrere Variable-Domäne-Proteine umfaßt, die mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind.
Eine besonders wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem porösen Trägermaterial, wie Kieselsäure, mit einer Porengröße von mindestens 30 A, aber nicht größer als 1000 A, immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, wobei das spezifische Bindungsreagenz ein oder mehrere Variable-Domäne-Proteine umfaßt, die mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind. Vorzugsweise weist der Träger eine Porengröße von mindestens 60 A auf. Vorzugsweise ist die Porengröße nicht größer als 500 A, insbesondere nicht größer als 300 A.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Immunoadsorptionsmaterials, welches ein Fv- oder Dab- Fragment auf einem porösen Trägermaterial, ausgewählt aus der aus amorpher Kieselsäure, porösem Glas mit kontrollierter Porenverteilung und synthetischen Polymeren und Copolymeren bestehenden Gruppe, umfaßt, wobei das Trägermaterial eine nominale Porengröße im Bereich von 30 bis 300 A aufweist, zur Erhöhung der Geschwindigkeit und/oder des Durchsatzes eines Affinitätsreinigungsverfahrens.
Der Einfachheit halber wird die Erfindung mit Bezug auf die Verwendung von Kieselsäure als Trägermaterial beschrieben. Dem Leser ist jedoch klar, daß die Erfindung die Verwendung anderer poröser Trägermaterialien mit analogen Eigenschaften zu denen von Kieselsäure einschließt.
Chromatographiekieselsäuren weisen im allgemeinen eine nominale Porengröße im Bereich von 30 bis 300 Angström (A) auf. Kieselsäuren mit Porengrößen von 200 bis 300 A sind im Handel erhältlich und werden als Weitporen-Festphasen zur Anwendung in herkömmlichen physikalischen Proteintrennungen empfohlen. Diese Kieselsäuren können mit Liganden derivatisiert werden, um funktionale Medien für die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), z.B. Anion-Austauscher, herzustellen.
Kieselsäuren mit Porengrößen von 200 bis 300 A sind noch robust, und mit einem derartigen Material gepackte Säulen können bei einem hohen Druck betrieben werden. Derartige Kieselsäuren sind jedoch als Träger für herkömmliche Immunoreagenzien (d.h. ganze Antikörpermoleküle oder große Antikörperfragmente, wie Fab-Fragmente) ziemlich ungeeignet, weil - obgleich derartige große Moleküle in die Poren in der Kieselsäure passen können - das erhaltene Immunoadsorptionsmaterial sehr ineffizient sein würde, weil in den Poren sehr viel weniger Raum für den Zutritt des Antigens und dessen Wechselwirkung mit dem spezifischen Bindungsreagenz verbleiben würde (Mohan et al. in Separations for Biotechnology, Herausgeber D L Pyle, 1990). Wenn intakte Antikörper als Immunoadsorptionsmaterial auf einem Kieselsäureträger eingesetzt werden, muß die Porengröße der Kieselsäure wesentlich größer, z.B. über 1000 A sein. Kieselsäuren mit einer Porengröße von 1000 A weisen drei Nachteile auf: Sie sind teurer in der Herstellung, sie sind weniger robust und sie weisen eine geringere Oberfläche pro Einheitsvolumen auf (was wiederum die Menge an Ligand einschränkt, der immobilisiert werden kann). Es sei auf Ritchie et al., Chromatography and Analysis, 1990, verwiesen.

Porengrößenbestimmung

Die nominale Porengröße eines Trägermediums, wie amorpher Kieselsäure, wird im Stand der Technik oft mit dem mittleren Porendurchmesser beschrieben und als Funktion von Porenvolumen und Oberfläche ausgedrückt. Im Prinzip kann das Porenvolumen und die Oberfläche durch Standardstickstoffabsorptionsmethoden nach Brunauer, Emmett und Teller (BET) bestimmt werden. Der mittlere Porendurchmesser (MPD) wird aus der Wheeler-Gleichung (MPD = (40000 x Porenvolumen)/Oberfläche) berechnet. Oberhalb eines Porendurchmessers von etwa 200 A wird die Messung des Porenvolumens durch Stickstoffadsorption jedoch weniger genau; die Messung eines Wasserporenvolumens durch Titration einer trockenen Probe bis zum Einsetzen der Agglomeration liefert ein genaueres Ergebnis.
Für einige Medien ist die Stickstoffadsorptionsmethode ungeeignet, z.B. nichtvernetzte Agaroseträger, die dem für die Stickstoffadsorptionsmessungen erforderlichen Trocknungs schritt nicht standhalten können. In diesem Fall kann die Größenauschlußchromatographie zur Abschätzung des mittleren Porendurchmessers verwendet werden. Die Größenauschlußchromatographie ist ein bekanntes Verfahren, bei dem Polymerstandards zur Abschätzung der Porengröße verwendet werden.
Sehr große Polymere können in keine Poren eintreten und werden ausgeschlossen, während sehr kleine Moleküle in alle Poren eintreten können und vollständig eingeschlossen werden. Zwischen diesen Extremen können Polymere von dazwischenliegender Größe in einen Bruchteil des Porenvolumens ein treten, und dieser Bruchteil kann gemessen und als Kd ausgedrückt werden. Für ausgeschlossene Polymere ist Kd 0 und für vollständig eingeschlosse Polymere 1.
Ein auf Kieselsäuren anwendbares Standardsystem beruht auf der Chromatographie von Polystyrolstandards mit Tetrahydrofuran als Lösungsmittel. In diesem System würde ein Polystyrol eines Molekulargewichts von etwa 34000 (log 10 MW = 4,5) die folgenden ungefähren Kd-Werte für die folgenden Kieselsäuren aufweisen: 60 A < 0,05, 200 A 0,2-0,3, 500 A 0,55-0,65, 1000 A 0,75-0,85. Daher würden Kieselsäuren einer Porengröße von 1000 A oder weniger einen Kd-Wert von weniger als 0,85 für ein Polystyrol eines Molekulargewichts von 34 Kilodalton aufweisen. Weil der Kd-Wert eine Funktion des log des Molekulargewichts ist, soll angemerkt werden, daß kleine Änderungen beim Molekulargewicht des 34K-Standards (d.h. eine Variation zwischen 30K und 40K) einen geringen Effekt auf das Ergebnis haben würden.
Bestimmte Medien können in Tetrahydrofuran nicht verwendet werden, und in diesen Fällen kann eine derivatisierte Kieselsäuresäule gegen Polystyrol kalibriert und anschließend zur Kalibrierung der alternativen Medien verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Kohlehydrat-artiger Träger vermessen werden soll, würde Tetrahydrofuran zur Dehydratation führen; Proteinstandards in wäßrigem Puffer könnten jedoch akkommodiert werden. In diesem Fall kann eine Kieselsäure geeigneter Porengröße nach bekannten Verfahren mit Diolgruppen modifiziert und diese Medien mit dem Polystyrolsystem kalibriert werden. Das Lösungsmittelsystem kann dann auf ein für die Proteintrennung geeignetes umgestellt werden, z.B. phosphatgepufferte Salzlösung, und ein Sortiment von Proteinstandards getestet werden. Dies gestattet die Umrechnung der Polystyrolkalibrierung in eine Proteinkalibrierung. Die Proteinstandards werden dann auf den alternativen Testmedien getestet und die relevanten Kd-Werte mit den Diol-Medien verglichen. Derartige Daten gelten nur, wenn keine Adsorption auf der Säule stattfindet. Tests auf Adsorption und Mittel, diese durch geeignete Modifizierung des Lösungsmittel zu verhindern, sind dem Fachmann der Gelpermeationschromatographie bekannt.

