JPH0518968A - 試 薬 - Google Patents
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- JPH0518968A JPH0518968A JP2411240A JP41124090A JPH0518968A JP H0518968 A JPH0518968 A JP H0518968A JP 2411240 A JP2411240 A JP 2411240A JP 41124090 A JP41124090 A JP 41124090A JP H0518968 A JPH0518968 A JP H0518968A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】特異的結合特性を有する試薬、並びにかかる試
薬の免疫吸着法、特に免疫アフィニティー精製法におけ
る用途を提供する。 【構成】改良されたアフィニティー精製用媒体が、３０
乃至１０００オングストロームの範囲に孔径を有する多
孔質担体材料上に固定化した小さな特異的結合剤、特に
Ｆｖ抗体フラグメントまたは単一領域抗体フラグメント
を含む免疫吸着剤材料の使用によって与えられる。該特
異的結合剤は i) 元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質と、ii) 基本的な特異的結合特性には寄与し
ないが該結合剤の基本的な特異的結合活性にさほど影響
を与えることなく該固相担体材料と化学的手段もしくは
他の手段でカップリングし得る化学基（好ましくはペプ
チド基）とを含んでなるものであってもよく、該ペプチ
ド連結基としては第２図に示すようなアミノ酸配列を有
するものが挙げられる。
薬の免疫吸着法、特に免疫アフィニティー精製法におけ
る用途を提供する。 【構成】改良されたアフィニティー精製用媒体が、３０
乃至１０００オングストロームの範囲に孔径を有する多
孔質担体材料上に固定化した小さな特異的結合剤、特に
Ｆｖ抗体フラグメントまたは単一領域抗体フラグメント
を含む免疫吸着剤材料の使用によって与えられる。該特
異的結合剤は i) 元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質と、ii) 基本的な特異的結合特性には寄与し
ないが該結合剤の基本的な特異的結合活性にさほど影響
を与えることなく該固相担体材料と化学的手段もしくは
他の手段でカップリングし得る化学基（好ましくはペプ
チド基）とを含んでなるものであってもよく、該ペプチ
ド連結基としては第２図に示すようなアミノ酸配列を有
するものが挙げられる。
Description
【０００１】本発明は、特異的結合特性を有する試薬、
並びにかかる試薬の免疫吸着法、特に免疫アフィニティ
ー精製法における用途に関する。
並びにかかる試薬の免疫吸着法、特に免疫アフィニティ
ー精製法における用途に関する。
【０００２】天然の抗体は、ポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体のいずれについても、特異的結合剤と
してこれまでかなり長い間にわたって使用されてきた。
これらは固相に固定化すると精製に使用できる。
ノクローナル抗体のいずれについても、特異的結合剤と
してこれまでかなり長い間にわたって使用されてきた。
これらは固相に固定化すると精製に使用できる。
【０００３】抗体は複数鎖からなる大きくて複雑なタン
パク質構造体である。ある時期、かかる構造体のかなり
の部分は抗体の特異的結合特性とは無関係であると認識
されていたが、適当な特異的結合特性を与えるのに必要
な最小部分に関しては論争の的であった。しかし、いわ
ゆるＦｖフラグメント（即ち、本質的に単一重鎖可変部
とそれに対応する軽鎖可変部のみを含む抗体フラグメン
ト）が特異的結合活性を示し得ることが既に判明してい
る。最近、ワード（Ward）他によって抗体の単一可変領
域（single variable domain; Ｄａｂ）がかなりの特異
的結合活性を示すことも明らかにされた（Nature, 1989
年第 341巻 544-546頁）。ワード他の記載した上記単一
可変領域抗体の製造に関しても1990年５月16日に刊行さ
れた欧州特許公開公報第 0368684号（Medical Research
Counsil）に記載されている。Ｄａｂよりもずっと短い
ペプチド、いわゆるパラログ (paralog)を抗体の結合特
性にある程度似せて設計することができることに関して
も、現時点で幾つかの証拠がある（カウヴァ (Kauva)
他、Biochromatography,第５巻1990年22頁）。
パク質構造体である。ある時期、かかる構造体のかなり
の部分は抗体の特異的結合特性とは無関係であると認識
されていたが、適当な特異的結合特性を与えるのに必要
な最小部分に関しては論争の的であった。しかし、いわ
ゆるＦｖフラグメント（即ち、本質的に単一重鎖可変部
とそれに対応する軽鎖可変部のみを含む抗体フラグメン
ト）が特異的結合活性を示し得ることが既に判明してい
る。最近、ワード（Ward）他によって抗体の単一可変領
域（single variable domain; Ｄａｂ）がかなりの特異
的結合活性を示すことも明らかにされた（Nature, 1989
年第 341巻 544-546頁）。ワード他の記載した上記単一
可変領域抗体の製造に関しても1990年５月16日に刊行さ
れた欧州特許公開公報第 0368684号（Medical Research
Counsil）に記載されている。Ｄａｂよりもずっと短い
ペプチド、いわゆるパラログ (paralog)を抗体の結合特
性にある程度似せて設計することができることに関して
も、現時点で幾つかの証拠がある（カウヴァ (Kauva)
他、Biochromatography,第５巻1990年22頁）。
【０００４】免疫吸着法において実用に供するために
は、特異的結合活性だけでは不十分である。特異的結合
剤はまたカラム内の担体材料のような固相に結合し得る
ものでなくてはならない。理想的には、この結合は特異
的結合活性に如何なる顕著な悪影響も与えずに達成され
る。かかる悪影響は、特異的結合領域の化学的変化もし
くはコンフォメーション変化、或いは単に特異的結合領
域に接近する際の物理的（立体）障害によって容易に生
じ得る。従来の特異的結合試薬の場合、とりわけ抗体分
子全体又はＦａｂフラグメントのような抗体分子の大き
な部分の場合、単数もしくは複数個存在する特異的結合
領域は分子全体のほんのわずかな部分しか占めない。特
異的結合活性には直接関与しないことが明らかな、分子
の比較的広範な残余部分は、固相との化学的又は物理的
結合に関与し得る部位の存在する機会を著しく増やす。
得られる結合が特異的結合活性を妨害しなくて済むよう
に、これらの領域は本質的な特異的結合領域からは比較
的離れていてもよい。
は、特異的結合活性だけでは不十分である。特異的結合
剤はまたカラム内の担体材料のような固相に結合し得る
ものでなくてはならない。理想的には、この結合は特異
的結合活性に如何なる顕著な悪影響も与えずに達成され
る。かかる悪影響は、特異的結合領域の化学的変化もし
くはコンフォメーション変化、或いは単に特異的結合領
域に接近する際の物理的（立体）障害によって容易に生
じ得る。従来の特異的結合試薬の場合、とりわけ抗体分
子全体又はＦａｂフラグメントのような抗体分子の大き
な部分の場合、単数もしくは複数個存在する特異的結合
領域は分子全体のほんのわずかな部分しか占めない。特
異的結合活性には直接関与しないことが明らかな、分子
の比較的広範な残余部分は、固相との化学的又は物理的
結合に関与し得る部位の存在する機会を著しく増やす。
得られる結合が特異的結合活性を妨害しなくて済むよう
に、これらの領域は本質的な特異的結合領域からは比較
的離れていてもよい。
【０００５】しかし、元の単数もしくは複数の抗体の如
何なる実質的部分とも結合していない１種類以上の可変
領域のみを基本的に含んでなる特異的結合性のもの、例
えばＦｖフラグメント又は単一可変領域の場合、基本的
な特異的結合活性に関与する分子の相対的割合は非常に
高い。実際、小さな特異的結合性物質を固相に結合させ
る如何なる試みにおいても、基本的な特異的結合活性が
悪影響を受ける非常に高い危険性を必然的に伴っている
ものと予想される。
何なる実質的部分とも結合していない１種類以上の可変
領域のみを基本的に含んでなる特異的結合性のもの、例
えばＦｖフラグメント又は単一可変領域の場合、基本的
な特異的結合活性に関与する分子の相対的割合は非常に
高い。実際、小さな特異的結合性物質を固相に結合させ
る如何なる試みにおいても、基本的な特異的結合活性が
悪影響を受ける非常に高い危険性を必然的に伴っている
ものと予想される。
【０００６】しかしながら、今回我々は、驚くべきこと
に、小さな特異的結合剤を多孔質担体材料上に固定化す
ることが可能であることを発見した。実際、小さな特異
的結合剤を多孔質担体材料上に固定化することが単に可
能なだけでなく、小さな特異的結合剤の使用に伴って改
良された担体材料の利用が可能となるために得られた免
疫吸着剤の特性を高めることができる。本発明を用いる
ことによって、免疫吸着法を、卓上規模の実験技術か
ら、工業的に重要な広範な材料の工業的回収又は精製に
適した規模で経済的かつ効率的に応用することのできる
技術に変化させることが可能になる。
に、小さな特異的結合剤を多孔質担体材料上に固定化す
ることが可能であることを発見した。実際、小さな特異
的結合剤を多孔質担体材料上に固定化することが単に可
能なだけでなく、小さな特異的結合剤の使用に伴って改
良された担体材料の利用が可能となるために得られた免
疫吸着剤の特性を高めることができる。本発明を用いる
ことによって、免疫吸着法を、卓上規模の実験技術か
ら、工業的に重要な広範な材料の工業的回収又は精製に
適した規模で経済的かつ効率的に応用することのできる
技術に変化させることが可能になる。
【０００７】本発明の一つの具体的態様は、多孔質固相
担体材料上に固定化した約２５０００以下の分子量を有
する特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料である。
担体材料上に固定化した約２５０００以下の分子量を有
する特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料である。
【０００８】本発明は、特に、多孔質固相担体材料上に
固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料にして、
該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）を含んでなる免疫吸
着剤材料を供する。特異的結合剤は単一可変領域タンパ
ク質（Ｄａｂ）であっても、複数の可変領域が組合わさ
ったもの（特にＦｖフラグメント）であってもよい。Ｆ
ｖフラグメントは「天然型」Ｆｖ（この場合ＶＨとＶＬ
は疎水結合している）であっても「単鎖」Ｆｖ（この場
合ＶＨとＶＬは短いペプチドで結合している）であって
もよい。
固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料にして、
該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）を含んでなる免疫吸
着剤材料を供する。特異的結合剤は単一可変領域タンパ
ク質（Ｄａｂ）であっても、複数の可変領域が組合わさ
ったもの（特にＦｖフラグメント）であってもよい。Ｆ
ｖフラグメントは「天然型」Ｆｖ（この場合ＶＨとＶＬ
は疎水結合している）であっても「単鎖」Ｆｖ（この場
合ＶＨとＶＬは短いペプチドで結合している）であって
もよい。
【０００９】従来の多孔質固相担体材料、例えばアガロ
ース、ポリスチレン、制御された多孔質ガラス（contro
lled pore glass;ＣＰＧ）、セルロース、デキストラ
ン、アガロースを充填したケイソウ土、並びに疎水性
「Ｐｗ」ポリマー（東ソー株式会社から市販）、疎水性
としたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、N-ア
クリロイル-2‐アミノ-2‐ヒドロキシメチル-1,3‐プロ
パンジオールの（所望により他のモノマーとの）重合
体、2-ヒドロキシメタクリレートとエチレンジメタクリ
レートとの共重合体（ＨＥＭＡ）等の合成ポリマー及び
コポリマーを使用し得る。特に好ましい担体材料は多孔
質無定形シリカである。これらの担体材料は粒状（例え
ば抽出カラムに一般に使用されるビーズ又は粒体）のも
のであっても、例えばメンブラン又はフィルター（これ
らは平板状であってもプリーツ状であっても、或いは中
空の繊維又は管であってもよい）のようなシート状のも
のであってもよい。
ース、ポリスチレン、制御された多孔質ガラス（contro
lled pore glass;ＣＰＧ）、セルロース、デキストラ
ン、アガロースを充填したケイソウ土、並びに疎水性
「Ｐｗ」ポリマー（東ソー株式会社から市販）、疎水性
としたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、N-ア
クリロイル-2‐アミノ-2‐ヒドロキシメチル-1,3‐プロ
パンジオールの（所望により他のモノマーとの）重合
体、2-ヒドロキシメタクリレートとエチレンジメタクリ
レートとの共重合体（ＨＥＭＡ）等の合成ポリマー及び
コポリマーを使用し得る。特に好ましい担体材料は多孔
質無定形シリカである。これらの担体材料は粒状（例え
ば抽出カラムに一般に使用されるビーズ又は粒体）のも
のであっても、例えばメンブラン又はフィルター（これ
らは平板状であってもプリーツ状であっても、或いは中
空の繊維又は管であってもよい）のようなシート状のも
のであってもよい。
【００１０】比較的非圧縮性の担体、特にシリカが好ま
しい。これらは、カラムに充填した場合アガロースのよ
うな柔らかい担体材料にかけることのできる圧力よりも
かなり高い圧力で操作することができるので、工業的規
模でのクロマトグラフィーに使用する際に重大な利点を
有する。さらに、シリカ、ガラス、並びに「Ｐｗ」ポリ
マーのような合成ポリマー又はコポリマーは、撹拌式タ
ンク及び流動式ベッド内での使用に特に適した密度を有
している。これらの媒体は高速分析用分離法に対しても
好ましい。
しい。これらは、カラムに充填した場合アガロースのよ
うな柔らかい担体材料にかけることのできる圧力よりも
かなり高い圧力で操作することができるので、工業的規
模でのクロマトグラフィーに使用する際に重大な利点を
有する。さらに、シリカ、ガラス、並びに「Ｐｗ」ポリ
マーのような合成ポリマー又はコポリマーは、撹拌式タ
ンク及び流動式ベッド内での使用に特に適した密度を有
している。これらの媒体は高速分析用分離法に対しても
好ましい。
【００１１】本発明の重要な具体的態様は、多孔質シリ
カ等の上に固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材
料にして、該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗
体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類以上
の可変領域タンパク質を含んでなる免疫吸着剤材料であ
る。
カ等の上に固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材
料にして、該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗
体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類以上
の可変領域タンパク質を含んでなる免疫吸着剤材料であ
る。
【００１２】本発明の特に重要な具体的態様は、３０オ
ングストローム以上ではあるが１０００オングストロー
ム未満の孔径を有する多孔質担体材料（シリカ等）上に
固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料にして、
該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質を含んでなる免疫吸着剤材料である。好まし
くは、担体は６０オングストローム以上の孔径を有す
る。好ましくは、孔径は５００オングストローム以下、
より好ましくは３００オングストローム以下である。
ングストローム以上ではあるが１０００オングストロー
ム未満の孔径を有する多孔質担体材料（シリカ等）上に
固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材料にして、
該特異的結合剤が元の単数もしくは複数の抗体の如何な
る実質的部分とも結合していない１種類以上の可変領域
タンパク質を含んでなる免疫吸着剤材料である。好まし
くは、担体は６０オングストローム以上の孔径を有す
る。好ましくは、孔径は５００オングストローム以下、
より好ましくは３００オングストローム以下である。
【００１３】本発明の別の重要な態様は、３０乃至３０
０オングストロームの範囲内の呼称孔径を有する多孔質
担体材料にして、無定形シリカ、制御された多孔質ガラ
ス、及び合成ポリマーもしくはコポリマーからなる群か
ら選択した多孔質担体材料上にＦｖフラグメント又はＤ
ａｂフラグメントを含む免疫吸着剤材料の、アフィニテ
ィー精製法の速度及び／又は処理量を向上させることを
目的とする用途である。
０オングストロームの範囲内の呼称孔径を有する多孔質
担体材料にして、無定形シリカ、制御された多孔質ガラ
ス、及び合成ポリマーもしくはコポリマーからなる群か
ら選択した多孔質担体材料上にＦｖフラグメント又はＤ
ａｂフラグメントを含む免疫吸着剤材料の、アフィニテ
ィー精製法の速度及び／又は処理量を向上させることを
目的とする用途である。
【００１４】便宜上、本発明を特に担体材料としてシリ
カを使用した場合について説明する。ただし、本発明が
シリカと類似の性質を有する他の多孔質担体材料の使用
を包含することは当業者の容易に理解するところであろ
う。
カを使用した場合について説明する。ただし、本発明が
シリカと類似の性質を有する他の多孔質担体材料の使用
を包含することは当業者の容易に理解するところであろ
う。
【００１５】クロマトグラフィー用シリカは一般に３０
乃至３００オングストロームの範囲内に呼称孔径を有す
る。２００乃至３００オングストロームの孔径のシリカ
が市販されており、従来の物理的タンパク質分離に使用
するための大孔径固相として推奨されていた。これらの
シリカは、リガンドで誘導体を作って陰イオン交換体等
の官能性高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と
することができる。
乃至３００オングストロームの範囲内に呼称孔径を有す
る。２００乃至３００オングストロームの孔径のシリカ
が市販されており、従来の物理的タンパク質分離に使用
するための大孔径固相として推奨されていた。これらの
シリカは、リガンドで誘導体を作って陰イオン交換体等
の官能性高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と
することができる。
【００１６】２００乃至３００オングストロームの孔径
を有するシリカはさらに強固であり、かかる材料を充填
したカラムは高圧で操作することができる。しかしなが
ら、かかるシリカは従来の免疫試薬（例えば抗体分子全
体又はＦａｂフラグメントのような抗体分子の大きな部
分）用の担体としては極めて不適当であった。その理由
は、かかる大きな分子はシリカの細孔に丁度釣合った大
きさであるとしても、得られる免疫吸着剤材料は、抗原
の入るべき細孔に空いた場所がほとんどなく特異的結合
剤で埋まってしまうために、非常に効率が悪い。（モハ
ーン(Mohan) 他、Separations for Biotechnology (D L
Pyle 編、1990年) 参照）。インタクトな抗体をシリカ
担体上の免疫吸着剤材料として使用する場合、シリカの
孔径は例えば１０００オングストロームを超えるような
かなり大きなものでなくてはならない。１０００オング
ストロームの孔径のシリカは三つの欠点を有している。
即ち、それらは製造費用が高い点、強固さに欠ける点、
並びに単位体積辺りの表面積が小さい点（これは固定化
し得るリガンドの量を制限することにも繋がる）であ
る。リッチー (Ritchie)他のChromatography and Analy
sis (1990 年) 参照。
を有するシリカはさらに強固であり、かかる材料を充填
したカラムは高圧で操作することができる。しかしなが
ら、かかるシリカは従来の免疫試薬（例えば抗体分子全
体又はＦａｂフラグメントのような抗体分子の大きな部
分）用の担体としては極めて不適当であった。その理由
は、かかる大きな分子はシリカの細孔に丁度釣合った大
きさであるとしても、得られる免疫吸着剤材料は、抗原
の入るべき細孔に空いた場所がほとんどなく特異的結合
剤で埋まってしまうために、非常に効率が悪い。（モハ
ーン(Mohan) 他、Separations for Biotechnology (D L
Pyle 編、1990年) 参照）。インタクトな抗体をシリカ
担体上の免疫吸着剤材料として使用する場合、シリカの
孔径は例えば１０００オングストロームを超えるような
かなり大きなものでなくてはならない。１０００オング
ストロームの孔径のシリカは三つの欠点を有している。
即ち、それらは製造費用が高い点、強固さに欠ける点、
並びに単位体積辺りの表面積が小さい点（これは固定化
し得るリガンドの量を制限することにも繋がる）であ
る。リッチー (Ritchie)他のChromatography and Analy
sis (1990 年) 参照。
【００１７】孔径の決定
無定型シリカのような担体用媒体の呼称孔径は、文献で
はしばしば平均孔径（ＭＰＤ）とも呼ばれ、細孔の体積
と表面積の関数として表される。原理上、細孔の体積と
表面積はブルナウアー‐エメット‐テーラー（ＢＥＴ）
の標準窒素吸着法によって決定することができる。平均
孔径はウィーラーの式（ＭＰＤ＝（４００００×細孔体
積）／表面積）から計算される。しかし、約２００オン
グストロームより大きな孔径に対しては、窒素吸着法に
よる細孔体積の測定は余り正確でなくなり、凝集の始ま
るまでの乾燥試料の滴定による水細孔体積の測定の方が
より正確な結果を与える。
はしばしば平均孔径（ＭＰＤ）とも呼ばれ、細孔の体積
と表面積の関数として表される。原理上、細孔の体積と
表面積はブルナウアー‐エメット‐テーラー（ＢＥＴ）
の標準窒素吸着法によって決定することができる。平均
孔径はウィーラーの式（ＭＰＤ＝（４００００×細孔体
積）／表面積）から計算される。しかし、約２００オン
グストロームより大きな孔径に対しては、窒素吸着法に
よる細孔体積の測定は余り正確でなくなり、凝集の始ま
るまでの乾燥試料の滴定による水細孔体積の測定の方が
より正確な結果を与える。
【００１８】幾つかの媒体に対しては窒素吸着法は不適
当であり、例えば非架橋アガロース支持体は窒素吸着測
定に必要な乾燥工程に耐えない。この場合は、サイズ排
除クロマトグラフィーを平均孔径の見積りに使用でき
る。サイズ排除クロマトグラフィーは周知の技術であ
り、標準ポリマーを用いて細孔の大きさを推定する。非
常に大きなポリマーは如何なる細孔にも入り込めず排除
されるが、一方、非常に小さな分子はすべての細孔に入
り込むことができて完全に取り込まれる。これらの両極
の間で、中間のサイズのポリマーは細孔体積のある分率
に入り込むことができ、この分率を測定してＫｄとして
表す。Ｋｄは、排除されるポリマーに対しては０であ
り、完全に取り込まれるポリマーに対しては１である。
当であり、例えば非架橋アガロース支持体は窒素吸着測
定に必要な乾燥工程に耐えない。この場合は、サイズ排
除クロマトグラフィーを平均孔径の見積りに使用でき
る。サイズ排除クロマトグラフィーは周知の技術であ
り、標準ポリマーを用いて細孔の大きさを推定する。非
常に大きなポリマーは如何なる細孔にも入り込めず排除
されるが、一方、非常に小さな分子はすべての細孔に入
