DE1767404B2 - Verfahren zur Gewinnung von Lysozym aus einem lysozymhaltigen Ausgangsmaterial - Google Patents

Description

kann, beispielsweise für Riuerungszweeke, nachdem Nach einiger Zeit beginnt die Kristallisation der

das Lysozym daraus abgetrennt wurde. Lysozymbase. Si« wird in einem Kühlschrank bei

Bei Verwendung von Eiweiß oder rohem Lysozym 4 C 70 bis 80 Stunden stehengelassen und schließlich

als Ausgangsmaterial wird dieses zuerst mit einer abfilirieru

Pufferlösung mit einem pH-Wert oberhalb 7, Vorzugs- 5 Das so gewonnene Lysozym besteht aus mindestens

weise einem pH-Wert von 9 bis 11,5, gepuffert. Eine 90'},, der ursprünglich eingesetzten Menge und ist

derartige Pufferlösung ist ein Glycinpuffer pH 10,0. immunologisch rein.
Das verdünnte Ausgangsmaterial wird dann auf die

Carboxylalkylcellulose gegeben, um das Lysozym zu Beispiel 2

absorbieren. Danach kann das Absorbens mit einer io ,,, . · · _D · ■ ι . u u · u

Pufferlösung oder mit Wasser gewaschen werden. Das \^kf ¹^"^{1 werd}.^e" ^₁"^{1 Be}'^sP^ie'. ^schneben

Lysozym wird dann mit verdünnter Salzlösung, bei- *^{n 5} _u ^k? Carboxymethylcellulose absorbiert. Ahnl.che

spielsweise 2%iger Natriumchloridlösung, eluiert. Er^bms« werden hierbei erhalten, wobei die Ausbeute

Gegebenenfalls kann die ursprüngliche Pufferlösung, ^und die Reinheit des Produktes nicht gennger ist als

nachdem sie mit einem Salz versetzt wurde, aTs 15 ⁱⁿ °^eisP^iel '·

Elutionsmittel verwendet werden. Natürlich kann eine _R . 1-1

große Zahl verschiedener Salze in dem Elutionsmittel Beispiel

verwendet werden, deren Konzentration im Elutions- Eine 0,5%ige Lysozymlösung in 0,05 M Glycin/

mittel sollte jedoch nicht so groß sein, daß hierdurch Natriumhydroxyd-Puffer pH 10,0 (3,75 g Glycin/1)

tine Ausfällung des Lysozyms hervorgerufen wird. 20 wird mit Carboxymethlycellulose, Uie nvii dem gleichen

Da^ Lysozym wird dann aus dem Eluat ausgefällt. Puffer äquilibrieri wurde, zusammengebracht und

vorzugsweise nachdem der pH-Wert auf 9,0 bis 10,0 zwar in einer Menge von 5 Teilen Harz auf 1 Teil

eingestellt wurde, indem die Salzkonzentralion erhöht Lysozym.

wird, beispielsweise durch Zusatz von 5% Natrium- Die Carboxymethylcellulose wird dann mit dem

chlorid. 25 Puffer gewaschen, worauf das Lysozym mit dem

Die chemischen und mikrobiologischen Titer und gleichen Puffer, dem 2% Natriumchlorid zugesetzt

insbesondere die immunologischen Tests gegen Ka- worden waren, eluiert wird. Der pH-Wert des Eluats

ninchenserum, welches gegen Eiweiß empfindlich wird auf 9,5 eingestellt. Dann werden dem Eluat

gemacht wurde, zeigen, daß das nach dem erfindungs- weitere 5 ⁿ„ Natriumchlorid zugesetzt, um das Lysozym

gemäßen Verfahren erhaltene L>sozym im wescnt- 30 auszufällen,

liehen rein ist. Das so erhaltene Lysozym ist immunologisch rein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

weiter. -, . · , ,

Beispiel 4

35 I kc Eiweiß wird mit dem Dreifachen seines VoIu-

^BeisP^lei ' mens*an 0,05 M Glycinpuffer pH 10 verdünnt und

100 g Lysozym, welches durch Kristallisation in dann mit 15 g Carboxymethylcellulose zusammen-

Form der Base oder des Hydrochlorids gereinigt gebracht, welche vorher gegen den gleichen Puffer

wurde, aber immer noch eine positive Reaktion gegen äquiiibriert ν orden war. Die Carboxymethylcellulose

