PT1397681E - Processos para a identificação de agentes para o tratamento de diabetes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES PARA O TRATAMENTO DE DIABETES"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se à utilização de "cinases que interagem com MAP-cinase" humanas Mnk2a e Mnk2b, em processos para a identificação de agentes farmaceuticamente úteis, em particular agentes úteis para o tratamento de diabetes tipo II.

TÉCNICA ANTERIOR

Uma das principais hormonas que influencia o metabolismo é a insulina, que é sintetizada em células beta nas insulas de Langerhans do pâncreas. A insulina regula principalmente a direcção do metabolismo, transferindo muitos processos para a armazenagem de substratos e longe da sua degradação (para uma panorâmica, ver, por exemplo, Shepherd, P.R. et al. (1998), Biochem, J. 333: 471-490;

Alessi, D.R. & Downes, C.P. (1998), Biochim. Biophys. Acta 1436: 151-164). A insulina actua para aumentar o transporte da glucose e de aminoácidos, bem como minerais chave, tais como o potássio, magnésio e fosfatos, do sangue para as células. Também regula uma variedade de reacções enzimáticas no interior das células, as quais têm todas uma direcção global comum, nomeadamente a sintese de grandes moléculas a partir de pequenas unidades. Uma deficiência na acção da insulina (diabetes mellitus) causa graves deficiências (i) na armazenagem da glucose na forma de glicogénio e na oxidação da glucose para a energia; (ii) na sintese e na armazenagem de gordura dos ácidos gordos e dos seus precursores, e na conclusão da oxidação de ácidos 2 gordos; e (iii) na síntese de proteínas a partir dos aminoácidos. Há duas variedades de diabetes. 0 tipo I é a diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM; antigamente designada por ataque de diabetes juvenil), para a qual é requerida a injecção de insulina. Neste tipo, a insulina não é segregada pelo pâncreas e, portanto, tem que ser tomada por injecção. A diabetes tipo II, diabetes mellitus não dependente da insulina (NIDDM), é caracterizada clinicamente por hiperglicémia e resistência à insulina e está comummente associada à obesidade. A diabetes tipo II é um grupo heterogéneo de distúrbios nos quais a hiperglicémia resulta tanto de uma resposta secretória de insulina à glucose enfraquecida, como da eficácia diminuída da insulina na estimulação da absorção da glucose pelos músculos do esqueleto e na restrição da produção hepática da glucose (resistência à insulina). Antes da diabetes se desenvolver, os pacientes geralmente perdem a prematura resposta secretória de insulina à glucose e podem segregar quantidades relativamente grandes de proinsulina. Na diabetes instalada, ainda que níveis de insulina no plasma em jejum possam ser normais ou mesmo aumentados nos pacientes de diabetes tipo II, a secreção de insulina estimulada pela glucose é claramente diminuída. Os níveis de insulina diminuídos reduzem a absorção da glucose mediada pela insulina e falham na restrição da produção hepática de glucose. A homeostase de glucose depende de um equilíbrio entre a produção de glucose pelo fígado e a utilização da glucose pelos tecidos dependentes da insulina, tais como a gordura e oso músculos, e por tecidos independentes da insulina, tais como o cérebro e os rins. Na diabetes tipo II, a 3 entrada de glucose na gordura e nos músculos é reduzida e a produção de glucose no fígado é aumentada, devido à resistência à insulina nos tecidos.

Os receptores tirosina-cinase (RTKs) são um tipo importante de receptores da superfície das células. Os ligantes para RTKs são as hormonas peptídeo/proteína, incluindo o factor de crescimento do nervo (NGF), o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o factor de crescimento da epiderme (EGF), e a insulina. A união de um ligante a um RTK estimula a actividade proteina-tirosina-cinase intrínseca do receptor, que subsequentemente estimula uma cascata de transdução de sinais, conduzindo a alterações na fisiologia celular nos moldes da expressão genética. As vias de sinalização de RTK têm um amplo espectro de funções, incluindo a regulação da proliferação e da diferenciação das células, a promoção de células sobreviventes, e a modulação do metabolismo celular.

Ras é uma proteína de união de GTP, que actua como uma molécula chave de sinalização em vias desencadeadas por activação de RTKs. Todos os RTKs ligados a Ras nas células dos mamíferos parecem utilizar uma via de transdução de sinal altamente conservada, na qual o Ras activado induz uma cascata cinase que culmina na activação da MAP-cinase (proteína-cinase activada por mitogénio). Esta serina/treonina-cinase, que pode deslocar-se para o núcleo, promove fosforilação de muitas proteínas diferentes, incluindo factores de transcrição que regulam a expressão de importantes ciclos de células e proteínas especificas de diferenciação.

Os produtos dos genes murínicos Mnkl e Mnk2 ("cinase que interage com MAP-cinase" ou "cinase integradora de 4 sinal de MAP-cinase" 1 e 2) são serina/treonina-cinases de domínio único, que partilham 72% de identidade sequencial (Waskiewicz A.J. et al. (1997) EMBO J. 16: 1909-1920; GenBank Accession Nos. Y11091 e Y11092). Foi também descrito Mnkl humano (Fukunaga, R. et al. (1999) EMBO J. 16: 1921-1933; GenBank Acession No. AB000409). Todas estas três proteínas foram identificadas pela sua aptidão para ligarem firmemente as MAP-cinases. Tanto o Mnkl como o 2 ligam as cinases extracelulares reguladoras de sinal ERKl e ERK2, e o Mnkl também liga a cinase activada pelo stress, p38. O factor de iniciação eucariótico 4E (elF4E) foi identificado como sendo um dos substratos fisiológicos de Mnkl e Mnk2 (Scheper, G.C. et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 743-754). O gene Mnk2 humano foi identificado e caracterizado através de uma pesquiza de duas leveduras híbridas, na qual a proteína Mnk interagiu com o domínio de união do ligante do receptor de estrogénio v (ERp) (Slentz-Kesler, K. et al. (2000) Genomics 69: 63-71). Mostrou-se que o gene Mnk2 humano tem duas variantes de corte do terminal C, designados Mnk2a (as sequências de nucleótidos e de amino-ácidos de Mnk2a são designadas SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente; GenBank Acession No. AF237775) e Mnk2b (as sequências de nucleótidos e de amino-ácidos de Mnk2b são designadas SEQ ID NOS: 3 e 4, respectivamente; GenBank Acession No. AF237776). As duas isoformas são idênticas para os primeiros 385 amino-ácidos da sequência codificante e diferem somente no exão final, que codifica 80 resíduos adicionais para Mnk2a e 29 resíduos para Mnk2b. Foi posteriormente mostrado que a interacção de Mnk2 era selectiva para o receptor de estrogénio (ER)v, em oposição a ERI, e que a interacção era específica para Mnk2b em oposição a Mnk2a ou Mnkl. 5

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 é um gráfico que mostra o efeito de sobre- expressão de Mnk2b nos adipócitos 3T3-L1 transfectados com GLU-REx3, CRE, IRE ou SREBP-RE. Células de controle foram transfectadas com um vector de plasmideo vazio e o nivel da expressão de controle foi fixada em 1.00. A fig. 2 é um gráfico que mostra o efeito de Mnk2b na absorção da glucose, quando sobre-expresso em (2A) adipócitos diferenciados 3T3-L1, e em (2B) linha de células neuronal humana SHSY. Células de controle (Ctrl) foram transfectadas com um vector plasmideo vazio. As barras cinzentas indicam células não estimuladas, as barras brancas indicam células estimuladas pela insulina. A fig. 3 é um gráfico que mostra o efeito da sobre-expressão de Mnk2b e o derrube de RNAi da expressão de Mnk2b na absorção de glucose em células humanas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Descobriu-se, surpreendentemente, que o Mnk2 está envolvido na via de sinalização da insulina.