Immobilisierung

Es gibt viele bekannte Vorschriften zur Immobilisierung von Proteinen oder Polypeptiden auf Chromatographiemedien. Einige davon können zur Immobilisierung von Proteinen mit einzelnen oder mehreren Variablen Domänen verwendet werden. Z.B. kann Diolkieselsäure durch Tresylchlorid aktiviert und anschließend an ein Variable-Domäne-Protein gekoppelt werden. Alternativ kann Epoxy-aktivierte Kieselsäure mit einem Polymer, wie Polyethylenimin (PEI), beschichtet und das Variable-Domäne-Protein mittels eines bifunktionellen Reagenzes, wie Glutaraldehyd, an die Polymerbeschichtung gebunden werden.
Verfahren zur Anbindung von Proteinen an andere Chromatographiemedien auf der Basis von Agarose, Polystyrol, porösem Glas mit kontrollierter Porenverteilung und Kieselgur sind in der Literatur ebenfalls gut eingeführt.
Obgleich wir in der Praxis gefunden haben, daß eine kleine spezifische Bindungseinheit, wie ein Fv, manchmal ohne signifikanten Verlust an Aktivität unmittelbar auf eine Festphase immobilisiert werden kann, kann dies in einigen Fällen nicht möglich sein. Ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die Bindung derartiger kleiner spezifischer Bindungseinheiten an Festphasen mit sogar geringerem Risiko einer Beeinträchtigung ihrer eigentlichen spezifischen Bindungseigenschaften zu erleichtern.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Immunoadsorptionsmaterial bereit, das ein auf einem porösen Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, wobei das spezifische Bindungsreagenz besteht aus:
i) einem oder mehreren Variable-Domäne-Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden), die mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind, und
ii) einer chemischen Gruppe, vorzugsweise einer Peptidgruppe (im folgenden als Bindungsgruppe bezeichnet), die zu den eigentlichen spezifischen Bindungseigenschaften nicht beiträgt, die aber durch chemische oder andere Mittel an ein Festphasenträgermaterial gekoppelt werden kann, ohne daß die eigentliche spezifische Bindungsaktivität des Reagenzes signifikant beeinträchtigt wird. Vorzugsweise umfaßt die Bindungsgruppe mindestens 5 Aminosäurereste. Vorzugsweise umfaßt die Bindungsgruppe nicht mehr als 20 Aminosäurereste.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein an einen Protein-"Schwanz" gebundenes Variable-Domäne-Protein (Dab), der als vorstehend definierte Bindungsgruppe wirkt, wobei der "Schwanz" an ein Chromatographiemedium mit einer Porengröße im Bereich von 30 bis 300 A, vorzugsweise 60 bis 300 A, ohne signifikanten Verlust an spezifischer Bindungsaktivität gekoppelt ist.
Die Eigenschaften der Bindungsgruppe können so gewählt werden, daß sie zur Befestigungsmethode passen, die für die einzusetzende Oberfläche am besten geeignet ist. Die Bindungsgruppe kann hydrophob, hydrophil oder von gemischtem Charakter sein. Sie kann potentielle Stellen für eine kovalente Bindung beinhalten. Vorzugsweise enthält eine derartige Proteinbindungsgruppe mindestens einen, insbesondere eine Vielzahl, von Aminosäureresten, vorzugsweise Cystein, das Sulfhydrylgruppen beinhaltet. Sulfhydrylgruppen können als chemische Kopplungsmittel für die kovalente Anbindung an Chromatographiemedien wirken. Dies kann unter Verwendung eines bispezifischen Reagenzens, wie Succinimidyl-maleimidophenylbutyrat (SMPB), geschehen. Alternativ oder zusätzlich kann die Proteinbindungsgruppe mindestens einen, insbesondere eine Vielzahl, von Lysinresten enthalten, die &epsi;-Aminogruppen besitzen. Die eigentliche Kopplung kann z.B. mittels herkömmlicher bifunktioneller chemischer Vernetzungsmittel erreicht werden. Vorzugsweise ist ein derartiges chemisches Vernetzungsmittel an einer Stelle angeordnet, die ausreichend weit von der Variable-Domäne-Sequenz selbst entfernt ist, so daß ein an die Bindungsgruppe angekoppelter Träger in Entfernung von der Variable-Domäne-Sequenz gehalten wird. Die Bindungsgruppe kann tatsächlich ohne weiteres so gestaltet werden, daß die Kopplungsstelle die spezifische Bindungsregion in eine vorteilhafte, vom Träger entfernte Position orientiert.
Eine weitere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist eine Variable Domäne, die mit einem hydrophoben "Schwanz" versehen ist, der die Immobilisierung der Variablen Domäne durch nicht-kovalente Anbindung an eine hydrophobe Oberfläche, z.B. poröses Kunststoffmaterial, wie poröses Polystyrol, ermöglicht. Kieselsäure, die mit standardmäßigen hydrophoben Liganden, z.B. Alkylketten (z.B. C&sub8; oder C&sub1;&sub8;) oder Phenylgruppen, derivatisiert ist, kann die hydrophoben Schwänze dieses Typs leicht aufnehmen.
Zur Bereitstellung einer Bindungsgruppe mit zur Erzielung der erfindungsgemäßen Zwecke ausreichender Hydrophobie sollte die die Bindungsgruppe umfassende Polypeptidkette eine ausreichende Zahl (wobei bereits 2 ausreichen können, wenn die Reste benachbart sind) an Aminosäureresten enthalten, die aus der aus Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Prolin und Alanin bestehenden Gruppe ausgewählt sind. Wir haben gefunden, daß selbst wenn die Mehrzahl der Aminosäurereste im Polypeptid andere, relativ polare (und daher relativ hydrophile) Aminosäurereste sind, das Vorliegen lediglich eines kleinen Anteils von Resten der vorstehenden Gruppe dem Polypeptid effektive Hydrophobie verleihen kann. Die hydrophobe Region(en) kann (können) Regionen mit hoher Ladungsdichte benachbart sein, d.h. der Peptidanspruch ist von gemischtem Charakter, ohne daß die wesentliche Hydrophobie der Bindungsgruppe als Ganzes verloren geht.
-Eine besonders bevorzugte Bindungsgruppe umfaßt die "Myc"- Aminosäuresequenz
GLU-GLN-LYS-LEU-ILE-SER-GLU-GLU-ASP-LEU-ASN
Da diese Gruppe einen Lysinrest enthält, kann sie auch für die kovalente Anbindung auf Oberflächen verwendet werden.
Die Bindungsgruppe wird normalerweise an oder nahe an einem Ende des Variable-Domäne-Proteins angeknüpft. Normalerweise ist der Anknüpfungspunkt der Amino-Terminus der Peptidbindungsgruppe. Dies ist das linke Ende der in Figur 2 der anliegenden Zeichnungen dargestellten Sequenzen A und B. Vorzugsweise sind das (die) Variable-Domäne-Protein(e) und die Bindungsgruppe zusammen durch Expression in einem genetisch modifizierten Organismus hergestellt worden. Die Polypeptidbindungsgruppe kann z.B. zusammen mit einem Variable-Domäne-Protein synthetisiert (geklont) sein und einen Proteinschwanz an einem Ende der Domäne-Sequenz umfassen. Die Bindungsgruppe umfaßt mindestens etwa 5 Aminosäurereste, um eine hinreichende Länge mitzubringen, um die variable Domäne von der Oberfläche oder dem Tracer, an die (den) sie gebunden ist, "auf Abstand" zu halten.
Gegebenenfalls kann eine variable Domäne mit einem "natürlichen" hydrophoben Polypeptidschwanz, z.B. der Transmembransequenz aus dem Influenzavirus, versehen sein. Ein Phospholipidschwanz wäre eine Alternative.
Die Erfindung beinhaltet auch spezifische Bindungsreagenzien, die aus einer Mehrzahl von Variable-Domäne-Proteinen be stehen. Diese können natürlichen Fv-Fragmenten entsprechen, d.h. der variablen Region einer schweren Kette mit dem variablen Protein einer leichten Kette, oder sie können Kombinationen von Variable-Region-Proteinen von schweren Ketten oder leichten Ketten umfassen. Derartige Kombinationen werden normalerweise durch relativ schwache Wechselwirkungen zusammengehalten. Die einzelnen Variable-Domäne-Proteine können während des Klonens getrennt exprimiert werden. Im allgemeinen kombinieren sie unter milden Bedingungen, die die schwachen Wechselwirkungen, welche ihre Assozuerung verursachen können, nicht inhibieren, von selbst.