り込むことができて完全に取り込まれる。これらの両極
の間で、中間のサイズのポリマーは細孔体積のある分率
に入り込むことができ、この分率を測定してＫｄとして
表す。Ｋｄは、排除されるポリマーに対しては０であ
り、完全に取り込まれるポリマーに対しては１である。
【００１９】シリカに適用できる標準系には、溶媒とし
てテトラヒドロフランを用いる標準ポリスチレンのクロ
マトグラフィーが含まれる。この系において、分子量約
３４０００（ｌｏｇ10ＭＷ＝４．５）のポリスチレンは
以下のシリカに対して以下のおよそのＫｄ値を有する。
６０オングストローム：＜０．０５、２００オングスト
ローム：０．２〜０．３、５００オングストローム：
０．５５〜０．６５、１０００オングストローム：０．
７５〜０．８５。従って、孔径１０００オングストロー
ム以下のシリカは分子量３４Ｋダルトンのポリスチレン
に対して０．８５未満のＫｄ値を有するものと思われ
る。Ｋｄ値は分子量の対数の関数であるので、３４Ｋ標
準の分子量に小さな変化（即ち、３０Ｋから４０Ｋの間
の変化）を与えても結果にはほとんど影響を与えない。
てテトラヒドロフランを用いる標準ポリスチレンのクロ
マトグラフィーが含まれる。この系において、分子量約
３４０００（ｌｏｇ10ＭＷ＝４．５）のポリスチレンは
以下のシリカに対して以下のおよそのＫｄ値を有する。
６０オングストローム：＜０．０５、２００オングスト
ローム：０．２〜０．３、５００オングストローム：
０．５５〜０．６５、１０００オングストローム：０．
７５〜０．８５。従って、孔径１０００オングストロー
ム以下のシリカは分子量３４Ｋダルトンのポリスチレン
に対して０．８５未満のＫｄ値を有するものと思われ
る。Ｋｄ値は分子量の対数の関数であるので、３４Ｋ標
準の分子量に小さな変化（即ち、３０Ｋから４０Ｋの間
の変化）を与えても結果にはほとんど影響を与えない。
【００２０】ある種の媒体はテトラヒドロフラン中で使
用できないが、この場合は誘導体としたシリカカラムに
ついてポリスチレンに対する検量線を作成し、次いで代
わりの媒体の検量線作成に使用することができる。例え
ば炭水化物型支持体について測定しようとする場合、テ
トラヒドロフランは脱水を起こすので、水性緩衝液中の
標準タンパク質が都合がよい。この場合、適当な孔径の
シリカを公知の手順によってジオール基で修飾し、この
媒体についてポリスチレン系を用いて検量線を作成す
る。次に、溶媒系をタンパク質の分離に適したもの（例
えばリン酸緩衝液）に変え、ある範囲の複数の標準タン
パク質を流す。これによってポリスチレン検量線をタン
パク質検量線に変換できる。この標準タンパク質を次に
代わりの試験媒体に流し、ジオール媒体とそれぞれのＫ
ｄ値について比較する。かかるデータはカラム上で吸着
が全く起こらない場合にしか信頼性を持たない。吸着に
関する試験、並びに溶媒を適当なものに変えることによ
ってこれらの問題を解決する手段は、ゲル浸透クロマト
グラフィー技術の当業者には周知である。
用できないが、この場合は誘導体としたシリカカラムに
ついてポリスチレンに対する検量線を作成し、次いで代
わりの媒体の検量線作成に使用することができる。例え
ば炭水化物型支持体について測定しようとする場合、テ
トラヒドロフランは脱水を起こすので、水性緩衝液中の
標準タンパク質が都合がよい。この場合、適当な孔径の
シリカを公知の手順によってジオール基で修飾し、この
媒体についてポリスチレン系を用いて検量線を作成す
る。次に、溶媒系をタンパク質の分離に適したもの（例
えばリン酸緩衝液）に変え、ある範囲の複数の標準タン
パク質を流す。これによってポリスチレン検量線をタン
パク質検量線に変換できる。この標準タンパク質を次に
代わりの試験媒体に流し、ジオール媒体とそれぞれのＫ
ｄ値について比較する。かかるデータはカラム上で吸着
が全く起こらない場合にしか信頼性を持たない。吸着に
関する試験、並びに溶媒を適当なものに変えることによ
ってこれらの問題を解決する手段は、ゲル浸透クロマト
グラフィー技術の当業者には周知である。
【００２１】固定化
クロマトグラフィー媒体上にタンパク質又はポリペプチ
ドを固定化するためのプロトコルは数多く知られてい
る。その内の幾つかは、単一又は多重可変領域タンパク
質の固定化に用いることができる。例えば、ジオールシ
リカを塩化トレシル(tresyl chloride) で活性化し、次
いで可変領域タンパク質とカップリングさせる。また、
エポキシ活性化シリカをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
のようなポリマーでコートし、グルタルアルデヒドのよ
うな二価性試薬によって可変領域タンパク質を該ポリマ
ーコートに結合させる。
ドを固定化するためのプロトコルは数多く知られてい
る。その内の幾つかは、単一又は多重可変領域タンパク
質の固定化に用いることができる。例えば、ジオールシ
リカを塩化トレシル(tresyl chloride) で活性化し、次
いで可変領域タンパク質とカップリングさせる。また、
エポキシ活性化シリカをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
のようなポリマーでコートし、グルタルアルデヒドのよ
うな二価性試薬によって可変領域タンパク質を該ポリマ
ーコートに結合させる。
【００２２】アガロース系、ポリスチレン系、制御され
た多孔質ガラス系、及びケイソウ土系のクロマトグラフ
ィー媒体にタンパク質を結合させる手順に関しても文献
に十分に記載されている。
た多孔質ガラス系、及びケイソウ土系のクロマトグラフ
ィー媒体にタンパク質を結合させる手順に関しても文献
に十分に記載されている。
【００２３】Ｆｖのような小さな特異的結合性物質は活
性をさほど失わずに固相に直接固定化することができる
場合も実際にあることを我々は発見したが、幾つかの事
例では不可能であった。本発明のもう一つの目的は、か
かる小さな特異的結合性物質の基本的な特異的結合特性
に損傷を与える危険性をむしろ低下させて、その固相へ
の結合を促進することである。
性をさほど失わずに固相に直接固定化することができる
場合も実際にあることを我々は発見したが、幾つかの事
例では不可能であった。本発明のもう一つの目的は、か
かる小さな特異的結合性物質の基本的な特異的結合特性
に損傷を与える危険性をむしろ低下させて、その固相へ
の結合を促進することである。
【００２４】別の具体的態様において、本発明は固相担
体材料上に固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材
料にして、該特異的結合剤が i) 元の単数もしくは複数
の抗体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類
以上の可変領域タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）と、
ii) 基本的な特異的結合特性には寄与しないが該結合剤
の基本的な特異的結合活性にさほど影響を与えることな
く該固相担体材料と化学的手段もしくは他の手段でカッ
プリングし得る化学基（好ましくはペプチド基）とを含
んでなることを特徴とする免疫吸着剤材料を供する。好
ましくは、該連結基は２０アミノ酸残基以下である。
体材料上に固定化した特異的結合剤を含む免疫吸着剤材
料にして、該特異的結合剤が i) 元の単数もしくは複数
の抗体の如何なる実質的部分とも結合していない１種類
以上の可変領域タンパク質（ＶＨ及び／又はＶＬ）と、
ii) 基本的な特異的結合特性には寄与しないが該結合剤
の基本的な特異的結合活性にさほど影響を与えることな
く該固相担体材料と化学的手段もしくは他の手段でカッ
プリングし得る化学基（好ましくはペプチド基）とを含
んでなることを特徴とする免疫吸着剤材料を供する。好
ましくは、該連結基は２０アミノ酸残基以下である。
【００２５】本発明の重要な具体的態様は、上記の連結
基として機能するタンパク質性のテール（tail）に付着
した単一領域タンパク質（Ｄａｂ）であって、該テール
が孔径３０乃至３００オングストローム、好ましくは６
０乃至３００オングストロームのクロマトグラフィー媒
体に特異的結合活性にさほどの損失を与えることなくカ
ップリングしているものである。
基として機能するタンパク質性のテール（tail）に付着
した単一領域タンパク質（Ｄａｂ）であって、該テール
が孔径３０乃至３００オングストローム、好ましくは６
０乃至３００オングストロームのクロマトグラフィー媒
体に特異的結合活性にさほどの損失を与えることなくカ
ップリングしているものである。
【００２６】連結基の特性は使用する表面に最も適した
付着法に適合するように選択できる。連結基は疎水性で
あっても、親水性であっても、或いはこれらの特性を併
せもつものであってもよい。潜在的共有結合部位を含ん
でいてもよい。好ましくは、かかるタンパク質系連結基
は少なくとも１個、より好ましくは複数の含ＳＨ基アミ
ノ酸残基（好ましくはシステイン）を含む。ＳＨ基は、
クロマトグラフィー媒体に共有結合させるための化学的
カップリング剤として作用し得る。これはスクシンイミ
ジル‐マレイミドフェニルブチレート（succinimidyl-m
aleimidophenylbutyrate：ＳＭＰＢ）のような二特異性
試薬を用いて行う。以上に代えて、或いは以上に加え
て、タンパク質系連結基は少なくとも１個、より好まし
くは複数のリシン残基（ε‐アミノ基を有する）を含
む。実際のカップリングは、例えば従来の二価性化学架
橋剤を用いて達成することができる。好ましくは、かか
る化学的カップリング剤は可変領域の配列自体からは十
分に離れた部位に位置させて、その連結部にカップリン
グするすべての担体が可変領域の配列からある程度の距
離を保つようにする。実際、カップリング部位によって
担体から離れた都合のよい位置に特異的結合領域がくる
ように連結基を設計するのは容易である。
付着法に適合するように選択できる。連結基は疎水性で
あっても、親水性であっても、或いはこれらの特性を併
せもつものであってもよい。潜在的共有結合部位を含ん
でいてもよい。好ましくは、かかるタンパク質系連結基
は少なくとも１個、より好ましくは複数の含ＳＨ基アミ
ノ酸残基（好ましくはシステイン）を含む。ＳＨ基は、
クロマトグラフィー媒体に共有結合させるための化学的
カップリング剤として作用し得る。これはスクシンイミ
ジル‐マレイミドフェニルブチレート（succinimidyl-m
aleimidophenylbutyrate：ＳＭＰＢ）のような二特異性
試薬を用いて行う。以上に代えて、或いは以上に加え
て、タンパク質系連結基は少なくとも１個、より好まし
くは複数のリシン残基（ε‐アミノ基を有する）を含
む。実際のカップリングは、例えば従来の二価性化学架
橋剤を用いて達成することができる。好ましくは、かか
る化学的カップリング剤は可変領域の配列自体からは十
分に離れた部位に位置させて、その連結部にカップリン
グするすべての担体が可変領域の配列からある程度の距
離を保つようにする。実際、カップリング部位によって
担体から離れた都合のよい位置に特異的結合領域がくる
ように連結基を設計するのは容易である。
【００２７】本発明のまた別の具体的態様は、多孔質プ
ラスチック材料（多孔質ポリスチレン等）のような疎水
性表面上に可変領域が非共有結合で付着できるようにす
る疎水性「テール」を与えた可変領域である。アルキル
鎖（例えばＣ8 又はＣ18）又はフェニル基のような標準
的な疎水性リガンドで誘導体としたシリカは、この種の
疎水性テールを容易に取り込む。
ラスチック材料（多孔質ポリスチレン等）のような疎水
性表面上に可変領域が非共有結合で付着できるようにす
る疎水性「テール」を与えた可変領域である。アルキル
鎖（例えばＣ8 又はＣ18）又はフェニル基のような標準
的な疎水性リガンドで誘導体としたシリカは、この種の
疎水性テールを容易に取り込む。
【００２８】本発明の目的を達成する上で十分な疎水性
を有する連結基を与えるためには、連結基を含んでなる
ポリペプチドは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フ
ェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリ
ン、及びアラニンからなる群から選択した十分な数（残
基が隣接しているときは２個程度であってもよい）のア
ミノ酸残基を含んでいなくてはならない。我々は、ポリ
ペプチド中のアミノ酸残基の大多数が上記以外の比較的
極性（従って、比較的親水性）のアミノ酸残基であって
も、上記の群に含まれるアミノ酸残基が低い割合でも存
在するだけで該ポリペプチドに有効な疎水性を付与す
る。連結基全体の基本的な疎水性を喪失させることな
く、単数又は複数の疎水性領域を高電荷密度領域に隣接
させることができる（即ち、このペプチド鎖は疎水性と
親水性を併せもつ）。
を有する連結基を与えるためには、連結基を含んでなる
ポリペプチドは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フ
ェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリ
ン、及びアラニンからなる群から選択した十分な数（残
基が隣接しているときは２個程度であってもよい）のア
ミノ酸残基を含んでいなくてはならない。我々は、ポリ
ペプチド中のアミノ酸残基の大多数が上記以外の比較的
極性（従って、比較的親水性）のアミノ酸残基であって
も、上記の群に含まれるアミノ酸残基が低い割合でも存
在するだけで該ポリペプチドに有効な疎水性を付与す
る。連結基全体の基本的な疎水性を喪失させることな
く、単数又は複数の疎水性領域を高電荷密度領域に隣接
させることができる（即ち、このペプチド鎖は疎水性と
親水性を併せもつ）。
【００２９】特に好ましい連結基は下記の「Ｍｙｃ」ア
ミノ酸配列を含む。
ミノ酸配列を含む。
【００３０】
Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn
この基はリシン残基を含むので、表面上への共有結合に
も使用できる。
も使用できる。
【００３１】連結基は通常可変領域タンパク質の一方の
末端もしくはその付近に付着する。
末端もしくはその付近に付着する。
【００３２】通常、付着の位置はペプチド系連結基のア
ミノ末端である。これは、添付の第２図に記載の配列Ａ
及び配列Ｂの左側の末端である。好ましくは、単数又は
複数の可変領域タンパク質並びに連結基は、遺伝子修飾
した生体内での発現によって一緒に生産したものであ
る。ポリペプチド系連結基は、例えば、可変領域タンパ
ク質と共に合成（クローン化）して、タンパク質性テー
ルを該領域の配列の一方の末端に含んでなるものであっ
てもよい。連結基の結合する表面又はトレーサーから可
変領域までの距離に十分な長さを与えるため、連結基は
少なくとも約５残基のアミノ酸残基を含む。
ミノ末端である。これは、添付の第２図に記載の配列Ａ
及び配列Ｂの左側の末端である。好ましくは、単数又は
複数の可変領域タンパク質並びに連結基は、遺伝子修飾
した生体内での発現によって一緒に生産したものであ
る。ポリペプチド系連結基は、例えば、可変領域タンパ
ク質と共に合成（クローン化）して、タンパク質性テー
ルを該領域の配列の一方の末端に含んでなるものであっ
てもよい。連結基の結合する表面又はトレーサーから可
変領域までの距離に十分な長さを与えるため、連結基は
少なくとも約５残基のアミノ酸残基を含む。
【００３３】所望によっては、可変領域に「天然型」疎
水性ポリペプチドテール、例えばインフルエンザウイル
ス由来の膜貫通性のペプチド配列を加えてもよい。リン
脂質テールを代わりに使用することもできる。
水性ポリペプチドテール、例えばインフルエンザウイル
ス由来の膜貫通性のペプチド配列を加えてもよい。リン
脂質テールを代わりに使用することもできる。
【００３４】本発明は、複数の可変領域タンパク質から
成る特異的結合試薬をも包含する。
成る特異的結合試薬をも包含する。
【００３５】これらは天然のＦｖフラグメント（即ち軽
鎖可変タンパク質を有する重鎖可変部）であってもよい
し、これらは重鎖又は軽鎖可変部タンパク質の組合わさ
ったものを含んでなるものであってもよい。かかる組合
わせ体は通常比較的弱い相互作用で一つに保持されてい
る。本発明の一つの連結基を複数の可変部タンパク質配
列の中の一つの配列の一方の末端もしくは末端付近に導
入することもできるが、所望によっては同一もしくは異
なる特性の２つ以上の連結基を上記組合わせ体の中に導
入することも可能である。個々の可変領域タンパク質を
クローニングの間別個に発現させることも可能である。
一般に、これらは、それらの会合を引起こす弱い相互作
用を阻害しないような温和な条件下で自然に結合する。
鎖可変タンパク質を有する重鎖可変部）であってもよい
し、これらは重鎖又は軽鎖可変部タンパク質の組合わさ
ったものを含んでなるものであってもよい。かかる組合
わせ体は通常比較的弱い相互作用で一つに保持されてい
る。本発明の一つの連結基を複数の可変部タンパク質配
列の中の一つの配列の一方の末端もしくは末端付近に導
入することもできるが、所望によっては同一もしくは異
なる特性の２つ以上の連結基を上記組合わせ体の中に導
入することも可能である。個々の可変領域タンパク質を
クローニングの間別個に発現させることも可能である。
一般に、これらは、それらの会合を引起こす弱い相互作
用を阻害しないような温和な条件下で自然に結合する。
【００３６】本発明の効果
免疫アフィニティー精製法は、研究手段としては盛んに
用いられているが、工業的規模でのプロセスにはほとん
ど用いられたことのない技術である。二特異性リガンド
として単一又は複数の可変領域をもつ本発明の新規アフ
ィニティー用媒体は、以下の利点を有しているので工業
的規模のプロセスでの使用により適している。
用いられているが、工業的規模でのプロセスにはほとん
ど用いられたことのない技術である。二特異性リガンド
として単一又は複数の可変領域をもつ本発明の新規アフ
ィニティー用媒体は、以下の利点を有しているので工業
的規模のプロセスでの使用により適している。
【００３７】i) リガンド分子量の低下
インタクトな抗体がおよそ１５００００の分子量を有す
るのに対して、単一可変領域タンパク質（Ｄａｂ）は典
型的には約１２０００の分子量を有し、またＦｖフラグ
メントは約２５０００の分子量を有する。小さなタンパ
ク質はシリカのような硬質クロマトグラフィー媒体の小
孔内により容易に適合する。硬質媒体を使用すると研究
室の卓上レベルから工業プラントへのスケールアップが
容易になる。タンパク質精製用に製造されるクロマトグ
ラフィー用シリカは通常は２００乃至３００オングスト
ロームの範囲の細孔を有する。単一可変領域及びＦｖフ
ラグメントはかかる細孔内に容易に収まり、かつ立体障
害なしにほとんどの抗原が自由に出入りできる。しかし
ながら、抗原が非常に大きい（１５０ｋＤを超えるよう
なタンパク質など）場合は、抗原の自由な交換ができる
ように５００オングストロームまでの孔径のシリカを使
用するのが望ましい。抗原が非常に小さなもの（ペプチ
ドもしくは非タンパク質性の医薬品など）の場合は、３
０乃至２００オングストロームの範囲の細孔を有するシ
リカを使用するのが望ましい。こうすると小孔径シリカ
のより大きな表面積を利用できるので、より多量の免疫
リガンドを固定化することができて単位体積当りの収容
力が増大する。目的とする検体の大きさの如何を問わ
ず、より小さな免疫リガンド（抗体全体よりもＤａｂ又
はＦｖの方）を使用すると、それに応じてより小さな孔
径のシリカが使用できるようになる。小孔径シリカは剛
性が高く表面積がより大きいという利点を有する。
るのに対して、単一可変領域タンパク質（Ｄａｂ）は典
型的には約１２０００の分子量を有し、またＦｖフラグ
メントは約２５０００の分子量を有する。小さなタンパ
ク質はシリカのような硬質クロマトグラフィー媒体の小
孔内により容易に適合する。硬質媒体を使用すると研究
室の卓上レベルから工業プラントへのスケールアップが
容易になる。タンパク質精製用に製造されるクロマトグ
ラフィー用シリカは通常は２００乃至３００オングスト
ロームの範囲の細孔を有する。単一可変領域及びＦｖフ
ラグメントはかかる細孔内に容易に収まり、かつ立体障
害なしにほとんどの抗原が自由に出入りできる。しかし
ながら、抗原が非常に大きい（１５０ｋＤを超えるよう
なタンパク質など）場合は、抗原の自由な交換ができる
ように５００オングストロームまでの孔径のシリカを使
用するのが望ましい。抗原が非常に小さなもの（ペプチ
ドもしくは非タンパク質性の医薬品など）の場合は、３
０乃至２００オングストロームの範囲の細孔を有するシ
リカを使用するのが望ましい。こうすると小孔径シリカ
のより大きな表面積を利用できるので、より多量の免疫
リガンドを固定化することができて単位体積当りの収容
力が増大する。目的とする検体の大きさの如何を問わ
ず、より小さな免疫リガンド（抗体全体よりもＤａｂ又
はＦｖの方）を使用すると、それに応じてより小さな孔
径のシリカが使用できるようになる。小孔径シリカは剛
性が高く表面積がより大きいという利点を有する。
【００３８】ii) リガンドのアフィニティーの低下
単一又は多重可変領域の中には、抗原に対するアフィニ
ティーがインタクトな抗体に比べると低下しているもの
もある。この性質を有利に活用することもでき、例えば
一般に必要とされるものより温和な緩衝液を用いること
によって、より温和な条件下でアフィニティー媒体から
抗原を脱着させることができる。これには、カラムの寿
命が延び、かつ目的検体（即ち、抗原）を不活性化する
危険性が減少するという２つの利点ある。
ティーがインタクトな抗体に比べると低下しているもの
もある。この性質を有利に活用することもでき、例えば
一般に必要とされるものより温和な緩衝液を用いること
によって、より温和な条件下でアフィニティー媒体から
抗原を脱着させることができる。これには、カラムの寿
命が延び、かつ目的検体（即ち、抗原）を不活性化する
危険性が減少するという２つの利点ある。
【００３９】iii) リガンドの製造コストの低下
単一又は多重可変領域フラグメントは、下記の２つの理
由により、インタクトな抗体よりも低い単価（結合部位
当りのコスト）で製造し得る。第一の理由は、かかるフ
ラグメントを細菌中で発現させるための入手可能な発現
系が存在することである。細菌培養用の培地は、哺乳類
の細胞培養用の培地（ハイブリドーマによるインタクト
な抗体生産に通常使用される）よりも安価であり、これ
によってかなりの費用を節約できる。第二に、タンパク
質合成は細胞代謝に関して非常に費用がかかるので、抗
体全体ではなく免疫吸着に必要なタンパク質構造（即
ち、結合領域）だけを産生する細胞によって格段の利点
が生ずる。
由により、インタクトな抗体よりも低い単価（結合部位
当りのコスト）で製造し得る。第一の理由は、かかるフ
ラグメントを細菌中で発現させるための入手可能な発現
系が存在することである。細菌培養用の培地は、哺乳類
の細胞培養用の培地（ハイブリドーマによるインタクト
な抗体生産に通常使用される）よりも安価であり、これ
によってかなりの費用を節約できる。第二に、タンパク
質合成は細胞代謝に関して非常に費用がかかるので、抗
体全体ではなく免疫吸着に必要なタンパク質構造（即
ち、結合領域）だけを産生する細胞によって格段の利点
が生ずる。
【００４０】遺伝子工学によって製造したＤａｂ及びＦ
ｖは抗体全体よりも結合部位当りの製造費用が安いの
で、免疫アフィニティー精製法を対価効率よくより広範
な検体について用いることができる。従って、これまで
よりも低価格及び／又は小さな検体を精製するのに経済
的である。
ｖは抗体全体よりも結合部位当りの製造費用が安いの
で、免疫アフィニティー精製法を対価効率よくより広範
な検体について用いることができる。従って、これまで
よりも低価格及び／又は小さな検体を精製するのに経済
的である。
【００４１】iv) 「ＨＡＭＡ」反応の低下
免疫アフィニティー精製法において、操作中にカラムか
ら少量のリガンドが流れ出ることが判明しており、目的
とする検体標品中に混入物として現れる。目的の検体が
注射用治療薬である場合、マウス抗体混入物が患者に抗
