EP1244772A2 - Krankhaft veränderte herzmuskelzelle, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Krankhaft veränderte herzmuskelzelle, ihre herstellung und verwendung

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EP1244772A2
EP1244772A2 EP00990011A EP00990011A EP1244772A2 EP 1244772 A2 EP1244772 A2 EP 1244772A2 EP 00990011 A EP00990011 A EP 00990011A EP 00990011 A EP00990011 A EP 00990011A EP 1244772 A2 EP1244772 A2 EP 1244772A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
muscle cell
cardiac muscle
protein
heart
cell according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00990011A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker RÖNICKE
Barbara Nave
Thomas Henkel
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Medigene AG
Original Assignee
Medigene AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Medigene AG filed Critical Medigene AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a pathologically altered heart muscle cell, which can be produced from healthy heart tissue by isolating at least one healthy heart muscle cell, stimulating the isolated heart muscle cell by means of suitable hormones, hormone analogues and / or cytokines; and detection of the at least one pathologically altered heart muscle cell by determining the location of at least one signal molecule, preferably at least one protein in the sarcomere.
  • the invention further relates to a ner driving for the production of a pathologically altered heart muscle cell, a ner driving for the detection or identification of cardiac active substances and the use of a pathologically changed heart muscle cell.
  • the cardiovascular system In addition to the heart as the central element, the cardiovascular system consists of large and medium-sized vessels with a defined arrangement, as well as many small and smallest vessels that are created and regressed as required.
  • the cardiovascular system is subject to self-regulation (homeostasis), which supplies the peripheral tissues with oxygen and nutrients and removes metabolites.
  • the heart is a hollow muscular organ with the task of maintaining continuous blood flow to the blood vessels through alternating contraction (systole) and relaxation (diastole) of norhofs and chambers.
  • the heart muscle is a functional cell assembly (syncytium) made of striated muscle cells that is embedded in connective tissue. Each cell has a nucleus and is bordered by the plasma membrane, the sarcolemma.
  • the contractile substance of the heart is made up of highly organized, long and parallel cell components, the myofibrils, which in turn are irregular are separated by sarcoplasm. Each myofibril is divided into several identical, structural and functional units, the sarcomeres.
  • the sarcomers are composed of the thin filaments, which mainly consist of actin, tropomyosin and troponin, and the thick filaments, which mainly consist of myosin.
  • each sarcomere is called the M-line, where thick filaments meet in opposite directions.
  • the sarcomere is limited by the Z-bands, which ensure the anchoring of the thin filaments and represent the connection to the next sarcomere.
  • the molecular mechanism of muscle contraction is based on cyclic attachment and detachment of the globular myosin heads from the actin filaments.
  • Ca 2+ is released from the sarcoplasmic reticulum, which influences the troponin complex and tropomyosin through an allosteric reaction and thus allows the actin filament to come into contact with the myosin head.
  • the attachment causes a change in the conformation of the myosin, which then pulls the actin filament along.
  • ATP is required.
  • the activity of the heart muscle can be adjusted at short notice to the respective blood flow requirement (perfusion requirement) by means of nervous and hormonal regulation measures. In this way, both the force of contraction and the speed of contraction can be increased. Long-term overuse leads to physiological reorganization in the heart muscle, which is mainly characterized by an increase in myofibrils (myocyte hypertrophy).
  • Oxidative damage to the heart muscle results from anemia (ischemia), which in turn is caused by heart diseases, bacterial or viral infections, toxins, metabolic abnormalities, autoimmune diseases or genetic defects.
  • Therapeutic measures are currently aimed at strengthening the contraction force and controlling the compensatory neuronal and hormonal compensation mechanisms.
  • the mortality rate after diagnosed heart failure is still high (35 to 50% within the first five years after diagnosis). It is the leading cause of death worldwide.
  • the only causal therapy used today is costly heart transplantation, which is associated with considerable risks for the patient.
  • G protein-coupled receptors such as adrenergic receptors or endothelin receptors
  • receptor tyrosine kinases such as IGF-1 receptors
  • cytokine receptors such as receptors for cytokines of the Interleukin-6 family
  • serine / threonine receptor kinases such as TGF-ß receptors.
  • the first group of receptors are G protein-coupled receptors, which include adrenergic receptors.
  • G protein-coupled receptors include adrenergic receptors.
  • adrenergic receptors A distinction is made between the types cci, ⁇ and ⁇ in the case of the adrenergic receptors, each type in turn comprising three subtypes. While all ß-adrenergic receptors have the Gcts subunit of the trimeric G proteins, the concentration of cyclic
  • cAMP Adenosine monophosphate
  • PKA protein kinase A
  • Isoforms of protein kinase C PKC can also be activated in this way (Castellano and Böhm (1997) Hypertension 29, p. 715). It was also possible to show that PKC is an activator of the raf-MAP kinase cascade and that it stimulates both cell growth and cell division in cell culture systems (Ho et al. (1998) JBC 273, p. 21730).
  • the endothelin receptors which appear as types ET A and ET B and at least partially perform different tasks (Miyauchi and Masaki) also belong to the G protein-coupled receptors
  • the receptors ET A and ET B can NEN stimulated via the signaling molecule ET-1, which also leads to the activation of the phospholipase C ⁇ (PLC ⁇ ).
  • PLC ⁇ phospholipase C ⁇
  • Activated PLC ⁇ then catalyzes the conversion of phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphate (PIP 2 ) into diacylglycerol (DAG) and inositol triphosphate (InsP 3 ) (Dorn et al. (1999) Trends Cardiovasc. Med. 9, p. 26) , DAG in turn activates
  • An increased Ca 2+ concentration in cardiac muscle cells influences the contraction and activates further signal transduction proteins, such as, for example, isoforms of the PKC (Nakamura and Nishizuka (1994) J Biochem. 115, p. 1029).
  • Another important group in the transmission of cellular signals are the receptor tyrosine kinases, which activate a number of signal transduction molecules such as the adapter proteins Grb2, APS or Shc, which in turn have a positive effect on the phosphatidylinositol 3-kinase or ras.
  • the MAP kinase cascade is switched on via these activated proteins, which leads to increased protein biosynthesis and cell growth (Ho et al. (1992) Cell 71, p. 335).
  • ERK MAP kinase cascade
  • the p38 signal transduction path is associated with programmed cell death (apoptosis) and can be triggered by endotoxins, cytokines and physiological stress in the cell (Wang et al. (1998) JBC 273, p. 2161).
  • Kinase signal transduction path is also affected by stress factors solved, the activation via PKC, MAP-ERK kinases (MEKK) and sec-kinases and also leads to increased gene transcription (Lazou (1998) J Biochem. 332, p. 459).
  • Ad iii The third group of receptors, which are summarized under the generic term cytokine receptors, are characterized by the peculiarity that they do not contain their own kinase activity.
  • the cytokine receptors include the LIF receptor, which in turn is assigned to the Interleukin-6 family.
  • the LIF receptor consists of a ligand-specific component and a GP130 subunit.
  • GP130 When activated, GP130 causes signal transduction that attracts JAK and Tyr kinases. These kinases phosphorylate STAT (signal transducer and activator of transcription) proteins, which are thereby prepared for entry into the cell nucleus. There the STAT proteins influence gene expression (summarized in: Tetsuya Taga (1997)
  • the last group of receptors the serine / threonine receptor kinases, has only recently been given increased attention. This includes the TGF-ß receptor, which transmits extracellular signals to intracellular SMAD proteins, which in turn are phosphorylated. After phosphorylation, the SMAD proteins actively migrate into the cell nucleus, bind to DNA there and specifically activate gene transcription (Attisano et al. (1998) Curr. Opin. Cell Biol. 10, p. 188).
  • ANP expression atrial natriuretic peptide
  • c-fos atrial natriuretic peptide
  • erg-1 transcription factors
  • the third group of genes that show an increased expression during hypertrophy are structural components of the contractile apparatus, whereby the direct connection with the development of hypertrophy is unclear in all cases (Lowes BD et al. (1997) J Clin. Invest. 100, pp. 2315-2324; Shubeita HE et al.
  • the increased expression of components of the contractile apparatus contributes significantly to the increase in the total protein synthesis rate, which results in a measurable increase in volume of the heart muscle cells. It is used as a further indicator of hypertrophy and is either measured as an increase in surface area after fixation and staining of the cells or evaluated by determining the ratio of the change in length and width of the cells (US 5,837,241; Wollert KC (1996) JBC 271, 16, S. 9535-45). None of the methods described is suitable for simulating the human in vivo situation in vitro, since the clear correlation between the increased expression rate of individual genes and the hypertrophy of cardiac muscle cells has not been clarified.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a pathologically altered heart muscle cell, with the aid of which the molecular changes which lead to heart diseases in vivo can be examined and with the aid of which substances can be found for their effectiveness for prophylaxis and therapy of cardiac patients ,
  • the DCMAG-1 gene product When an isolated cardiac muscle cell is stimulated by suitable hormones, hormone analogues and / or cytokines, the DCMAG-1 gene product can be specifically detected in the sarcomere of the cardiac muscle cells, while it is present in the unstimulated cardiac muscle cell evenly distributed in the cytoplasm. This different subcellular localization of the DCMAG-1 gene product is also detectable in cardiac biopsies of DCM patients compared to healthy people. Furthermore, the same shift in the localization of the DCMAG-1 gene product in a DCM induced by increased contraction speed in animal experiments.
