DE19543252A1 - Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekreten für eine zytologische Diagnostik - Google Patents
Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekreten für eine zytologische DiagnostikInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vorbereiten von
zellhaltigen Bronchialsekreten und/oder Sputum für eine
zytologische Diagnostik.
Abgehustetes, durch Absaugung oder Bürstung gewonnenes Sekret
aus den Bronchien enthält von der Bronchialschleimhaut abge
schilferte Zellen. Diese Zellen lassen sich zu diagnostischen
Zwecken untersuchen. Beispielsweise werden beim Vorliegen
eines Bronchialkarzinoms oder seiner Vorstufen Tumorzellen
bzw. deren Vorläufer abgegeben, an denen eine mikroskopische
Analyse des Karzinoms oder seiner Vorstadien möglich ist. Die
mikroskopische Diagnostik erfolgt entweder am Lichtmikroskop
manuell durch Pathologen, Pulmologen, Pathologie- bzw.
Zytologieassistenten oder aber automatisiert durch
Zytoautomaten.
Im Bronchialsekret bzw. Sputum sind die zu untersuchenden
Zellen von Schleim umgeben, der eine Diagnostik erschwert, da
er zu einer Überlagerung mehrerer Zellen führen kann und eine
Abtrennung von Fragmenten abgestorbener Zellen, die die
Diagnostik stören, nicht möglich ist.
Es ist daher vorgeschlagen worden, das durch eine Alkohollö
sung fixierte Bronchialsekret mit einem Küchenmixer oder
Ultraturrax bei hoher Umdrehungszahl zu homogenisieren. Durch
diesen Vorgang sollen die Schleimfäden mechanisch in kurze
Bruchstücke zerschnitten werden, die die anschließende
Zelldiagnostik weniger stören. Es ist auch vorgeschlagen
worden, nach dem mechanischen Zerkleinern der Schleimfäden
einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Jedoch führt eine
solche Zentrifugierung nicht zu einer Trennung der Zellen von
den gekürzten Schleimfäden, vielmehr erhält man eine aufkon
zentrierte Mischung von Zellen und Schleim. Die Zerkleinerung
des Schleims vermindert zwar das Auftreten von Zellüberlage
rungen beim Ausstreichen auf einem Objektträger, jedoch wird
bei dem für die Zytodiagnostik in der Regel notwendigen
Anfärben der Zellen der Schleim mit angefärbt und stört daher
die Diagnose. Dieses sogenannte Saccomanno-Verfahren ist
detailliert beschrieben in Leopold G. Koss, "Diagnostic
Cytology", 4. Edition, Volume 2, Chapter 33, J.B. Lippincott
Company. Ein weiterer schwerwiegender Nachteil dieses Verfah
rens liegt darin, daß das mechanische Zerkleinern des Schleims
mit schnellaufenden Zerkleinerungsinstrumenten zur Bildung
eines infektiösen Aerosols führen kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein
einfaches und sicher anwendbares Verfahren der eingangs
genannten Art zu schaffen, mit dem sich eine weitgehende
Trennung der Zellen im Sekret vom Schleim erreichen läßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist die folgenden Schritte
auf:
- a) Zugabe eines Mukolytikums und chemische Mukolyse des Schleims,
- b) differentielles Zentrifugieren in einem flüssigen Medium, dessen Dichte zwischen der Dichte der Zellen in dem Bronchialsekret bzw. dem Sputum und der Dichte des Schleims liegt,
- c) Abtrennen der sedimentierten Zellen vom schleimhaltigen Zentrifugat.
Die im Bronchialsekret bzw. Sputum enthaltenen Schleimfäden
enthalten Disulfidbrücken in Längsrichtung eines Schleimfadens
und sind über solche Brücken untereinander vernetzt. Disulfid
brücken bilden sich in der Regel zwischen den Schwefelatomen
von Cystein aus, zwei Cysteinreste gehen dabei in einen
Cystinrest über. Im Rahmen der Erfindung wird unter dem
Begriff Mukolytikum jedes Reagenz verstanden, das in der Lage
ist, in einem solchen Bronchialsekret Disulfidbrücken aufzu
spalten. Besonders vorteilhaft sind zu diesem Zweck thiolgrup
penhaltige Substanzen verwendbar. Die chemische Mukolyse führt
sowohl zu einer Verkürzung der Schleimfäden als auch zu einer
weitgehenden Auflösung des Netzwerks der Schleimfäden unter
einander.
Es ist daher möglich, durch anschließendes differentielles
Zentrifugieren in einem flüssigen Medium mit einer Dichte
zwischen der Dichte der Zellen und der Dichte des Schleims
bzw. der Schleimreste die Zellen vom Schleim zu trennen, da
der nicht mehr vernetzte Schleim beim Zentrifugieren die
Zellen freigibt. Nach Abtrennen der sedimentierten Zellen vom
Zentrifugat bzw. Überstand können diese Zellen entweder
manuell oder mittels eines Zytoautomaten einer Zytodiagnostik
unterworfen werden.