マウス反応、いわゆる「ＨＡＭＡ」反応を引き起こすの
でこれは重大な問題である。ＨＡＭＡ反応は主としてマ
ウス抗体のＦｃ領域に対して起こること、また可変領域
フラグメントはＨＡＭＡ反応を引き起こすことが少ない
ことが判明している。従って、注射薬中に可変領域フラ
グメントが混入したとしてもマウス抗体全体が混入した
場合よりも問題は少ない。
ら少量のリガンドが流れ出ることが判明しており、目的
とする検体標品中に混入物として現れる。目的の検体が
注射用治療薬である場合、マウス抗体混入物が患者に抗
マウス反応、いわゆる「ＨＡＭＡ」反応を引き起こすの
でこれは重大な問題である。ＨＡＭＡ反応は主としてマ
ウス抗体のＦｃ領域に対して起こること、また可変領域
フラグメントはＨＡＭＡ反応を引き起こすことが少ない
ことが判明している。従って、注射薬中に可変領域フラ
グメントが混入したとしてもマウス抗体全体が混入した
場合よりも問題は少ない。
【００４２】v) 非特異的結合の減少
免疫リガンド上には非特異的吸着を起こし得る部位がほ
とんどもしくは全く存在市内のが望ましい。免疫リガン
ドの大きさを特異的結合に必要な最低限度まで減少させ
る（即ち、結合領域だけを固定化する）ことによって、
特異的結合を最大とし、かつ非特異的結合を最低限に抑
えることができる。
とんどもしくは全く存在市内のが望ましい。免疫リガン
ドの大きさを特異的結合に必要な最低限度まで減少させ
る（即ち、結合領域だけを固定化する）ことによって、
特異的結合を最大とし、かつ非特異的結合を最低限に抑
えることができる。
【００４３】３０乃至３００オングストローム、好まし
くは６０乃至３００オングストロームの範囲内の孔径を
有する多孔質シリカに、単一可変領域（Ｄａｂ）又はＦ
ｖフラグメントのいずれかである特異的結合剤を担持し
た免疫吸着剤材料は、従って、多大な利点を有する材料
である。このシリカ担体材料は比較的安価に製造でき、
かつ得られる免疫吸着剤材料は物理的に非常に強固であ
って多種多様な商業規模の免疫吸着施設に使用できる。
くは６０乃至３００オングストロームの範囲内の孔径を
有する多孔質シリカに、単一可変領域（Ｄａｂ）又はＦ
ｖフラグメントのいずれかである特異的結合剤を担持し
た免疫吸着剤材料は、従って、多大な利点を有する材料
である。このシリカ担体材料は比較的安価に製造でき、
かつ得られる免疫吸着剤材料は物理的に非常に強固であ
って多種多様な商業規模の免疫吸着施設に使用できる。
【００４４】本発明の新規免疫吸着剤材料は、醗酵培
地、血清、ミルクホエー、並びに血液などの供給材料か
らある特定の抗原を含む化合物を抽出するのに使用する
ことができる。
地、血清、ミルクホエー、並びに血液などの供給材料か
らある特定の抗原を含む化合物を抽出するのに使用する
ことができる。
【００４５】抗体フラグメントの製造
本発明は本来、単一領域抗体フラグメントもしくはＦｖ
フラグメントの新規製造方法に関するものでも、かかる
フラグメントとペプチドテールの組合わさったものの新
規製造方法に関するものでもない。Ｆｖ及び単一領域フ
ラグメントは、従前のインタクトな抗体の伝統的酵素消
化法で製造できる。ホッチマン(Hochman) 他、Biochemi
stry, (1973)第12巻1130‐1135頁参照。より好ましく
は、リーチマン(Riechmann) 他、J. Mol. Biol., (198
8) 第 203巻 825-828頁；スケーラ(Skerra)他、Scienc
e, (1988) 第 240巻1038‐1040頁；並びに上述のワード
他の論文(1989)に記載されているような遺伝子工学によ
って製造する。上述のワード他の論文(1989)には、「Ｍ
ｙｃ」テールを有する抗リゾチーム単一領域抗体の製造
が記載されている。この組合わせ体は本発明で使用する
ことができるが、ワード他は「Ｍｙｃ」テールを、彼等
の製造した抗リゾチームＤａｂを実験的に同定しかつ単
離するためのエピトープとして用いたに過ぎない。ワー
ド他は、「Ｍｙｃ」テールが多孔質クロマトグラフィー
用媒体上にＤａｂを固定化するのに理想的なものとなり
得ることに関して何等示唆していない。以下に示すよう
に、ワード他の手法は、Ｄａｂフラグメント上に他の
「テール」を作るのに容易に応用できる。
フラグメントの新規製造方法に関するものでも、かかる
フラグメントとペプチドテールの組合わさったものの新
規製造方法に関するものでもない。Ｆｖ及び単一領域フ
ラグメントは、従前のインタクトな抗体の伝統的酵素消
化法で製造できる。ホッチマン(Hochman) 他、Biochemi
stry, (1973)第12巻1130‐1135頁参照。より好ましく
は、リーチマン(Riechmann) 他、J. Mol. Biol., (198
8) 第 203巻 825-828頁；スケーラ(Skerra)他、Scienc
e, (1988) 第 240巻1038‐1040頁；並びに上述のワード
他の論文(1989)に記載されているような遺伝子工学によ
って製造する。上述のワード他の論文(1989)には、「Ｍ
ｙｃ」テールを有する抗リゾチーム単一領域抗体の製造
が記載されている。この組合わせ体は本発明で使用する
ことができるが、ワード他は「Ｍｙｃ」テールを、彼等
の製造した抗リゾチームＤａｂを実験的に同定しかつ単
離するためのエピトープとして用いたに過ぎない。ワー
ド他は、「Ｍｙｃ」テールが多孔質クロマトグラフィー
用媒体上にＤａｂを固定化するのに理想的なものとなり
得ることに関して何等示唆していない。以下に示すよう
に、ワード他の手法は、Ｄａｂフラグメント上に他の
「テール」を作るのに容易に応用できる。
【００４６】可変領域フラグメントの製造方法、並びに
本発明の免疫吸着剤材料の例の幾つかを以下に挙げる
が、これらは単に例示を目的としたものである。
本発明の免疫吸着剤材料の例の幾つかを以下に挙げる
が、これらは単に例示を目的としたものである。
【００４７】
【実施例】実施例１
ａ） Pst1‐BstEIIカセットとして抗リゾチーム VH フ
ラグメントD1.3を含有するベクターの調製 抗リゾチーム VH フラグメントD1.3を発現ベクターpSW1
-VHD1.3-VKD1.3からPst1‐BstEIIフラグメントとして切
り出した。本実施例において使用したこのベクターとも
う一つの発現ベクターであるpSW1-VHPOLY-TAG1はワード
他によって記載されている(1989)。
ラグメントD1.3を含有するベクターの調製 抗リゾチーム VH フラグメントD1.3を発現ベクターpSW1
-VHD1.3-VKD1.3からPst1‐BstEIIフラグメントとして切
り出した。本実施例において使用したこのベクターとも
う一つの発現ベクターであるpSW1-VHPOLY-TAG1はワード
他によって記載されている(1989)。
【００４８】pSW1-VHPOLY-TAG1をPst1とBstEIIを用いて
制限的に切断し、上記Ｄ1.3 の抗リゾチームPst1‐BstE
II VH フラグメントをこの開いたベクターにつないだ。
この結合によって、 VH D1.3フラグメントが挿入されか
つ発現ベクターpSW1-VHPOLY-TAG1（ワード他）とほぼ同
じ（Pst1とBstEIIの制限部位が組込まれたことを除い
て）発現ベクターが生ずる。我々はこの発現ベクターを
pVHD1.3-TAG1と呼ぶ事ができる。
制限的に切断し、上記Ｄ1.3 の抗リゾチームPst1‐BstE
II VH フラグメントをこの開いたベクターにつないだ。
この結合によって、 VH D1.3フラグメントが挿入されか
つ発現ベクターpSW1-VHPOLY-TAG1（ワード他）とほぼ同
じ（Pst1とBstEIIの制限部位が組込まれたことを除い
て）発現ベクターが生ずる。我々はこの発現ベクターを
pVHD1.3-TAG1と呼ぶ事ができる。
【００４９】ｂ） pVHD1.3-TAG1中のクローン化 VH遺
伝子の下流の連結基配列のクローニング VH 遺伝子の下流の連結基配列によるTAG1の置換を、ヴ
ェルホイェン(Verhoeyen) 他、Science (1988)第 239巻
1534‐1536頁に記載された大オリゴヌクレオチドを用い
る部位特異的変異導入法によって行った。
伝子の下流の連結基配列のクローニング VH 遺伝子の下流の連結基配列によるTAG1の置換を、ヴ
ェルホイェン(Verhoeyen) 他、Science (1988)第 239巻
1534‐1536頁に記載された大オリゴヌクレオチドを用い
る部位特異的変異導入法によって行った。
【００５０】一本鎖ＤＮＡテンプレートをmp19VHD1.3-T
AG1 から調製した。これはpVHD1.3-TAG1由来の VH D1.3
とTAG1を含有するHindIII-EcoRI フラグメントであっ
て、mp19のHindIII 及びEcoRI 部位にクローン化したも
のである。このクローンから得られた一本鎖ＤＮＡは V
H D1.3‐TAG1配列をコードする鎖を含んでいる。あるＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドを次のＤＮＡ鎖を重合させるた
めのプライマーとしてこのテンプレートにハイブリダイ
ズさせた。このオリゴヌクレオチドは所要の連結基配列
を含んでおり、その配列の両側に組込み部位とそれぞれ
相同の１２塩基を有していた。二重鎖ＤＮＡ分子を大腸
菌(E. coli) 中に形質導入したが、該分子のある一定の
部分は活性化配列構造の導入によって「修復」されてい
る。上記の組込み部位と相同の１２塩基はそれぞれ、 V
H D1.3の最後の４つのコドン、並びにpVHD1.3-TAG1に存
在する２つの終結コドンとそれに続く６塩基であった。
このオリゴヌクレオチドはTAG1遺伝子配列を連結基遺伝
子配列で置き換える。
AG1 から調製した。これはpVHD1.3-TAG1由来の VH D1.3
とTAG1を含有するHindIII-EcoRI フラグメントであっ
て、mp19のHindIII 及びEcoRI 部位にクローン化したも
のである。このクローンから得られた一本鎖ＤＮＡは V
H D1.3‐TAG1配列をコードする鎖を含んでいる。あるＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドを次のＤＮＡ鎖を重合させるた
めのプライマーとしてこのテンプレートにハイブリダイ
ズさせた。このオリゴヌクレオチドは所要の連結基配列
を含んでおり、その配列の両側に組込み部位とそれぞれ
相同の１２塩基を有していた。二重鎖ＤＮＡ分子を大腸
菌(E. coli) 中に形質導入したが、該分子のある一定の
部分は活性化配列構造の導入によって「修復」されてい
る。上記の組込み部位と相同の１２塩基はそれぞれ、 V
H D1.3の最後の４つのコドン、並びにpVHD1.3-TAG1に存
在する２つの終結コドンとそれに続く６塩基であった。
このオリゴヌクレオチドはTAG1遺伝子配列を連結基遺伝
子配列で置き換える。
【００５１】連結基は親水性でも、疎水性でも、これら
の混合型であってもよい。ＤＮＡ配列の操作を容易にす
るため都合のよい制限部位を導入することができる。
の混合型であってもよい。ＤＮＡ配列の操作を容易にす
るため都合のよい制限部位を導入することができる。
【００５２】添付の第１図に上記の方法に役立つ３種類
のオリゴヌクレオチド配列Ｉ、II、及びIII を示した。
配列Ｉと配列IIは同一の親水性連結基を産生する二つ配
列であり、配列III は疎水性連結基を産生するのに使用
できる。
のオリゴヌクレオチド配列Ｉ、II、及びIII を示した。
配列Ｉと配列IIは同一の親水性連結基を産生する二つ配
列であり、配列III は疎水性連結基を産生するのに使用
できる。
【００５３】第２図は２種類の連結基Ａ及びＢのｃＤＮ
Ａとアミノ酸配列を示したものである。連結基Ａは親水
性で、オリゴヌクレオチドＩ及びIIのいずれを用いても
生産できる。連結基Ｂは疎水性で、オリゴヌクレオチド
III を用いて生産できる。
Ａとアミノ酸配列を示したものである。連結基Ａは親水
性で、オリゴヌクレオチドＩ及びIIのいずれを用いても
生産できる。連結基Ｂは疎水性で、オリゴヌクレオチド
III を用いて生産できる。