  • the invention therefore relates to a pathologically altered heart muscle cell, which can be produced from healthy heart tissue and / or at least one healthy heart muscle cell by a method comprising the steps: (a) providing or isolating at least one healthy heart muscle cell; (b) stimulating the isolated myocardial cell by suitable hormones, hormone analogues and / or cytokines.
  • healthy heart tissue or healthy heart muscle cell in the sense of the present invention mean heart tissue or cells isolated therefrom which are clinically unremarkable.
  • the heart muscle cells were isolated from biopsy material, the donor of which showed no signs of chronic heart failure associated with hypertrophy of the heart muscle cells.
  • a healthy heart muscle cell can be differentiated from stem cells are obtained. Such methods are described, for example, by Kolossov E. et al. (1998) J Cell Biol 28; 143 (7), pp. 2045-2056.
  • the term “pathologically altered heart muscle cell” in the sense of the present invention is to be understood as a heart muscle cell that has been isolated from biopsy material from a cardiac patient, for example an inadequate patient.
  • this term is understood to mean a cardiac muscle cell stimulated according to the invention, which has the histopathological appearance of such a pathological cardiac muscle cell. This can be achieved by in vitro stimulation of the heart muscle cells, which thereby show a shift in the location of certain signaling molecules from the cytoplasm into the sarcomere, for example into the M line or the Z band. This shift is similar to that seen in cardiac muscle cells obtained from the hearts of inadequate patients.
  • the term “signal molecule” is understood to mean a cellular endogenous molecule or protein which occurs in particular in cardiac muscle cells and which, after hormone, hormone analogues and / or cytokine stimulation, changes its location within the heart muscle cell in comparison to the healthy starting cell .
  • the term “signal molecule” is understood in particular to mean a protein of the sarcomere of heart muscle cells.
  • suitable hormones includes, in particular, the hormones adrenaline, noradrenaline, including their derivatives, as well as ET-1, ET-2, ET-3, angiotensin I and II, insulin (IN), IGF-1 and myotrophin understood.
  • Catecholamine derivatives such as isoproterenol (ISO) and phenylephrine (PE) are preferably used as “suitable” hormone analogs.
  • suitable cytokines are understood to mean in particular LIF, cardiotrophin-1 (CT-1), interleukin-6 and -11 (IL-6 and -1 1), oncostatin M and the ciliary neurotrophic factor.
  • CT-1 cardiotrophin-1
  • IL-6 and -1 1 interleukin-6 and -11
  • oncostatin M and the ciliary neurotrophic factor.
  • the healthy starting material for the production of the pathologically altered heart muscle cell can come from birds, in particular from chickens, or from mammals. In the mammals, human heart tissue and heart tissue from rabbits and rodents, in
  • the cardiac muscle cell is stimulated essentially simultaneously with the described hormones, hormone analogs and / or cytokines. In this way, different stimulants can be mixed together, which means that they are used at the same time. Likewise, “essentially simultaneous” stimulation is to be understood as the use of the various stimulants in immediate succession.
  • the hormones, hormone analogs and / or cytokines act via at least partially different signal transduction cascades, already described under (i) to (iv), in particular via different receptors on or in the heart muscle cell.
  • the hormones, hormone analogs and / or cytokines mentioned have an activating effect on signal transduction cascades, but not via receptors, but directly on cascades downstream of the receptors.
  • Such stimulation can take place, for example, using phorbol esters such as phorbol myristate acetate (PMA).
  • PMA phorbol myristate acetate
  • PKC protein kinase C
  • PKC protein kinase C
  • phorbol ester The interaction between phorbol ester and PKC is very sensitive and can lead to significant PKC stimulation even with 1 nM phorbol ester (Gschwendt et al. (1991) TIBS, 16, p. 167).
  • the stimulation of PKC by phorbol ester leads as well as the receptor-mediated stimulation of PKC for increased gene transcription, protein biosynthesis and cell growth.
  • the present invention further provides a method for producing the heart muscle cell according to the invention from healthy heart tissue and / or at least one healthy heart muscle cell, the method comprising the following steps:
  • the detection of the localization of the signaling molecule is preferably carried out at the individual cell level.
  • the term “single cell level” in the sense of the present invention means, for example, the microscopic examination of an individual cell with regard to specific properties.
  • morphological features of the cell such as its size or shape, can contribute to the characterization.
  • a particularly preferred method for examining signal molecules, in particular proteins at the single cell level is microscopic detection with the aid of immunofluorescence. With this method proteins are detected by co-localization with known proteins within their cellular structure. This term also means the electron microscopic examination of subcellular structures, such as sarcomeres.
  • the association of a sarcomere protein with known Z-band proteins such as ⁇ -actinin after stimulation can be identified as a component of the Z-band with the aid of immunofluorescence.
  • the DCMAG-1 gene product is particularly suitable, since it could be shown in vitro and in vivo that it is distributed evenly in the cytoplasm in unstimulated or healthy cardiac muscle cells, while it is present in the stimulated or pathological cardiac muscle cells together with ⁇ -actinin Z-band co-localized. In vitro, in addition to the Z band localization, a coloration of the M line can also be observed.
  • the DCMAG-1 gene product can be labeled, for example, by means of a specific antibody and can be detected by subsequent immunofluorescence using methods which are known to the person skilled in the art.
  • Another immunological detection method for the co-localization of proteins at the individual cell level is immunoelectron microscopy, which is also known to the person skilled in the art.
  • fusion proteins between, for example, the DCMAG-1 gene product and a marker protein can be used to detect proteins at the individual cell level.
  • marker proteins are prokaryotic peptide sequences which can be derived, for example, from the galactosidase from E. coli.
  • Viral peptide sequences, such as that of bacteriophage Ml 3, can also be used in order to generate fusion proteins for the “phage display” method known to the person skilled in the art (Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol, 12 , Pp. 433-455).
  • fluorescent proteins are also suitable as marker proteins, which, depending on the fluorescent color, are referred to as B-, C-, G-, R- or YFP (Blue, Cyano, Green, Red or Yellow Fluorescent Protein).
  • Fluorescence fusion proteins can also be used, for example, to detect protein-protein interactions at the individual cell level using the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Another detection method for shifting the localization of certain proteins at the individual cell level is the characteristic modification of sarcomer proteins, in particular M-line or Z-band proteins.
  • post-translational modifications such as phosphorylation on serine, threonine and / or tyrosine residues can be used for the detection by using specific antibodies.
  • phosphorylation and / or dephosphorylation of the DCMAG-1 gene product on certain serine, threonine and / or tyrosine residues can be responsible for the association and binding to Z-band proteins.
  • Tropomodulin is known as a protein which has an effect on the formation of the myofibrils and the contractility of the cells in chicken cardiomyocytes (Gregorio et al. (1995) Nature 377, pp. 83-86). This protein binds to tropomyosin on the one hand and to the actin filaments on the other, but is not regulated in its activity itself.
  • the DCMAG-1 gene product also has some structural features of the tropomodulin, such as a tropomyosin binding domain. In contrast to tropomodulin, the DCMAG-1 gene product has additional structural features that indicate regulation of the activity of the protein by tyrosine kinases.
  • the term "functional variant" of the amino acid sequence of the DCMAG-1 gene product in the sense of the present invention means proteins which are functionally related to the protein according to the invention, ie can also be referred to as an adjustable modulator of the contractility of cardiac muscle cells, preferably in striated muscles are expressed in the heart muscle and there in particular in heart muscle cells, have structural features of the tropomodulin, such as one or more Tropomyosin binding domains and / or their activity can be regulated by tyrosine kinases.
  • “functional variants” are the corresponding proteins which come from organisms other than humans, preferably from non-human mammals.
  • this also includes proteins with a sequence homology, in particular a sequence identity of approximately 50%, preferably approximately 60%, in particular approximately 70%, of the DCMAG-1 gene product with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 ,
  • proteins with a sequence homology in particular a sequence identity of approximately 50%, preferably approximately 60%, in particular approximately 70%, of the DCMAG-1 gene product with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1
  • These include, for example, polypeptides which are encoded by a nucleic acid which is isolated from non-heart-specific tissue, for example skeletal muscle tissue, but which have the designated functions after expression in a heart-specific cell.
  • This also includes deletions of the polypeptide in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids.
  • this also includes fusion proteins which contain the protein described above, the fusion proteins themselves already having the function of an adjustable modulator of the contractility of cardiac muscle cells or being able to acquire the specific function only after the fusion portion
  • “functional variants” also include fusion proteins with a proportion of in particular non-heart-specific sequences of approximately 1-200, preferably approximately 1-150, in particular approximately 1-100, especially approximately 1-50 amino acids.
  • non-heart-specific protein sequences are prokaryotic protein sequences, which can be derived, for example, from the galactosidase from E. coli or from the DNA binding domain of a transcription factor for use in the "two-hybrid” system described below.
  • viral peptide sequences for use in the "phage display” V already mentioned are to be mentioned.
  • the nucleic acid according to the invention which codes for the protein according to the invention, is generally a DNA or RNA, preferably a DNA. A double-stranded DNA is generally preferred for the expression of the gene in question.
  • Another object of the present invention is a method for the detection or identification of one or more cardiac active substances, characterized in that the method contains the following steps: (i) providing or isolating at least one cardiac muscle cell; (ii) contacting the myocardial cell with one or more test substances; and (iii) detection or identification of one or more cardiac active substances by determining the location of at least one signaling molecule, preferably at least one protein in the sarcomere.
