JP2008510856A

JP2008510856A - ナノ細孔ポリマー上の両親媒性でタンパク質性のコーティング

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Publication number: JP2008510856A
Application number: JP2007528068A
Authority: JP
Inventors: フランシスインバルザノジョン; スティーグリッツバリー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-17
Publication date: 2008-04-10
Also published as: EP1778308A2; US7147912B2; CN101022838A; US20060040098A1; WO2006023795A3; WO2006023795A2

Abstract

本発明は、ナノ細孔ポリマー上への両親媒性でタンパク質性のコーティングの形成に関する。

Description

本発明は、ナノ細孔ポリマー表面上の水湿潤性の改変に関する。

（特許文献１）には、表面のコーティングであって、ハイドロフォービンと呼ばれ該表面上に両親媒性コーティングを形成する、タンパク質性材料を含むコーティングが開示されている。両親媒性とは、該タンパク質性材料が該コーティングに疎水性基および親水性基の両方を付与することを意味する（（非特許文献１）における両親媒性の定義参照）。ハイドロフォービンは、このようなタンパク質性材料の一群の例である。ハイドロフォービンの両親媒性特性により、該タンパク質性材料は、コートされた基質の表面で自己組織化してコーティングを形成するが、かかるコーティング・プロセスは、コートされる表面の湿潤性に従って方向付けられる疎水性および親水性を備える。表面が疎水性であれば、該コーティングの疎水性側がコートされる疎水性表面と接触し、該コーティングの外側表面が親水性となり、コート後の表面の水湿潤性は増大する。ハイドロフォービン様材料は、天然物から単離されたハイドロフォービンのみならず化学的に改変されたまたは遺伝子操作で改変されたハイドロフォービンであるが、両親媒性膜（コーティング）に親水性または疎水性の界面で自己組織化するというハイドロフォービン特性を有するものとして、（特許文献２）に開示されている。簡素化のため、本明細書で用いる用語の「ハイドロフォービン」にはハイドロフォービン様材料も含まれるものとする。自己組織化前のハイドロフォービンは、モノマーと呼ばれることもあり、自己組織化には、コートされた表面上のモノマーが凝集または重合して両親媒性コーティングを形成することも含まれることを意味する。メカニズムの如何を問わず、得られた両親媒性コーティングは非水溶性であり、コーティング形成に使用された溶液中で水溶性であることとは対照的である。コーティングが非水溶性であることは、重合または他のメカニズムによるにせよ、より大きな分子が形成されたことを示唆する。用語の「ハイドロフォービン」は、ハイドロフォービン出発物質（モノマー）から得られた非水溶性コーティングを説明するのにも使われる。

米国特許公報（特許文献３）には、表面塗布後に界面活性剤の存在下で両親媒性コーティングを加熱してコーティングの安定性を増進させることが開示されている。該特許出願公報の実施例２および４のテフロン（ＴＥＦＬＯＮ）（登録商標）ポリテトラフルオロエチレン・シートに関して示されているように、加熱／界面活性剤で処理されたコーティングは、未処理のコーティングに比べ、溶液洗浄の際のハイドロフォービンの脱着が少なくなる。コーティングの安定性／耐久性の向上は望ましいものの、実施が不可欠の上乗せステップとなり、コーティングの塗布機に不都合または望ましくない加熱が必要となる。例えば、コンタクトレンズのコーティングは室温（１５〜２５℃）で好適に実施でき、界面活性剤の使用も不要である。さらに、加熱処理中に界面活性剤が存在すると、コーティングが界面活性剤の残渣で汚染される問題が発生する。

国際公開第２００４／０００８８０Ａ１号パンフレット国際公開第２００４／０００８８０号パンフレット米国特許出願公開第２００３／０１３４０４２Ａ１号明細書米国特許第５，５４３，２１７号明細書米国特許第５，６６３，２５５号明細書米国特許第５，９１９，８７８号明細書米国特許第４，７５４，００９号明細書米国特許第４，９３５，４７７号明細書米国特許第５，８８３，１７７号明細書米国特許第４，８９７，４５７号明細書米国特許出願公開第２００３／０１３４０４２号明細書国際公開第２０００／０５８３４２号パンフレット米国特許出願公開第２００３０１６６９６０号明細書国際公開第０１／５７５２８Ａ１号パンフレットＩＵＰＡＣ化学技術一覧、第２版、３１、６１２（１９７２年）「ナノ多孔質材料」、Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ，Ｌｔｄ．出版、２００３年１０月Ａ．Ｙ．アレンティーフ（Ａ．Ｙ．Ａｌｅｎｔｉｅｖ）ら、「パーフルオロジオキソールコポリマーの高輸送パラメーターおよび自由体積」、Ｊ．ＭｅｍｂｒａｎｅＳｃｉｅｎｃｅ１２６、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＢ．Ｖ．出版、１２３−１３２頁（１９９７年）ナガラジャン，Ｖ．（Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｖ．）ら、１９９２年、Ｇｅｎｅ、１１４：１２１−１２６頁バークイスト，Ｐ．Ｌ．（Ｂｅｒｑｕｉｓｔ，Ｐ．Ｌ．）ら、２００４年、３２：２９３−２９７頁ゴウカ，Ｒ．Ｊ．（Ｇｏｕｋａ，Ｒ．Ｊ．）ら、１９９７年、ＡｐｐｌＭｉｃｔｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、４７：１−１１頁スコルメイジャー，Ｍ．（Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ，Ｍ．）ら、２００２年、ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６８：１３６７−１３７３頁ファンデルメイ，Ｈ．Ｃ．（ｖａｎｄｅｒＭｅｉ，Ｈ．Ｃ．）ら、１９９１年、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ、２６１−２６７頁、Ｄ．Ｓ．モゼス（Ｄ．Ｓ．Ｍｏｚｅｓ）ら編、ＶＣＨ、ニューヨークバイレイ（Ｂａｉｌｅｙ）ら、２００２年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、５８７２１−７２７頁リンダー（Ｌｉｎｄｅｒ）ら、２００１年、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２５１１−５１７頁ウォステン（Ｗｏｓｔｅｎ）ら、１９９３年、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．５、１５６７−１５７４頁