Kaninchenserum zeigt, mit Ausfällungskurven sogar 40 wird danach abgetrennt und das Lysozym wie in

bei einer Konzentration von 0,62 "■;„ werden in 20 I Beispiel 1 beschrieben eluiert.
O.05 M Glycinpuffer pH 10 gelöst und mit 500 g

Carboxymethylcellulose, welche mit dem gleichen r> · 15

Puffer gepuffert wurde, zusammengebracht. eispi

Die Carboxymethylcellulose wird dann mit 41 Puffer 45 Das Verfahren von Beispiel 4 wird wiederholt,

gewaschen und danach mit dem gleichen Puffer, dem jedoch ohne Verdünnung des Eiweißes mit der Puffer-

2% Natriumchlorid zugesetzt wurden, eluiert. Etwa lösung. Das nach der Abtrennung der Carboxymelhyl-

13 I Eluat werden gesammelt und der pH-Wert auf cellulose zurückbleibende Eiweiß kann beispielsweise

9.5 bis 9,6 eingestellt. Dann werden dem Eluat weitere zur Herstellung von Nahrungsmitteln weiterverwendet

5°,, Natriumchlorid zugesetzt. 5° werden.

Claims (3)

I 767 404 Auch ein ci.romatogmphisches Verfahren, bei dem Patentansprüche: als Säulenfüllung eine mit 0,1 M Amrnanmmaeelat- Lösung vom pH = 4,0 ins Gleichgewicht gebrachte

1. Verfahren zur Gewinnung von Lysazym aus Carboxymethylcellulose verwendet wird und neben einem lysozymhaltigen Ausgangsmaterial unter 5 anderen Verbindungen auch Lysozym anfällt, wobei Verwendung einer Carboxyalkylcellulose, da- das Lysozym nach Anwendung einer Gradientendurch gekennzeichnet, daß das lyso- elution mit vom pH-Wert von etwa 4 ansteigen der·, zymhaltige Ausgangsmaterial auf einen pH-Wert pH-Werten und mit mehreren sich auch hinsichtlich über 7 gepuffert, dann mit einer Carboxylalkyl- der Salz-Zusammensetzung unterscheidenden EIucellulose in Berührung gebracht, die Carboxyl- ίο tionslösungen schließlich als letzte Substanz in einer alkylcellulose abgetrennt und das daran absorbierte Menge von Il mg erhalten wird, ist vielleicht für Lysozym anschließend mit einer verdünnten Salz- analytische Zwecke gut geeignet, aber eine Gewinnung lösung oder mit einer Pufferlösung, der ein Salz von Lysozym in größeren Mengen würde sich sehr zugesetzt wurde, eluiert wird. umständlich, langwierig und kostspielig gestalten; vgl.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekenn- 15 Saiskin-Ion-Kokan, herausgegeben von Kakibona zeichnet, daß das iysozymhaltige Ausgangsmaterial und Narita, S. 289 bis 291 vom 20. 8. 62. Die vorauf einen pH-Wert zwischen 9 und 11,5 gepuffert stehenden Nachteile gellen desgleichen für ein 4stufiges wird. chromatographisches Verfahren zur Reinigung von

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch Lysozym, bei dem der Chromatographie an Carboxygekennzeichnet, daß die Carboxyla'ikylcellulose 20 methv !cellulose noch eine Adsorption an einem benach Absorption des Lysozyms mit einer Puffer- stimmten Kunstharz vorgeschaltet ist und eine Emlösung oder mit Wasser gewaschen wird, ehe das salzung an einem \on zwei bestimmten dreidimen-Lysozym eluiert wird. sionale vernetzten Dexlran-Gelen sowie eine weitere

Ionenaustausch-Chromatographie an einem Kationen-25 ausiauscherharz nachgeschaltet sind.