  • a heart muscle cell according to the invention which shows the clinical picture of a pathologically altered heart muscle cell by stimulation with suitable hormones, hormone analogs and / or cytokines.
  • test substances in the sense of the present invention is to be understood as meaning all those molecules, compounds and / or compositions and substance mixtures which can interact with the heart muscle cell according to the invention under suitable conditions.
  • Possible test substances are low molecular weight, organic or inorganic molecules or compounds, preferably molecules or compounds with a relative molecular weight of up to approx. 1,000, in particular approx. 500.
  • test substances can be expressable nucleic acids, which are caused by infection or transfection using known vectors and / or procedures are brought into the heart muscle cell.
  • Suitable vectors are, for example, viral vectors, in particular adenovirus, or non-viral vectors, in particular liposomes.
  • Suitable procedures are for example calcium phosphate trans fection or electroporation.
  • expressible nucleic acid is understood to mean a nucleic acid which on the one hand consists of an open reading frame and on the other hand contains cis-active sequences, for example a promoter or a polyadenylation signal, which ensure transcription of the nucleic acid and translation of the transcript.
  • Test substances can furthermore also include natural and synthetic peptides, for example peptides with a relative molecular weight of up to approximately 1,000, in particular up to approximately 500, and proteins, for example proteins with a relative molecular weight of greater than approximately 1,000, in particular greater than approximately 10,000 , or complexes thereof.
  • the peptides can be encoded by selected or random nucleic acids, which preferably originate from gene banks or nucleic acid libraries, the peptides being obtained by natural or artificial expression of the sequences. This term also includes kinase inhibitors, phosphatase inhibitors and their derivatives. Due to their interaction, the test substances can either reduce / prevent or favor / cause the localization shift of the DCMAG-1 gene product after stimulation.
  • Another object of the present invention is the use of a pathologically altered cardiac muscle cell, preferably an inventive, pathologically modified cardiac muscle cell for the detection or identification of one or more cardiac active substances.
  • a suitable test system for identifying test substances is based on the identification of functional interactions with the so-called “two-hybrid” system “(Fields and Sternglanz, (1994), TIGS 10, pp. 286-292; Colas and Brent, (1998) TIBTECH 16, pp. 355-363)
  • cells are transformed with expression vectors, the fusion proteins from the DCMAG-1 gene product and express a DNA binding domain of a transcription factor such as Gal4 or LexA.
  • the transformed cells also contain a reporter gene, the promoter of which carries binding sites for the corresponding DNA binding domain.
  • the expression of the reporter gene can be greatly increased if the second fusion protein interacts functionally with the polypeptide according to the invention .
  • This increase in expression can be used to identify new interactors, for example by producing a cDNA library for the construction of the second fusion protein which codes for interactors of interest.
  • this test system can be used for the screening of substances which inhibit an interaction between the polypeptide according to the invention and a functional interactor.
  • substances which inhibit an interaction between the polypeptide according to the invention and a functional interactor.
  • Such substances reduce the expression of the reporter gene in cells which express fusion proteins of the polypeptide according to the invention and the interactor (Vidal and Endoh, (1999), TIBS 17, pp. 374-81).
  • new cardiac-active substances that can be both toxic and pharmaceutically effective can be identified or detected quickly.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the DCMAG-1 protein. 1 shows an immunofluorescence of unstimulated neonatal rat cardiomyocytes, which were stained with a polyclonal anti-DCMAG-1 antibody and a Cy3-coupled secondary antibody.
  • Figure 2 shows immunofluorescence from ET-1 / ISO / LIF-stimulated neonatal rat cardiomyocytes stained with a polyclonal anti-DCMAG-1 antibody and a Cy3-coupled secondary antibody.
  • the ⁇ -actinin staining of both the healthy and the DCM heart shows a pattern with sharp stripes, which is streaked across the course of the myofibrils and is typical of a Z-band protein.
  • the DCMAG-1 staining of the healthy heart shows a uniform, diffuse staining of the sarcoplasma, a striated pattern can be seen for the DCM heart, which correlates with the staining for ⁇ -actinin. This shows that when comparing healthy and DCM Hearts that the DCMAG-1 protein changes its intracellular localization and migrates from the sarcoplasma into the Z-band, so that the Z-band undergoes a molecular reorganization in connection with the clinical picture DCM.
  • Chinchilla bastard rabbits (2.5 - 3 kg) were kept under normal stall conditions and were allowed to drink and eat ad libitum.
  • the test animals were pre-injected with medetomidine (10 ⁇ g / kg) and then anesthetized with propofol (5 mg / kg / hour).
  • Fentanyl (10 ⁇ g / kg) was administered intravenously for analgesia.
  • the rabbits were ventilated under control and blood pressure, EKG and blood oxygenation were continuously monitored. Under sterile operating conditions, a 2 Fr pacemaker probe (Medtronic, Unterschleissheim) was advanced and anchored into the right ventricular cavity via the vena jugularis extema dextra.
  • the pacemaker probe was then subcutaneously transferred via cannula to a prefabricated laterodorsal subcutaneous pocket and connected there to the pacemaker unit (Diamond II, Vitatron, Leiden, Holland, with user-defined software). The skin incisions were closed with surgical sutures.
  • cardiac stimulation was started at 320 heartbeats / min.
  • the pacemaker rate was increased by 20 beats / min weekly.
  • the left ventricular shortening fraction was measured echocardiographically to control the development of heart failure.
  • the test animals were sacrificed and the hearts were cut for histological examination in a cryostat (layer thickness 4 ⁇ m). The histological heart sections were fixed with 3% paraformaldehyde.
  • the antibody staining ( ⁇ -actinin and DCMAG-1) was carried out as described in Example 3. The evaluation was carried out in a fluorescence microscope.
  • the control rabbit shows a diffuse, sarcoplasma staining, whereas in rabbits with the induced heart failure a clear transverse striation of the muscle cells is recognizable. This striation is also evident in an ⁇ -actinin staining, so that DCMAG-1 is associated with the Z-bands in the heart-deficient heart in this animal model as well.
  • cardiomyocytes were isolated from neonatal rats. The rats were one to seven days old and were killed by cervical dislocation. To isolate the cardiomyocytes, the ventricles of the contracting hearts were removed and separated using the "Neonatal Cardiomyocyte Isolation System" (Worthington Biochemicals Corporation, Lakewood, New Jersey). For this purpose, the ventricles were twice with "Hank's Balanced Salt Solution” without Calcium and magnesium (CMF HBBS) washed, crushed with a scalpel until they had a size of about 1 mm 3 and subjected to a cold trypsin treatment (2 - 10 ° C) overnight.
  • CMF HBBS "Hank's Balanced Salt Solution” without Calcium and magnesium
  • the trypsin treatment was stopped by adding a trypsin inhibitor and then a collagenase treatment was carried out at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the cells were through Individual pipetting, passed through a "cell trainer” (70 ⁇ m) and centrifuged twice for 5 min at 60 ⁇ g. The cell sediment was then taken up in 20 ml of conventional attachment medium. Sowing was carried out at a density of 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on gelatin-coated (Sigma. Deisenhofen) tissue culture dishes or coverslips The next morning, the medium was suctioned off and, after washing twice with DMEM (conventional cell culture medium), replaced by culture medium.
  • DMEM conventional cell culture medium
  • Attachment Medium DMEM / M-199 (4/1); 10% horse serum; 5% fetal calf serum; 1 mM sodium pyruvate; Penicillin, streptomycin, amphotericine B culture medium: DMEM / M-199 (4/1); 1 mM sodium pyruvate
  • the cells were stimulated two to six hours after changing the medium.
  • the cardiomyocytes were treated with various stimulants or combinations of stimulants (see Table 1) for 48 hours and then analyzed.
  • the course of the one-time stimulation could be observed based on the morphological changes in the cells (hypertrophy).
  • immunofluorescence analyzes were also used to determine hypertrophy parameters (DCMAG-1 recruitment).
  • the stimulated cardiomyocytes were washed twice with cold PBS and fixed for 20 minutes with 3% paraformaldehyde solution in PBS. After washing again with cold PBS, the cells were washed twice with 100 mM ammonium chloride in PBS, each for 10 min. at room temperature. This was followed by a further washing step with cold PBS and incubation with 0.2% Triton-X 100 in PBS at room temperature for 5 min. After washing twice with 0.1% gelatin in PBS, the first antibody was incubated at 37 ° C.
  • the first antibody (against the second domain of DCMAG-1) was diluted 1/500 in incubation solution (0.5% Tween-20; 0.5% BSA; in PBS). After one hour, three washing steps with PBS for 5 min each at room temperature The second antibody (obtained from goat, directed against rabbits, Cy3-coupled; Dianova, Hamburg) was diluted 1/200 in incubation solution and also incubated for one hour at 37 ° C. with the fixed cells In further washing steps with PBS for 5 minutes each at room temperature and a brief immersion in desalinated water, the preparations were overlaid with Histosafe (Linaris, Wertheim-Bettingen) and applied to slides. The evaluation was carried out microscopically (Axiovert 100S, Cy3 filter set, Zeiss, Göttingen).
  • Unstimulated cardiomyocytes show a diffuse, sarcoplasmic staining for DCMAG-1 (Fig. 1).