本発明は、ナノ細孔ポリマー上にコーティングを形成することにより、加熱／界面活性剤での処理が不要な、安定し／耐久性の高いタンパク質性で両親媒性のコーティングを提供する。ポリマーのナノサイズの細孔は、コーティングと相互作用し、コーティングの安定性／耐久性を驚異的に増大させる。こうして、本発明の一実施形態は、その上にタンパク質性で両親媒性のコーティングを有するナノ細孔ポリマーを含む、複合構造体として記載することができる。

本発明の複合体における別の予想外の実施結果は、ナノ細孔ポリマーの酸素透過度がその上のコーティングによって実質的に損なわれないことである。

（配列表示の簡単な説明）
本発明は、以下の詳細な説明および本出願の一部である付属する配列の説明によって、より十分に理解され得る。

以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の必要要件−配列規則」）に従い、かつ世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）の基準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表示規則（規則５．２および４９．５（ａ”）、ならびに実施細則のセクション２０８および付属文書Ｃ）に適合している。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のデータの用いた符号およびフォーマットは、上記規則３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に従っている。

配列番号１は、成熟したＴＴ１ハイドロフォービンのアミノ酸配列である。

配列番号２は、タラロミセス・サーモフィルスの成熟したＴＴ１ハイドロフォービンをコードするＤＮＡの配列である。

配列番号３は、ＴＴ１ハイドロフォービン前駆体のアミノ酸配列である。

配列番号４は、タラロミセス・サーモフィルスのＴＴ１ハイドロフォービン前駆体をコードするＤＮＡの配列である。

ナノ多孔質材料は、（非特許文献２）に、大きさが１００ｎｍ未満の細孔を有するポリマーを含む、幅広い種類の材料として開示されている。ナノ多孔質材料を製造する方法も開示されている。本発明で用いるナノ細孔ポリマーは、好ましくは５０ｎｍ未満の、より好ましくは５ｎｍ以下の平均ナノ細孔（開口）サイズを有している。ナノ細孔ポリマーは親水性でも疎水性でもよく、タンパク質性で両親媒性のコーティングは該ポリマーの表面に密着し、該コーティングの外側表面が該ポリマー表面の水湿潤性を改変し、ナノ細孔ポリマーが疎水性の場合にはより湿潤性とし、ナノ細孔ポリマーが親水性の場合には湿潤性を低下させる。いずれの場合にも、該ポリマーのナノ細孔がコーティングと相互作用し、安定性／耐久性を増大させる。

ナノ細孔を得るための好ましい方法は、ポリマーの融点が存在しないことで示される、結晶構造が存在しないポリマーで一般に示されるように、ポリマーを非晶質にすることである。より詳細には、「非晶質」とは、重合直後のポリマーの示差走査熱量計（ＤＳＣ）での３Ｊ／ｇ以下、好ましくは１Ｊ／ｇ以下であると検知される吸熱で決定される融解熱で示されるように、ポリマーが非結晶性であることを意味する。１回目の加熱で弱い吸熱が検知されても、一般に２回目のＤＳＣで吸熱は認められない。非晶質ポリマーが示す吸熱の最大値は３Ｊ／ｇと考えられ、ＤＳＣ走査時の「バックグラウンド・ノイズ」がほぼ同じ３Ｊ／ｇであれば、ポリマーの結晶化（融解）熱は検知が困難である。ポリマーの非晶質状態は分子構造が十分に開放されていることで特徴付けられ、したがってポリマーの結晶が存在しないため、これらのポリマーで形成されたフィルムを、不活性ガスなどの小分子は透過できる。

（非特許文献３）に、ポリマーが非晶質状態である、すなわちポリマーが自由体積を有している、効果が開示されており、空隙率は、ポリマーの真の密度とポリマー中に細孔が存在することによる実際の低い密度との間の違いを示す。この論文から、パーフルオロジオキソールコポリマーの自由体積がポリ（トリメチルシリルプロピン）（ＰＴＭＳＰ）と同じく高く、フッ素含有ノルボルネンポリマーより高いことが見出された。ポリマー中の自由体積、および自由体積から細孔のサイズ（自由体積要素と呼ばれる）を決定するための陽電子消滅寿命法が開示されており、上記論文は平均細孔サイズがジオキソールコポリマーで１ｎｍ未満の５．９〜６．４Å（０．５９〜０．６４ｎｍ）、ＰＴＭＳＰで６．７Å（０．６７ｎｍ）と報告している。自由体積は、非晶質ポリマー形成時の無秩序状態に起因している。ポリマー表面の開口（細孔）はポリマーの厚さを貫通しており、典型的にはフィルムとして作製されるので、酸素はフィルムを透過できる。かかる細孔のサイズは非常に小さく、典型的には炭化水素ガスに対するバリヤーを形成する。形成時に結晶性を有するポリマーは、アレンティーフ（Ａｌｅｎｔｉｅｖ）の論文に報告されるように、低レベルの自由体積（ＰＴＦＥでは１４〜１８％）を有しているが、比較的に酸素不透過であるにもかかわらず、すなわちナノ多孔質ではない。溶融流れ可能な部分結晶性のフッ素ポリマーも、その比較的酸素不透過性で示されるように、低い自由体積を有している。