Vorteile der Erfindung

Die Immunoaffinitätsreinigung ist ein Verfahren, das als Forschungsinstrument intensiv genutzt wird, aber sie ist in Verfahren im industriellen Maßstab selten eingesetzt worden. Die neuen erfindungsgemäßen Affinitätsmedien mit einzelnen oder mehreren Variablen Domänen als biospezifischem Ligand sind für die Anwendung in Verfahren im industriellen Maßstab aufgrund der folgenden Vorteile besser geeignet.

i) Geringeres Molekulargewicht des Liganden

Einzelne Variable-Domäne-Proteine (Dabs) weisen üblicherweise ein Molekulargewicht von etwa 12000 und Fv-Fragmente von etwa 25000 auf, im Vergleich zu etwa 150000 für einen intakten Antikörper. Die kleinen Proteine können leichter in den kleinen Poren von starren Chromatographiemedien, wie Kieselsäure, untergebracht werden. Die Verwendung von starren Medien erleichtert den Scale-Up von der Laborbank zur industriellen Fertigungsanlage. Chromatographie-Kieselsäuren, die für die Proteinreinigung hergestellt werden, weisen üblicherweise Poren im Bereich von 200 A bis 300 A auf. Einzelne Variable Domänen und Fv-Fragmente passen leicht in diese Poren und der freie Austausch der meisten Antigene kann noch ohne sterische Hinderung stattfinden. Wenn das Antigen jedoch sehr groß ist (z.B. ein Protein von mehr als 150 kD), kann die Verwendung einer Kieselsäure mit bis zu 500 A Porengröße ratsam sein, um den freien Antigenaustausch sicher zu gewährleisten.
Wenn das Antigen sehr klein ist (z.B. ein Peptid oder ein nicht-proteinisches pharmazeutisches Erzeugnis), kann der Einsatz von Kieselsäure mit Poren im Bereich von 30 bis 200 A ratsam sein. Dies würde den Vorteil der größeren Oberfläche von kleinporiger Kieselsäure nutzen, so daß mehr Immunoligand immobilisiert werden könnte, was zu einer Kapazitätszunahme pro Einheitsvolumen führen würde. Ungeachtet der Größe des Zielanalyten gestattet die Verwendung eines kleineren Immunoliganden (Dab oder Fv anstelle eines ganzen Antikörpers) den Einsatz einer entsprechend kleinere Kieselsäureporengröße Kleinporige Kieselsäuren weisen üblicherweise die Vorteile erhöhter Starrheit und einer höheren Oberfläche auf.

ii) Geringere Affinität des Liganden

Man hat gefunden, daß einige einzelne oder mehrere Variable Domänen eine im Vergleich zu einem intakten Antikörper verminderte Affinität zum Antigen aufweisen. Diese Erscheinung kann in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden und gestattet die Desorption des Antigens vom Affinitätsmedium unter milderen Bedingungen, z.B. durch Anwendung weniger stringenter Puffer, als üblicherweise erforderlich sind. Dies weist die zwei wünschenswerten Effekte der Erhöhung der Säulenlebensdauer und eines herabgesetzten Risikos der Inaktivierung des Zielanalyten (d.h. des Antigens) auf.