  • the DCMAG-1 for cells stimulated with PE or LIF is evenly distributed over the sarcoplasma, but the LIF-stimulated cells show an elongated shape.
  • ET-1 stimulated cells show DCMAG-1 in filament-like structures.
  • Cells stimulated twice with ET-1 and PE show a weak sarcoplasmic pattern, whereas cells stimulated three times with ET-1, ISO and LIF have a clearly visible, streaked pattern (FIG. 2).
  • FITC-anti-mouse (1: 250) and Texas Red-anti-rabbit (1: 50; both from Dianova) were used as secondary antibodies.
  • the evaluation was carried out using a fluorescence microscope, a Fuji CCD camera and Aida software, or using a confocal microscope (Pascal from Zeiss) and LSM software (Zeiss). It was shown that triple stimulation with ET-1 / LEF / ISO for DCMAG-1 staining resulted in a pattern of dots or stripes, in which DCMAG-1 was strung along the sarcomere like pearls.
  • DCMAG-1 can therefore be found in different structures in the sarcomere, depending on the stimulant. 8. Measurement of the effect of inhibitors on the DCMAG-1 translocation in the immunofluorescence test in cardiomyocytes from the neonatal rat
  • Neonatal rat cardiomyocytes were prepared according to Example 3 and sown at a density of 1 ⁇ 10 5 cells per 1.5 cm well (reaction space in the cell culture dish).
  • the cell culture dishes contained 1.5 cm coverslips (Schubert and White) coated with 1% gelatin solution.
  • the cells were incubated after 24 hours with DMEM and then in maintenance medium with or without stimulus (LIF / ISO and ET-1, concentrations as above for simple dosing) for 48 hours.
  • the stimulated cells were inhibited, namely 30 ⁇ M LY294002 (Sigma), 50 ⁇ M SB 203580 (Sigma), 15 nM Gö 6976 (Alexis) or 50 ⁇ M PD98059 (NEB) for 48 h (medium and inhibitors were renewed after 24 h due to the activity of the inhibitors limited to 24 h in aqueous solution).
  • the cells were fixed with 4% paraformaldehyde solution, permeabilized with 0.2% Triton-XIOO and with anti-DCMAG (polyclonal, in-house production, 1: 500) or ⁇ -actinin (as a control, Sigma, 1: 500) stained and visualized in immunofluorescence using antiMaus or anti-Rabbit Cy3 (Jackson Labs, USA). In order to measure the effect of the inhibitors, the cells were optically classified and counted.

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Abstract

Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, herstellbar aus gesundem Herzgewebe durch Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle, Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine; Nachweis der mindestens einen krankhaft veränderten Herzmuskelzelle durch Bestimmen der Lokalisation mindestens eines Signalmoleküls sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung einschließlich eines Verfahrens zum Nachweis oder zur Identifizierung herzaktiver Substanzen.

Description

Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, ihre Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, herstellbar aus gesundem Herzgewebe durch Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle, Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine; sowie Nachweis der minde- stens einen krankhaft veränderten Herzmuskelzelle durch Bestimmen der Lokalisation mindestens eines Signalmoleküls, vorzugsweise mindestens eines Proteins im Sarkomer. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Nerfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle, ein Nerfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung herzaktiver Substanzen sowie die Verwendung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle.
Das Herz-Kreislaufsystem besteht neben dem Herz als dem zentralen Element aus großen und mittleren Gefäßen mit einer definierten Anordnung sowie vielen kleinen und kleinsten Gefäßen, die nach Bedarf entstehen und zurückgebildet werden. Das Herz-Kreislaufsystem unterliegt der Selbstregulation (Homöostase), wodurch die peripheren Gewebe mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt sowie Metabolite abtransportiert werden. Das Herz ist ein muskuläres Hohlorgan mit der Aufgabe, durch wechselnde Kontraktion (Systole) und Erschlaffung (Diastole) von Norhö- fen und Kammern die kontinuierliche Durchblutung der Gefäße aufrecht zu er- halten.
Der Herzmuskel, das Myokard, stellt einen funktionellen Zellverband (Synzyti- um) aus quergestreiften Muskelzellen dar, der in Bindegewebe eingebettet ist. Jede Zelle besitzt einen Kern und wird von der Plasmamembran, dem Sarkolemm begrenzt. Die kontraktile Substanz des Herzens wird durch hochorganisierte, lange und parallele Zellbestandteile, die Myofibrillen, die ihrerseits unregelmäßig durch Sarkoplasma getrennt sind, gebildet. Jede Myofibrille unterteilt sich in mehrere gleiche, strukturelle und funktionelle Einheiten, die Sarkomere. Die Sarkome- re wiederum setzen sich aus den dünnen Filamenten, die hauptsächlich aus Actin, Tropomyosin und Troponin bestehen und den dicken Filamenten zusammen, die hauptsächlich aus Myosin bestehen. Das Zentrum eines jeden Sarkomers wird als M-Linie bezeichnet, wo dicke Filamente mit entgegengesetzter Orientierung aufeinander treffen. Begrenzt wird das Sarkomer durch die Z-Banden, die die Verankerung der dünnen Filamente gewährleisten und die Verbindung zum nächsten Sarkomer darstellen.
Der molekulare Mechanismus der Muskelkontraktion beruht auf einer zyklischen Anheftung und Ablösung der globulären Myosinköpfe von den Actinfilamenten. Bei elektrischer Stimulation des Herzmuskels wird Ca2+ aus dem sarkoplasmati- schen Retikulum freigesetzt, welches durch eine allosterische Reaktion den Tro- ponin-Komplex und Tropomyosin beeinflußt und auf diese Weise den Kontakt des Actinfilaments mit dem Myosinkopf erlaubt. Die Anheftung bewirkt eine Konformationsänderung des Myosins, welches daraufhin das Actinfilament an sich entlang zieht. Um die Konformationsänderung rückgängig zu machen und um an den Anfang eines Kontraktionszyklus zurückzukehren, wird ATP benötigt.
Die Aktivität des Herzmuskels kann durch nervöse und hormonelle Regulationsmaßnahmen kurzfristig an den jeweiligen Durchblutungsbedarf (Perfusionsbedarf) angepaßt werden. So können sowohl die Kontraktionskraft als auch die Kontraktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Bei langfristiger Überbeanspruchung kommt es zur physiologischen Umorganisation im Herzmuskel, die hauptsächlich durch eine Vermehrung der Myofibrillen charakterisiert ist (Myozyten- Hypertrophie).
Bei Schädigungen des Herzmuskels führen häufig die ursprünglich physiologi- sehen Anpassungsmechanismen langfristig zu pathophysiologischen Zuständen, die in chronische Herzschwäche (Herzinsuffizienz) münden und meist mit akutem Herzversagen enden. Bei schwerer chronischer Insuffizienz kann das Herz nicht mehr adäquat auf veränderte Leistungsanforderungen reagieren, selbst geringe körperliche Verrichtungen fuhren zu Erschöpfung und Atemnot.
Schädigungen des Herzmuskels resultieren aus Blutleere (Ischämie), die ihrerseits verursacht wird durch Herzerkrankungen, bakterielle oder virale Infektionen, To- xine, metabolische Abnormalitäten, Autoimmunerkrankungen oder genetische Defekte. Therapeutische Maßnahmen richten sich zur Zeit auf eine Stärkung der Kontraktionskraft und eine Kontrolle der kompensatorischen neuronalen und hormonellen Kompensationsmechanismen. Trotz dieser Behandlung ist die Sterblichkeitsrate nach festgestellter Herzinsuffizienz nach wie vor hoch (35 bis 50 % innerhalb der ersten fünf Jahre nach Diagnose). Sie stellt weltweit die Haupttodesursache dar. Die einzige heute angewandte Kausaltherapie ist die kostenintensive und für den Patienten mit erheblichen Risiken verbundene Herztransplantati- on.
Zur Entwicklung neuer Kausaltherapien muß die zelluläre Umorganisation der Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten), die mit der Ausbildung bzw. dem Fortschreiten einer Herzmuskelerkrankung einhergeht, detailliert verstanden werden. Bisher ist aus Zellkulturexperimenten mit HeLa-, HEK 293- oder CHO-Zellen bekannt, daß externe Signale über zelluläre Rezeptoren aufgenommen werden und über Signal transduktionswege bzw. -netze oder -kaskaden in das Innere der Zelle weitergeleitet werden. Die Aktivierung von Rezeptoren durch Signalmoleküle hat zur Folge, daß intrazelluläre Enzymkaskaden angeschaltet werden, die den Ca2+- Haushalt, den Energiestatus der Zelle, die Genexpression und die Proteinbiosynthese regulieren.