本発明で用いられるポリマーのナノ多孔質構造は、ポリイミド、ポリスルホン、セルロースアセテート、ポリアラミド、およびゴアテックス（ＧＯＲＥＴＥＸ）（登録商標）シートとして入手可能な多孔質のポリテトラフルオロエチレンなどのポリマーから形成され、細孔サイズがミクロンオーダーで測定され、濾過などの用途で用いられる、マイクロ多孔質ポリマー構造とは区別すべきである。１μｍ＝１０００ｎｍである。したがって、本発明で用いられるポリマーのナノ細孔は、マイクロ多孔質ポリマー基質中の細孔に比べてはるかに小さい。

マイクロ多孔質ポリマー構造は、かなり大きな「穴」をポリマー中に有するため、酸素透過度を有しているが、マイクロ細孔を有するような何らかの処理または変性を受けていない部分結晶性ポリマーは、４２５センチ・バリヤー（１センチ・バリヤー＝（ｃｍ³×ｃｍ／ｃｍＨｇｃｍ²×１０^-8））未満の酸素透過度で示されるように、酸素に対してバリヤーである。部分結晶性ポリマーは、ポリマー中に結晶性が存在するため、ナノ多孔質ではない。上記のシエンティフィカ（Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ）社の刊行物に開示されているものなどの技術の一つが、ポリマーに課せられてナノ多孔質にされなければならない。

本発明で用いられる好ましい非晶質ナノ細孔ポリマーは、非晶質パーフルオロポリマーである。本発明で有用な非晶質パーフルオロポリマーの一群は、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）と、米国特許公報（特許文献４）および米国特許公報（特許文献５）に開示されているように、３〜８個の炭素原子を含むパーフルオロオレフィン、好ましくはヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）、あるいは、米国特許公報（特許文献６）に開示されているように、アルキル基が１個または２個の炭素原子を含むパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）とのコポリマーである。両方の特許においても、ＴＦＥと共重合するコモノマーの量は、得られるフルオロポリマーが非晶質な状態となるのに十分である。両方の特許によると、コポリマーを非晶質な状態とするのに必要な、ＨＦＰまたはパーフルオロ（エチルビニルエーテル）（ＰＥＶＥ）の最小限の量は、２０モル％である。他のコモノマーが存在すれば、より少なくてもよい。ＴＦＥ／ＰＥＶＥコポリマーの場合、フルオロポリマー中のＰＥＶＥとパーフルオロ（メチルビニルエーテル）（ＰＭＶＥ）との合計重量の少なくとも１５重量％をＰＥＶＥが占めるという条件付きで、ＰＭＶＥの量がＰＥＶＥの量を超えてもよい。

非晶質なフルオロポリマーの別の群は、パーフルオロ−２，２−ジメチル−１．３−ジオキソール（ＰＤＤ）などのパーフルオロ脂肪族環構造を含むフルオロポリマーである。このフルオロポリマーはＰＤＤのホモポリマーであってもよい。他の実施形態において、フルオロポリマーは、テトラフルオロエチレン、パーフルオロ（メチルビニルエーテル）、フッ化ビニリデン、およびクロロトリフルオロエチレンからなる群から選択される補足的な量の少なくとも１種のモノマーを有するコポリマーを含む、ＰＤＤのコポリマー（アレンティーフ（Ａｌｅｎｔｉｅｖ）らのパーフルオロジオキソールポリマー）である。ガス透過度が高いため、好ましいフルオロポリマーは、ＰＤＤおよび補足的な量のテトラフルオロエチレンを含むコポリマー、特に６５〜９９モル％のＰＤＤを含むかかるポリマーである。非晶質なポリマーは、少なくとも１４０℃、より好ましくは少なくとも１８０℃のガラス転移温度を有することが好ましい。ガラス転移温度（Ｔｇ）は当該技術分野で既知であり、ポリマーが堅く、ガラス質の状態、すなわちガラス状態からゴム状またはプラスチック状の状態に変化する温度である。これらのコポリマーの例は、米国特許公報（特許文献７）および米国特許公報（特許文献８）に開示されている。ポリマーは、ＰＤＤと補足的な量の少なくとも１種の他のコモノマーとの非晶質なコポリマーであってもよく、前記コポリマーは、パーフルオロ（ブテニルビニルエーテル）との二元重合体、およびパーフルオロ（ブテニルビニルエーテル）と第三のコモノマーとの三元重合体から選択され、第三のコモノマーが、ハロゲンが少なくとも一つのフッ素または塩素である過ハロゲン化オレフィン、あるいはパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）であってよく、第三のコモノマーが存在する場合、第三のコモノマーの量は、組成物全体の４０モル％までであることが好ましい。かかるフルオロポリマーのＴｇは、少量のテトラフルオロエチレンコモノマーを有するテトラフルオロエチレンとの二元重合体の２６０℃から、少なくとも６０モル％のテトラフルオロエチレンを含むフルオロポリマーの１００℃未満にまで及ぶ。本発明で使用可能な、他のジオキソールを含むポリマーは、ＴＦＥと４，５−ジフルオロ−２，２−トリフルオロメチル−１，３−ジオキソールとのコポリマーなどの米国特許公報（特許文献９）に開示されているポリマーである。