iii) Geringere Kosten der Ligandenherstellung

Fragmente mit einzelnen oder mehreren Variablen Domänen können aus zwei Gründen mit geringeren Kosten pro Einheit (d.h. Kosten pro Bindungsstelle) hergestellt werden als ein intakter Antikörper. Erstens existieren Expressionssysteme für die Expression derartiger Fragmente in Bakterien. Weil ein Bakterienkulturmedium billiger als ein Säugerzellkulturmedium (das üblicherweise für die Herstellung von intakten Antikörpern durch Hybridomzellen eingesetzt wird) ist, können an dieser Stelle beträchtliche Einsparungen gemacht werden. Zweitens wird, weil die Proteinsynthese hinsichtlich des Zeilmetabolismus sehr kostenaufwendig ist, dadurch ein beträchtlicher Vorteil erzielt, daß die Zelle nur die für die Immunoadsorption (d.h. Bindungsdomänen) erforderlichen Proteinstrukturen statt ganzer Antikörper herstellt.
Weil durch genetische Veränderung hergestellte Dabs und Fvs in der Herstellung pro Bindungsstelle billiger sein sollten als ganze Antikörper, kann die Immunoaffinitätsreinigung nun kostengünstig für ein breiteres Spektrum von Ziel-Analyten eingesetzt werden. Es ist daher wirtschaftlich, niederwertigere und/oder kleinere Analyten zu reinigen, als dies die bisherige Praxis ist.

iv) Geringere "HAMA"-Antwort

Bei der Immunoaffinitäts-Reinigung erwies es sich, daß kleine Mengen des Liganden während des Betriebs von der Säule durchsickern und als Verunreinigung in der Präparation des Ziel-Analyten erscheinen. Wenn der Ziel-Analyt ein injizier bares Therapeutikum ist, kann dies bedenklich sein, da eine Verunreinigung durch einen Maus-Antikörper eine anti-Maus- Immunantwort im Patienten - die sogenannte HAMA-Antwort - hervorrufen kann. Man hat gezeigt, daß die HAMA-Antwort sich primär gegen die Fc-Region des Maus-Antikörpers richtet und daß Variable-Domäne-Fragmente eine verringerte HAMA-Antwort hervorrufen. Etwaige verunreinigende Variable-Domäne-Fragmente in Injektionslösungen sind daher weniger bedenklich als Verunreinigungen durch ganze Maus-Antikörper.

v) Geringere unspezifische Bindung

Es ist wünschenswert, daß wenige oder praktisch keine potentielle Stellen für unspezifische Adsorption auf dem Immunoligand vorliegen. Durch Verringerung der Größe des Immunoliganden auf das für die spezifische Bindung erforderliche Minimum (d.h. Immobilisung lediglich der Bindungsdomäne) wird die spezifische Bindung maximiert und die unspezifische Bindung minimiert.
Ein Immunoadsorptionsmaterial, das eine mit einem spezifischen Bindungsreagenz, das entweder eine einzelne Variable Domäne (Dab) oder ein Fv-Fragment ist, beladene poröse Kieselsäure mit einer Porengröße im Bereich von 30 bis 300 A, vorzugsweise 60 bis 300 A, umfaßt, stellt daher ein sehr vorteilhaftes Material dar. Das Kieselsäureträgermaterial kann relativ preiswert hergestellt werden, und das erhaltene Immunoadsorptionsmaterial ist mechanisch sehr robust und kann in einer breiten Vielzahl von Immunoadsorptions-Anlagen im kommerziellen Maßstab eingesetzt werden.
Die neuen erfindungsgemäßen Immunoadsorptionsmaterialien können zur Extraktion von Stoffen, die ein spezifisches Antigen enthalten, aus Rohstoffen, wie Fermentationsbrühen, Serum, Milchmolke und Blut, eingesetzt werden.

Herstellung von Antikörperfragmenten

Die Erfindung betrifft im Prinzip keine neuartigen Wege zur Herstellung von Antikörper-Fragmenten mit einzelnen Domänen, Fv-Fragmenten oder neuartige Wege zur Herstellung von Kombinationen derartiger Fragmente mit Peptidschwänzen. Fv- Fragmente und Fragmente mit einer einzelnen Domäne können durch klassische Enzym-Verdauung intakter herkömmlicher Antikörper hergestellt werden. Hierzu sei auf Hochman et al, Biochemistry, (1973) Band 12, S. 1130-1135, verwiesen. Vorzugsweise werden sie durch genetische Veränderung, z.B. wie bei Riechmann et al, J. Mol. Biol. (1988), Band 203, S. 825-828, Skerra et al, Science (1988), Band 240, S. 1038- 1040, und Ward et al (1989, s.o.) beschrieben, hergestellt Ward et al (1989) offenbaren die Herstellung eines Anti- Lysozym-Antikörperfragments mit einer einzelnen Domäne und einem "Myc"-Schwanz. Diese Kombination könnte gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, aber Ward et al ziehen die Verwendung des "Myc"-Schwanzes lediglich als Epitop zur Erleichterung ihrer experimentellen Identifizierung und Isolierung des Anti-Lysozym-Dabs, das sie hergestellt hatten, in Betracht. Ward et al machen keinen Vorschlag, daß der "Myc"-Schwanz für die Immobilisierung des Dab auf porösen chromatographischen Medien ideal sein könnte. Wie nachstehend gezeigt, kann das Verfahren von Ward et al ohne weiteres an die Herstellung anderer "Schwänze" an Dab- Fragmenten angepaßt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Variable-Domäne-Fragments und einige Erläuterungen der erfindungsgemäßen Immunoadsorptionsmaterialien sind nachstehend lediglich beispielhaft angegeben.

Zeichnungen

Die anliegenden Zeichnungen zeigen:
Figur 1: Drei zur Herstellung von Antikörperreagenzien mit einer einzelnen Domäne und Bindungsgruppen geeignete Oligonukleotide.
Figur 2: Zwei Bindungsgruppen-Peptidsequenzen, die mittels der in Figur 1 dargestellten Oligonukleotide hergestellt werden können.
Figuren 3a bis 3c: In Beispiel 2b erhaltene Chromatographie- Profile.
Figuren 4a bis 4c: In Beispiel 2c erhaltene Chromatographie- Profile.
Figur 5: In den Beispielen 2c und 2d erhaltene SDS-PAGE- Ergebnisse.
Figur 6: In Beispiel 3 erhaltenes Chromatographie-Profil.
Figuren 7a und 7b: In Beispiel 4 erhaltene Chromatographie- Profile.
Figur 8: In Beispiel 5 erhaltenes Chromatographie-Profil.