【００５４】このようにして３種類のプラスミドが得ら
れたが、その連結基の配列構造は１２もしくは１１個の
アミノ酸（ｎ＝１）を含んでおり、配列Ｉ、II、及びII
I を用いてそれぞれpVHD1.3-ADI 、pVHD1.3-ADII、並び
にpVHD1.3-ADIII と名付けたものが得られた。これらの
プラスミドを大腸菌中で発現させた（ワード他の記載の
通り）。
れたが、その連結基の配列構造は１２もしくは１１個の
アミノ酸（ｎ＝１）を含んでおり、配列Ｉ、II、及びII
I を用いてそれぞれpVHD1.3-ADI 、pVHD1.3-ADII、並び
にpVHD1.3-ADIII と名付けたものが得られた。これらの
プラスミドを大腸菌中で発現させた（ワード他の記載の
通り）。
【００５５】VH フラグメントについて、ＥＬＩＳＡ（e
nzyme-linked immunosorbent assay;酵素免疫吸着測定
法）で活性を、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度をチェッ
クした。
nzyme-linked immunosorbent assay;酵素免疫吸着測定
法）で活性を、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度をチェッ
クした。
【００５６】本明細書中で引用した文献の教示するとこ
ろに従う同様の方法を用いることによって、 VH 及び V
L でそれぞれ「テール」を有するものと有さないもの、
並びにＦｖフラグメントが容易に調製できる。
ろに従う同様の方法を用いることによって、 VH 及び V
L でそれぞれ「テール」を有するものと有さないもの、
並びにＦｖフラグメントが容易に調製できる。
【００５７】実施例２：アガロース上への抗リゾチーム
Ｆｖの固定化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 ２mgの抗リゾチームＦｖ（連結基を持たない）をおよそ
４００μg/mlの濃度でカップリング緩衝液（0.1M炭酸水
素ナトリウム＋0.5M塩化ナトリウム、pH8.3 ）に対して
透析した。小さな口径の透析チューブを使用した（スペ
クトラム(Spectrum)132580）。CNBr活性化セファロース
4B（ファルマシア(Pharmacia) 17-0430-02）を１mMの塩
酸中で膨潤し洗浄した。３mlの膨潤ゲルを栓付容器内の
上記Ｆｖ標品に加えた。この混合物を４℃で一晩穏やか
に振盪した。該セファロースを遠心によって回収し、１
M エタノールアミンを含むカップリング緩衝液を用いて
４℃で一晩振盪することによってブロックした。この免
疫吸着剤をトリス緩衝液（0.1Mトリス＋0.1%アジ化物）
中で３回洗浄し、ガラス製カラム（ファルマシア19-500
2-01）に充填した。
Ｆｖの固定化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 ２mgの抗リゾチームＦｖ（連結基を持たない）をおよそ
４００μg/mlの濃度でカップリング緩衝液（0.1M炭酸水
素ナトリウム＋0.5M塩化ナトリウム、pH8.3 ）に対して
透析した。小さな口径の透析チューブを使用した（スペ
クトラム(Spectrum)132580）。CNBr活性化セファロース
4B（ファルマシア(Pharmacia) 17-0430-02）を１mMの塩
酸中で膨潤し洗浄した。３mlの膨潤ゲルを栓付容器内の
上記Ｆｖ標品に加えた。この混合物を４℃で一晩穏やか
に振盪した。該セファロースを遠心によって回収し、１
M エタノールアミンを含むカップリング緩衝液を用いて
４℃で一晩振盪することによってブロックした。この免
疫吸着剤をトリス緩衝液（0.1Mトリス＋0.1%アジ化物）
中で３回洗浄し、ガラス製カラム（ファルマシア19-500
2-01）に充填した。
【００５８】ｂ） １０倍過剰のアルブミンからのリゾ
チームの回収 ２mgの鶏卵リゾチーム（シグマ(Sigma) L-6876）と２０
mgのウシアルブミン（シグマA-7888）を２０mlのトリス
緩衝液中で混合した。この供給原料を上記の免疫吸着剤
上に流し、トリス緩衝液で洗浄した。結合したタンパク
質を、４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で溶出
した。リゾチームの漏出点を決定することによって、該
免疫吸着剤の吸着容量を計算した。その値は０．５mgで
あった（第３図ａ参照）。非特異的結合の程度を以下の
２種類の対照実験で決定した。
チームの回収 ２mgの鶏卵リゾチーム（シグマ(Sigma) L-6876）と２０
mgのウシアルブミン（シグマA-7888）を２０mlのトリス
緩衝液中で混合した。この供給原料を上記の免疫吸着剤
上に流し、トリス緩衝液で洗浄した。結合したタンパク
質を、４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で溶出
した。リゾチームの漏出点を決定することによって、該
免疫吸着剤の吸着容量を計算した。その値は０．５mgで
あった（第３図ａ参照）。非特異的結合の程度を以下の
２種類の対照実験で決定した。
【００５９】対照実験１
２０mgのウシアルブミンを２０mlのトリス緩衝液中に溶
解し、上記免疫吸着剤に流した。該免疫吸着剤をトリス
緩衝液で洗浄し、４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩
衝液で結合物を溶出した。
解し、上記免疫吸着剤に流した。該免疫吸着剤をトリス
緩衝液で洗浄し、４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩
衝液で結合物を溶出した。
【００６０】対照実験２
３mlの膨潤させたCNBr活性化セファロースを１M エタノ
ールアミンでブロックすることによって、「ブランク」
カラムを作成した。Ｆｖ免疫リガンドは加えなかった。
２０mgのリゾチームを２０mlのトリス緩衝液に溶解して
このカラムに流した。カラムをトリス緩衝液で洗浄し、
４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物を溶
出した。
ールアミンでブロックすることによって、「ブランク」
カラムを作成した。Ｆｖ免疫リガンドは加えなかった。
２０mgのリゾチームを２０mlのトリス緩衝液に溶解して
このカラムに流した。カラムをトリス緩衝液で洗浄し、
４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物を溶
出した。
【００６１】どちらの対照実験においても、非特異的結
合は最小であった（それぞれ第３図ｂ及びｃ参照）。
合は最小であった（それぞれ第３図ｂ及びｃ参照）。
【００６２】ｃ） ５％ウマ血清からのリゾチームの回
収 １mlのウマ血清（セララボ(Serlab)S-004a）を２０mlの
トリス／ツイーン緩衝液（0.1Mトリス，0.1%アジ化物，
0.15% ツイーン20（シグマ P1379））に溶解させた（即
ち、５％血清）。この供給原料に２mgの鶏卵リゾチーム
を加え、０．４５μm のフィルター（シュライヒャー・
アンド・シューエル(Schleicher and Schuell)452100）
を通過させた。２０mlの添加血清（供給原料Ａ）を上記
免疫吸着剤に流し、トリス／ツイーン緩衝液で洗浄し
た。４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物
を溶出した。トリス緩衝液に対して透析した後にＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析したところ、溶出画分は均質なリゾチ
ームであった。使用した系は、注入済みゲル（ファルマ
シア17-0624-01）とＳＤＳ緩衝液（ファルマシア17-051
6-01）であった。ゲルは銀染色によって染色した。クロ
マトグラフを第４図ａに、電気泳動したゲルを第５図に
示す。ゲル上に乗せた試料は以下の通りであった。
収 １mlのウマ血清（セララボ(Serlab)S-004a）を２０mlの
トリス／ツイーン緩衝液（0.1Mトリス，0.1%アジ化物，
0.15% ツイーン20（シグマ P1379））に溶解させた（即
ち、５％血清）。この供給原料に２mgの鶏卵リゾチーム
を加え、０．４５μm のフィルター（シュライヒャー・
アンド・シューエル(Schleicher and Schuell)452100）
を通過させた。２０mlの添加血清（供給原料Ａ）を上記
免疫吸着剤に流し、トリス／ツイーン緩衝液で洗浄し
た。４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物
を溶出した。トリス緩衝液に対して透析した後にＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分析したところ、溶出画分は均質なリゾチ
ームであった。使用した系は、注入済みゲル（ファルマ
シア17-0624-01）とＳＤＳ緩衝液（ファルマシア17-051
6-01）であった。ゲルは銀染色によって染色した。クロ
マトグラフを第４図ａに、電気泳動したゲルを第５図に
示す。ゲル上に乗せた試料は以下の通りであった。
【００６３】レーン３：供給原料Ａ
レーン４：供給原料Ａから回収されたリゾチーム
レーン５：リゾチーム標準
レーン６：分子量マーカー
非特異的結合の程度を以下の２種類の対照実験で決定し
た。
た。
【００６４】対照実験１
２０mlの未添加血清（即ち、リゾチームを加えていない
もの）を前記の通り調製した。この未添加血清をトリス
／ツイーン緩衝液中の免疫吸着剤に流した。洗浄／溶出
条件は前記の通りであった。
もの）を前記の通り調製した。この未添加血清をトリス
／ツイーン緩衝液中の免疫吸着剤に流した。洗浄／溶出
条件は前記の通りであった。
【００６５】対照実験２
１０mlの添加血清をトリス／ツイーン緩衝液中の「ブラ
ンク」カラム（実施例２ｂに記載）に流した。洗浄／溶
出条件は前記の通りであった。
ンク」カラム（実施例２ｂに記載）に流した。洗浄／溶
出条件は前記の通りであった。
【００６６】どちらの対照実験においても、非特異的結
合は最小であった（それぞれ第４図ｂ及びｃ参照）。
合は最小であった（それぞれ第４図ｂ及びｃ参照）。
【００６７】ｄ） タンパク質混合物からのリゾチーム
の回収 以下のタンパク質を各４mgづつ３０mlのトリス／ツイー
ン緩衝液中に加えて、０．４５μm のフィルターを通過
させた。
の回収 以下のタンパク質を各４mgづつ３０mlのトリス／ツイー
ン緩衝液中に加えて、０．４５μm のフィルターを通過
させた。
【００６８】ウシアルブミン（シグマA-7888）、ミオグ
ロビン（シグマ）、ヘモグロビン（自家標品）、トリプ
シン（シグマT-8003）、トランスフェリン（シグマ）、
チトクロームｃ（シグマC-7752）、並びに卵白アルブミ
ン（シグマ）。
ロビン（シグマ）、ヘモグロビン（自家標品）、トリプ
シン（シグマT-8003）、トランスフェリン（シグマ）、
チトクロームｃ（シグマC-7752）、並びに卵白アルブミ
ン（シグマ）。
【００６９】このタンパク質混合物（供給原料Ｂ）を免
疫吸着剤に流し、トリス／ツイーン緩衝液で洗浄した。
４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物を溶
出した。トリス緩衝液に対して透析した後にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分析したところ、溶出画分は均質なリゾチーム
であった（第５図）。ゲル上に乗せた試料は以下の通り
であった。
疫吸着剤に流し、トリス／ツイーン緩衝液で洗浄した。
４M 塩化マグネシウムを含むトリス緩衝液で結合物を溶
出した。トリス緩衝液に対して透析した後にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分析したところ、溶出画分は均質なリゾチーム
であった（第５図）。ゲル上に乗せた試料は以下の通り
であった。
【００７０】レーン１：供給原料Ｂ