Num aspecto, a invenção revela um processo para a identificação de um agente que modula (aumenta ou diminui) a aptidão de um polipeptídeo Mnk2 para modular a absorção de glucose numa célula, compreendendo o processo: pôr-se em contacto um polipeptídeo Mnk2 com um agente candidato; e determinação do efeito do agente candidato na aptidão do polipeptídeo Mnk2 para modular a absorção de glucose numa célula. Num exemplo, o agente candidato diminui a aptidão do polipeptídeo Mnk2 para diminuir a absorção de glucose na célula. 6

Noutro aspecto a invenção revela um processo para a identificação de um agente que modula a aptidão de um polipeptídeo Mnk2 para modular a actividade de um elemento que responde à glucose numa célula, compreendendo o processo: pôr-se em contacto um polipeptídeo Mnk2 com um agente candidato; e a determinação do efeito do agente candidato na aptidão do polipeptídeo Mnk2 para modular a actividade de um elemento que responde à glucose numa célula. Num exemplo, o agente candidato diminui a aptidão do polipeptídeo Mnk2 para diminuir a actividade do elemento que responde à glucose (por exemplo, um elemento de resposta descrito aqui) numa célula.

Num outro aspecto, a invenção revela um processo para a identificação de um modulador da absorção de glucose, compreendendo o processo: o fornecimento de uma célula que exprime um peptídeo Mnk2 recombinante; a exposição da célula a um agente candidato; e a medição da absorção de glucose na célula, na presença do agente candidato, em que a absorção da glucose alterada na célula na presença do agente candidato, comparada com a ausência do agente candidato, indica que o agente candidato é um modulador da absorção de glucose. Num exemplo, o agente candidato causa um aumento da absorção de glucose.

Um agente candidato pode conter, por exemplo, um peptídeo, peptidomimético, amino-ácido, análogo de amino-ácido, polinucleótido, análogo de polinucleótido, nucleótido, análogo de nucleótido, ou outra pequena molécula. Num exemplo, o agente candidato inibe uma actividade biológica de Mnk2, tal como uma actividade serina/treonina-cinase, a aptidão para reduzir a absorção de glucose numa célula, a aptidão para diminuir a 7 actividade de um elemento de resposta à glucose (por exemplo, um elemento aqui descrito), e/ou a aptidão para ligar um ligante de Mnk2 aqui descrito. Numa forma de realização, o agente candidato liga-se a um polipeptideo Mnk2 ou a um ácido nucleico (RNA ou DNA) que codifica para um polipeptideo Mnk2.

Os processos de pesquisa descritos aqui podem incluir opcionalmente uma etapa de introdução, numa célula, de um ácido nucleico que codifica para um polipeptideo Mnk2. 0 efeito de um agente candidato sobre uma actividade biológica aqui descrita pode ser avaliado na presença e/ou na ausência de um polipeptideo Mnk2 ou de um ácido nucleico que codifica para um polipeptideo Mnk2. Os processos descritos aqui podem ser realizados in vitro e in vivo, utilizando um sistema baseado na célula, um sistema isento de células, ou uma combinação de sistemas baseado na célula e isentos de células.

Num outro aspecto, a invenção revela um processo para a modulação da absorção da glucose in vitro numa célula, compreendendo o processo pôr-se em contacto uma célula com uma quantidade de um composto eficaz para modular a expressão ou a actividade de um polipeptideo Mnk2 e, desta forma, modular a absorção de glucose na célula. 0 polipeptideo Mnk2 usado nos processos descritos aqui, pode ser um polipeptideo Mnk2 de mamífero, por exemplo, um polipeptideo Mnk2 humano. Por exemplo, o polipeptideo Mnk2 pode ser um polipeptideo Mnk2a ou Mnk2b humano. 0 polipeptideo Mnk2 pode ter uma sequência representada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Um polipeptídeo Mnk2 também pode diferir da correspondente sequência representada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Preferencialmente, as diferenças são diferenças ou trocas num resíduo não essencial ou uma substituição conservativa. Numa forma de realização, o polipeptideo Mnk2 inclui uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 60% idêntica à sequência representada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, ou fragmento das mesmas. A sequência de amino-ácido é, preferivelmente, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e tem uma actividade biológica de Mnk2 descrita aqui. Por exemplo, a sequência de amino-ácidos pode ser idêntica à SEQ ID NO: 2 ou à SEQ ID NO: 4.

Os polipeptideos Mnk2 preferidos têm no minimo 10%, preferivelmente no minimo 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais do comprimento da sequência representada como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 e têm uma actividade biológica de Mnk2 descrita aqui. Por exemplo, um polipeptideo Mnk2 pode ter uma actividade de serina/treonina-cinase, reduz a absorção de glucose numa célula, diminui a actividade de um elemento de resposta à glucose (por exemplo, um elemento descrito aqui), e/ou liga-se a um ligante de Mnk2 descrito aqui.

Um polipeptídeo Mnk2 também inclui um polipeptídeo compreendendo um domínio funcional do polipeptídeo da SEQ IN NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 descrito aqui, por exemplo, um domínio de cinase. Numa forma de realização, o polipeptídeo Mnk2 tem actividade de cinase.

Um polipeptídeo Mnk2 também inclui um polipeptídeo compreendendo pelo menos 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou mais resíduos de amino-ácidos 9 contíguos da SRQ ID NO: 2 ou da SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, o polipeptídeo tem uma actividade biológica de Mnk2 descrita aqui. 0 polipeptídeo Mnk2, em alguns aspectos da invenção, pode ser um polipeptídeo essencialmente puro. 0 termo "essencialmente puro", tal como é usado aqui com referência a um dado polipeptídeo, significa que o polipeptídeo é essencialmente isento de outras macromoléculas biológicas. Por exemplo, o polipeptídeo essencialmente puro é pelo menos 75%, 80, 85, 95 ou 99% puro por peso em seco. A pureza pode ser medida por qualquer processo normalizado apropriado conhecido na técnica, por exemplo, por cromatografia de coluna, electroforese em gel de poliacrilamida, ou análise por HPLC.

Ao longo da presente descrição, os termos "protocolos normalizados" e "procedimentos normalizados", quando usados no contexto das técnicas da biologia molecular, deverão ser entendidas como protocolos e procedimentos encontrados num manual de laboratório usual, tal como: Current Protocols in Molecular Biology, Editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994, ou Sambrook, J. Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989. A menos que sejam definidos de qualquer outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o que é habitualmente entendido pelos peritos na técnica, aos quais pertence a presente invenção. Os processos e materiais adequados são descritos abaixo, embora possam também ser usados na prática ou nos sensaios da presente invenção processos e materiais semelhantes ou 10 equivalentes aos descritos aqui. Todas as publicações, aplicações de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, prevalece a presente especificação, incluindo definições. Além disso, os materiais, processos e exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser tomados como limitativos. A invenção será descrita adiante nos exemplos anexos, que são entendidos para ilustrar a invenção sem limitar o âmbito da protecção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Identificação de LK6 e Mnk A mutagénese mediada pelo elemento P é uma tecnologia largamente usada na genética da Drosophila (Cooley, L. et al. (1988) Science 239: 1121-1128; Robertson, H.M. et al. (1988) Genetics 118: 461-470). O elemento P é um elemento transponivel bem caracterizado, que pode introduzir perda transmissível de mutações de função num amplo arranjo de genes. Acoplado com a anotação genómica do sítio de inserção do elemento P, bibliotecas do elemento P fornecem uma valiosa ferramenta da genética inversa. Pesquisas genéticas usando bibliotecas dos mutantes de inserção de P em genes conhecidos permitem uma pesquisa rápida do genoma para identificar potenciais genes modificadores. A sinalização do receptor de insulina enfraquecida tem uma manifestação fenotípica de menor tamanho das células (Huang, H., et al. (1999) PTEN affects cell size, cell proliferation and apoptosis durlng Drosophila eye development. Development 126: 5365-5372). Foi realizada uma pesquisa genética para identificar modificadores da sinalização do receptor de insulina, usando uma biblioteca de linhas de Drosophila mutageneizada por inserção de P. 11

Nesta pesquisa, a manifestação fenotipica do olho pequeno foi usada como seguidor. O gene LK6 de D. melanogaster (GenBank Accession No. U76378) foi identificado como um intensificador fraco mas consistente do fenotipo receptor de insulina D.N. A proteína L6K da Drosophila melanogaster foi usada numa pesquisa TBLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/blast-tutorial.html) na base de dados de nucleótidos pública (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Os impactos humanos foram MNKl (AB000409; valor e de e-113), MNK2a (AF237775; valor e de e-114) e MNK2b (AF237776; valor e de e-110) . Consequentemente, concluiu-se por análise bioinformática que o gene LK6 de D. melanogaster tem dois homólogos humanos, Mnkl e Mnk2. EXEMPLO 2: Clonaqem de MNK2b A extremidade 3' de cDNA de Mnk2 foi isolada do clone "Incyte" No. 1309709. Este clone contém uma sequência correspondente aos últimos 570 bp de Mnk2b. 0 inserto de cDNA do clone "Incyte" foi verificado por sequenciação, realizada pelo "kit" ABI PrismBigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (reacção rápida de sequenciação do ciclo do terminador ABI PrismBigDye), no sistema de sequenciação de DNA Appplied Biosystems Model ABI 377 XL/96.