Beispiel 1

a) Herstellung eines das Anti-Lysozym-VH-Fragment D1.3 als Pst1-BstEII-Kassette enthaltenden Vektors

Das Anti-Lysozym-VH-Fragment D1.3 wird als Pst1-BstEII- Fragment aus dem Expressionsvektor pSW1-VHD1.3-VKD1.3 ausgeschnitten. Dieser Vektor und der andere in diesem Beispiel eingesetzte Expressionsvektor pSW1-VHPOLY-TAG1 sind von Ward et al (1989) beschrieben worden.
pSW1-VHPOLY-TAG1 wird mit Pst1 und BstEII verdaut, und das Anti-Lysozym-Pst1-BstEII-VH-Fragment aus D1.3 wird in den geöffneten Vektor ligasiert. Diese Ligasierung erzeugt einen Expressionsvektor mit insertiertem VH-D1.3-Fragment, der im wesentlichen dem Expressionsvektor pSW1-VHD1.3-TAG1 (Ward et al) entspricht, aber die Pst1- und BstEII-Restriktionsstellen enthält. Wir können auf diesen Expressionsvektor als pVHD1.3- TAG1 Bezug nehmen.

b) Klonierung einer Bindungsgruppensequenz stromabwärts zum klonierten VH-Gen in pVHD1.3-TAG1

Der Ersatz von TAG1 durch eine Bindungsgruppensequenz stromabwärts vom VH-Gen geschieht mit dem Verfahren der sequenzgerichteten Mutagenese mit großen Oligonukleotiden, wie bei Verhoeyen et al., Science (1988), 239, S. 1534-1536 beschrieben.
Ein einzelsträngiges DNA-Templat wird aus mp19VHD1.3-TAG1 hergestellt. Es handelt sich dabei um das HindIII-EcoRI- Fragment aus pVHD1.3-TAG1, das VH-D1.3 und TAG1, kloniert in die HindIII- und EcoRI-Stellen von mp19, enthält. Aus diesem Klon erhaltene einzelsträngige DNA enthält den codierenden Strang der VH-D1.3-TAG1-Sequenz. An das Templat wird ein DNA- Oligonukleotid hybridisiert, das als Primer für die Polymerisation eines zweiten DNA-Stranges dient. Dieses Oligonukleotid enthält die erforderliche Bindungsgruppensequenz, die an beiden Seiten von 12 der Integrationsstelle homologen Basen flankiert wird. Das doppelsträngige Molekül wird in E.coli transformiert, wo ein bestimmter Anteil der Moleküle durch Einbau der Aktivierungssequenzstruktur "repariert" wird. Die 12 der Integrationsstelle homologen flankierenden Basen sind die letzten 4 Codons von VH-D1.3 und die 2 Stoppcodons, worauf 6 in pVHD1.3-TAG1 vorliegende Base folgen. Das Oligonukleotid ersetzt die TAG1-Gensequenz durch die Bindungsgruppengensequenz.
Die Bindungsgruppe kann von hydrophiler, hydrophober oder gemischter Beschaffenheit sein. Geeignete Restriktionsstellen können zur Erleichterung der Manipulation der DNA-Sequenzen eingebaut werden.
Figur 1 der beiliegenden Zeichnungen zeigt 3 Oligonukleotidsequenzen I, II und III, die im vorstehenden Verfahren geeignet sind. Die Sequenzen I und II sind alternative Sequenzen zur Herstellung einer identischen hydrophilen Bindungsgruppe und III kann zur Herstellung einer hydrophoben Bindungsgruppe eingesetzt werden.
Figur 2 zeigt die CDNA- und Aminosäuresequenzen der zwei Bindungsgruppen A und B. Die Bindungsgruppe A ist hydrophil und kann unter Einsatz von entweder Oligonukleotid I oder II hergestellt werden. Die Bindungsgruppe B ist hydrophob und kann unter Einsatz des Oligonukleotids III hergestellt werden.
Drei auf diese Weise gewonnene Plasmide, in denen die Bindungsgruppensequenzstruktur 12 oder 11 Aminosäuren (n=1) enthält und die pVHD1.3-ADI, pVHD1.3-ADII und pVHD1.3-ADIII bezeichnet werden, werden unter Verwendung der Sequenzen I, II und III hergestellt. Diese Plasmide werden in E.coli (wie bei Ward et al.) exprimiert.
Die VH-Fragmente werden mittels ELISA auf ihre Aktivität und durch SDS-PAGE auf Reinheit überprüft.
Die VH- und VL-Fragmente, mit und ohne "Schwänze", und auch Fv-Fragmente können unter Anwendung ähnlicher Verfahren in Anlehnung an die Lehre in den zuvor zitierten Veröffentlichungen ohne weiteres hergestellt werden.

Beispiel 2: Immobilisierung eines Anti-Lysozym-Fv auf Agarose und dessen Verwendung als Immunoadsorbens

a) Herstellung des Immunoadsorbens

2 mg Anti-Lysozym-Fv (ohne Bindungsgruppe) wurden in einer Konzentration von etwa 400µg/ml gegen Kupplungspuffer (0,1M NaHCO&sub3; + 0,5M NaCl pH8,3) dialysiert. Es wurde ein Dialyseschlauch mit kleiner Öffnung (Spektrum 132580) eingesetzt. CNBr-aktivierte Sepharose 48 (Pharmacia 17-0430-02) wurde gequollen und in 1mM HCl gewaschen. 3 ml gequollenes Gel wurden der Fv-Präparation in einem verschlossenen Gefäß zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC leicht rotiert. Die Sepharose wurde durch Zentrifugieren zurückgewonnen und blockiert, indem sie über Nacht bei 4ºC mit 1M Ethanolamin, aufgefüllt mit Kupplungspuffer, rotiert wurde. Das Immunoadsorbens wurde dreimal in Tris-Puffer (0,1M Tris pH8 + 0,1% Azid) gewaschen und in eine Glassäule (Pharmacia 19-5002-01) gepackt.

b) Isolierung von Lysozym aus einem zehnfachen Überschuß von Albumin

2 mg Hühnerei-Lysozym (Sigma L-6876) und 20 mg Rinderalbumin (Sigma A-7888) wurden in 20 ml Tris-Puffer zusammengegeben. Diese Vorratslösung wurde auf das Immunoadsorbens geladen, das dann dreimal mit Tris-Puffer gewaschen wurde. Gebundenes Protein wurde mit 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert. Die Kapazität des Immunoadsorbens wurde durch Bestimmung des Durchbruchspunkts für Lysozym berechnet. Man fand, daß diese 0,5 mg (s. Figur 3a) betrug. Das Ausmaß der nicht-spezifischen Bindung wurde durch zwei Kontrollversuche bestimmt:

Kontrollversuch 1

20 mg Rinderalbumin wurden in 20 ml Tris-Puffer angesetzt und auf das Immunoadsorbens aufgetragen. Das Immunoadsorbens wurde mit Tris-Puffer gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert.