レーン２：供給原料Ｂから回収されたリゾチーム
レーン５：リゾチーム標準
レーン６：分子量マーカー実施例３
：多孔質シリカ上への抗リゾチームＦｖの固定
化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 ６mgの抗リゾチームＦｖ（連結基としてTAG1、即ち「Ｍ
ｙｃ」テールを持つ）をおよそ２４０μg/mlの濃度でリ
ン酸緩衝液（0.1Mリン酸二水素ナトリウム pH7）に対し
て透析した。透析チューブはスペクトラム製（132580）
であった。約２００オングストロームの孔径を有するグ
ルタルアルデヒド活性化シリカ（PREPSCALE Glutaralde
hyde-P、ＪＴベーカー(J T Baker)7567-02）をリン酸緩
衝液中で洗浄した。３．５mlの洗浄したシリカを栓付容
器内の前記Ｆｖ標品に加えた。この混合物をゆっくりと
振盪し、４℃で塩化シアノボロハイドライドを終濃度が
０．１M となるように数回に分けて５時間にわたって加
え、この混合物を４℃で一晩穏やかに振盪した。この生
成物（免疫吸着剤）をリン酸緩衝液、次に１M の塩化ナ
トリウムを含むリン酸緩衝液で洗浄した。４℃で一晩、
０．２M エタノールアミンでこの免疫吸着剤を洗浄し、
ブロックした。この免疫吸着剤をトリス緩衝液中で平衡
化し、ガラス製カラム（ファルマシア19-5002-01）に充
填した。
化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 ６mgの抗リゾチームＦｖ（連結基としてTAG1、即ち「Ｍ
ｙｃ」テールを持つ）をおよそ２４０μg/mlの濃度でリ
ン酸緩衝液（0.1Mリン酸二水素ナトリウム pH7）に対し
て透析した。透析チューブはスペクトラム製（132580）
であった。約２００オングストロームの孔径を有するグ
ルタルアルデヒド活性化シリカ（PREPSCALE Glutaralde
hyde-P、ＪＴベーカー(J T Baker)7567-02）をリン酸緩
衝液中で洗浄した。３．５mlの洗浄したシリカを栓付容
器内の前記Ｆｖ標品に加えた。この混合物をゆっくりと
振盪し、４℃で塩化シアノボロハイドライドを終濃度が
０．１M となるように数回に分けて５時間にわたって加
え、この混合物を４℃で一晩穏やかに振盪した。この生
成物（免疫吸着剤）をリン酸緩衝液、次に１M の塩化ナ
トリウムを含むリン酸緩衝液で洗浄した。４℃で一晩、
０．２M エタノールアミンでこの免疫吸着剤を洗浄し、
ブロックした。この免疫吸着剤をトリス緩衝液中で平衡
化し、ガラス製カラム（ファルマシア19-5002-01）に充
填した。
【００７１】ｂ） ２５倍過剰のチトクロームｃからの
リゾチームの回収 トリス緩衝液中で、０．０４mg／mlの鶏卵リゾチーム
（シグマL-6876）と１mg／mlのチトクロームｃ（シグマ
C-7752）の２種類のタンパク質の混合物を作成した。２
０mlのこの混合物を上記の免疫吸着剤上に流し、トリス
緩衝液で洗浄した。４M 塩化マグネシウムを含むトリス
緩衝液で結合物を溶出した。溶出画分をスペクトラム製
透析チューブ（132580）を用いてトリス緩衝液に対して
透析した。２種類のタンパク質を検出するために２８０
nmにセットしたオンライン分光光度計（ＬＫＢ社、 UVI
CORD）を用いてクロマトグラフの溶出曲線を得た。
リゾチームの回収 トリス緩衝液中で、０．０４mg／mlの鶏卵リゾチーム
（シグマL-6876）と１mg／mlのチトクロームｃ（シグマ
C-7752）の２種類のタンパク質の混合物を作成した。２
０mlのこの混合物を上記の免疫吸着剤上に流し、トリス
緩衝液で洗浄した。４M 塩化マグネシウムを含むトリス
緩衝液で結合物を溶出した。溶出画分をスペクトラム製
透析チューブ（132580）を用いてトリス緩衝液に対して
透析した。２種類のタンパク質を検出するために２８０
nmにセットしたオンライン分光光度計（ＬＫＢ社、 UVI
CORD）を用いてクロマトグラフの溶出曲線を得た。
【００７２】クロマトグラフの溶出曲線に沿って、リゾ
チームとチトクロームｃの各々について特異的な測定を
行うことによって、２種類のタンパク質の命運を調べた
（第６図）。リゾチームはミクロコッカス（シグマM-37
70）の懸濁液を用いる酵素活性の測定により決定した。
１０mlのリン酸カリウム緩衝液（0.066M、pH6.24）中に
１．５mgのM-3770を含むミクロコッカス・リゾデルクテ
ィカス (Micrococcuslysodelkticus)懸濁液から２．５m
lをピペットで取り、石英キュベット（光路１cm）に入
れた。４５０nmにおける吸光度は０．６から０．７の間
であった（ＬＫＢ社、ULTRASPEC 光度計を用いて測
定）。リゾチーム溶液を加えて、４５０nmにおける吸光
度の減少をモニターし、最大線速度を用いて分当りの変
化を得た。これを既知リゾチーム標準と比較して、ml当
りの酵素単位量を決定した。チトクロームｃは、このタ
ンパク質の最大吸光度を与える４０６nmにおける光学密
度を測定して決定した。
チームとチトクロームｃの各々について特異的な測定を
行うことによって、２種類のタンパク質の命運を調べた
（第６図）。リゾチームはミクロコッカス（シグマM-37
70）の懸濁液を用いる酵素活性の測定により決定した。
１０mlのリン酸カリウム緩衝液（0.066M、pH6.24）中に
１．５mgのM-3770を含むミクロコッカス・リゾデルクテ
ィカス (Micrococcuslysodelkticus)懸濁液から２．５m
lをピペットで取り、石英キュベット（光路１cm）に入
れた。４５０nmにおける吸光度は０．６から０．７の間
であった（ＬＫＢ社、ULTRASPEC 光度計を用いて測
定）。リゾチーム溶液を加えて、４５０nmにおける吸光
度の減少をモニターし、最大線速度を用いて分当りの変
化を得た。これを既知リゾチーム標準と比較して、ml当
りの酵素単位量を決定した。チトクロームｃは、このタ
ンパク質の最大吸光度を与える４０６nmにおける光学密
度を測定して決定した。
【００７３】リゾチームとチトクロームｃの分離は完璧
でリゾチームの溶出幅はシャープであった（第６図）。
チトクロームｃとリゾチームは物理的に非常に類似して
いるので（チトクロームｃ：MW=12300,pI=10.5、リゾチ
ーム：MW=14500,pI=11.0）、これらが完全に分離された
ということは高分解能を有する事象であることを示して
いる。
でリゾチームの溶出幅はシャープであった（第６図）。
チトクロームｃとリゾチームは物理的に非常に類似して
いるので（チトクロームｃ：MW=12300,pI=10.5、リゾチ
ーム：MW=14500,pI=11.0）、これらが完全に分離された
ということは高分解能を有する事象であることを示して
いる。
【００７４】ｃ） 結合リゾチームの分布を示すための
免疫吸着剤の免疫電子顕微鏡試験 上述の免疫吸着剤をカラムから取り出した。トリス緩衝
液中の１mg／mlのリゾチーム溶液中にこの免疫吸着剤を
入れた。トリス緩衝液で洗浄して過剰のリゾチームを除
去した。１％パラホルムアルデヒド及び０．０５％グル
タルアルデヒドを含む生理的リン酸緩衝液を用いて、シ
リカ粒子を４℃で２時間固定し、樹脂中に埋め込んだ。
超薄切片（厚さ約９０nm）をニッケルグリッド上で調製
した。
免疫吸着剤の免疫電子顕微鏡試験 上述の免疫吸着剤をカラムから取り出した。トリス緩衝
液中の１mg／mlのリゾチーム溶液中にこの免疫吸着剤を
入れた。トリス緩衝液で洗浄して過剰のリゾチームを除
去した。１％パラホルムアルデヒド及び０．０５％グル
タルアルデヒドを含む生理的リン酸緩衝液を用いて、シ
リカ粒子を４℃で２時間固定し、樹脂中に埋め込んだ。
超薄切片（厚さ約９０nm）をニッケルグリッド上で調製
した。
【００７５】１％卵白アルブミン及び５％ヤギ血清を含
む生理的リン酸緩衝液でグリッド及び切片をブロックし
た。次いで、１％卵白アルブミン、５％ヤギ血清及び
０．１％ツイーン２０を含む生理的リン酸緩衝液中で作
成したウサギ抗リゾチーム抗体溶液中に一晩放置した。
グリッドを生理的リン酸緩衝液で洗浄し、５nmの金コロ
イド（バイオセル (Biocell)）に結合したヤギ抗ウサギ
抗体とインキュベートした。
む生理的リン酸緩衝液でグリッド及び切片をブロックし
た。次いで、１％卵白アルブミン、５％ヤギ血清及び
０．１％ツイーン２０を含む生理的リン酸緩衝液中で作
成したウサギ抗リゾチーム抗体溶液中に一晩放置した。
グリッドを生理的リン酸緩衝液で洗浄し、５nmの金コロ
イド（バイオセル (Biocell)）に結合したヤギ抗ウサギ
抗体とインキュベートした。
【００７６】電子顕微鏡による検査で、リゾチームがシ
リカ粒子全体に均一に分布していることが判明した。ウ
サギ抗リゾチーム抗体を除いた陰対照(negative contro
l)はブランクであった。この酵素はシリカ担体の多孔質
構造全体に均一に分布しており、Ｆｖが細孔内の表面全
体に配置されていること、並びに該酵素も細孔内に結合
するようになることを示している。
リカ粒子全体に均一に分布していることが判明した。ウ
サギ抗リゾチーム抗体を除いた陰対照(negative contro
l)はブランクであった。この酵素はシリカ担体の多孔質
構造全体に均一に分布しており、Ｆｖが細孔内の表面全
体に配置されていること、並びに該酵素も細孔内に結合
するようになることを示している。
【００７７】実施例４：多孔質シリカ上に固定化したＦ
ｖフラグメントを用いるリゾチームの回収 ａ） 免疫吸着剤の調製 およそ２００オングストロームの孔径のエポキシシリカ
粒子（クロスフィールド・ケミカルズ (Crosfield Chem
icals)、C200）を、モーハン(Mohan) 他の方法（Separa
tions for Biotechnology, D L Pyle編(1990)）でジオ
ール誘導体に変換した。このC200ジオール粒子を以下の
ようにしてトレシル化した。
ｖフラグメントを用いるリゾチームの回収 ａ） 免疫吸着剤の調製 およそ２００オングストロームの孔径のエポキシシリカ
粒子（クロスフィールド・ケミカルズ (Crosfield Chem
icals)、C200）を、モーハン(Mohan) 他の方法（Separa
tions for Biotechnology, D L Pyle編(1990)）でジオ
ール誘導体に変換した。このC200ジオール粒子を以下の
ようにしてトレシル化した。
【００７８】２g のジオールシリカを、０．７６mlの乾
燥トリエチルアミン（フルカ (Fluka)）及び０．６６６
g の4-ジメチルアミノピリジン（フルカ）を含む１００
mlの乾燥アセトン（ＢＤＨ）中で穏やかに撹拌した。塩
化トレシル（フルカ）の２％溶液５０mlを、穏やかに撹
拌したシリカ溶液に２時間にわたって（温度を３０℃未
満に保ちながら）ゆっくりと滴下した。さらに１時間た
った後、内容物を漏斗上の濾紙（ワットマン(Whatman)N
o1）に移し、エタノール（ＢＤＨ）で洗浄した。さらに
エタノール（３０ml×５回）で洗浄し、次いで１：１の
エタノール／アセトン混合物（３０ml×５回）で洗浄
し、最後にアセトン（３０ml×５回）で洗浄した。この
シリカを、３０℃で一晩、強制空気（ファン）オーブン
中で乾燥した。
燥トリエチルアミン（フルカ (Fluka)）及び０．６６６
g の4-ジメチルアミノピリジン（フルカ）を含む１００
mlの乾燥アセトン（ＢＤＨ）中で穏やかに撹拌した。塩
化トレシル（フルカ）の２％溶液５０mlを、穏やかに撹
拌したシリカ溶液に２時間にわたって（温度を３０℃未
満に保ちながら）ゆっくりと滴下した。さらに１時間た
った後、内容物を漏斗上の濾紙（ワットマン(Whatman)N
o1）に移し、エタノール（ＢＤＨ）で洗浄した。さらに
エタノール（３０ml×５回）で洗浄し、次いで１：１の
エタノール／アセトン混合物（３０ml×５回）で洗浄
し、最後にアセトン（３０ml×５回）で洗浄した。この
シリカを、３０℃で一晩、強制空気（ファン）オーブン
中で乾燥した。
【００７９】０．９g のトレシル化C200を１００mlの１
M 塩化ナトリウム、次いで１００mlのホウ酸緩衝液（0.