Para isolar um clone de cDNA que codifica para a extremidade 5' de Mnk2b (670 bp), a sequência pública de Mnk2b (GenBank Accession No. AF237776) foi usada para desenhar "primers" PCR para amplificação do PCR. 12

Como padrão para a clonagem foi usado o cDNA feito a partir de figado humano. Foi realizada uma sintese da primeira espiral do cDNA, usando o "SUPER-SCRIPT Choice System" (Life Technologies; Cat # 18090-019), utilizando 1 pg de mRNA de figado humano (Clontech; Cat.# 6510-1) com hexâmeros aleatórios, de acordo com as instruções do fabricante.

Os 100 μΐ de PCR foram realizados usando um "kit" " Native Pfu DNA Polimerase" (Stratagene; Cat. #600135) e 5 μΐ dos "primers" específicos de cada um dos genes LAKQ166 (SEQ ID NO: 5) e LAKQ168 (SEQ ID NO: 6). Foi usado o Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 480 com o programa: 1 ciclo de 94°C, 2 min.; 60°C, 1 min.; 74°C, 2 min; 25 ciclos de 94°C, 1 min; 58°C, 1 min; 74°C, 2 min.; e finalmente 72°C, 7 min., seguido por arrefecimento a 4°C. Foram realizadas cinco rotinas adicionais de amplificação como acima, excepto por a temperatura do recozimento ter sido baixada para 55°C.

Uma parte aliquota, de 15 μΐ, do PCR foi carregada num gel de agarose de temperatura de fusão baixa NuSieve GTG a 1% (FMC BioProducts; Cat. #50082) e o fragmento de cerca de 670 bp foi excisado do gel. Foram clonados 3 μΐ do fragmento isolado em 1 μΐ do plasmideo pCR2.1-TOPO, usando o "kit" de clonagem TOPO TA (Invitrogen; Cat. #4500-01). 3 μΐ da mistura de ligação foram transformados em células de E. coli TOP10 "One Shot" quimicamente competentes (Invitrogen; Cat #C4040-03) .

Foram obtidos DNAs de plasmideo de três clones (3 ml de cultura de uma noite), usando o "kit" "QIAprep Spin Miniprep" (QIAGEN; Cat. #27104) e a subsequente sequenciação (#A0452) foi realizada como acima. O plasmideo 13 com a sequência correcta confirmada foi designado por pMB 1500.

As duas partes de Mnk2b, a extremidade 3' do "Incyte" 1309709 e a extremidade 5' de pMB 1500, foram reunidas por uma ligação de três fragmentos em pCR2.1-TOPO, produzindo o pBVl556. 2.4 pg do pBM 1500 foram digerido com EcoRl e Saci, e 1,8 pg do mesmo plasmideo foram digeridos com AcoRi e BglII. Metade das digestões foram carregadas num E-gel a 1.2%, Invitrogen, e foi cortada uma banda de aproximadamente 3800 bp (fragmento a) da digestão por EcoRi-Sacl, e foi cortada uma banda de aproximadamente 680 bp (fragmento b) da digestão por EcoRI-BglII. 2.7 pg do plasmideo "Incyte" 1309709 foram digerido com Saci e BglII. Metade da digestão foi carregada num E-Gel e foi cortada do gel uma banda de aproximadamente 700 bp (fragmento c) . Os fragmentos foram purificados usando o "kit" de extracção "QIAquick Gel" (Qiagen #28704) e a subsequente eluição em 50 pl de H20. A ligação foi realizada utilizando DNA-ligase "Ready-To-Go" (Amersham Pharmacia Biotech; Cat.# 27-0361-01). 6 pl do fragmento A foram misturados com 7 pl dos fragmentos B e C, respectivamente. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli TOP10 "One Shot" quimicamente competentes, e o DNA de plasmideo foi obtido como acima. Digestões de controle usando os enzimas de restrição usados para clonagem, EcoRl, Saci e BglII, verificaram o inserto.

Foi construído o Mnk2b para expressão em mamíferos usando tecnologia de clonagem Gateway™ de Life Technologies. Foram designados os "primers" compatíveis com Gateway (SEQ ID NOS: 7 e 8) e o PCR foi realizado usando 14 pBVl556 como padrão. 0 PCR foi realizado em 50 μΐ, usando Taq-DNA-polimerase, Roche (Cat. # 1 435 094) e 1 μΐ de cada um dos "primers" BEKA 248 e BEKA 247. Foi usado o sistema de PCR Perkin Elmer Gene Amp 2400 com o seguinte programa: 95°C, 5 min.; (95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 2 min.) χ 25; e 72°C, 7 min; seguido por arrefecimento a 4°C. 10 μΐ da reacção foram carregados em E-gel a 1.2%, e foi cortado do gel um fragmento de aproximadamente 1400 bp, e purificado usando o "kit" de extracção QIAquick Gel. O fragmento de PCR foi clonado no pDONR201 (Life Technologies; Cat # 11798-014) de acordo com as instruções do fabricante. O clone de entrada resultante foi designado por pBV27, e o inserto foi confirmado por sequenciação. Foi construído um clone de expressão de mamífero com fusão 5'-GST, designado por pBV44 (SEQ ID NO: 9) (de acordo com as instruções do fabricante), usando o vector de destino pDEST27 (Life Technologies; Cat# 11812-013). Na SEQ ID NO: 9, os aminoácidos 1 a 226 representam o domínio GST, enquanto os amino-ácidos 237 a 649 representam o Mnk2b humano. EXEMPLO 3: Perfil de expressão

Para determinar os níveis de expressão relativos de MNK2b em diferentes tecidos, foi usado um "Multiple Tissue Expression Array" (arranjo de expressão de tecidos múltiplos) (CLONTECH; Cat # 775) numa experiência de hibridização com uma sonda específica de genes de 106 bp. O clone de cDNA de MNK2b, pBV27, foi digerido com enzimas de restrição Ncol e PpuMI. Os fragmentos foram separados em gel de agarose a 1,2% (invitrogen; Cat. #G5018-01) . O fragmento de 106 bp foi excisado do gel e 15 purificado usando um "QlAquick Gel Extraction Kit" {"kit" de extracção de gel QlAquick) (Qiagen; Cat. #28704).

Foram usados 25 ng do fragmento purificado numa reacção de marcação com 32P, realizada com reagentes como osrecomendados no manual de instrução da sintese de sonda de DNA Strip-EZ (Ambion; Cat #1470). O [cT32P]dATP usado na reacção foi adquirido na Amersham Pharmacia Biotech (Cat. #AA0004).

As condições de hibridização e lavagem foram realizadas como é recomendado pelo manual CLONTECH PT3307-1. O arranjo MTE foi exposto numa pesquisa de fósforo STORM860 durante 70 horas. Foi usado o ImageQuant para analisar o sinal de hibridização.