Kontrollversuch 2

Eine "leere" Säule wurde durch Blockieren von 3 ml gequollener CNBr-aktivierter Sepharose mit 1M Ethanolamin, angesetzt in Kupplungspuffer, hergestellt. Der Fv-Immunoligand wurde nicht zugesetzt. 20 mg Lysozym wurden in 20 ml Tris- Puffer angesetzt und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Tris-Puffer gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert.
In beiden Kontrollexperimenten war die unspezifische Bindung minimal (s. Figur 3b bzw. 3c).

c) Isolierung von Lysozym aus 5%-igem Pferdeserum

1 ml Pferdeserum (Seralab S-0004a) wurde in Tris/Tween-Puffer (0,1M Tris pH8, 0,1% Azid, 0,15% Tween 20 - Sigma P1379) auf 20 ml (d.h. 5% Serum) aufgefüllt. Diese Vorratslösung wurde mit 2 mg Hühnerei-Lysozym versetzt und durch einen 0,45 µm- Filter (Schleicher und Schuell 452100) geleitet. 20 ml des versetzten Serums ("Vorratslösung A") wurde auf das Immunoadsorbens geladen, das anschließend mit Tris/Tween-Puffer gewaschen wurde. Das gebundene Material wurde 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert. Man fand durch Analyse mit SDS-PAGE nach Dialyse gegen Tris-Puffer, daß die eluierte Fraktion homogenes Lysozym war. Das eingesetzte System war ein vorgegossenes Gel (Pharmacia 17-0624-01) in Verbindung mit SDS-Pufferstreifen (Pharmacia 17-0516-01). Das Gel wurde mit Silber-Beize gefärbt. Der Chromatograph ist in Figur 4a, das Elektrophoresegel in Figur 5 dargestellt. Die Beladung der Proben auf das Gel war wie folgt:
Spur 3 Vorratslösung A
Spur 4 aus Vorratslösung A zurückgewonnenes Lysozym
Spur 5 Lysozymstandard
Spur 6 Molekülgewichtsmarker
Das Maß unspezifischer Bindung wurde durch zwei Kontrollversuche bestimmt.

Kontrollversuch 1

20 ml unversetztes Serum (d.h. ohne Lysozymzugabe) wurde wie vorstehend hergesßellt. Das unversetzte Serum wurde in Tris/Tween-Puffer auf das Immunoadsorbens geladen und die Wasch-/Elusions-Bedingungen wurden wie zuvor wiederholt.

Kontrollversuch 2

10 ml versetztes Serum wurden auf die "leere" Säule (beschrieben in Beispiel 3b) in Tris/Tween-Puffer geladen und die Elutions-Bedingungen wurden wie zuvor wiederholt.
In beiden Kontrollversuchen war die unspezifische Bindung minimal (s. Figur 4b bzw. 4c)

d) Isolierung von Lysozym aus einem Proteingemisch

Jeweils 4 mg der folgenden Proteine wurden zusammengegeben, in Tris/Tween-Puffer auf 30 ml aufgefüllt und durch einen 0,45 µm-Mikrofiler geleitet:
Rinderalbumin (Sigma A-7888), Myoglobin (Sigma), Hämoglobin (eigene Präparation), Trypsin (Sigma T- 8003), Lysozym (Sigma L-6876), Transferrin (Sigma), Cytochrome-c (Sigma C-7752) und Ovalbumin (Sigma).
Dieses Proteingemisch ("Vorratslösung B") wurde auf das Immunoadsorbens geladen, das anschließend mit Tris/Tween- Puffer gewaschen wurde. Das gebunden Material wurde mit 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert. Man fand durch Analyse mit SDS-PAGE nach Dialyse gegen Tris-Puffer, daß die eluierte Fraktion homogenes Lysozym war (Figur 5).
Die Beladung der Proben auf das Gel war wie folgt:
Spur 1 Vorratslösung B
Spur 2 aus Vorratslösung B zurückgewonnenes Lysozym
Spur 5 Lysozym-Standard
Spur 6 Molekülgewichtsmarker.

Beispiel 3: Immobilisierung eines Anti-Lysozym-Fv auf poröse Kieselsäure und dessen Verwendung als Immunoadsorbens

a) Herstellung des Immunoadsorbens

6 mg Anti-Lysozym-Fv (mit TAG1, d.h. dem "Myc"-Schwanz, als Bindungsgruppe) wurde in einer Konzentration von etwa 240 µg/ml gegen Phosphatpuffer (0,1M NaH&sub2;PO&sub4; pH7) dialysiert. Der Dialyseschlauch war Spektrum (132580). Glutaraldehyd-aktivierte Kieselsäure mit etwa 200 A Porengröße (PREPSCALE Glutaraldehyd-P, J T Baker 7567-02) wurde in Phosphatpuffer gewaschen. 3,5 ml der gewaschenen Kieselsäure wurden der Fv- Präparation in einem verschlossenen Gefäß zugegeben. Das Gemisch wurde langsam rotiert, und Natriumcyanoborhydrid wurde bei 4ºC in Aliquoten über einen Zeitraum von 5 Stunden zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von 0,1M erreicht wurde, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC geschüttelt. Das Produkt (Immunoadsorbens) wurde mit Phosphatpuffer, anschließend mit 1M Natriumchlorid enthaltendem Phosphatpuffer gewaschen. Das Immunoadsorbens wurde dann gewaschen und über Nacht bei 4ºC mit 0,2M pH7 Ethanolamin gewaschen. Das Immunoadsorbens wurde in Tris-Puffer äquilibriert und in eine Glassäule (Pharmacia 19-5002-01) gepackt.

