DD237749A3

DD237749A3 - Verfahren zur herstellung von loesbaren gliadinen

Info

Publication number: DD237749A3
Application number: DD25854383A
Authority: DD
Inventors: Werner Muehle
Original assignee: 7010 Leipzig,Karl-Marx-Platz,Dd
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1983-12-23
Publication date: 1986-07-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in neutralen waessrigen Medien loesbaren, fremdproteinfreien Gliadinen. Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, in dem durch chemische Minimalmodifikation die negative Nettoladung bei p H 7 erhoeht und der isoelektrische Punkt verlagert wird. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass ein alkoholischer Extrakt aus einem gliadinhaltigen pflanzlichen Produkt gefriergetrocknet, das erhaltene Pulver in Essigsaeure geloest, zu dieser Loesung Bernsteinsaeureanhydrid zugegeben und dabei mittels Natronlauge neutralisiert, erforderlichenfalls die Loesung zentrifugiert und nach Dialyse gefriergetrocknet wird, dieses haltbare und rueckstandsfrei bei p H 7 loesliche Pulver in Puffer geloest, gelchromatografisch gereinigt und nach Dialyse gegen Wasser gefriergetrocknet wird. Das erhaltene Pulver, das bei p H 7 rueckstandsfrei loeslich ist, ist insbesondere in biologischen und immunologischen Tests einsetzbar.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von in neutralen wäßrigen Medien lösbaren, fremdproteinfreien Gliadinen. Derartige Proteingemische werden insbesondere in biologischen und immunologischen Tests eingesetzt. Dabei ist von besonderem Interesse die Diagnostik von Dünndarmerkrankungen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Gewinnung von Gliadinen ist ein Verfahren von Patey und Evans (J. sei. fd. agric. 24 [1973], 1229) bekannt, bei dem aus Weizenmehl mit einer 70%igen wäßrigen Ethanollösung die Gliadine bei einer Temperatur zwischen 10⁰C und 45⁰C extrahiert werden. Der Extrakt wird eingeengt und die ausgefallenen Gliadine in Essigsäure gelöst und anschließend dialysiert gegen 0,1 m Essigsäure pro Liter. Das Produkt wird beispielsweise in gefriergetrockneter Form angeboten. Derartig hergestellte Gliadine haben den Nachteil, daß sie nur in schwachen Säuren oder starken Laugen löslich sind, in neutral wäßrigen Medien dagegen fast nicht. Sie sind daherfür biologische und immunologische Arbeitsmethoden und Trennverfahren nicht geeignet, weil die Verwendung von Säuren und Laugen mit einer Denaturierung der Proteine und Gewebe verbunden ist. Die geringe Löslichkeit in neutral wäßrigen Medien ist durch die geringe Nettoladung und die hohe Oberflächenhydrophobizität der Gliadine bedingt. Außerdem ist der isoelektrische Punkt in der Nähe des Neutralbereiches. Ein weiterer Nachteil ist, daß die Gliadine nur in ungereinigter Form angeboten werden, da eine weitere Reinigung mit an sich bekannten Verfahren nur unter Einsatz denaturierender Agenzien oder Tensiden möglich ist

Gliadine mit guter Löslichkeit in neutralen wäßrigen Medien sind nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Herstellung von Gliadinen so zu gestalten, daß eine gute Löslichkeit des Proteingemisches in neutral wäßrigen Medien erreicht wird, ohne daß dabei die Gefahr einer Denaturierung besteht. Das Produkt soll erforderlichenfalls in gereinigter, fremdproteinfreier Form vorliegen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von in neutralen wäßrigen Medien lösbaren, fremdproteinfreien Gliadinen zu schaffen, in dem durch chemische Minimalmodifikation die negative Nettoladung bei pH 7 erhöht und der isoelektrische Punkt verlagert wird.

Erfindungsgemäß wird ein alkoholischer, zweckmäßigerweise ein ethanolischer, Extrakt aus einem gliadinhaltigen pflanzlichen Produkt gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 0,1 m Essigsäure pro Liter bei einer Temperatur zwischen 8°C und 45⁰C gelöst. Dazu wird portionsweise entweder festes Bernsteinsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid gelöst in einem aprotischen Lösungsmittel im Massenverhältnis zwischen 10:1 und 1:10 bei einer Temperatur zwischen 8°C und 25°C gegeben.

Dabei wird mittels Natronlauge neutralisiert. Die Lösung wird erforderlichenfalls zentrifugiert und die pH 7 löslichen Gliadine werden nach Dialyse gegen Wasser gefriergetrocknet. Dieses haltbare und rückstandsfrei bei pH 7 lösliche Pulver wird in Puffer gelöst und gelchromatografisch gereinigt. Nach Dialyse gegen Wasser bei Temperaturen zwischen 1 °C und 10⁰C wird die Substanz gefriergetrocknet. Das entstehende Pulver ist haltbar und bei pH7 rückstandsfrei löslich.