Um die spezielle Signal transduktion in Herzmuskelzellen zu untersuchen und ihren Einfluß auf Herzerkrankungen aufzuklären, wurden vor allem neonatale Rat- ten-Kardiomyozyten verwendet. Mit Hilfe dieses Modellsystems konnten mehrere Signaltransduktionswege in Herzmuskelzellen identifiziert werden, in denen mindestens vier verschiedene Rezeptorklassen von Bedeutung sind:
i) G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, wie adrenerge Rezeptoren oder En- dothelin-Rezeptoren; ii) Rezeptor-Tyrosinkinasen, wie IGF-1 Rezeptoren; iii) Zytokin-Rezeptoren, wie Rezeptoren für Zytokine der Interleukin-6 Familie und iv) Serin/Threonin-Rezeptor Kinasen, wie TGF-ß Rezeptoren.
zu i) Die erste Gruppe von Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, wozu adrenerge Rezeptoren gehören. Man unterscheidet bei den adrener- gen Rezeptoren die Typen cci, α und ß, wobei jeder Typ wiederum drei Subtypen beinhaltet. Während alle ß-adrenergen Rezeptoren über die Gcts- Untereinheit der trimeren G-Proteine die Konzentration von zyklischem
Adenosin-Mono-Phosphat (cAMP) erhöhen, aktivieren die α-adrenergen Rezeptoren unterschiedliche G-Proteinkomponenten, die ihrerseits den cAMP-Gehalt senken können (Selbie and Hill, (1998) Trends. Pharmacol. Sei. 19, S. 87). Eine erhöhte cAMP-Konzentration aktiviert die Proteinki- nase A (PKA), die ihrerseits u.a. bei der Regulierung des Ca2+-Haushalts eine Rolle spielt (Hefti et al. (1997) J Mol. Cell. Cardiol. 29, S. 2873). Über diesen Weg können auch Isoformen der Proteinkinase C (PKC) aktiviert werden (Castellano und Böhm (1997) Hypertension 29, S. 715). Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß PKC ein Aktivator der raf-MAP- Kinase Kaskade ist und in Zellkultursystemen sowohl das Zellwachstum als auch die Zellteilung anregt (Ho et al. (1998) JBC 273, S. 21730).
Ebenfalls zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören die Endothe- lin-Rezeptoren, die als die Typen ETA und ETB auftreten und zumindest teilweise unterschiedliche Aufgaben erfüllen (Miyauchi und Masaki
(1999) Ann. Rev. Physiol. 61, S. 391). Die Rezeptoren ETA und ETB kön- nen über das Signalmolekül ET-1 stimuliert werden, was auch zur Aktivierung der Phospholipase Cγ (PLCγ) fuhrt. Aktivierte PLCγ katalysiert anschließend die Umsetzung von Phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Diacylglycerol (DAG) und Inositoltriphosphat (InsP3) (Dorn et al. (1999) Trends Cardiovasc. Med. 9, S. 26). DAG aktiviert seinerseits
Isoformen der PKC-Familie, wohingegen InsP die Ausschüttung von Ca2+ aus intrazellulären Ca2+-Lagern verursacht.
Eine erhöhte Ca2+-Konzentration in Herzmuskelzellen beeinflußt die Kon- traktion und aktiviert weitere Signaltransdutionsproteine, wie beispielsweise Iso formen der PKC (Nakamura und Nishizuka (1994) J Biochem. 115, S. 1029).
Eine weitere wichtige Gruppe in der Weiterleitung zellulärer Signale sind die Rezeptor-Tyrosinkinasen, die eine Reihe von Signaltransduktionsmo- lekülen wie beispielsweise die Adaptorproteine Grb2, APS oder Shc aktivieren, die ihrerseits die Phosphatidylinositol 3-Kinase oder ras positiv beeinflussen. Über diese aktivierten Proteine wird die MAP-Kinase-Kaskade angeschaltet, was zu verstärkter Proteinbiosynthese und Zellwachstum führt (Ho et al. (1992) Cell 71, S. 335).
Innerhalb der MAP-Kinase-Kaskade unterscheidet man drei Signaltrans- duktionswege, die als ERK-, p38- und JNK-Kinase-Signaltransduk- tionsweg bezeichnet werden. Aus Zellkulturexperimenten ist bekannt, daß PKC hauptsächlich den ERK-Signaltransduktionsweg aktiviert, der die
Proteinbiosynthese und die Zellteilung fordert (Sugden et al. (1998) Adv. Enzyme Regul. 38, S. 87). Der p38-Signaltransduktionsweg wird dagegen mit dem programmierten Zelltod (Apoptose) in Verbindung gebracht und kann durch Endotoxine, Zytokine und physiologischen Streß in der Zelle ausgelöst werden (Wang et al. (1998) JBC 273, S. 2161). Der JNK-
Kinase-Signaltransduktionsweg wird ebenfalls durch Streßfaktoren aus- gelöst, wobei die Aktivierung über PKC, MAP-ERK-Kinasen (MEKK) und Sek-Kinasen verläuft und ebenfalls zu verstärkter Gentranskription führt (Lazou (1998) J Biochem. 332, S. 459).
zu iii) Die dritte Gruppe von Rezeptoren, die unter dem Oberbegriff Zytokin- Rezeptoren zusammengefaßt werden, zeichnen sich durch die Besonderheit aus, daß sie keine eigene Kinaseaktivität enthalten. Zu den Zytokin- Rezeptoren zählt der LIF-Rezeptor, der seinerseits der Interleukin-6 Familie zugeordnet wird. Der LIF-Rezeptor setzt sich aus einer Liganden- spezifischen Komponente und einer GP130-Untereinheit zusammen.
GP130 bewirkt im aktivierten Zustand eine Signaltransduktion, die JAK- und Tyr-Kinasen anzieht. Diese Kinasen phosphorylieren STAT-Proteine (signal transducer and activator of transcription), die dadurch für den Eintritt in den Zellkern vorbereitet werden. Dort beeinflussen die STAT- Proteine die Genexpression (zusammengefaßt in: Tetsuya Taga (1997)
Ann. Rev. Imm nol. 15, S. 797-819 "GP 130 and the Interleukin-6 Family of Cytokines").
zu iv) Der letzten Gruppe von Rezeptoren, den Serin/Threonin-Rezeptorkinasen wurde erst in jüngster Zeit verstärkt Beachtung geschenkt. Hierzu gehört der TGF-ß Rezeptor, der extrazelluläre Signale auf intrazelluläre SMAD- Proteine weiterleitet, die ihrerseits phosphoryliert werden. Nach Phospho- rylierung wandern die SMAD-Proteine aktiv in den Zellkern ein, binden dort an DNA und aktivieren spezifisch die Gentranskription (Attisano et al. (1998) Curr. Opin. Cell Biol. 10, S. 188).
Viele der beteiligten Mediatoren dieser Signaltransduktionswege sowie die Beziehungen der Wege und Mediatoren untereinander sind mittlerweile bekannt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden erste Versuche unternommen, um Aus- sagen über das krankhaft veränderte Herz treffen zu können. So sind beispielsweise Testsysteme zur Bestimmung des Hypertrophiegrades von Herzmuskelzellen bekannt, die im wesentlichen auf der Messung einer veränderten Expression bestimmter Gene, der Zunahme der allgemeinen Proteinbiosynthese oder auf der Messung der Leistungsfähigkeit des Herzens (Morphometrie) be- ruhen. Diese Versuchsansätze weisen den gravierenden Nachteil auf, daß sie Si- gnaltransduktionswege, die im erkrankten Herz gegenüber dem gesunden Herz spezifisch herauf- oder herunterreguliert sein können, nicht berücksichtigt.
In den bekannten Versuchsansätzen wird am häufigsten der Anstieg der ANP- Expression (atrial natriuretic peptide) als Parameter zur Bestimmung der Erkrankung der Herzmuskelzelle verwendet, wobei jedoch der funktionelle Zusammenhang zwischen einem ANP-Anstieg und Hypertrophie bisher nicht geklärt ist. Weiterhin werden der Anstieg der Expressionsrate von Transkriptionsfaktoren wie c-fos, c-jun oder erg-1 zur Beschreibung einer Hypertrophie von Herzmuskelzel- len herangezogen. Die dritte Gruppe von Genen, die eine erhöhte Expression während einer Hypertrophie zeigen, sind strukturelle Komponenten des kontraktilen Apparates, wobei in allen Fällen der direkte Zusammenhang mit der Ausbildung einer Hypertrophie unklar ist (Lowes B.D. et al. (1997) J Clin. Invest. 100, S. 2315-2324; Shubeita H.E. et al. (1990) JBC 265, 33, S. 20555-62; Iwaki K et al. (1990) JBC 265, 23, S. 13809-17; Donath et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 9\, S>. 1686-1690).