本発明で有用な非晶質なフルオロポリマーの他の群は、ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）らの米国特許公報（特許文献１０）に記載のように、ＣＦ₂＝ＣＦ−Ｏ−（ＣＦ₂）_n−ＣＦ＝ＣＦ₂（式中ｎ＝１または２）などのパーフルオロ（アリルビニルエーテル）またはパーフルオロ（ブテニルビニルエーテル）の重合で形成され、下記の環構造、

（式中、ｎは１または２の整数）を含むポリマー、およびそれらのコポリマーを形成するパーフルオロ脂肪族環構造を有するポリマーである。

上記の非晶質なフルオロポリマーはすべてナノ多孔質であり、したがって酸素透過性を有している。

ナノ細孔ポリマー用のコーティングの出発物質は、コーティング形成時に両親媒性を示すタンパク質性材料である。タンパク質性材料は、幅広い範囲のアミノ酸配列を有することができ、ペプチドからタンパク質までのサイズ範囲であることができる。タンパク質の例は、上記のように、ハイドロフォービン様材料を含む、ハイドロフォービンである。ハイドロフォービンは７０個〜１２５個のアミノ酸からなると考えられるが、改変ハイドロフォービンは長さが１５０アミノ酸に届くことができ、典型的には、改変ハイドロフォービンは保存配列内に８個のシステインを含む。（特許文献２）に開示されているように、ハイドロフォービンのアミノ酸の長さを切り詰めて短くすることができ、切り詰めたハイドロフォービンも本発明では有用である。５００アミノ酸を超えるほどはるかに長いタンパク質性材料も本発明で使用可能である。本発明で使用可能な追加のタンパク質性材料の例は、米国特許公報（特許文献１１）に開示されている、ハイドロフォービンおよびハイドロフォービン様材料である。具体的な例は、ハイドロフォービンＳＣ３およびＳＣ４（１１０アミノ酸）である。これらはクラスＩハイドロフォービンである。クラスＩＩハイドロフォービンの例は、ＨＢＩおよびＨＦＢＩＩ（８０アミノ酸）である。他のハイドロフォービンの例は、高熱性菌類のタラロミセス・サーモフィルスからのクラスＩハイドロフォービンである、ＴＴ１（１３５アミノ酸）である。このハイドロフォービンについては以下で詳細に説明する。クラスＩハイドロフォービンはエタノールなどの極性溶剤に不溶であり、クラスＩＩハイドロフォービンはこれらの溶剤に可溶である。現在、さまざまな菌類からの５０を超えるハイドロフォービン配列が知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋおよび国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、ベテスダ市、メリーランド州）を通して入手でき、これらのハイドロフォービンを塗布して、本発明で用いる両親媒性コーティングを形成できる。このコーティング・プロセスに用いられるハイドロフォービンは他のタンパク質を含んでよく、すなわち１００％純粋である必要はない。

ハイドロフォービンのＴＴ１は新たに発見された高熱性ハイドロフォービンであり、本出願と同じ日に出願された、事件識別子ＣＬ２５０４に対応する米国特許出願の対象となっている。分泌信号が除去された成熟ＴＴ１タンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１および２で示される。分泌信号が損なわれていないＴＴ１タンパク質前駆体のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号３および４で示される。「ＴＴ１タンパク質のサンプル」は、成熟ＴＴ１または前駆体ＴＴ１をコードするポリヌクレオチドが発現される、発現系から調製された部分的精製ＴＴ１タンパク質を指す。ＴＴ１タンパク質に加えて、このサンプルは、精製過程で除外されていない、他の発現宿主のタンパク質も含むことができる。ナノ細孔ポリマーのコーティング用のＴＴ１タンパク質サンプルの調製は、組換えＤＮＡ技術により達成できる。当業者であれば、産生系内で前駆体ＴＴ１タンパク質または成熟ＴＴ１タンパク質を発現させるのに適合した、ＴＴ１コード領域を含むキメラ遺伝子の調製法がわかるはずである。好ましい産生系は、バシラス属（非特許文献４）などの細菌の発現系、サッカロミセス属およびピチア属などの酵母菌の発現系、トリコデルマ属（非特許文献５）およびコウジカビ属（非特許文献６）などの菌類の発現系を含むがこれらに限定されない、分泌系である。発現のために、ＴＴ１コード領域は、所望の宿主内で機能するプロモーターに、および任意選択で他の調節信号配列に操作可能に結合され、キメラ遺伝子を産生する。成熟ＴＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを用いる場合、直接分泌させるためには、キメラ遺伝子内で操作可能に結合した、分泌信号ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むことが必要である。分泌信号ペプチドは、前駆体ＴＴ１タンパク質に由来するものであってよく、あるいは異種遺伝子に由来するものであってもよい。バシラス属発現系内で用いられる分泌信号ペプチドの例は、（非特許文献４）に記載されている。発現系内で用いる分泌信号ペプチドは、宿主内で分泌されるタンパク質に由来するものであってよく、例えば、ハイドロフォービンの信号ペプチドを菌類発現系内での分泌に使用できる。