1Mホウ酸ナトリウム／塩酸,pH8.5）で洗浄した。このシ
リカを１４mlの抗リゾチームＦｖ溶液（連結基を持たな
い）に加え、栓付容器内において４℃で一晩振盪させ
た。上記Ｆｖ溶液はＰＢＳ（0.01M リン酸ナトリウム、
0.15M 塩化ナトリウム,pH7）中でおよそ３５０μg/mlで
あった。この免疫吸着剤を遠心によって回収した。およ
そ１mgのＦｖタンパク質が結合していることがＢＣＡタ
ンパク質アッセイ（ピアース(Pierce)）による分析で判
明した。１M エタノールアミンを含むホウ酸緩衝液内で
振盪することによって免疫吸着剤をブロックした。免疫
吸着剤をトリス緩衝液で３回洗浄してガラス製カラムに
充填した。
M 塩化ナトリウム、次いで１００mlのホウ酸緩衝液（0.
1Mホウ酸ナトリウム／塩酸,pH8.5）で洗浄した。このシ
リカを１４mlの抗リゾチームＦｖ溶液（連結基を持たな
い）に加え、栓付容器内において４℃で一晩振盪させ
た。上記Ｆｖ溶液はＰＢＳ（0.01M リン酸ナトリウム、
0.15M 塩化ナトリウム,pH7）中でおよそ３５０μg/mlで
あった。この免疫吸着剤を遠心によって回収した。およ
そ１mgのＦｖタンパク質が結合していることがＢＣＡタ
ンパク質アッセイ（ピアース(Pierce)）による分析で判
明した。１M エタノールアミンを含むホウ酸緩衝液内で
振盪することによって免疫吸着剤をブロックした。免疫
吸着剤をトリス緩衝液で３回洗浄してガラス製カラムに
充填した。
【００８０】ｂ） １０％ウマ血清からのリゾチームの
回収 ２０mlの１０％ウマ血清（トリス緩衝液で稀釈）に鶏
卵リゾチームを終濃度が０．０２mg／mlとなるように加
えた。この添加血清を０．４５μm のフィルターに通
し、上記免疫吸着剤に流し、実施例３ｂと同様に溶出
し、分析した。溶出ピークは非常にリゾチームに富んで
いた（第７図ａ）。
回収 ２０mlの１０％ウマ血清（トリス緩衝液で稀釈）に鶏
卵リゾチームを終濃度が０．０２mg／mlとなるように加
えた。この添加血清を０．４５μm のフィルターに通
し、上記免疫吸着剤に流し、実施例３ｂと同様に溶出
し、分析した。溶出ピークは非常にリゾチームに富んで
いた（第７図ａ）。
【００８１】非特異的結合の程度を決定するため、１M
エタノールアミンを含むホウ酸緩衝液で０．２g のトレ
シル化C200をブロックして「ブランク」カラムを作成し
た。
エタノールアミンを含むホウ酸緩衝液で０．２g のトレ
シル化C200をブロックして「ブランク」カラムを作成し
た。
【００８２】Ｆｖ免疫リガンドは添加しなかった。５ml
の１０％ウマ血清に鶏卵リゾチームを終濃度が０．１mg
／mlとなるように加えた。上記と同様にカラムを洗浄
し、溶出した。このカラムにはリゾチームも血清も結合
しなかった（第７図ｂ）。
の１０％ウマ血清に鶏卵リゾチームを終濃度が０．１mg
／mlとなるように加えた。上記と同様にカラムを洗浄
し、溶出した。このカラムにはリゾチームも血清も結合
しなかった（第７図ｂ）。
【００８３】このことは、リゾチームの回収がＦｖ免疫
リガンドとの特異的相互作用によることを実証するもの
である。
リガンドとの特異的相互作用によることを実証するもの
である。
【００８４】実施例５：多孔質シリカ上への抗リゾチー
ムＤａｂの固定化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 約２００オングストロームの孔径を有するグルタルアル
デヒド活性化シリカ（PREPSCALE Glutaraldehyde-P、Ｊ
Ｔベーカー 7567-02）を実施例３ａと同様に洗浄した。
この洗浄したシリカを１０mlのＤａｂ標品に加えた。Ｄ
ａｂは連結基として「Ｍｙｃ」ペプチドを有する抗リゾ
チーム VH であった。タンパク質濃度はＰＢＳ（0.01M
リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム,pH7）中でお
よそ７０μg/mlであった。カップリングは実施例３ａと
同様に行った。
ムＤａｂの固定化並びにその免疫吸着剤としての使用 ａ） 免疫吸着剤の調製 約２００オングストロームの孔径を有するグルタルアル
デヒド活性化シリカ（PREPSCALE Glutaraldehyde-P、Ｊ
Ｔベーカー 7567-02）を実施例３ａと同様に洗浄した。
この洗浄したシリカを１０mlのＤａｂ標品に加えた。Ｄ
ａｂは連結基として「Ｍｙｃ」ペプチドを有する抗リゾ
チーム VH であった。タンパク質濃度はＰＢＳ（0.01M
リン酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウム,pH7）中でお
よそ７０μg/mlであった。カップリングは実施例３ａと
同様に行った。
【００８５】ｂ） １０倍過剰のチトクロームｃからの
リゾチームの回収 トリス／ツイーン緩衝液（0.1Mトリス,pH8、0.15%ツイ
ーン）中で、０．０１mg／mlの鶏卵リゾチームと０．１
mg／mlのチトクロームｃの２種類のタンパク質の混合物
を作成した。２０mlのこの混合物を上記免疫吸着剤上に
流し、実施例３と同様にして溶出し、分析した。
リゾチームの回収 トリス／ツイーン緩衝液（0.1Mトリス,pH8、0.15%ツイ
ーン）中で、０．０１mg／mlの鶏卵リゾチームと０．１
mg／mlのチトクロームｃの２種類のタンパク質の混合物
を作成した。２０mlのこの混合物を上記免疫吸着剤上に
流し、実施例３と同様にして溶出し、分析した。
【００８６】チトクロームｃからのリゾチームの分離は
完璧であった（第８図）。チトクロームｃとリゾチーム
は類似の分子量並びに等電点を有するので、これらが完
全に分離されたということは高分解能を有する事象であ
ることを示している。
完璧であった（第８図）。チトクロームｃとリゾチーム
は類似の分子量並びに等電点を有するので、これらが完
全に分離されたということは高分解能を有する事象であ
ることを示している。
【図１】第１図は連結基を有する単一領域抗体の調製に
有用な３種類のオリゴヌクレオチドを示したものであ
る。
有用な３種類のオリゴヌクレオチドを示したものであ
る。
【図２】第２図は第１図に示したオリゴヌクレオチドに
よって製造された２種類の連結基のペプチド配列を示し
たものである。
よって製造された２種類の連結基のペプチド配列を示し
たものである。
【図３】第３図ａ乃至ｃは実施例２ｂで得られたクロマ
トグラフの溶出曲線を示したものである。
トグラフの溶出曲線を示したものである。
【図４】第４図ａ乃至ｃは実施例２ｃで得られたクロマ
トグラフの溶出曲線を示したものである。
トグラフの溶出曲線を示したものである。
【図５】第５図は実施例２ｃ及び２ｄで得られたＳＤＳ
−ＰＡＧＥの結果を示したものである。
−ＰＡＧＥの結果を示したものである。
【図６】第６図は実施例３で得られたクロマトグラフの
溶出曲線を示したものである。
溶出曲線を示したものである。
【図７】第７図ａ及びｂは実施例４で得られたクロマト
グラフの溶出曲線を示したものである。
グラフの溶出曲線を示したものである。
【図８】第８図は実施例５で得られたクロマトグラフの
溶出曲線を示したものである。
溶出曲線を示したものである。
【手続補正書】
【提出日】平成３年２月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 11/14 2121−4Ｂ
(72)発明者 ポール・ジエイムス・デイビス
英国、ベツドフオードシヤー、フエルマー
シヤム、パベンハム・ロード、ザ・ホート
ーンズ（番地なし）
(72)発明者 マーチン・エリサ・バーホーエン
英国、エヌエヌ10・０エヌピー・ノーザン
ツ、ラツシユデン、マノア・フアーム・エ
ステイト、テインタゲル・クローズ １
(72)発明者 ロナルド・フランク・ヤコブス・ド・ウイ
ンター
英国、ベツドフオードシヤー、ベツドフオ
ード、ダドリー・ストリート 97
Claims (18)
- 【請求項１】 多孔質固相担体材料上に固定化した約２
５０００以下の分子量を有する特異的結合剤を含むこと
を特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項２】 多孔質固相担体材料上に固定化したＦｖ
フラグメントを含むことを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項３】 多孔質固相担体材料上に固定化したＤａ
ｂを含むことを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項４】 請求項１乃至請求項３のいずれか１項記
載の免疫吸着剤材料において、前記多孔質固相担体材料
が１０００オングストローム未満の呼称孔径を有するこ
とを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項５】 請求項４記載の免疫吸着剤材料におい
て、前記呼称孔径が約５００オングストローム未満であ
ることを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項６】 請求項４記載の免疫吸着剤材料におい
て、前記呼称孔径が約３００オングストローム未満であ
ることを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項７】 請求項４乃至請求項６のいずれか１項記
載の免疫吸着剤材料において、前記呼称孔径が約３０オ
ングストローム以上であることを特徴とする免疫吸着剤
材料。 - 【請求項８】 請求項７記載の免疫吸着剤材料におい
て、前記呼称孔径が約６０オングストローム以上である
ことを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項９】 請求項１乃至請求項８のいずれか１項記
載の免疫吸着剤材料において、前記担体材料が多孔質無
定形シリカ、制御された多孔質ガラス、又は親水性「Ｐ
Ｗ」ポリマーであることを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項１０】 請求項９記載の免疫吸着剤材料におい
て、前記前記担体材料がシリカであることを特徴とする
免疫吸着剤材料。 - 【請求項１１】 固相担体材料上に固定化した特異的結
合剤を含む免疫吸着剤材料にして、該特異的結合剤が
i) 元の単数もしくは複数の抗体の如何なる実質的部分
とも結合していない１種類以上の可変領域タンパク質
（ＶＨ及び／又はＶＬ）と、ii) 基本的な特異的結合特
性には寄与しないが該結合剤の基本的な特異的結合活性
にさほど影響を与えることなく該固相担体材料と化学的
手段もしくは他の手段でカップリングし得る化学基（好
ましくはペプチド基）とを含んでなることを特徴とする
免疫吸着剤材料。 - 【請求項１２】 請求項１乃至請求項１１のいずれか１
項記載の免疫吸着剤材料において、前記特異的結合剤が
Ｆｖフラグメント又はＤａｂであって、５残基以上のア
ミノ酸残基を含むペプチド系連結基を介して前記担体材
料とカップリングしていることを特徴とする免疫吸着剤
材料。 - 【請求項１３】 請求項１２記載の免疫吸着剤材料にお
いて、前記ペプチド系連結基が２０残基以下のアミノ酸
を含むことを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項１４】 請求項１１乃至請求項１３のいずれか
１項記載の免疫吸着剤材料において、前記連結基が疎水
性であることを特徴とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項１５】 請求項１２記載の免疫吸着剤材料にお
いて、前記連結基が「Ｍｙｃ」テールであることを特徴
とする免疫吸着剤材料。 - 【請求項１６】 請求項１乃至請求項１５のいずれか１
項記載の免疫吸着剤材料のアフィニティー精製法におけ
る用途。 - 【請求項１７】 ３０乃至３００オングストロームの範
囲内の呼称孔径を有する多孔質担体材料にして、無定形
シリカ、制御された多孔質ガラス、及び合成ポリマーも
しくはコポリマーからなる群から選択した多孔質担体材
料上のＦｖフラグメント又はＤａｂフラグメントを含む
免疫吸着剤材料の、アフィニティー精製法の速度及び／
又は処理量を向上させることを目的とする用途。 - 【請求項１８】 請求項１７記載の用途において、前記
担体材料がシリカであることを特徴とする用途。
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