Das in Merkmal c) des Anspruchs 1 genannte Abtrennen der
sedimentierten Zellen vom Zentrifugat bzw. Überstand beinhal
tet nicht notwendigerweise eine vollständige Trennung der
Zellen von jeglichen Resten des flüssigen Mediums. Für den
Erfolg der Erfindung ist es lediglich notwendig, das derjenige
Teil des Zentrifugats abgenommen wird, der die Schleimrück
stände bzw. -reste enthält. "Schleimhaltiges Zentrifugat" im
Sinne der Erfindung ist derjenige Teil des Zentrifugats, der
die Zytodiagnostik störende Anteile von Schleim und/oder
mukolysierten Schleimrückständen enthält.
Ein besonders vorteilhaft verwendbares Mukolytikum ist Thio
glykolsäure oder deren Salze, die Thioglykolate. Zweckmäßiger
weise wird die Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von etwa 6,3
bis 8,3 gepuffert. Dieser Bereich entspricht dem pH-Wert des
Bluts (7,3 + 1,0). Als Puffer kann Ammoniak bzw. eine Ammoni
ak/Ammoniumchloridlösung verwendet werden.
Es ist vorteilhaft, wenn der Schleim durch die chemische
Mukolyse auf eine Schleimfadenlänge von höchstens 30 µm
zerkleinert wird. Häufig ist die Mukolyse so vollständig, daß
eine Fadenstruktur des Schleims im Lichtmikroskop nicht mehr
erkennbar ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unmittelbar mit abgehuste
ten Bronchialsekreten bzw. Sputum durchgeführt werden. In der
Regel wird jedoch das Sekret vor der Zugabe des Mukolytikums
mit einem alkoholhaltigen Fixativ fixiert. Eine solche Fixie
rung ist insbesondere dann sinnvoll bzw. erforderlich, wenn
der Patient die Probennahme durch Abhusten selber Zuhause
durchführt. Er wird dann ein Fixativ zu der Probe geben und
die fixierte Probe an das zytodiagnostische Labor einsenden.
Ein zweckmäßigerweise im Rahmen des Verfahrens verwendbares
Fixativ enthält erfindungsgemäß folgende Bestandteile:
- - 40-60 Gew.-% Ethanol
- - 1-3 Gew.-% Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 14 000
- - Rest auf 100 Gew.-% Wasser.
Die genannte Aufzählung der Bestandteile des Fixativs ist
nicht abschließend, es können ggf. zusätzliche Bestandteile
enthalten sein. Zur Verminderung der Infektionsgefahr kann
bspw. ein Antibiotikum wie Rifampizin beigefügt werden.
Polyethylenglykole im genannten Molekulargewichtsbereich sind
kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen Carbowax®.
Besonders bevorzugt ist eine Zusammensetzung, die 50 Gew.-%
Ethanol und 2 Gew.-% Polyethylenglykole enthält.
Die nach der chemischen Mukolyse erhaltene Lösung, die das
Zell-Schleimgemisch enthält, kann unmittelbar der differen
tiellen Zentrifugierung gemäß Merkmal b) des Anspruchs 1
unterzogen werden. Häufig ist es jedoch vorteilhaft, das Zell-
Schleimgemisch zunächst durch Zwischenzentrifugieren der
Mukolyselösung zu sedimentieren und damit aufzukonzentrieren.
Dieses Zwischenzentrifugieren unterscheidet sich vom differen
tiellen Zentrifugieren gemäß dem genannten Merkmal b) darin,
daß beim Zwischenzentrifugieren sowohl die Zellen als auch der
Schleim eine höhere Dichte als die Mukolyselösung aufweisen
und sich daher gemeinsam sedimentieren.
Als flüssiges Medium zur differentiellen Zentrifugierung ist
eine wäßrige Saccharoselösung besonders geeignet. Eine solche
Saccharoselösung ist preisgünstig und toxikologisch unbedenk
lich. Zur Erzielung der gewünschten Dichte der Saccharoselö
sung wird deren Konzentration in der Regel auf 40 bis 50
Gew.-%, bevorzugt 40 bis 45 Gew.-% Saccharose in Wasser
eingestellt. Statt einer Saccharoselösung kann auch jede
andere Lösung verwendet werden, die sich gegenüber dem Sekret
und den verwendeten Reagenzien chemisch inert verhält.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im folgenden
beschrieben:
In 50 ml destilliertes Wasser werden 8,242 ml 25%ige
wäßrige Ammoniaklösung (ϕ = 0,91 g/ml, entspricht 0,11 Mol
NH₃) und 3,89 ml 97%ige Thioglykolsäure (ϕ = 1,325 g/ml,
entspricht 0,055 Mol Thioglykolsäure) gegeben. Durch
Zugabe von 4 molarer Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung
auf 6,5 eingestellt. Anschließend wird mit destilliertem
Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml aufgefüllt. Man
erhält so eine wäßrige Thioglykolsäurelösung mit einer
Konzentration von etwa 5 Gew.-% bezogen auf die Thioglykol
säure, die mit einem Ammoniak/Ammoniumchloridpuffer
auf pH 6,5 gepuffert ist.