さまざまな標識をキメラ遺伝子に加え、発現されたタンパク質に結合したペプチド標識の発現をもたらす。例えば、発現されたタンパク質の検知または精製のための、これらの標識の使用は、標識されたペプチドに対する抗体または標識されたペプチドを基質に吸着させる手段が利用できるため、当業者に既知である。かかる標識の例は、Ｆｌａｇ標識およびＨｉｓ標識である。

トリコデルマ属内でＴＴ１を発現させるためのキメラ遺伝子構造には、以下の成分が以下の順序で含まれる。
１）トリコデルマ属ｃｂｈ１（セルラーゼ）遺伝子からのプロモーター
２）ｃｂｈ１前駆体タンパク質の分泌信号ペプチドをコードするポリヌクレオチド
３）転写停止コドンを含まず、成熟ＴＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド
４）転写停止コドンが後に続く、取り込まれて菌類形質転換体のスクリーニングを容易にし精製を助けるＦｌａｇオクタペプチドおよびＨｉｓ（６個）標識をコードするポリヌクレオチド
５）ｃｂｈ１遺伝子からの転写停止配列

ＴＴ１キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを構築して、キメラ遺伝子を宿主内に移すことができる。プラスミドベクターの選択は、選択した宿主および宿主細胞を形質転換する方法による。異種タンパク質、マーカー遺伝子、および所望する場合に複製起点、の高レベル発現を指示する調節配列を含む発現ベクターは、当業者に周知である。当業者は、組換えＤＮＡ構築物またはキメラ遺伝子を含む宿主細胞を成功裏に形質転換させ、選択し、増殖させるために、プラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子要素をよく知っている。例えば、マーカー遺伝子の選択が含まれ、マーカー遺伝子は形質転換体の同定に使われる。組換えＤＮＡベクターの形質転換により、プラスミドが一時的なものまたは宿主細胞の複製される安定な構成物となり、あるいは導入されたＤＮＡのすべてのまたは一つのセグメントが宿主のゲノムに組み込まれる。組込みベクターは遺伝子的に、標的とする組込みのために、宿主のゲノムと相同な配列のポリヌクレオチドを含む。当業者は、異なる独立した組込みによる安定した形質転換事象から異なるレベルの発現が生じ、そのため、所望する発現レベルを示す細胞系列を得るため、多くの事象をスクリーニングしなければならないことを認識している。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によっておこなうことができる。

ＴＴ１は、スエヒロタケ属については（非特許文献７）に、コウジカビ属については（非特許文献６）に、そしてトリコデルマ属については（特許文献１２）に記載されているように、当業者に既知の方法を使い、菌類の発現系内で産生することが好ましい。上記のキメラ遺伝子構造を含み、選別を通して同定された、形質転換体は、セルロースを含む培地上で成長し、ｃｂｈ１遺伝子プロモーターの発現を引き起こす。ＴＴ１の産生は抗Ｆｌａｇ抗体を用いる免疫検出でアッセイされ、最も発現度が高い菌株が同定される。当業者に既知の方法で、ＴＴ１に対する抗体を調製してＴＴ１ポリペプチドとするが、ＴＴ１ポリペプチドは形質転換体内のＴＴ１の免疫検出のための代替のプローブとして働く。

菌類発現宿主内で、内因性ハイドロフォービンの発現をブロックして、内因性ハイドロフォービンが産生されたハイドロフォービンと同時に精製されないようにすることができる。内因性遺伝子発現は、当業者に既知の方法、例えば、コードする遺伝子または遺伝子部位を欠失させる、コードする遺伝子内にブロック配列を挿入する、コードする遺伝子のプロモーターを分離する、内因性ハイドロフォービンのメッセンジャーＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現させる、および他の類似した方法で、ブロックすることができる。トリコデルマ属発現宿主菌株においては、ＴＴ１産生のために、内因性ＨＦＢＩＩハイドロフォービンの発現を排除することが好ましい。

当業者に既知のハイドロフォービン・タンパク質精製法を用いて、発現されたＴＴ１タンパク質を部分的に精製することができる。一般にこれらの方法には、泡を形成して泡表面上にハイドロフォービンを取り込むことが含まれる。泡は、培地表面下にアノードを備えた容器の底に配置されたＰｔカソードから水素気泡を放出し（非特許文献７）、急速に混合するなどの方法で形成できる。泡サンプルを収集し、凍結乾燥する。サンプルをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）内に再懸濁し、ＴＦＡを蒸発させて乾燥し、サンプルを水に再懸濁する。ＴＴ１の泡サンプルは水に直接溶解することができ、１５ｍＭの酢酸アンモニアを用いてｐＨ７．５で脱塩する。別のハイドロフォービンの精製方法は、ハイドロフォービンを表面に吸収させ、吸収されたハイドロフォービンを界面活性剤を含む溶液中で９０℃未満の温度でインキュベートし、分離してハイドロフォービンの多い溶液を得ることである（米国特許公報（特許文献１３））。部分的に精製されたハイドロフォービンは、上記のように、コーティング塗布用材料として使用できる。あるいは、Ｈｉｓ標識、ＴＴ１の抗体、または当業者に既知の他のタンパク質精製法を用いて、さらに精製されたＴＴ１タンパク質を調製できる。