Die erhöhte Expression von Komponenten des kontraktilen Apparates trägt wesentlich zum Anstieg der Gesamtprotein-Syntheserate bei, die in einer meßbaren Volumenzunahme der Herzmuskelzellen resultiert. Sie wird als weiterer Indikator für die Hypertrophie herangezogen und entweder als Oberflächenzunahme nach Fixierung und Färbung der Zellen gemessen oder durch die Bestimmung des Verhältnisses der Längen- und Breitenveränderung der Zellen bewertet (US 5,837,241 ; Wollert K.C. (1996) JBC 271 , 16, S. 9535-45). Keines der beschriebenen Verfahren ist geeignet, die humane in vivo Situation in vitro nachzubilden, da die eindeutige Korrelation zwischen der erhöhten Expressionsrate einzelner Gene und der Hypertrophie von Herzmuskelzellen nicht geklärt ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine krankhaft veränderte Herzmuskelzelle zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe die molekularen Veränderungen, die zu Herzerkrankungen in vivo führen, untersucht und mit deren Hilfe Substanzen auf ihre Wirksamkeit für Prophylaxe und Therapie von Herzpatienten aufgefunden werden können.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Stimulation von neonata- len Ratten-Kardiomyozyten mit Hormonen, Hormonanaloga und/oder Zytokinen in Zellkultur im Vergleich zu unstimulierten Kardiomyozyten zu einer veränder- ten Lokalisation mindestens eines Signalmoleküls im Sarkomer der Herzmuskelzelle führt. Das Gen des Signalmoleküls wurde aus einer cDNA-Bank des menschlichen Herzgewebes isoliert, und es konnte gezeigt werden, daß dieses Gen in insuffizientem Herzgewebe stärker exprimiert wird als in gesundem Herzgewebe, weshalb ein kausaler Zusammenhang dieser Genexpression mit der be- obachteten Herzinsuffizienz naheliegend war. Aufgrund seiner Assoziation mit Herzerkrankungen, die mit einer Hypertrophie der Herzmuskelzellen einhergehen, insbesondere der Dilatativen Kardiomyophathie (DCM) wird das Genprodukt des Signalmoleküls als DCMAG-1 Protein bezeichnet. Seine Aminosäuresequenz ist in der SEQ ID NO: 1 dargestellt. Bei Stimulation einer isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine läßt sich das DCMAG-1 Genprodukt spezifisch im Sarkomer der Herzmuskelzellen nachweisen, während es in der unstimulierten Herzmuskelzelle gleichmäßig im Zytoplas- ma verteilt vorliegt. Diese unterschiedliche subzelluläre Lokalisation des DCMAG-1 Genprodukts ist auch in Herzbiopsien von DCM-Patienten im Ver- gleich zu gesunden Menschen nachweisbar. Des weiteren konnte dieselbe Ver- schiebung der Lokalisation des DCMAG-1 Genprodukts in einer durch erhöhte Kontraktionsgeschwindigkeit induzierten DCM im Tierversuch ausgelöst werden.
Im erkrankten Herzen kann daher die zunehmende Assoziation des DCMAG-1 Genprodukts mit der Z-Bande als Maßstab für die Progression des Krankheitsverlaufs verwendet werden. Diese, mit einer Umorganisation der Z-Bande im Verlauf von Herzerkrankungen einhergehende Lokalisationsverschiebung des DCMAG-1 Genprodukts ist deshalb so überraschend, weil die Struktur der Z- Bande bislang als statisch angesehen und daher wenig beachtet wurde (Alexander R.W. et al. (1997) in Hurst's "The Heart", 9. Edit., McGraw Hill, S. 74). Ferner wurde bisher nur eine Umorganisation der kompletten Sarkomere von einer parallelen in eine serielle Anordnung wahrgenommen, so daß eine Verbindung zwischen einer Verschiebung der Lokalisation bestimmter, im erkrankten Herzen verstärkt exprimierter Genprodukte und Herzerkrankungen wie der DCM nicht vermutet werden konnte.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher eine krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, herstellbar aus gesundem Herzgewebe und/oder mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle nach einem Verfahren, enthaltend die Schritte: (a) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle; (b) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine.
Unter den Begriffen "gesundes Herzgewebe bzw. gesunde Herzmuskelzelle" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Herzgewebe bzw. daraus isolierte Zellen, die klinisch unauffällig sind. Die Herzmuskelzellen wurden aus Biopsie- material isoliert, deren Spender keine Anzeichen einer chronischen Herzinsuffizienz, einhergehend mit Hypertrophie der Herzmuskelzellen zeigte. Des weiteren kann eine gesunde Herzmuskelzelle durch in vitro Differenzierung aus Stamm- zellen gewonnen werden. Derartige Verfahren sind beispielsweise durch Kolossov E. et al. (1998) J Cell Biol 28; 143(7), S. 2045-2056 beschrieben.
Demzufolge ist unter dem Begriff "krankhaft veränderte Herzmuskelzelle" im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Herzmuskelzelle zu verstehen, die aus Biopsiematerial eines herzkranken, beispielsweise insuffizienten Patienten isoliert wurde. Ferner wird unter diesem Begriff eine gemäß der Erfindung stimulierte Herzmuskelzelle verstanden, die histopathologisch das Erscheinungsbild einer solchen krankhaften Herzmuskelzelle besitzt. Dies kann durch in vitro Stimulation der Herzmuskelzellen erreicht werden, die dadurch eine Verschiebung der Lokalisation bestimmter Signalmoleküle vom Zytoplasma in das Sarkomer, beispielsweise in die M-Linie oder in die Z-Bande, zeigen. Diese Verschiebung gleicht jener, die in Herzmuskelzellen erkennbar ist, die aus Herzen insuffizienter Patienten gewonnen wurden.
Dementsprechend wird unter dem Begriff "Signalmolekül" im Sinne der vorliegenden Erfindung ein zelluläres, insbesondere in Herzmuskelzellen vorkommendes, endogenes Molekül bzw. Protein verstanden, das nach Hormon, Hormonanaloga und/oder Zytokinstimulation seine Lokalisation innerhalb der Herzmus- kelzelle im Vergleich zur gesunden Ausgangszelle verändert. Dabei wird unter "Signalmolekül" insbesondere ein Protein des Sarkomers von Herzmuskelzellen verstanden.
Unter dem Begriff "geeignete" Hormone werden im Sinne der vorliegenden Er- fϊndung insbesondere die Hormone Adrenalin, Noradrenalin einschließlich deren Derivate sowie ET-1, ET-2, ET-3, Angiotensin I und II, Insulin (IN), IGF-1 und Myotrophin verstanden. Als "geeignete" Hormonanaloga finden bevorzugt Ka- techolamin-Derivate wie beispielsweise Isoproterenol (ISO) und Phenylephrin (PE) Verwendung. Unter "geeigneten" Zytokinen werden im Sinne der vorliegen- den Erfindung besonders LIF, Cardiotrophin-1 (CT-1), Interleukin-6 und -11 (IL- 6 und -1 1), Oncostatin M und der Ciliary Neurotrophic Factor verstanden. Das gesunde Ausgangsmaterial für die Herstellung der krankhaft veränderten Herzmuskelzelle kann von Vögeln, insbesondere von Hühnern, oder von Säugetieren stammen. Bei den Säugetieren sind menschliches Herzgewebe sowie Herz- gewebe von Kaninchen und Nagetieren, hierbei insbesondere von Ratten besonders bevorzugt.
Die Stimulation der Herzmuskelzelle erfolgt mit den beschriebenen Hormonen, Hormonanaloga und/oder Zytokinen im wesentlichen gleichzeitig. So können ver- schiedene Stimulanzien miteinander gemischt werden, wodurch ihre Verwendung absolut gleichzeitig erfolgt. Ebenfalls unter "im wesentlichen gleichzeitiger" Stimulation ist die unmittelbar nacheinander erfolgende Anwendung der verschiedenen Stimulanzien zu verstehen.
Die Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine wirken über zumindest teilweise unterschiedliche, bereits unter (i) bis (iv) beschriebene Signaltransduktions- Kaskaden, insbesondere über verschiedene Rezeptoren auf bzw. in der Herzmuskelzelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wirken die genannten Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine aktivierend auf Signaltransduktions- Kaskaden, jedoch nicht über Rezeptoren, sondern direkt auf, den Rezeptoren nachgeordnete Kaskaden. Eine solche Stimulation kann beispielsweise durch Phorbolester wie Phorbolmyristatacetat (PMA) erfolgen. So ist bekannt, daß Phorbolester die Proteinkinase C (PKC) direkt binden kann und hierfür keinen Rezeptor benötigt. Durch die direkte Interaktion wird die Kinaseaktivität von PKC, vor allem der konventionellen PKC-Isoformen α, ßl, ßLT und γ aktiviert. Die Wechselwirkung zwischen Phorbolester und PKC ist sehr sensitiv und kann bereits mit 1 nM Phorbolester zu signifikanter PKC-Stimulation fuhren (Gschwendt et al. (1991) TIBS, 16, S. 167). Die Stimulation von PKC durch Phorbolester führt ebenso wie die Rezeptor-vermittelte Stimulation von PKC zu erhöhter Gentranskription, Proteinbiosynthese und Zellwachstum.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her- Stellung der erfindungsgemäßen Herzmuskelzelle aus gesundem Herzgewebe und/oder mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält:
(i) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle; (ii) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine; und gegebenenfalls
(iii) Nachweis der mindestens einen krankhaft veränderten Herzmuskelzelle durch Bestimmen der Lokalisation mindestens eines Signalmoleküls, vorzugsweise mindestens eines Proteins im Sarkomer.
Der Nachweis der Lokalisation des Signalmoleküls, welches bevorzugt ein Protein ist, wird bevorzugt auf Einzelzellebene durchgeführt. Unter dem Begriff "Einzelzellebene" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise die mikroskopische Untersuchung einer einzelnen Zelle bezüglich spezifischer Eigen- schaffen verstanden. Hierbei können morphologische Merkmale der Zelle wie ihre Größe oder ihre Form zur Charakterisierung beitragen. Eine besonders bevorzugte Methode, um Signalmoleküle, insbesondere Proteine auf Einzelzellebene zu untersuchen, ist der mikroskopische Nachweis mit Hilfe der Immunfluoreszenz. Bei dieser Methode werden Proteine durch Ko-Lokalisation mit bekannten Proteinen innerhalb ihrer zellulären Struktur nachgewiesen. Femer wird unter diesem Begriff die elektronenmikroskopische Untersuchung subzellulärer Strukturen, wie beispielsweise Sarkomere, verstanden. So läßt sich beispielsweise die Assoziation eines Sarkomerproteins mit bekannten Z-Bandenproteinen wie α-Actinin nach Stimulation als Bestandteil der Z-Bande mit Hilfe der Immunfluoreszenz identifizieren. Das DCMAG-1 Genprodukt ist besonders geeignet, da in vitro und in vivo gezeigt werden konnte, daß es in un- stimulierten bzw. gesunden Herzmuskelzellen gleichmäßig im Zytoplasma verteilt vorliegt, während es in stimulierten bzw. krankhaften Herzmuskelzellen zusammen mit α-Actinin in der Z-Bande ko-lokalisiert. In vitro kann man allerdings neben der Z-Banden Lokalisation auch eine Färbung der M-Linie beobachten. Das DCMAG-1 Genprodukt läßt sich beispielsweise über einen spezifischen Antikör- per markieren und über anschließende Immunfluoreszenz mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, nachweisen. Eine weitere immunologische Nachweismethode zur Ko-Lokalisation von Proteinen auf Einzelzellebene ist die ebenfalls dem Fachmann bekannte Immunelektronenmikroskopie.