Os resultados indicaram os mais altos niveis de expressão para MNK2b nos músculos do esqueleto. Isto era inesperado, uma vez que os resultados publicados sobre o tecido do rato adulto mostraram a expressão de mRNA de Mnk2 em todos os tecidos estudados, excepto para o cérebro (Waskiewicz A.J. et al (1997) EMBO J. 16: 1909-1920). EXEMPLO 4: A sobre-expressão de Mnk2b afecta a capacidade de resposta da glucose e o metabolismo dos lípidos em adipócitos do rato

Foram preparados ou adquiridos vectores repórter indutiveis que contêm o gene repórter luciferase de Photinus pyralis (pirilampo), dirigido por um elemento promotor básico (TATA box), assim como elementos indutiveis cis-intensificadores (repetições directas de regiões promotoras de vários genes). Os vectores repórter são designados para o seguimento in vivo das vias de transdução de sinal, uma vez que os intensificadores são pontos 16 convergentes de muitas vias de transdução de sinal. Quando um plasmideo que exprime o gene de interesse é cotransfectado para células de mamífero com um plasmideo cis-repórter, a expressão de luciferase aumentada indica uma activação transcricional, quer directa, quer indirecta.

Foi preparado um vector designado por pGluREx3-Luciferase (gtgCACGTtgaCAGCTGcaa)x3), usando o vector promotor pTAL (Clontech; cat. #6252). 0 vector pGluREx3 é designado para monitorizar os efeitos sobre a resposta à glucose (Portois L. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274; 8181-8190) .

Foi preparado um vector designado por pSREBP-Luciferase (aTCACcCCAC) por clonagem de dois elementos de resposta da proteína de ligação do elemento regulador de esteróis (SREBP) no vector promotor de pGLE2 (Promega; cat.#1631). O vector pSREBP é designado para monitorizar os efeitos sobre o elemento de resposta do esteróide (Yokyama, C. et al. (1993) Cell 75: 187-197). O vector pCRE-Luciferase, designado para monitorizar a activação da proteína de ligação de cAMP (CREB) e as vias de transdução de sinal mediadas por cAMP, foi adquirido de Stratagene (cat. #19075).

Foi preparado um vector designado por pIRE-Luciferase ((tagCAAAACAaactTATTTTGaaca)χ3), usando o vector promotor pGL2 (Promega; cat #1631) . O vector plRE é designado para monitorizar a sinalização mediada pelo receptor de insulina através da proteína de ligação do factor de crescimento de tipo insulina (IGFBP-1). 17

Os adipócitos do rato (células 3T3-L1 diferenciadas) foram transitoriamente transfectados com o construído do elemento de resposta de interesse, em combinação com o Mnk2b ou com um construído do plasmídeo esqueleto (controle), usando LipofectAmine™ 2000 (Life Technologies). Após 48 horas, as células foram lisadas usando um tampão de lise (Tris-EDTA + 0,25% Triton-X100) durante 10 min. à temperatura ambiente, e foi medida a actividade de luciferase usando um ensaio de actividade de luciferase (BioThema).

Os resultados (fig. 1) indicam que a sobre-expressão de Mnk2b nos adipócitos do rato resultou em 70% da diminuição da actividade do repórter GLUx3-Luciferase, indicando um decréscimo da capacidade de resposta à glucose nas células. Tanto quanto é do conhecimento dos inventores, não há resultados descritos previamente que indiquem uma ligação entre o Mnk2b e a absorção de glucose.

Os resultados representados na fig. 1 indicam, além disso, que a sobre-expressão de Mnk2b nos adipócitos do rato conduzem à diminuição da actividade do elemento de resposta SREBP. A nossa conclusão é que o Mnk2b afecta o metabolismo dos lípidos, uma vez que se demonstrou que o elemento de resposta SREBP controla a transcrição, por exemplo, do gene receptor de lipoproteínas de baixa densidade (Yokoyama, C. et al. (1993) Cell 75: 187-197) e regula o metabolismo do colesterol (Brown, M.S. e Goldstein J.L. (1997) Cell 83: 331-340). A sobre-expressão de Mnk2b nos adipócitos do rato também conduz à diminuição da actividade dos repórteres pCRE e pIRE. Estes resultados confirmam os dados publicados sobre Mnk2b como parte da via de sinalização de MAP-cinase 18 (Waskiewicz, A. et al. (1997) embo J. 16: 1909-1920;

Fukunaga, R. e Hunter, T.(1997) EMBO J. 16: 1921-1933). EXEMPLO 5: A sobre-expressão de Mnk2b modula a absorção da glucose nos adipócitos A absorção da glucose foi determinada de acordo com o processo de Hundal et al. (1994) Biochem. J. 297: 289-295. Resumidamente, após a incubação com hormonas durante 45 minutos, se não for indicado nada em contrário, as células em camada única foram lavadas com PBS isento de glucose. A absorção de glucose foi guantificada por incubação das células na presença de 1 pCi/ml de 3H-2-desoxi-glucose em PBS durante 8 min. Foi determinada a absorção não especifica por quantificação da radioactividade associada às células na presença de 10 μΜ de citochalasina B. A absorção de 2-desoxi-glucose foi determinada por rápida aspiração do meio, seguida por três lavagens sucessivas das células em camada única com PBS arrefecido com gelo. As células foram lisadas em NaOH 0,5 M, seguido da contagem de cintilação de liquido. As taxas de transporte foram normalizadas para o conteúdo de proteína em cada cavidade.

Os resultados (fig. 2) indicam que a sobre-expressão de Mnk2b nos adipócitos (células 3T3-L1 diferenciadas) e numa linha de células humana (SHSY) diminuiu a taxa de absorção de glucose de uma forma dependente da insulina. Os resultados confirmam os resultados do ensaio repórter (exemplo 4) e, além disso, indicam que um efeito da expressão de Mnk2b é a redução da absorção de glucose. EXEMPLO 6: Modelos de estrutura de proteínas Mnk

Foram preparados modelos de estruturas tridimensionais de Mnkl, Mnk2a e Mnk2b, a partir de dados de homologia. A estrutura da proteína cinase dependente da 19 calmodulina da ratazana (Protein Data Bank entry 1A06) foi usada como padrão para os três modelos (está disponível um banco de dados de proteínas em http://www.rcsb.org/pdb; ver também Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research 28: 235-242) . Os modelos de estruturas foram preparados usando o software ICM de MolSoft Inc. (http//www.mol-soft.com).

Os modelos de Mnkl, Mnk2a e Mnk2b eram muitíssimo semelhantes, mas foram identificadas algumas diferenças estruturais, que devem ser empregues para se conseguir a selectividade de ligação. Foi identificado um número de 87 resíduos não idênticos quando o Mnk2b foi comparado com o Mnkl. Muitos deles estão situados afastados do sítio activo, mas duas diferenças interessantes entre o Mnkl e o Mnk2b são Y-^H no sítio activo (ver posição 95 em SEQ ID NO: 4) e T-^L num anel, que poderia ser envolvido num reconhecimento de substrato (ver posição 248 em SEQ ID NO: 4) .

Uma comparação entre o Mnk2a e o Mnk2b indica que o terminal C, que é a única parte diferente entre as duas variantes de corte, duplica contra o sítio activo nos modelos. Isto indica a possibilidade de identificar agentes que tenham especificidade entre Mnk2a e Mnk2b EXEMPLO 7: a anulação de Mnk2 modela a resposta à glucose em células de neuroblastoma humanas RNAi (interferência de RNA) refere-se à introdução de RNA de espiral dupla homólogo (dsRNA) para marcar especificamente um produto de gene, resultando em fenotipos hipomórficos ou nulos. A técnica RNAi foi usada para estudar os efeitos sobre a resposta à glucose em células cultivadas depois da anulação da expressão da proteína de Mnk2. As células de neublastoma humano (SH-SY5y) foram transitoriamente transfectadas com um elemento de resposta 20 à glucose acoplado a um gene repórter luciferase (GluREx3-Luciferase), Mnk2b ou plasmídeo esqueleto e [RNAi-Mnk2] usando LipofectAmine 2000 (Life Technologies): para cada cavidade de uma placa de 96 cavidades, 0,2 pg de GluREx3-Luciferase, 0,07 pg de Mnk2b/esqueleto e 0,13 pg [RNAi-Mnk2] foram misturados com 1,8 pl de LA2000/pg de DNA diluído em 50 pl de Opti-MEM (Gibco) . Após 48 horas, as células foram lisadas usando 15 pl/cavidade de tampão de lise (TRIS-EDTA com 0,25% de Triton χ 100) e foi medida a actividade de luciferase ("kit" de ensaio de actividade luciferase, Bio Thema).