ＴＴ１コーティングの検討の前に、凍結乾燥したＴＴ１タンパク質サンプルの粉体を少量のトリフルオロ酢酸に懸濁し、蒸発させて乾燥し、次いで再懸濁して脱ガス水に希釈する。ＴＴ１の濃度は、ゲル電気泳動でサンプル内のタンパク質を分離し、クーマシーで染色されたタンパク質を視認することで、推定できる。タンパク質濃度が既知のサンプル内のＴＴ１タンパク質の推定％から、ＴＴ１のタンパク質濃度が与えられる。ＴＴ１で共精製する追加のタンパク質は、ＴＴ１コーティングに含まれる。ＴＴ１コーティングは、いかなる量のＴＴ１であってもよく、表面の水接触角が１５°、より好ましくは少なくとも２０°変化する材料表面上に保持される。

本発明は、ナノ細孔ポリマー上のコーティングとして、両方のクラスのハイドロフォービンが安定し耐久性を有していることを見出した。非常に長い両親媒性でタンパク質性の材料の例はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から入手可能であり、５００を超えるアミノ酸単位から構成されている。

タンパク質性出発物質はすべて水溶性であり、そのため、ナノ細孔ポリマー基質にコーティングを塗布するのに水溶液を使用できる。一般に塗布には、基質を水溶液内に所望のコーティングが得られる時間に渡り浸漬することが含まれる。浸漬は室温でおこなうのが好ましく、何時間も続けてもよいが、コーティング操作を高温でおこなうと、ＴＴ１ハイドロフォービンにはコーティング形成速度が増大する利点がある。浸漬中に、ナノ細孔ポリマー基質がタンパク質性材料の親水性または疎水性のドメインを吸引し、基質上にコーティングが形成される。このハイドロフォービン・コーティングは、コーティング源の溶液に不溶である。基質が疎水性である時、コーティングの曝露面は親水性になりやすく、すなわちコーティング前の基質より小さな接触角を示す。基質が親水性である時は、コーティングの曝露面は疎水性になりやすく、すなわちコーティング前の基質より大きな接触角を示す。一般に、このようなコーティングは、一般的な水道水の流速である１Ｌ／分で５分間暖かい（３７℃）水道水で洗っても、不溶である。次に、コーティングは室温で風乾される。

コーティングは非常に薄くて目視できず、厚さは一般に１０ｎｍ未満であるが、存在していることが、コーティング表面上の湿潤角を測定しポリマー基質の湿潤角と比較することにより、確認できる。両親媒性コーティングが少なくとも１５°の湿潤角の変化をもたらすことが好ましく、より好ましくは少なくとも２０°である。本明細書に記載された湿潤角は、（非特許文献８）に記載のように液滴法によりクルス（Ｋｒｕｓ）社のＤＳＡＭＫ２装置および液滴形状解析ソフトエウェアプログラムを用いて測定されたものである。パーフルオロポリマーは一般に１１０°の湿潤角を示すが、本発明のタンパク質性コーティングにより、好ましくは少なくとも９０°に、より好ましくは少なくとも７５°に、さらに好ましくは少なくとも６０°に、下げられる。ＴＦＥと１５モル％のＰＳＥＰＶＥ（パーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホニルフロリド）とのコポリマーなどのいくつかの機能性パーフルオロポリマーは、９０°の接触角を示してまだ疎水性であると考えられるが、このポリマーの基質上にタンパク質性コーティングを形成すると、７０°以下の接触角を示す。逆に、６０°未満の接触角を示す親水性ポリマーは、本発明にしたがってコーティングされると、７５°の接触角、より好ましくは少なくとも９０°の接触角を示す。

コーティングの厚さは非常に薄いが、コーティングは、実施例に示すように、ポリマー基質の水湿潤性を改変するように機能する。ただし、コーティング厚さはポリマー基質のナノ細孔に比べて非常に大きく、ナノ細孔ポリマー基質をコーティング溶液内に浸漬するコーティング方法では実際に、溶解した両親媒性でタンパク質性の材料が細孔に入り込む機会を与える。ある程度入り込むことは、ナノ細孔ポリマー上のコーティングの安定性／耐久性が増大することから明らかである。驚くべきことに、コーティングされたナノ細孔ポリマー基質の酸素透過度はそれでもかなり高く、ポリマー基質上にコーティングを形成する前の透過度の好ましくは少なくとも８０％である。

酸素透過度が高いため、非晶質フルオロポリマーは、特にＰＤＤジオキソールパーフルオロポリマーの場合には、コンタクトレンズとして特に有用になる。このようなレンズは、他のあらゆる市販コンタクトレンズ材料より通気性が高く（酸素輸送度が高く）、例えば、酸素透過度はあらゆる市販レンズ材料より少なくとも５倍以上高い。しかし、非晶質フルオロポリマーは疎水性であって、９５°を超える水接触角を有している。ナノ細孔ポリマーが非晶質フルオロポリマーフィルムの形状である、本発明の複合構造は、フィルム上のタンパク質性で両親媒性のコーティングに起因する表面の水湿潤性をもたらし、このような複合構造はコンタクトレンズとして有用になる。フィルムは、本発明にしたがってコーティングするための、ナノ細孔ポリマーの単一構造にすぎない。このようなフィルムは、支持されていても支持されていなくともよく、単一平面状、湾曲状、あるいは導管などの環状に形成されてもよい。これらすべての形状において、ナノ細孔ポリマーは、たとえコーティングであっても、酸素などの所望の分子種の透過を可能にする膜として機能する。本発明の複合構造の他の用途には、光学センサーなどの水中用途用のウィンドウ、液体コア導波管用の水湿潤性被覆加工、水湿潤性排ガス管または膜、燃料電池拡散器用の炭素化ＰＡＮまたはＰＭＭＡシートなどの水湿潤性表面の疎水性加工、通気性だが水湿潤性ではない外出着用の水湿潤性布地の疎水性加工、履物、ヘッドギア、およびスポーツ用品が含まれる。