b) Isolierung von Lysozym aus einem 25fachen Überschuß von Cytochrom-c

Ein Gemisch von 2 Proteinen wurde nach den folgenden Angaben in Tris-Puffer angesetzt: Hühnerei-Lysozym (Sigma L-6876) @ 0,04 mg/ml und Cytochrom-c (Sigma C-7752) @ 1 mg/ml. 20 ml dieses Gemisches wurden auf das Immunoadsorbens geladen, das anschließend mit Tris-Puffer gewaschen wurde. Das gebundene Material wurde mit 4M MgCl&sub2;, angesetzt in Tris-Puffer, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde gegen Tris-Puffer unter Verwendung eines Spektrum-Dialyseschlauchs (132580) dialysiert. Unter Verwendung eines zum Nachweis beider Proteine auf 280 nm gestellten On-line-Spektrophotometers (LKB "UVI- CORD") wurde ein Chromatographieprofil erzeugt.
Das Schicksal von Lysozym und Cytochrom-c wurde bestimmt, indem man spezifische Messungen für diese beiden Proteine über das Chromatographie-Profil (Figur 6) machte. Lysozym wurde durch Messung der Enzymaktivität unter Einsatz einer Suspension von Micrococcus (Sigma M-3770) bestimmt. 2,5 ml Micrococcus Lysodelkticus-Suspension, die 1,5 mg M-3770 in 10 ml 0,066M Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,24, enthielt, wurde bei 25ºC in eine Quarzküvette (1 cm Lichtweg) pipettiert. Die Extinktion dieser Suspension bei 450 nm lag zwischen 0,6 und 0,7, bei Messung unter Einsatz eines LKB-"ULTRASPEC"- Photometers. Die Lysozymlösung wurde zugesetzt und die Abnahme der Extinktion bei 450 nm beobachtet, um die Veränderung/Minute zu erhalten, wobei die maximale lineare Geschwindigkeit verwendet und mit einem bekannten Lysozymstandard verglichen wurde, um die Menge von Enzymeinheiten pro ml zu bestimmen. Cytochrom-c wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei 406 nm, dem Absorptionsmaximum für dieses Protein, gemessen wurde.
Man fand, daß die Auftrennung von Lysozym vom Cytochrom-c vollständig und der Durchbruch für Lysozym scharf war (Figur 6). Weil Cytochrom-c und Lysozym physikalisch sehr ähnlich sind (Cytochrom-c: M.W. = 12300, pl 10,5; Lysozym: M.W. = 14500, pI = 11,0) stellt deren vollständige Auftrennung ein hohes Auflösungsereignis dar.

Beispiel 3c: Immunoelektronenmikroskopie eines Immunoadsorbens zum Nachweis der Verteilung von gebundenem Lysozym

Das vorstehend beschriebene Immunoadsorbens wurde aus der Säule entfernt. Das Immunoadsorbens wurde in eine 1 mg/ml- Lösung von Lysozym in Tris-Puffer gegeben. Überschüssiges Lysozym wurde durch Waschen mit Tris entfernt. Die Kieselsäureteilchen wurden unter Verwendung von 1% Paraformaldehyd plus 0,05% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung 2 Stunden lang bei 4ºC fixiert, anschliessend in Harz eingebettet. Ultradünne Schnitte (etwa 90 nm dick) wurden auf Nickelgitter hergestellt.
Die Gitter und Schnitte wurden mit 1% Ovalbumin plus 5% Ziegenserum in phosphatgepufferter Salzlösung blockiert, anschließend über Nacht in einer Lösung von Kaninchen-anti- Lysozym-Antikörper, angesetzt in 1% Ovalbumin, 5% Ziegenserum, 0,1% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung, stehen gelassen. Die Gitter wurden dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und mit mit 5 nm kolloidalem Gold (Biocell) konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert.
Die Elektronenmikroskopie zeigte, daß das Lysozym gleichmäßig über die Kieselsäureteilchen verteilt war. Eine Negativkontrolle, bei der der Kaninchen-anti-Lysozym-Antikörper ausgelassen wurde, diente als Leerprobe. Das Enzym war über die poröse Struktur des Kieselsäureträgers gleichmäßig dispergiert, was anzeigt, daß das Fv über die ganze Oberfläche in den Poren angeordnet und das Enzym ebenfalls in den Poren gebunden worden ist.

Beispiel 4: Isolierung von Lysozym aus Serum unter Einsatz von auf Kieselsäure immobilisiertem Fv-Fragment

a) Herstellung des Immunoadsorbens

Epoxy-Kieselsäureteilchen mit einer Porengröße von etwa 200 A (C200, Crosfield Chemicals) wurden nach dem Verfahren von Mohan et al (In Separations for Biotechnology, herausgegeben von D. L. Pyle, 1990) in das Diol-Derivat überführt. Die C200-Diol-Teilchen wurden wie folgt tresyliert:
2 g Diol-Kieselsäure wurden in 100 ml trockenem Aceton (BDH) mild gerührt, das 0,76 ml trockenes Triethylamin (Fluka) und 0,666 g 4-Dimethylaminopyridin (Fluka) enthielt. 50 ml einer 2%-igen Lösung von Tresylchlorid (Fluka), angesetzt in trockenem Aceton, wurden langsam in die mild gerührte Kieselsäure über einen Zeitraum von 2 Stunden (wobei die Temperatur unter 30ºC gehalten wurde) getropft. Nach einer weiteren Stunde wurde der Inhalt auf einem Filtertrichter und -papier (Whatman Nr. 1) unter Verwendung von Ethanol (BDH) gewaschen. Weiteres Waschen mit Ethanol wurde durchgeführt (5 x 30 ml), worauf mit einem 1:1-Ethanol/Aceton-Gemisch (5 x 30 ml) und abschließend nur mit Aceton (5 x 30 ml) gewaschen wurde. Die Kieselsäure wurde in einem Umluftofen (Ventilator) über Nacht bei 3000 getrocknet.
0,9 g tresyliertes C200 wurden mit 100 ml 1M NaCl und anschließend 100 ml Boratpuffer (0,1M Na&sub2;8&sub4;0&sub7;/HCl, pH 8,5) gewaschen. Die Kieselsäure wurde dann zu 14 ml einer Lösung von Anti-Lysozym-Fv (ohne Bindungsgruppe) gegeben und über Nacht bei 4ºC in einem verschlossenen Gefäß rotiert. Die Fv- Lösung betrug etwa 350 ug/ml in PBS (0,01M Natriumphosphat, 0,15M NaCl, pH7). Das Immunoadsorbens wurde durch Zentri fugation zurückgewonnen. Durch Analyse mit dem BCA-Protein- Assay (Pierce) fand man, daß etwa 1 mg des Fv-Proteins gekoppelt worden ist. Das Immunoadsorbens wurde blockiert, indem man es über Nacht in 1M Ethanolamin, angesetzt in Boratpuffer, rotierte. Das Immunoadsorbens wurde anschließend dreimal in Tris-Puffer gewaschen und in eine Glassäule gepackt.