Os resultados (fig. 3) indicam que a anulação da expressão da proteína Mnk2 nas células do neublastoma humano (SH-SY5y) pelo uso de RNAi conduz a um aumento da actividade do elemento de resposta à glucose. A sobre-expressão da proteína de Mnk2b nas mesmas células diminui a actividade do elemento de resposta à glucose. Esta diminuição é neutralizada pela anulação da sobre-expressão da proteína Mnk2b, que é combinada com a transfectação do plasmídeo de expressão e RNAi nas mesmas células. exemplo 8: Pesquisa por nmr para compostos que se ligam ao Mnk2b

Uma diversidade de biblioteca, consistindo em compostos relativamente pequenos e bastante solúveis em água, foi usada para pesquisar MNK-2B nativos quanto a ligantes por NMR (ressonância magnética nuclear). A técnica de NMR usada para identificar os ligantes foi a diferença de transferência de saturação (STD): as ressonâncias da proteína são saturadas por meio de um campo de rádio-frequência fraco aplicado a uma região espectral estreita. A saturação é transferida por difusão de spin para o resto da proteína e subsequentemente ainda para compostos que se 21 ligam à proteína, atenuando os seus sinais no espectro NMR. O espectro é então subtraído de um espectro obtido em condições de não saturação para se obter um espectro STD, mostrando somente os sinais de compostos que interagem com a proteína. Na prática, a sequência de impulsos é escrita de maneira que a subtracção seja feita automaticamente em qualquer outro "scan", isto é, nunca são observados os espectros individuais (Mayer & Meyer, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1784-1788, 1999) .

Os compostos da biblioteca são divididos em misturas que consistem em 4-8 compostos cada uma. Cada amostra continha 1 μΜ de MNK-2B nativo, 200 μΜ da mistura do composto, 50 mM de tampão de fosfato de sódio, 1 mM de DTT, pH 7,5, em cerca de 98% de D20/2% de H20. Uma amostra não continha qualquer composto e funcionou como controle negativo. O volume era de 600 μΐ e foram usados tubos NMR normalizados. Foram realizadas experiências num espectrómetro NMR Varian Unity de 600 MHz a 20°C. Foram registadas uma experiência 1H 1D de referência e uma experiência STD em cada amostra. Os ligantes identificados na pesquisa foram reapresentados como um composto simples para confirmação. Para esta sequencia de experiências foram usadas amostras contendo 2 μΜ de Mnk2B nativo e 250 μΜ do composto individual. Foram identificados como ligantes de Mnk2b vários compostos, por exemplo, 4-hidroxi-benzoato de metilo.

O 4-hidroxi-benzoato de metilo 22

Um ensaio de actividade de cinase de acordo com os processos normalizados indicou que os compostos identificados inibiam a actividade de cinase de Mnk2b numa forma dependente da dose. Consequentemente, mostrou-se que é possível identificar pequenos compostos ligantes de Mnk2b.

LISTAS DE SEQUÊNCIAS <110> Biovitrum AB <120> Novos processos <130> 00572 <160> 9 <170> Versão Patentln 3.0 <210> 1 <211> 1444 <212> DNA <213> humano <220>

<221> CDS <222> (37) . . (1434) < 3 0 0 > <308> GenBank/AF237775 <309> 2000-10-26 <400> 1 23 cggtcecctc i cccegctggc ggggcccgga cagaag atg gtg cag aag aaa cea 54 «et 1 Vai Gin Lys Lys 5 Pro gcc gaa ctt. cag ggt tfcc cac cgfc teg tfcc aag ggg cag aac ccc tfcc 102 Ala Slu Leu Gin Gly Phe His Arg Ser The Lys Gly Gin Asn Pro Phe 10 15 20 gag ctg gcc tfcc tcc cfca gac cag ccc gac cac 93* gac tet gac fctt 150 Glu Leu Ala Phe Ser Leu Aap GlU Pro Asp .HiS Gly Asp Ser A:sp Phe 25 30 35 ggc ctg cag fcgc tea gcc ege cefc gac atg CCC gcc age cag ccc att 198 Gly Leu Gin Cys Ser Avia Arg Pro Asp «et Pro Ala Ser Gin Pro lie 40 45 50 gac ate ccg gac gcc aag aag agg 99c aag aag aag aag ege ggc egg 245 Asp Ile pro Asp Ala Lys Lys Arg Gly Lys Lys Lys Lys Arg Gly Arg 55 60 65 70 gcc acc gac age fcte teg ggc agg fctt gaa gac gtc tac cag ctg cag 294 Ala Thr Asp Ser Pàe Ser Gly Arg Phe Giu Asp Yal Tyr Gin Leu GlÈt 75 80 35 gaa gafe gtg ctg 993 gag S9C gcfc cat gcc cga gtg cag acc tgs ate 342 Glu Asp val Leu siy Glu Gly Ala Kia Ala Atg val Gin Thr cys Ile 90 95 100 ase Cfcg ate acc age cag S®3 tac gcc gfcc aag ate att gag aag cag 390 Asa Leu Ile Thr Ser Glu Gltt Tyr Ala Vai Lys Ile Ue Glu Lys Gin