（方法）
（タンパク質性材料溶液の調製）
（非特許文献９）および（非特許文献１０）に記載のように調製されたハイドロフォービンＨＦＢＩＩをＶＴＴバイオテクノロジー（ＶＴＴＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社（フィンランド）から購入した。ハイドロフォービンＳＣ３は、（非特許文献１１）および（非特許文献７）に記載のように、スエヒロタケ、ＡＴＣＣ４４２００の培養濾液から精製した。ハイドロフォービンＴＴ１は、ＶＴＴバイオテクノロジー（ＶＴＴＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社（フィンランド）製のトリコデルマ・リーセイ内でクローニングし過剰発現させることにより入手した。ＴＴ１融合タンパク質の凍結乾燥した粉体を少量のトリフルオロ酢酸に溶解し、これを蒸発させて乾燥し、次いで再溶解し脱ガス水で希釈した。他のハイドロフォービンの溶液は、以下のように調製した。凍結乾燥したＨＦＢＩＩ粉体を脱イオンし脱ガスした水に直接再懸濁させた。凍結乾燥したＳＣ３粉体を少量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に再懸濁させ、これを蒸発させて窒素気流で乾燥し、次いで脱ガス水に再懸濁させた（特許文献１４）。シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６６０アミノ酸）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社が凍結乾燥した粉体、カタログ番号；７０３０）は、脱ガス水に溶解させて溶液とした。すべての凍結乾燥したハイドロフォービン粉体のタンパク質濃度は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入したＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃＡｃｉｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔを用いて決定した（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社分析手順番号；ＴＰＲＯ−５６２）。好適な希釈液を調製し、そのハイドロフォービン濃度で以下の実施例をおこなった。

（ナノ細孔ポリマー上の両親媒性コーティング用のタンパク質性材料による表面コーティング）
テフロン（ＴＥＦＬＯＮ）（登録商標）ＡＦ２４００非晶質フルオロポリマーとして入手可能で０．６ｎｍの平均細孔サイズを有する、テトラフルオロエチレン／パーフルオロ−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソールの非晶質コポリマーフィルムのコーティングは、洗浄し（アセトン、エタノール、および水で洗浄した）、乾燥させた、ポリマー表面上でおこなった。洗浄し乾燥させたフィルムは、１１０°のＷＣＡ（水接触角）を有していた。コポリマーフィルムの小さな断片（０．８ｍｍ×２２ｍｍ）を、本実施例中に示す濃度を有し室温のタンパク質性材料の溶液内に１６時間浸漬させた。浸漬させた断片を溶液から取り出し、蒸留水で洗浄し、風乾した。ＷＣＡは、コートされ風乾された複合構造体上で測定した。表面が疎水性あるいは親水性であるかは、液滴法によりクルス（Ｋｒｕｓ）社のＤＳＡＭＫ２装置および液滴形状解析ソフトエウェアプログラムを用いて測定したＷＣＡから決定した。コートされたフィルム表面に比べ、未コートのフィルム表面のＷＣＡ測定値が異なることから、両親媒性でタンパク質性のコーティングが存在していると推察される。

（両親媒性でタンパク質性のコーティングの耐久性）
両親媒性でタンパク質性の材料でコートされた表面の耐久性または安定性は、コーティングを、全開の水道水（１Ｌ／分）、暖かい（３７℃）水道水で各５分間洗い、次いでコートされたフィルムを室温で乾燥し（簡素化のため、このやり方を水道水法と呼ぶ）、コートされたフィルムのＷＣＡを再測定して、評価した。実施例３に示すように、より厳しい試験もおこなった。

（実施例１）
この実施例においては、タンパク質性材料がＢＳＡであり、表１に示すようにさまざまな溶液濃度でおこなった。コートされたフィルムのＷＣＡは、各溶液のコーティング後に測定し、コーティングを水道水にさらした後に再度測定した。このような実験は、テフロン（ＴＥＦＬＯＮ）（登録商標）ＡＦ２４００フィルムと同様に洗浄し乾燥した、ポリマーフィルムが、ＴＥＦＬＯＮＰＦＡ１０００ＬＰフルオロポリマー（本願特許出願人、ウィルミントン、デラウェア州、米国）として入手可能で１１０°のＷＣＡを有する、テトラフルオロエチレン／パーフルオロ（プロピルビニルエーテル）のコポリマーで３０５℃の融点を有する市販の部分結晶性コポリマーである、フィルムサンプルでも繰り返し、その結果も表１に示した。

表１に示すように、ＡＦポリマーとＰＦＡポリマーの両方で、コーティング溶液中のＢＳＡの濃度が高くなるほど、湿潤性が増大（接触角が低下）した。しかし、水道水法への曝露では、コーティングの不安定で耐久性の欠如を示す、ＷＣＡの増大ではなく、ＷＣＡのさらなる低下が示された。対照的に、ＰＦＡポリマー上のコーティングのＷＣＡは、水道水法への曝露で増大した。他の両親媒性でタンパク質性のコーティングについても、同様な結果が得られた。このように、非晶質ポリマー基質のナノ多孔質構造は、部分結晶性ＰＦＡポリマーに比べ、コーティングの安定性／耐久性を増大させたが、これはＰＦＡの部分結晶がナノ多孔質ではないためである。