Femer konnte in bezug auf die Ratten-Herzmuskelzellen gezeigt werden, daß die Stimulation durch Phorbolester eine Verschiebung des DCMAG-1 Genprodukts in die Mitte der M-Linie des Sarkomers bewirkt.
Des weiteren können zum Nachweis von Proteinen auf Einzelzellebene Fusions- proteine zwischen beispielsweise dem DCMAG-1 Genprodukt und einem Mar- kerprotein verwendet werden. Beispiele solcher Markerproteine sind prokaryoti- sche Peptidsequenzen, die zum Beispiel aus der Galactosidase von E. coli abgeleitet sein können. Es können femer virale Peptidsequenzen, wie die des Bacterio- phagen Ml 3 verwendet werden, um auf diese Weise Fusionsproteine für das dem Fachmann bekannte "Phage Display"-Verfahren zu erzeugen (Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol, 12, S. 433-455). Ebenfalls als Markerproteine geeignet sind die sogenannten Fluoreszenzproteine, die je nach Fluoreszenzfarbe als B-, C-, G-, R-, oder YFP (Blue, Cyano, Green, Red oder Yellow Fluorescent Protein) bezeichnet werden. Fluoreszenzfusionsproteine können beispielsweise über die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Methode auch zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf Einzelzellebene eingesetzt werden. Ein weiteres Nachweisverfahren für die Verschiebung der Lokalisation bestimmter Proteine auf Einzelzellebene ist die charakteristische Modifikation von Sarko- merproteinen, insbesondere M-Linien- oder von Z-Bandenproteinen. Hier können insbesondere postranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen an Serin-, Threonin- und/oder Tyrosin-Resten durch die Verwendung von spezifischen Antikörpern zum Nachweis herangezogen werden. Beispielsweise kann eine Phos- phorylierung und/oder Dephosphorylierung des DCMAG-1 Genprodukts an bestimmten Serin-, Threonin- und/oder Tyrosin-Resten für die Assoziation und Bin- düng an Z-Bandenproteine verantwortlich sein.
Ein Vergleich der Proteinsequenz des DCMAG-1 Genprodukts mit einer Protein- Datenbank ergab eine gewisse Sequenzhomologie mit dem Protein Tropomodulin. Tropomodulin ist als Protein bekannt, das in Hühner-Kardiomyozyten Einfluß auf die Ausbildung der Myofibrillen und der Kontraktionsfähigkeit der Zellen besitzt (Gregorio et al. (1995) Nature 377, S. 83-86). Dieses Protein bindet zum einen an Tropomyosin und zum anderen an die Actin-Filamente, wird aber selbst nicht in seiner Aktivität reguliert. Das DCMAG-1 Genprodukt weist ebenso einige Strukturmerkmale des Tropomodulins auf, wie zum Beispiel eine Tropomyosin- Bindedomäne. Im Gegensatz zu Tropomodulin besitzt das DCMAG-1 Genprodukt zusätzliche Strukturmerkmale, die auf eine Regulation der Aktivität des Proteins durch Tyrosinkinasen hinweisen.
Unter dem Begriff "funktionelle Variante" der Aminosäuresequenz des DCMAG- 1 Genprodukts im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Proteine, die funktionell mit dem erfindungsgemäßen Protein verwandt sind, d.h. ebenso als regulierbarer Modulator der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen bezeichnet werden können, in quergestreifter Muskulatur, vorzugsweise im Herzmuskel und dort insbesondere in Herzmuskelzellen exprimiert werden, Struktur- merkmale des Tropomodulins aufweisen, wie zum Beispiel eine oder mehrere Tropomyosin-Bindedomänen und/oder deren Aktivität durch Tyrosinkinasen reguliert werden können.
Beispiele "funktioneller Varianten" sind die entsprechenden Proteine, die aus an- deren Organismen als dem Menschen, vorzugsweise aus nicht-menschlichen Säugern stammen.
Im weiteren Sinn versteht man darunter auch Proteine mit einer Sequenzhomologie, insbesondere einer Sequenzidentität von ca. 50%, vorzugsweise von ca. 60%, insbesondere von ca. 70% zu dem DCMAG-1 Genprodukt mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 haben. Dazu zählen beispielsweise Polypeptide, die von einer Nukleinsäure kodiert werden, die aus nicht-herzspezifischem Gewebe, zum Beispiel Skelettmuskelgewebe isoliert wird, jedoch nach Expression in einer herzspezifischen Zelle die bezeichneten Funktionen besitzen. Femer zählen hierzu auch Deletionen des Polypeptides im Bereich von ca. 1-60, vorzugsweise von ca. 1-30, insbesondere von ca. 1-15, vor allem von ca. 1-5 Aminosäuren. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die das oben beschriebene Protein enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion eines regulierbaren Modulators der Kontraktionsfähigkeit von Herzmuskelzellen haben oder erst nach Ab- Spaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können.
Vor allem zählen zu "funktioneilen Varianten" auch Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht-herzspezifischen Sequenzen von ca. 1-200, vorzugsweise ca. 1-150, insbesondere ca. 1-100, vor allem ca. 1-50 Aminosäuren. Beispiele von nicht-herzspezifischen Proteinsequenzen sind prokaryotische Proteinsequenzen, die zum Beispiel aus der Galactosidase von E. coli oder von der DNA-Bindedomäne eines Transkriptionsfaktors für den Einsatz im unten beschriebenen "Two-Hybrid"-System abgeleitet sein können. Als weiteres Beispiel für nicht-herzspezifische Proteinsequenzen sind virale Peptidsequenzen für den Einsatz im bereits genannten "Phage-Display"-V erfahren zu nennen. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäße Protein kodiert, ist im allgemeinen eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine DNA. Für die Expression des betreffenden Gens ist im allgemeinen eine doppel strängige DNA bevorzugt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte enthält: (i) Bereitstellen oder Isolieren mindestens einer Herzmuskelzelle; (ii) In-Kontakt-bringen der Herzmuskelzelle mit einer oder mehreren Prüfsubstanzen; und (iii) Nachweis oder Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen durch Bestimmung der Lokalisation mindestens eines Signalmoleküls, vorzugsweise mindestens eines Proteins im Sarkomer.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Herzmuskelzelle verwendet, die durch Stimulation mit geeigneten Hormonen, Hormonanaloga und/oder Zytokinen das klinische Bild einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle zeigt.
Unter dem Begriff "Prüfsubstanzen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle diejenigen Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Stoffgemische zu verstehen, die mit der erfindungsgemäßen Herzmuskelzelle unter geeigneten Bedingungen in Wechselwirkung treten können. Mögliche Prüfsub- stanzen sind niedermolekulare, organische oder anorganische Moleküle oder Verbindungen, vorzugsweise Moleküle oder Verbindungen mit einer relativen Molmasse bis ca. 1.000, insbesondere von ca. 500. Femer können Prüfsubstanzen ex- primierbare Nukleinsäuren sein, die durch Infektion oder Transfektion mittels bekannter Vektoren und/oder Verfahren in die Herzmuskelzelle gebracht werden. Geeignete Vekoren sind beispielsweise virale Vektoren, insbesondere Adenovirus, oder nicht-virale Vektoren, insbesondere Liposomen. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel die Kalziumphosphat-Trans fektion oder die Elektroporation. Unter dem Begriff "exprimierbare Nukleinsäure" wird eine Nukleinsäure verstanden, die zum einen aus einem offenen Leserahmen besteht und zum anderen cis-aktive Sequenzen enthält, beispielsweise einen Promotor oder ein Polyadenylierungs- signal, die eine Transkription der Nukleinsäure und eine Translation des Transkripts gewährleisten.
Prüfsubstanzen können weiterhin auch natürliche und synthetische Peptide, bei- spielsweise Peptide mit einer relativen Molmasse bis ca. 1.000, insbesondere bis ca. 500, sowie Proteine, beispielsweise Proteine mit einer relativen Molmasse von größer als ca. 1.000, insbesondere größer als ca. 10.000, oder Komplexe davon umfassen. Dabei können die Peptide durch ausgewählte oder zufällige Nukleinsäuren kodiert werden, die vorzugsweise aus Genbanken bzw. Nukleinsäure- Bibliotheken stammen, wobei die Peptide durch natürliche oder künstliche Expression der Sequenzen erhalten werden. Ebenfalls unter diesen Begriff fallen Kinase-Inhibitoren, Phosphatase-Inhibitoren und deren Derivate. Die Prüfsubstanzen können aufgrund ihrer Wechselwirkung die Lokalisationverschiebung des DCMAG-1 Genproduktes nach Stimulation entweder reduzieren/verhindern oder begünstigen/bewirken.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle, vorzugsweise einer erfmdungsgemäßen, krankhaft veränderten Herzmuskelzelle zum Nachweis oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen.