Es ist günstig, als gliadinhaltiges pflanzliches Produkt Weizenmehl einzusetzen.

Das erhaltene Pulver wird vorteilhaft bei einer Temperatur von 20°Cin Essigsäure gelöst.

Es ist vorteilhaft, als aprotisches Lösungsmittel Dioxan einzusetzen.

Weiterhin ist es günstig, wenn das Massenverhaltnis zwischen der Lösung und dem Bernsteinsäureanhydrid etwa 1:1 beträgt.

Dabei wird in vorteilhafter Weise das Bernsteinsäureanhydrid zur Lösung bei einer Temperatur von 10°C gegeben.

Schließlich ist es günstig, die Dialyse gegen Wasser bei einer Temperatur von 4°C durchzuführen.

Die erfindungsgemäß hergestellten Gliadine haben den Vorteil, daß sie in neutral wäßrigen Medien gut löslich sind. Das wird erreicht, indem das Bernsteinsäureanhydrid in wäßriger Lösung mit den nicht protonierten Aminogruppen reagiert und.ein stabiles Reaktionsprodukt liefert. Als Folge dieser chemischen Modifizierung treten Ladungsveränderungen ein, die auch zur Dissoziation in Untereinheiten führen können. Es läßt sich eine Senkung der Oberflächenhydrophobizität vermuten. Durch Einführung der ionisierbaren Carboxylgruppe kommt es zu einer Verlagerung des isoelektrischen Punktes.

Die Erfindung soll im folgenden in einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

Aus Weizenmehl wird ein ethanolischer Extrakt gewonnen und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 0,1 m Essigsäure pro Liter bei einer Temperatur von 2O⁰C gelöst. Erforderlichenfalls kann die Lösung dialysiert und gefriergetrocknet werden. Zum gelösten Protein wird Bernsteinsäureanhydrid gegeben, das zuvor in Dioxan gelöst wurde. Das Massenverhaltnis beträgt hierbei zwischen dem Protein und dem gelösten Bernsteinsäureanhydrid etwa 1:1, die Temperatur 10⁰C. Während der Zugabe des Bernsteinsäureanhydrids wird gleichzeitig Natronlauge zur Neutralisierung zugegeben. Zur Erhöhung der Reinheit wird die Lösung zentrifugiert und nach Dialyse gegen Wasser gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver ist haltbar und rückstandsfrei bei pH 7 löslich. Zur weiteren Reinigung wird das Pulver in Puffer gelöst, gelchromatografisch gereinigt.und nach Dialyse gegen Wasserbei einerTemperaturvon 4⁰C gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver enthältin neutral wäßrigen Medien rückstandsfrei lösbare, fremdproteinfreie Gliadine.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung von in neutralen wäßrigen Medien lösbaren, fremdproteinfreien Gliadinen, gekennzeichnet dadurch, daß ein alkoholischer Extrakt aus einem gliadinhaltigen pflanzlichen Produkt gefriergetrocknet, das erhaltene Pulver in 0,1 m Essigsäure pro Liter bei einer Temperatur zwischen 8°C und 45⁰C gelöst, zu dieser Lösung portionsweise entweder festes Bernsteinsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid, gelöst in einem aprotischen Lösungsmittel im Massenverhältnis zwischen 10:1 und 1:10 bei einer Temperatur zwischen 8°C und 25°C zugegeben und dabei mittels Natronlauge neutralisiert, erforderlichenfalls die Lösung zentrifugiert und die pH 7-löslichen Gliadine nach Dialyse gegen Wasser gefriergetrocknet werden, dieses haltbare und rückstandsfrei bei pH 7 lösliche Pulver in Puffer gelöst, gelchromatografisch gereinigt und nach Dialyse gegen Wasser bei Temperaturen zwischen 1 °C und 10⁰C gefriergetrocknet wird, wobei das entstehende Pulver haltbar und bei pH 7 rückstandsfrei löslich ist.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als gliadinhaltiges pflanzliches Produkt Weizenmehl eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das erhaltene Pulver in Essigsäure bei einer Temperatur von 20°C gelöst wird.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß als aprotisches Lösungsmittel Dioxan zum Einsatz kommt.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß das Masseverhältnis zwischen der Lösung und dem Bernsteinsäureanhydrid 1:1 beträgt.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Bernsteinsäureanhydrid zur Lösung bei einer Temperatur von 10⁰C zugegeben wird.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Dialyse gegen Wasser bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt wird.