10S 110 11S 24 cca ggc cae att cgg age agg gtt tte agg gag gtg gag atg ctg tac 438 Pro Gly Hifi IX* Arg Ser Arg Vai Phe Arg GlU val Glu Met Leu Tyr 120 125 130 cag tgc cag gga cac agg aac gtc cta gag ctg att gag tte tte gag 486 Gin Cys Gin Gly His Arg Asn vai Leu GlU Leu Ile Glu Phe Phe Glu 1.35 140 145 ISO gag gag gac ege tte tac ctg gtg ttt gag aag atg cgg gga ggç tcc 534 Glu Glu Asp Arg Phe Tyr Leu Val Phe Glu Lys Met Arg Gly Gly Ser 155 160 165 ate Gtg age cae ate cac aag ege cgg cac tte aac gag ctg gag gee 582 Ile Leu Ser KÍS Ile Eis Lys Arg Arg His Phe Asn Glu Leu Glu Ala 170 175 180 age gtg gtg gtg cag gac gtg gee age gee ttg gac ttt ctg cat aac 630 Ser Vai Vai Vai Glu Asp Vai Ala Ser Ala Leu Asp Phe Leu His Asn 185 190 195 aaa ggc ate gee cac agg gac cfca aag ecg gaa aac ate cte tgt gag 678 Lys Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asa Ile Leu Cys Glu 200 205 210 cac ccc aac cag gtc tcc ccc gtg aag ate tgt gac tte gac ctg ggc 726 Sis Pro Asn Gin Val Ser Pro Val Lys Ile cys Asp Phe Asp Leu Gly 215 220 225 230 age ggc ate aaa cte aac ggg gac tgc tcc cct ate tcc acc ecg gag 774 Ser Gly ile Lys Leu Asn Gly Mp Cys Ser Pro Ile Ser Tht Pro Glu 235 240 245 ctg etc act ceg tge ggc fceg geg gag tac atg gee cog gag gta gtg 822 Leu Leu Thr Pro Cys Gly Ser Ala Glu Tyr Met Ala pro Glu Val Val 350 255 260 gag gee tte age gag gag gct age ate tac gac aag ege tgc gac ctg 870 Glu Ala Phe Ser Glu Glu Ala Ser Ile Tyr Asp Lys Arg cys Asp Leu 265 270 275 tgg age ctg me gtc ate ttg tat ate cta etc age tac ceg ccc 918 Trp Ser Leu Gly Vai Ile Leu Tyr ile Leu Leu Ser Gly Tyr Pro pro 280 285 290 tte gtg ggc ege tgt 99e age gac tgc ggc tgg gac ege ggc gag gee 966 Phe Vai Gly Arg Cys Gly Ser Asp Cys Gly Trp Asp Arg Gly Glu Ala 295 300 305 310 tgc cct gee tgc cag aac atg ctg ttt 9*g age ate cag gag ggc aag 1014 Cys Pro Ala Cys Gin Asa Met Leu, Phe Glu Ser Ile Gin Glu Gly Lys 313 320 325 tac gag tte eee gac aag gac tgg gee cae ate tce tge gct gee aaa 1062 Tyr Glu Phe Pro Asp Lys Asp Trp Ala Eis Ile Ser Cys Ala Ala Lys 330 335 340 gac cfcc ate tcc aag ctg ctg gtc cgt gac gee aag cag agg ctg agt 1110 Asp Leu Ile Ser Lys Leu Leu Val Arg Asp Ala Lys Gin Arg Leu Ser 345 350 355 25 gcc gcc caa gtc ctg cag cac ccc tgg gtt cag 999 tgc gcc ccg gag 1158 Ala Ala Gin Val Leu Gin His Pro xrp Val Gin. Gly Cys Ala Pro Glu 360 365 370 aac acc ttg ccc aet ccc atg gtc ctg cag agg aac age tgt gcc aaa 1206 Asn Tbr Leu Pro Thr Pro Met Val Leu Gin Arg Asn Ser Cys Ala Lys 375 380 385 390 gac efcc acg tcc ttc gcg gct gag gcc atfc gcc atg aac egg cag Gin ctg 1254 Asp Leu Thr Ser Phe Ala Ala Glu Ala Ile Ala Met Aen Arg Leu 335 400 405 gcc cag cac gac gag gac ctg gct sag gag gag gcc gcg 999 cag flSC 1302 Ala Gin. EÍS Asp Glu Asp Leu Ala Glu Glu Glu Ala Ala Gly Gin Gly 410 415 420 cag ccc gtc ctg gtc cga gct acc tca cgc tgc ctg cag ctg fcct cca 1350 Gin Pro Val Leu Val Arg Ala Thr Ser Arg Cys Leu Gin Leu Ser Pro 425 430 435 ccc tcc cag tcc asg ctg gcg cag ogg cgg caa agg gcc agt ctg tcc 1398 Pro Ser Gin Ser Lys Leu Ala Glu Arg Arg Gin Arg Ala Ser Leu Ser 440 445 4S0 teg gcc CCâ gtg gtc ctg gtg gga gac cac gcc tga ccctcccatc 1444 Ser Ala Pro Val Val Leu Val aiy Asp Eis Ala 455 450 465 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> humano <400> 2 Met Val Gin Lys Lys Pro Ais GlU Leu Gin Gly Phe His Arg Ser Phe 1 5 10 15 Lys Gly Gin Asii Pro Phe Glu Leu Ala Phe Ser Leu Asp Gin Pro Asp 20 25 30 His Gly Asp Ser Asp Phe Gly Leu Gin Cys Ser Ala Arg Pro ASp Met 35 40 45 Pro Ala Ser Gin Pro Ile Asp Ile Pro Asp Ala Lys Lys Arg Gly Lys SG 55 50 26

Lys Lys Lys Arg Gly Arg Ala Thr Asp Ser Phe Ser Gly Arg Phe Glu 65 70 75 80 Asp Vai Tyr Gin Leu Gin Glu Asp Vai Leu Gly Glu Gly Ala His Ala 85 90 95 Atg Vai Gin Thr Cys Ile As» Leu Ile Thr Ser Gin Glu Tyr Ala Vai 100 105 110 Lys lie Ile Glu Lys Gin Pro Gly His Ile . Arg ser Arg vai Phe Arg 115 120 125 Qlu Vai Glu Met Leu Tyr Gin Cys Gin Gly His Arg As» Vai Leu Glu 130 135 140 LSU lie Glu Phe Phe Glu Glu Glu Asp Arg Phe Tyr Leu Vai Phe Glu 145 150 155 ISO Lys Mefc Arg Gly Gly Ser ile Leu ser His Ile HiS Lys Arg .Arg His 16.5 170 175 Phe Asn Glu Leu Glu Ala Ser Vai Vai Vai Gin Asp Vai Ala Ser Ala ISO 185 190 Leu Asp Phe Leu Kis Asn Lys Gly Ile Ala Bis Arg Asp Leu Lys Pro 155 200 2 OS Glu Asn Ile Leu Cys Glu His Pro Asrs Gin Vai Ser Pro Vai Lys Ile 210 215 220 Cys Asp Phe Asp Leu Gly Ser Gly I.le Lys Leu Asn Gly Asp Cys Ser 235 230 235 240 Pro Ile Ser Thr Pro Glu Leu Leu Thr Pro Cys Gly Ser Ala Glu Tyr 245 250 255 Met Ala Pro Glu Vai Vai Glu Ala Phe Ser Glu Glu Ala Ser Ile Tyr 260 265 270 Asp Lys Arg Cys Asp Leu Trp Ser Leu Gly Vai Xle Leu Tyr Ile Leu 275 280 235 Leu Ser Gly ‘Tyr Pro Pro Phe Vai Gly Arg Cys Gly Ser Asp Cys Gly 290 235 300 Trp Asp Arg Gly Glu Ala Cys Pro Ala Cys Gin Àsn Met Leu P»e Glu 305 310 315 320 Ser Ile Gin Glu Gly Lys Tyr Glu Phe Pro Asp Lys Asp Trp Ala His 325 330 335 ile ser çys AX& Ala Lys ASp Leu Ile Ser Lys Leu Leu Vai Arg Asp 340 345 350 27

Ala Lyg Gin Arg Leu Ser Ala Ala Gin Vai Leu Gin His Pro Trp Vai 355 360 3gg

Gin Gly Çys Ala Pro Glu Aâa ihr Leu Pr o Thr pro Hat Vai teu Gin 370 375 3&0

Arg Asn Ser Cys Ala Lys Asp Leu T&r Ser P&e Ala Ala Glu Ala He 335 390 395 400

Ala Met Asn Arg Gin Leu Ala Gin His Asp Glu Asp Leu Ala Glu Glu 4QS 410 415

Glu Ala Ala Gly Gin Gly Gin Pro Vai Leu Vai Arg Ala Thr Ser Arg 420 425 430 0¾¾ Leu Gin Leu Ser Pro pro Ser Gin Ser Lys Leu Ala Gin Arg Arg 435 440 445 61n Arg Ala Ser Leu Ser Ser Ala Pro Vai vai Leu vai Gly Asp His 450 4SS 460

Ala

4SS <210> 3 <211> 1564 <212> ADN <213> Humano <22 0>

<221> CDS <222> (37) . . (1281) <300> <308> GenBank/AF237776 <309> 2000-10-26 <400> 3 cggtecccte ceccgctggc ggggcccgga eagaag atg gfcg cag aag aaa cea 54

Met Vai Gin Lys Lys Pro 1 5 gcc gaa ctt cag ggfc ttc cac cgt, tcg ttc aag ggg eag aac coe ttc 102

Ala Glu Leu Gin Gly Phe His Arg Ser Phe Lys Gly Gin Asn Pro Phe 10 15 20 gag etg gcc ttc tcc cca gac cag ccc gac cac gga gac tct gac ttfc