Erfindungsgemäß wird nunmehr ein einstufiges neues Verfahren zur Gewinnung von Lysozym ge-

Lysozym, welches einen der Faktoren der natür- schaffen, welches vom Standpunkt der Reinheit des liehen Immunität darstellt, ist eine Mucopolysaccha- Endproduktes zu hervorragenden Ergebnissen führt, ridase, welche in allen Organismen vorhanden zu sein 30 da dieses sich als immunologisch rein erweist,
scheint und insbesondere in Blut, Muttermilch, Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur

Tränenflüssigkeit, Speichel und in vielen Organen, Gewinnung von Lysozym aus einem lysozymhaltigen wie Nieren, Lungen, Hirn u. dgl. sowie in Eiweiß Ausgangsmaterial unter Verwendung einer Carboxyvorhanden ist. alkylcelkiiose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

Lysozym wird häufig bei der Therapie verschiedener 35 das lysozvmhaltige Ausgangsmaterial auf einen pH-Erkrankungen verwendet, die durch Bakterien und Wert übei 7 gepuffert, dann mit einer Carboxyaikyl-Viren verursacht werden. Außerdem weist Lysozym, cellulose in Berührung gebracht, die Carboxyaikylda es ein basisches Polypeptid ist, auch eine anti- cellulose abgetrennt und das daran absorbierte Lysoinflammatorische Wirkung auf. Ferner wird es zur zym anschließend mit einer verdünnten Salzlösung Stimulierung von Leukopoiesis bei verschiedenen 40 oder mit einer Pufferlosung, der ein Salz zugesetzt Arten von Leulopenia, die beispielsweise durch wurde, eluiert wird.

cytostatische Arzneimittel. Benzol und ionisierende Hierbei wird Lysozym selektiv durch Carboxyalkyl-

Strahlen hervorgerufen wird, sowie als Analgetikum ceilulosen in sehr hohen Mengen absorbiert. Es ist gegen Schmerzen, die durch Neoplasien, Neuritis möglich, beispielsweise bis zu 3 g Lysozym durch u. dgl. verursacht werden, verwendet. 45 5 g Carboxvalkylcellulose unter geeigneten Bedingun-

Das Lysozymmolekü! besteht aus 129 Aminosäuren gen zu absorbieren.

und besitzt ein Molekulargewicht von 14386. Seine Wegen der verhältnismäßigen Billigkeit und leichten

räumliche Struktur, die vor kurzem ermittelt wurde, Verfügbarkeit ist Carboxymethylcellulose die bevorist vom Globulintyp. zugte Carboxyalkylcellulose zur Abführung des erfin-

Da Lysozym in der Therapie eine interessante und 50 dungsgemäßen Verfahrens.

breite Anwendungsmöglichkeit besitzt, besteht ein Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, da es sich

Bedarf nach großen Mengen an dieser Substanz, die rasch und einfach durchführen läßt und zu einem sehr gewöhnlich aus Hühnereiweiß erhalten wird, obwohl hohen Reinheitsgrad des Lysozyms führt,
das erfindungsgemäße Verfahren auch auf andere Infolgedessen werden die Herstellungskosten ver-

Eiweißsorten oder biologische Materialien wie Milch, 55 ringert. Die Möglichkeit, Carboxyalkylcellulose als verschiedene Gewebe u. dgl. angewendet werden kann. Absorbens für Lysozym zu verwenden, ist besonders

Lysozym, welches normalerweise im Eiweiß in einer vorteilhaft, wenn man berücksichtigt, daß die spezi-Menge von etwa 0,5 Gewichtsprozent vorliegt, sollte fische Absorption (mg absorbiertes Protein/mg Abkeine Fremdproteine enthalten, wenn es bei der sorbens) dieser Materialien extrem hoch ist im Ver-Humantherapie verwendet werden soll, insbesondere ⁶° gleich mit anderen Absorbentien (lonenaustauscherwenn es parenteral (intramuskulär oder intravenös) Chargen beispielsweise), die vorher zum gleichen Zweck verabreicht werden soll, damit Sekundärreaktionen verwendet wurden,
vermieden werden können. Carboxyalkylcellulosen können überdies Lysozym

Die bisher beschriebenen Verfahren, wie Aussalzen sogar aus Eiweiß absorbieren, so daß das erfindungs- und anschließende Kristallisation in Form einer Base 65 gemäße Verfahren sich auch zur Herstellung des oder eines Salzes (z. B. als Hydrochlorid oder Carbo- Enzyms direkt aus dem Eiweiß eignet. Dies stellt einen nat) sowie die Ausfällung durch Lösungsmittel oder wichtigen Vorteil dar, da es bedeutet, daß das Eiweiß Alkohole ergibt keine zufriedenstellenden Ergebnisse. auch für andere Zwecke weiter verwendet werden