b) Isolierung von Lysozym aus 10% Pferdeserum

20 ml 10% Pferdeserum (verdünnt in Tris-Puffer) wurden mit Hühnerei-Lysozym auf eine Endkonzentration von 0,02 mg/ml versetzt. Das versetzte Serum wurde über einen 0,45 µm-Filter geleitet und auf das Immunoadsorbens geladen, eluiert und wie in Beispiel 3b analysiert. Man fand, daß der eluierte Peak mit Lysozym hoch angereichert war (Figur 7a).
Zur Bestimmung des Ausmaßes an unspezifischer Bindung wurde eine "leere" Säule hergestellt, indem 0,2 g tresyliertes 0200 mit 1M Ethanolamin, angesetzt in Boratpuffer, blockiert wurden. Der Fv-Immunoligand wurde nicht zugegeben. 5 ml 10% Pferdeserum wurden mit Hühnerei-Lysozym auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml versetzt und auf die Leer-Säule aufgetragen. Die Säule wurde wie zuvor gewaschen und eluiert. Weder Lysozym noch Serum banden an die Säule (Figur 7b).
Dies demonstriert, daß die Eluierung von Lysozym mittels spezifischer Wechselwirkungen mit dem Fv-Immunoliganden geschieht.

Beispiel 5: Immobilisierung eines Anti-Lysgzym-Dabs auf poröser Kieselsäure und deren Verwendung als Immunoadsorbens

a) Herstellung des Immunoadsorbens

1 g Glutaraldehyd-aktivierte Kieselsäure mit etwa 200 A Porengröße (PREPSCALE Glutaraldehyd-P., J. T. Baker 7567-02) wurden wie in Beispiel 3a gewaschen. Die gewaschene Kieselsäure wurde zu 10 ml einer Dab-Präparation zugegeben.
Das Dab war ein Anti-Lysozym-VH mit dem "Myc"-Peptid als Bindungsgruppe. Die Konzentration des Proteins betrug etwa 70 µg/ml in PBS (0,01M Natriumphosphat, 0,15M NaCl, pH7). Die Kupplung wurde wie in Beispiel 3a durchgeführt.

b) Isolierung von Lysozym aus einem 10fachen Überschuß von Cytochrom-c

Ein Gemisch von 2 Proteinen wurde nach den folgenden Angaben in Tris/Tween-Puffer (0,1M Tris, pH8, 0,15% Tween) angesetzt: Hühnerei-Lysozym @ 0,01 mg/ml und Cytochrom-c @ 0,1 mg/ml. 20 ml dieses Gemisches wurden auf das Immunoadsorbens geladen, eluiert und wie in Beispiel 3b analysiert. Das Schicksal des Lysozyms und Cytochrom-c wurde wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt.
Man fand, daß die Abtrennung von Lysozym von Cytochrom-c vollständig war (Figur 8). Da Cytochrom-c und Lysozym sehr ähnliche Molekülgewichte und isoelektrische Punkte aufweisen, stellt ihre vollständige Auftrennung ein hohes Auflösungsereignis dar.

Claims

1. Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem porösen Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 25000, das aus einem oder mehreren Variable-Domäne- Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden) besteht, umfaßt.

2. Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem porösen Festphasenträgermaterial immobilisiertes Fv-Fragment oder Dab umfaßt.

3. Immunoadsorptionsmaterial nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Trägermaterial eine nominale Porengröße von weniger als 1000 A, vorzugsweise weniger als etwa 500 A, und insbesondere weniger als etwa 300 A, au£weist.

4. Immunoadsorptionsmaterial nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial eine nominale Porengröße von mindestens etwa 30 A, vorzugsweise mindestens etwa 60 A, aufweist.

5. Immunoadsorptionsmaterial nach einen der vorstehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial poröse amorphe Kieselsäure oder poröses Glas mit kontrollierter Porenverteilung ist.

6. Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem porösen Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, wobei das spezifische Bindungsreagenz besteht aus:

i) einem oder mehreren Variable-Domäne-Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden), die mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind, und

ii) einer chemischen Gruppe, vorzugsweise einer Peptidgruppe, die zu den eigentlichen spezifischen Bindungseigenschaften nicht beiträgt, die aber durch chemische oder andere Mittel an ein Festphasenträgermaterial gekoppelt werden kann, ohne daß die eigentliche spezifische Bindungsaktivität des Reagenzes signifikant beeinflußt wird.

7. Immunoadsorptionsmaterial nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das spezifische Bindungsreagenz, Fv-Fragment oder Dab über eine Peptidbindungsgruppe an das Trägermaterial gekoppelt ist, die mindestens 5 Aminosäurereste, jedoch vorzugsweise nicht mehr als 20 Aminosäurereste, umfaßt.

8. Immunoadsorptionsmaterial nach Anspruch 7, wobei die Bindungsgruppe hydrophob ist.

9. Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem Festphasenträgermaterial immobilisiertes spezifisches Bindungsreagenz umfaßt, das aus einer Vielzahl von Variable-Domäne- Proteinen (VH und/oder VL, wobei entsprechende VH und VL nur durch natürliche Wechselwirkungen zusammengehalten werden) besteht, welche mit keinerlei wesentlichem Anteil der (des) ursprünglichen Antikörper(s) assoziiert sind.

10. Immunoadsorptionsmaterial, das ein auf einem Festphasenträgermaterial immobilisiertes natürliches Fv-Fragment umfaßt.

11. Immunoadsorptionsmaterial, das ein einkettiges Fv umfaßt, das auf einem porösen Festphasenträgermaterial mit einer nominalen Porengröße von weniger als 1000 A, vorzugsweise weniger als etwa 500 A und insbesondere weniger als etwa 300 A immobilisiert ist.

12. Immunoadsorptionsmaterial nach Anspruch 11, wobei das Trägermaterial eine nominale Porengröße von mindestens etwa 30 A, vorzugsweise mindestens etwa 60 A, aufweist.

13. Verwendung eines Immunoadsorptionsmaterials nach einem der vorstehenden Ansprüche in einem Affinitätsreinigungsverfahren.

14. Verwendung eines Immunoadsorptionsmaterials, welches ein Fv-Fragment oder Dab auf einem porösen Trägermaterial, ausgewählt aus der aus amorpher Kieselsäure, porösem Glas mit kontrollierter Porenverteilung und synthetischen Polymeren und Copolymeren bestehenden Gruppe, umfaßt, wobei das Trägermaterial eine nominale Porengröße im Bereich von 30 bis 300 A aufweist, um die Geschwindigkeit und/oder den Durchsatz eines Affinitätsreinigungsverfahrens zu erhöhen.