Glu Leu Ala Phe Ser Leu Asp Glu Pro Asp His Gly Asp Ser Asp Phe 25 30 3 5 150 28 99« ntg cag tgc tea gee ege cet gac atg· ccc gee age cag ccc att 198 Gly keu Gin Cys Ser &ls Arg Pro Asp Met Pro Ala Ser Gin Pro Ile 40 45 50 g&C ate ccg gac gee aag agg ggc aag aag aag aag ege 99C cgg 246 Asp He Pro Asp Ala Lys Lys Arg Gly Lys Lys Lys Lys Arg Gly Arg 55 SO 65 70 gee aee gac age ttc teg ggc agg ttt gaa gac gtc tac cag ctg cag 294 Ala Thr Asp Ser Phe Ser Gly Arg Phe Glu Asp Val Tyr Gin Leu Gin 7S SO BS g&a gat gtg ctg ggg gag ggc gct cat gee cga gtg cag acc tgc afcc 342 Glu Asp Val Leu Gly Glu Gly Ala His Ala Arg Val Gin Thr Cys Ile 90 95 1.00 aac ctg ate acc age cag gag tac gee gtc aag ate att gag aag cag 390 Asn Leu Ile Thr Ser Gin Glu Tyr Ala val Lys Ile Ile Glu Lys Gin 105 110 115 eca ggc eac att egg age agg gtt ttc agg gag gtg gag atg ctg tac 439 Pro Gly His Ile krg Ser Arg Val Phe Arg Glu Val Glu Met Leu Tyr 120 125 130 cag tge cag gga çac agg aac gtc cta gag ctg att gag ttc ttc gag 486 Gin Cys Gin Gly His Arg Asn Val Leu Glu Leu Ile Glu Phe Phe Glu 135 140 145 150 gag gag gee ege ttc tac ctg gtg ttt gag aag atg cgg gga ggc tcc 534 Glu Glu Asp Arg Phe Tyr Leu Val Phe Glu Lys Met Arg Gly Gly Ser 155 ISO 165 ate ctg age eac ate eae aag ege cgg cac ttc aac gag ctg gag gee 582 lie Leu Ser His Ile His Lys Arg Arg His Phe Asn Glu Leu Glu Ala 170 175 ISO age gfcg gtg gtg cag gac gtg gac age gee ttg gac ttt ctg cafc aac 630 Ser Val Val Val Gin Asp Val Ala Ser Ala Leu Asp Phe Leu His Asn 185 190 195 aaa gge ate gee eae agg gac cta aag ccg gaa aac ate ctc tgt gag 678 Lys Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Cys Glu 200 205 210 eac ccc aac cag gtc tec ccc gtg aag ate tgt gac ttc gac ctg ggc 726 His pro Asn Glij Val ser Pro val Lys Ile Cys Asp Phe Asp Leu Gly 215 220 225 230 âgc ggc ate aaa ctc aac 393 gac tgc tcc cct atç tcc acc ccg gag 774 Ser Gly Ile Lys Leu Asn Gly Asp Cys Ser Pro Ile Ser Thr Pro Glu 235 240 345 etg etc act ccg tgc ggc teg geg aag tâc atg gee ccg gag gta gtg 822 Leu Leu Thr Pro Cys Gly Ser Ala Glu Tyr Met Ala Pro Glu Val Val 250 2E5 260 9«g gee ttc age gag gag gct age ate tac gac aag ege tgc gac ctg 870 Glu Ala Phe Ser Glu Glu Ala Ser Ile Tyr Asp Lys· Arg Cys Asp Leu 265 270 275 t-gs age ctg ggc gtc ate ttg tat ãtc cta ctc age ggc tac ccg ccc 918 Trp Ser Leu Gly val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Pro 280 285 290 29 ttc gtg ggc ege tgt ggc age gac tgc ggc tgg gac ege ggc gag gee 966 Phe Vai Gly Arg cys Giy Ser Asp cys Gly Trp Asp Arg Gly Glu Ala 295 300 305 310 tgc cct gee tgc cag aac atg etg fctt gag age ate cag gag ggc aag 1014 Cys ΡϊΟ Ala Cys Oln Asa Kfefc Leu phe Glu Ser Ile Gin Glu Gly Lys 315 320 225 tac gag ttc CCÇ gac aag gac tgg gee cac ate tee tgc Set gee aaa 1062 Tyr Glu Phe Pro Asp Lys A3p Trp Ala His Ile Ser Cys Ala Ala Lys 330 335 340 gac etc ate tcc aag etg etg gtc egt gac gee aag cag agg etg agt 1110 Asp Leu lie Ser Lys Leu Leu Vai Arg Asp Ala Lys Gin Arg MU Ser 345 350 355 gcc gee caa gtc etg cag cac ccc tgg gtt cag 3S9 tgc gee esg gag 1158 Ala Ala Gin Vai Leu Gin Mis Pro Trp Vai Gin Gly Cys Ala Pro Glu 3S0 365 370 aac aee ttg ccc a et ccc atg gtc etg cag agg tgg gac agt cac ttc 12 06 Aan Thr heu Pro Thr Pro Met Vai Leu Gin Arg Trp ASp Ser Hís Phe 375 380 385 350 etc etc cçt ccc cac ccc tgt ege ate cac gtg cga ccfc gga 99« etg 2254 Leu Leu Pr o Pro Hís Pro Cys Arg Ile His Vai Arg Pro Gly Gly Leu 395 400 405 gtc aga açc gtt act gtg aat s»g tga agatcctgga ggaccctggg 1301 Vai Arg Thr vai Thr Vai Asn Glu 4iô cCCcaçjgcca gctcccatcg ctgggggacg gtgaacggcc atgtgfctaat gttacgatgt 3.351 ttttaaaaga caaaaaaaaa aaaaaaacct cagaugtttt tttaaagtgg gggaaaaaca 1421 tccaagcact ttaattccaa tgtaccaggt gaactgacgg agctcagaag ttttccttta 1481 eaccsaefcgt caatgccgga atfcttgtatfc ctgttttgta aagatttaat aaaagtcaaa 1541 aaacttgcaa aaaâaaaaaa aaa 1564 <210> 4 <211> 414 <212> PRT <213> humano <400> 4 M*fe Vai Gin Lvs Lys Pro Ala Glu Leu Gin Gly Phe His Arg ser Phe 1 5 10 15 Lys Qly Gin Asn Pro phe Glu Leu Ala Phe Ser Leu Asp' Gin Pro Asp 20 25 30 His Gly Asp Ser Asp Phe Gly Leu Gin Cys Ser Ala Arg. Pro Asp Met 35 40 45 30

Pro Ala Ser Glu Pro Ile Asp Ile Pro Asp Ala Lys Lys Arg Gly Lys 50 5S~ 60 Lys Lys Lys Arg Gly Arg Ala Thr Asp Ser Phe Ser Gly Arg Phe Glu 65 70 7S SO Asp Vai Tyr Gin. Leu Gin Glu Asp Vai Leu Gly Glu Gly Ala His Ala 85 so 9S Arg Vai Gin Thr Cye Ile Asn Leu Ile Thr Ser Glu Glu Tyr Ala Vai 100 105 110 Lys Ile Ile Glu Lys Gin Pro Gly His Xle Arg Ser Arg Vai Phe Arg 115 120 12 S 01« vai Glu Met Léu Tyr Gin Cys Gin Gly Hís Arg Asn Vai Leu Glu 130 135 140 LôU Ile Glu File Phe Glu Glu Glu Asp Arg Phe Tyr Leu Vai Phe Glu 145 150 155 169 lys Met Arg Gly Gly Ser ile Leu Ser ais Ile His Lys Arg Arg His 165 170 175 Phe Asn Glu Leu GlU Ala ser Vai Vai Val Gin Asp Vai Ala Ser Ala 180 185 ISO Leu Asp Phe Leu His Asm Ly3 Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Pro 195 200 205 Qlu Asn Ile Leu Cys Glu Hís Pro Asn Gin Vai Ser Pro Vai Lys Ile 210 215 220 Cys Asp Phe Asp Leu Gly Ser Gly Ile Lys Leu Aen Gly Asp Cye Ser 225 230 235 240 Pro ile Ser Thr Pro Glu Leu Leu Thr Pro cys Gly Ser Ala Glu Tyr 245 250 255 Met Ala Pro Glu Vai val Glu Ala Phe Ser Glu Glu Ala Ser Ile Tyr 260 265 270 Asp Lys Arg Cys Asp Leu Trp Ser Leu Gly vai Ile Leu Tyr Ile Leu 275 280 285 Leu Ser Gly Tyr Pro Pro Phe Vai Gly Arg Cys Gly Ser Asp Cys Gly 29Ô 295 300 Trp Asp Arg Gly Glu Ala Cys Pro Ala Cys Gin Asn Met Leu Phe Glu 305 310 315 320 Ser Ile Gin Glu Gly Lys Tyr Glu Phe Pro Asp Lys Asp Trp Ala His 325 330 335 31