50 g Ethanol p.a., 48 g destilliertes Wasser und 2 g
Carbowax® 1540 werden miteinander vermischt.
Das von einem Patienten abgehustete Bronchialsekret bzw.
Sputum wird mit 50 bis 100 ml Fixativ versetzt und ver
mischt. In der Regel wird dieser Fixierschritt vom Patien
ten Zuhause durchgeführt, die so fixierte Probe wird an
das zytodiagnostische Labor eingesandt.
Zu 10 ml der fixierten Sputumlösung wird 1 ml des unter 1.
hergestellten Mukolytikums zugesetzt, die Mischung wird
auf einem Schüttler 30 s lang durchmischt und bei Raumtem
peratur 30 min stehengelassen. Anschließend wird die Probe
10 min lang bei 1600 g zentrifugiert. Es handelt sich
hierbei um das Zwischenzentrifugieren zum Aufkonzentrieren
des Zell-Schleimgemischs in der Probe.
Nach dem Zwischenzentrifugieren wird der Überstand bis auf
2 ml abpipettiert, das Sediment wird in dem verbleibenden
Rest 30 s lang aufgeschüttelt. 120 µl der aufgeschüttelten
Probe werden auf 10 ml 45%ige Saccharoselösung aufge
schichtet und 30 min bei 1500 g zentrifugiert. Bei diesem
differentiellen Zentrifugieren werden die Zellen aufgrund
ihrer höheren Dichte vom mukolysierten Schleim und sonsti
gen störenden, extrazellulären Beimengungen getrennt, sie
lagern sich als Sediment ab.
Nach Abpipettieren der überstehenden Saccharoselösung, die
den Schleim und sonstige störende Bestandteile enthält,
kann das Zellsediment auf Objektträgern ausgestrichen,
eingefärbt und mit dem Lichtmikroskop zytodiagnostiziert
werden. Man erhält eine einschichtige und dichte Lagerung
der diagnostisch relevanten Zellen. Zum Färben kann bspw.
die Hämatoxylin-Eosin-Färbung oder die Papanicolaou-Fär
bung verwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich kann das Zellsediment in einem
bekannten zytodiagnostischen Automaten untersucht werden.
Bspw. kann das Cyto-Rich®-System der Firma Roche Image Analy
sis Systems Verwendung finden (siehe James W. Geyer et al.,
Diagnostic Cytopathology 1993, Vol. 9, No. 4, 417-422).
Claims (13)
1. Verfahren zum Vorbereiten von zellhaltigen Bronchialsekre
ten und/oder Sputum für eine zytologische Diagnostik, mit
den folgenden Schritten:
- a) Zugabe eines Mukolytikums und chemische Mukolyse des Schleims,
- b) differentielles Zentrifugieren in einem flüssigen Medium, dessen Dichte zwischen der Dichte der Zellen in dem Bronchialsekret bzw. dem Sputum und der Dichte des Schleims liegt,
- c) Abtrennen der sedimentierten Zellen vom schleimhaltigen Zentrifugat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als
Mukolytikum Thioglykolsäure verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von 6,3 bis 8,3 gepuf
fert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als
Puffer Ammoniak verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß der Schleim durch die chemische
Mukolyse auf eine Schleimfadenlänge von max. 30 µm zer
kleinert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bronchialsekrete und/oder der
Sputum vor der Zugabe des Mukolytikums mit einem alkohol
haltigen Fixativ fixiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fixativ folgende Bestandteile enthält:
- - 40-60 Gew.-% Ethanol
- - 1-3 Gew.-% Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 14 000
- - Rest auf 100 Gew.-% Wasser.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß nach der chemischen Mukolyse und vor
der differentiellen Zentrifugierung das Zell-Schleimge
misch in der Mukolyselösung durch Zwischenzentrifugieren
aufkonzentriert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß als flüssiges Medium zur differentiel
len Zentrifugierung eine wäßrige Saccharoselösung verwen
det wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Konzentration der Saccharose in der Lösung 40 bis 50
Gew.-% beträgt.
11. Mukolytikum zur Verwendung in einem Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es
Thioglykolsäure enthält.
12. Mukolytikum nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
die Thioglykolsäure auf einen pH-Wert von 6,3 bis 8,3
gepuffert ist.
13. Mukolytikum nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
als Puffer Ammoniak verwendet wird.
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