（実施例２）
この実施例では、表２に示すように、上記の水溶液からのさまざまなタンパク質性材料を含むナノ細孔ポリマーのコーティングの結果を得たが、ＷＣＡは低下した。

（実施例３）
この実施例では、表３に示すように、水道水法への曝露の後のナノ細孔ポリマー上のコーティングの耐久性を示した。水道水法に曝露すると、ＳＣ３コーティングおよびＢＳＡコーティングではＷＣＡはほとんど変化せず、一方、ＨＦＢＩＩのＷＣＡは増大したがそれでもコーティングされていないポリマーのＷＣＡに比べ大幅に低いレベルであった。ＨＦＢＩＩコーティングに対する調整剤溶液の曝露は、水道水法に比べ効果が小さかった。ＢＳＡコーティングは、この曝露時に、最も小さなＷＣＡの変化を示した。次のより厳しい曝露処理は、酵素溶液の曝露処理であって、コンタクトレンズからのタンパク質の除去を意図したものであった。ＨＦＢＩＩコーティングの性能は水道水法に曝露した場合と同様に良好であった。ＳＣ３コーティングも同様に良好であったが、ＢＳＡコーティングではＷＣＡはほとんど増大しなかった。タンパク質性コーティングの安定性および耐久性はこのようであり、タンパク質性コーティングは、タンパク質の除去を意図した溶液による除去に耐性を有していた。ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）洗浄剤への曝露は最も厳しい処理であって、コーティングされていないポリマーのＷＣＡの回復によって示されるように、タンパク質性コーティングのほとんど（全てではない）が除去された。この実施例で、洗浄剤溶液、調整剤溶液、および酵素溶液との接触は、製造者（ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）社）の表示指示に従った。

ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）社のコンタクトレンズ用の、調整剤溶液、酵素溶液、および洗浄剤溶液については、製造者が以下のように記載している。

ボストンアドバンスコンフォート（ＢｏｓｔｏｎＡｄｖａｎｃｅＣｏｍｆｏｒｔ）調整剤溶液：滅菌された水性の若干高浸透圧の緩衝溶液であって、カチオン性のセルロース誘導ポリマー、セルロース様の増粘剤、湿潤剤としてのポリビニルアルコールおよび誘導ポリエチレングリコール、ならびに緩衝剤を含み、ボストンアドバンス（ＢｏｓｔｏｎＡｄｖａｎｃｅ）洗浄剤と共に使用される際には、有害な生物を破壊するための、グルコン酸クロルヘキシジン（０．００３％）、ポリアミノプロピルビグアニジン（０．０００５％）、およびエデト酸ジナトリウム（０．０５％）によって保存される。

ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）液状酵素洗浄剤：滅菌された水性溶液であって、活性成分としてのタンパク質分解酵素（サブチリシン）、およびグリセロールを含む。タンパク質様堆積物を除去するため、保存料を含まない。

ボストンアドバンス（ＢｏｓｔｏｎＡｄｖａｎｃｅ）洗浄剤：滅菌され、均質で界面活性剤を含む、濃縮溶液であって、硫酸アルキルエステル、エトキシル化アルキルフェノール、トリ四級ココアベースのリン脂質、ならびにフルオロシリコーンアクリレートおよびシリコーンアクリレート硬質ガス透過性コンタクトレンズ洗浄用の二酸化チタンを有する洗浄剤としてのシリカゲルを含む。

（実施例４）
この実施例では、コートされたナノ細孔ポリマーの酸素透過度の驚くべき保持を示す。酸素透過度は、ＡＳＴＭＤ３９８５−９５の手順にしたがって測定した。結果を表４に示す。これらの結果から、コーティングされていないポリマーの酸素透過度が非常に高いことが明らかである。ＨＦＢＩＩおよびＴＴ１（溶液中の濃度；１６μｇ／ｍＬ）のコーティングは、湿潤角を少なくとも４３％下げる一方、ポリマーの元々の酸素透過度の少なくとも８５％を保持している。

Claims

その上にタンパク質性で両親媒性のコーティングを有するナノ細孔ポリマーを含むことを特徴とする複合構造体。
前記タンパク質性で両親媒性のコーティングが前記ポリマーの水湿潤性を増大させ、前記増大した水湿潤性が少なくとも１５°の湿潤角の低下で特徴付けられることを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記ナノ細孔ポリマーの酸素透過度の少なくとも８０％の酸素透過度を有することを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記ポリマーのナノ細孔が５ｎｍ以下の平均直径を有することを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記ナノ細孔ポリマーがフィルムであることを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記フィルムがコンタクトレンズであることを特徴とする請求項５に記載の複合構造体。
前記ナノ細孔ポリマーが非晶質ポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記ナノ細孔ポリマーが疎水性であって、少なくとも９０°の湿潤角で特徴付けられることを特徴とする請求項１に記載の複合構造体。
前記ポリマーが非晶質フルオロポリマーであることを特徴とする請求項８に記載の複合構造体。
前記タンパク質性で両親媒性のコーティングがハイドロフォービンであることを特徴とする請求項８に記載の複合構造体。