Ile Ser Cys Ala Ala Lys Asp Leu Ile Ser Lys Leu Leu Vai Arg. Asp 340 345 \ . : 3S0 Ala hys δία Arg Leu Ser Ala Ala Gin Val Gin His Pro Trp Vai 355 360 365 Gin siy Cy© Ma Pr* GIu ÃBn Thr Leu Pro Thx Pro Het Val Leu Gin. 370 375 380 Arg Trp Asp Ser Eia Pbe Léu Leu Pro Pro His Pro Cys Arg Ile His 385 390 395 400 Vai Arg Pro Gly Gly Leu Val Tbr Vai Tbr Vai Asn Glu 405 410 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 5 atggtgcaga agaaaccagc cgaacttc 28 <210> 6 <211> 27

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 gcccaggtcg aagtcacaga tcttcac 27 <210> 7 <211> 49 < 212 > DNA < 213 > Homo sapiens <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgtgcagaag aaaccagcc 49 32 <210> 8 <211> 54 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctactcattc acagtaacgg ttct 54 <210> 9 <211> 649 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1) ..(226) < 2 2 0 > <221> DOMAIN <222> (237)..(649) <400> 9

Met Ala PrO Ile L$U Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val <a» Pro I 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu GlU EÍS Leu. 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asu Lys Lys P&e Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu The Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Le U Tbr Gin Ser Met Ala lie tle Arg Tyr Ile Ala Asp Lys Hls Asn 65 70 75 80 Mat Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile ser Mefc Leu Glu 85 §0 35 33 ely Ala Vál Leu Asp lie ATg Tyr Gly ' Vai Ser Arg Ile Tyr Ser 100 105 110 Lys ABp Phe Glu Thr Leu Lys Vai Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 ffet Leu Lys Wet Phe eiu Asp Arg Leu ! Cys Bis Lys Thr Tyr Leu Asn 130 1.35 140 Oly Asp Eis Vai Thr Eis Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ai & Leu Asp 145 ISO 155 ISO Vai Vai Leu Tyr Sfet Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Vai Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gla Ile Asp Lys Tyx 180 185 130 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro pro Lys Ser ASp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Ser Axg Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Val Gin Lys Lys 225 230 235 240 Pr o Ala Glu Leu Gin Gly Phe Hís Arg Ser Phe Lys Gly Gin Asn Pro 245 250 255 Phe Glu Leu Phe Ser Leu Asp Gin Pro Asp His Gly Asp Ser Asp 260 265 270 Phe Gly Leu Gin Cys Ser Ala Arg Pro Asp Ttet Pro Ala Ser Gin Pro 275 280 235 Lie Asp Ile Pro Asp Ala Lys Lys Arg Gly Lys Lys Lys Lys Arg Gly 290 295 300 Arg Alei Thr Asp Ser Phe Ser Gly Arg Phe Glu ASp Val Tyr Gin Leu 305 310 315 320 Gin Glu Asp Vai Leu Gly eiu Gly Ala His &lâ Arg Val Glu Thr Cys 325 330 335 Ile Asn Leu Ile Thr Ser Gin Glu. Tyr Ala Val Lys lie Ile Qlu Lys 340 345 350 Gin Pro Gly Hls lie Arg Ser Arg Vai Phe Ãrg Glu Val Glu fíefc Leu 355 360 365 Tyr Gin cys Gin. Gly His Arg Asn Vai Leu Glu Leu Ile Glu Phe Phe 370 375 380 34

Glu Glu Glu Asp Arg Phe Tyr Leu vai Phe Glu Lys Met Arg Gly Gly 3S5 390 395 400 Ser Ile Leu Ser His Ile His Lys Arg Arg HÍ6 Phe Asn Glu Leu Glu 405 410 415 Âlâ Ser Vai Vai Vai Gin Asp Vai Ala Ser Ala Leu Asp Phe Leu His 420 425 430 Asn Lys Gly Ile Ala His Arg ftsp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Cys 435 440 445 Giu ais Pro Asn Gin Vai Ser Pro Vai Lys Ile Cys Asp Phe Asp Leu 450 455 460 Gly Ser Gly Ile Lys Leu Asn Gly Asp Cys Ser Pro Ile Ser Thr Pro 465 470 475 480 Glu Leu Leu Thr Pro Cye Gly ser Ala Glu Tyr Met Ala Pro Glu Vai 4B5 490 495 Vai Glu Ala Phe Ser Glu Glu Alã Ser Ile Tyr Asp Lys Arg Cys Asp 500 505 510 Leu Trp Ser Leu Gly Vai Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Tyr Pro 515 S20 525 Pro Phe Vai Gly Arg Cys Gly Ser Asp Cys Gly Trp Asp Arg Gly Glu 530 535 540 Ala Cys Pro Ala Cys Gin Asn Met Leu Phe Glu Ser Ile Gin Glu Gly 545 550 555 560 Lya Tyr Glu Phe Pro Asp Lys Asp Trp Ala His Ile Ser Cys Ala Ala 565 570 575 Lys Asp Leu Ile Ser Lys Leu Leu Vai Arg ASp Ala Lys Gin Arg Leu 530 585 590 Ser Ala Ala Gin Vai Leu Gin His Pro Trp Vai Gin Gly Cys Ala Pro 595 600 605 Glu Asm Thr Leu Pro Thr Pro Met Vai Leu Gin Arg Trp Asp Ser His 610 615 620 Phe Leu Leu Pro Pro His Pro Cys Arg Ile His Vai Arg Pro Gly Gly 625 «30 635 640

Leu Vai Arg Thr Vai Thr Vai Asn Glu 645

Lisboa, 6 de Junho de 2007

Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a identificação de um agente que modula a capacidade de um polipeptideo Mnk2 para modular a absorção de glucose numa célula, compreendendo o processo: pôr-se em contacto um polipeptideo Mnk2 (cinase que interage com MAP-cinase 2) com um agente candidato; e a determinação do efeito do agente candidato sobre a capacidade do polipeptideo Mnk2 para modular a absorção da glucose numa célula.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o polipeptideo Mnk2 é um polipeptideo Mnk2 de mamífero.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é um polipeptideo Mnk2 humano.

4. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é o Mnk2a.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, no qual o polipeptideo Mnk2a compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é o Mnk2b.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, no qual o polipeptideo Mnk2b compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. 2

8. Processo para a identificação de um agente que modula a capacidade de um polipeptideo Mnk2 para modular a actividade de um elemento de resposta à glucose numa célula, compreendendo o processo: pôr-se em contacto um polipeptideo Mnk2 com um agente candidato; e a determinação do efeito do agente candidato sobre a capacidade do polipeptideo Mnk2 para modular a actividade de um elemento de resposta à glucose numa célula.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, no qual o polipeptideo Mnk2 é um polipeptideo Mnk2 de mamífero.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é um polipeptideo Mnk2 humano.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é o Mnk2a.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, no qual o polipeptideo Mnk2a compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

13. Processo de acordo com a reivindicação 9, no qual o polipeptideo Mnk2 de mamífero é o Mnk2b.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, no qual o polipeptideo Mnk2b compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

15. Processo para a identificação de um modulador da absorção de glucose, compreendendo o processo: 3 o fornecimento de uma célula que exprime um polipeptideo Mnk2 recombinante; a exposição da célula a um agente candidato; e a medição da absorção de glucose na célula na presença do agente candidato, no qual a absorção alterada de glucose na célula na presença do agente candidato, comparada com a absorção na ausência do agente candidato, indica que o agente candidato é um modulador da absorção de glucose.

16. Processo in vitro para a modulação da absorção de glucose numa célula, compreendendo o processo pôr-se em contacto uma célula com uma quantidade de um composto eficaz para modular a expressão ou a actividade de um polipeptideo Mnk2 e, assim, modular a absorção de glucose na célula.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual o composto faz diminuir a expressão ou a actividade do polipeptideo Mnk2 e faz assim aumentar a absorção de glucose na célula.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, no qual o composto faz diminuir a actividade de cinase do polipeptideo Mnk2 . Lisboa, 6 deJunho de 2007