Ein geeignetes Testsystem zur Identifizierung von Prüfsubstanzen basiert auf der Identifikation funktioneller Interaktionen mit dem sogenannten "Two-Hybrid"- System" (Fields und Sternglanz, (1994), TIGS 10, S. 286-292; Colas und Brent, (1998) TIBTECH 16, S. 355-363). Bei diesem Test werden Zellen mit Expressionsvektoren transformiert, die Fusionsproteine aus dem DCMAG-1 Genprodukt und einer DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors wie beispielsweise Gal4 oder LexA exprimieren. Die transformierten Zellen enthalten außerdem ein Reportergen, dessen Promotor Bindungsstellen für die entsprechende DNA Bindungsdomäne tragen. Durch Transformation eines weiteren Expressionsvektors, der ein zweites Fusionsprotein aus einem bekannten bzw. unbekannten Polypeptid mit einer Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Gal4 oder Herpes Virus VP16, exprimiert, kann die Expression des Reportergens stark gesteigert werden, wenn das zweite Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid funktioneil interagiert. Diese Expressionssteigerung kann man ausnutzen, um neue Interakto- ren zu identifizieren, beispielsweise indem man zur Konstruktion des zweiten Fusionsproteins eine cDNA-Bibliothek herstellt, die für interessierende Interaktoren kodiert.
Zudem läßt sich dieses Testsystem zum Screening von Substanzen ausnutzen, die eine Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem funktio- nellen Interaktor inhibieren. Solche Substanzen verringern die Expression des Reportergens in Zellen, die Fusionsproteine des erfindungsgemäßen Polypeptids und des Interaktors exprimieren (Vidal und Endoh, (1999), TIBS 17, S. 374-81). So lassen sich schnell neue herzaktive Substanzen, die sowohl toxisch als auch pharmazeutisch wirksam sein können, identifizieren oder nachweisen.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beschreibung der Figuren
SEQ ID NO: 1 zeigt die Aminosäuresequenz des DCMAG-1 Proteins. Fig. 1 zeigt eine Immunfluoreszenz von unstimulierten neonatalen Ratten-Kardio- myozyten, die mit einem polyklonalen anti-DCMAG-1 -Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten sekundären Antikö er gefärbt wurden.
Fig. 2 zeigt eine Immunfluoreszenz von ET-1/ISO/LIF-stimulierten neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, die mit einem polyklonalen anti-DCMAG-1 -Antikörper sowie einem Cy3-gekoppelten sekundären Antikörper gefärbt wurden.
Beispiele
1. Lokaiisation des DCMAG-1 im esunden und kranken humanen Myokard
Menschliches Herzgewebe wurde von zur Transplantation nicht geeigneten Spenderherzen und explantierten kranken Patientenherzen (DCM) sofort nach Explantation bei -80°C tiefgefroren. Von 5 verschiedenen DCM-Herzen und 5 verschie- denen gesunden Spenderherzen wurden Kryostatschnitte mit einer Schichtdicke von 4 μm angefertigt. Die histologischen Schnitte wurden mit 3% Paraformalde- hyd-Lösung fixiert und anschließend mit monoklonalen Antikörpern gegen α- Actinin bzw. mit polyklonalen anti-DCMAG-1 Antikörpern inkubiert, wobei die Inkubation mit Antikörpern im folgenden als (Antikörper)-Färbung bezeichnet wird (wie unter Beispiel 3 beschrieben). Die Auswertung wurde im Fluoreszens- mikroskop durchgeführt (Axiovert 100S, Cy3 -Filtersatz, Zeiss, Göttingen).
Die α-Actinin-Färbung des gesunden wie des DCM-Herzens zeigt ein zum Verlauf der Myofibrillen quergestreiftes, für ein Z-Banden-Protein typisches Muster mit scharfen Streifen. Während die DCMAG-1 -Färbung des gesunden Herzens eine gleichmäßige, diffuse Anfärbung des Sarcoplasmas aufweist, ist für das DCM-Herz ein quergestreiftes Muster zu erkennen, das mit der Färbung für α- Actinin korreliert. Dies zeigt, daß beim Vergleich von gesundem und DCM- Herzen das DCMAG-1 Protein seine intrazelluläre Lokaiisation verändert und vom Sarcoplasma in die Z-Bande wandert, so daß ein molekularer Umbau der Z- Bande im Zusammenhang mit dem Krankheitsbild DCM erfolgt.
2. Erzeugung einer herzschrittmacher-induzierten Herzinsuffizienz im Kaninchen
Chinchilla Bastard Kaninchen (2,5 - 3 kg) wurden unter normalen Stallbedingungen gehalten und durften Trinken und Fressen ad libitum. Für die Schrittmacherimplantation wurden die Versuchstiere mit Medetomidine (lOμg/kg) vorinjiziert und anschließend mit Propofol (5mg/kg/Std.) narkotisiert. Zur Analgesie wurde Fentanyl (lOμg/kg) intravenös appliziert. Die Kaninchen wurden kontrolliert beatmet, und der Blutdruck, das EKG sowie die Blutoxygenierung wurden kontinuierlich überwacht. Unter sterilen Operationsbedingungen wurde über die Vena jugularis extema dextra eine 2 Fr Schrittmachersonde (Medtronic, Unterschleiß- heim) ins rechtsventrikuläre Cavum vorgeschoben und verankert. Anschließend wurde die Schrittmachersonde subcutan über eine Kanüle zu einer vorgefertigten laterodorsalen Unterhauttasche verlagert und dort mit dem Herzschrittmacheraggregat (Diamond II, Vitatron, Leiden, Holland, mit benutzerdefinierter Software) konnektiert. Die Hautschnitte wurden mit chirurgischem Nahtmaterial ver- schlössen. Eine Woche nach Schrittmacherimplantation wurde die kardiale Stimulation mit 320 Herzschlägen/min begonnen. Wöchentlich wurde die Schrittmacherfrequenz um 20 Schläge/min erhöht. Zusätzlich wurde zur Kontrolle der Herzinsuffizienzentwicklung echokardiographisch die linksventrikuläre Verkürzungsfraktion gemessen. Nach dreiwöchigem kontrollierten Pacing wurden die Ver- suchstiere geopfert und die Herzen für die histologische Untersuchung im Kryostat geschnitten (Schichtdicke 4μm). Die histologischen Herzschnitte wurden mit 3 % Paraformaldehyd fixiert. Die Antikörperfärbungen (α-Actinin und DCMAG-1) erfolgte wie unter Beispiel 3 beschrieben. Die Auswertung wurde im Fluoreszensmikroskop durchgeführt.
Vergleicht man die subzelluläre Lokaiisation von DCMAG-1 anhand von histologischen Herzschnitten, so weist das Kontrollkaninchen eine diffuse, sarkoplasma- tische Färbung auf, wohingegen beim Kaninchen mit der induzierten Herzinsuffizienz eine deutliche Querstreifung der Muskelzellen erkennbar ist. Diese Querstreifung zeigt sich ebenso bei einer α-Actinin-Färbung, so daß auch in diesem Tiermodell DCMAG-1 in dem herzinsuffϊzienten Herzen mit den Z-Banden assoziiert.
Dieses Experiment wurde an drei verschiedenen Versuchs- und Kontrolltieren durchgeführt. Alle Tiere zeigten sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Herzinsuffizienzgruppe jeweils identische Lokalisationsmuster.
3. Gewinnung von neonatalen Ratten-Kardiomvozvten
Zur Durchführung eines Hypertrophie-Experiments wurden primäre Kardiomyo- zyten aus neonatalen Ratten isoliert. Die Ratten hatten ein Alter von ein bis sieben Tagen und wurden durch zervikale Dislokation getötet. Zur Isolation der Kar- diomyozyten wurden die Ventrikel der kontrahierenden Herzen entnommen und mittels des „Neonatal Cardiomyocyte Isolation System"s (Worthington Bioche- micals Corporation, Lakewood, New Jersey) vereinzelt. Die Ventrikel wurden hierzu zweimal mit „Hank's Balanced Salt Solution" ohne Kalzium und Magnesi- um (CMF HBBS) gewaschen, mit einem Skalpell zerkleinert bis sie eine Größe von etwa 1 mm3 aufwiesen und über Nacht einer kalten Trypsin-Behandlung (2 - 10 °C) unterzogen. Am nächsten Tag wurde die Trypsin-Behandlung durch Zugabe eines Trypsin-Inhibitors gestoppt und anschließend eine Kollagenase- Behandlung für 45 Minuten bei 37 °C durchgeführt. Die Zellen wurden durch Pipettieren vereinzelt, durch einen „Cellstrainer" (70 μm) gegeben und zweimal für 5 min. bei 60 x g zentrifugiert. Das Zellsediment wurde darauf in 20 ml herkömmlichem Anheftungsmedium aufgenommen. Die Aussaat erfolgte in einer Dichte von 6 x 104 Zellen/cm2 auf Gelatine-beschichteten (Sigma. Deisenhofen) Gewebekulturschalen bzw. Deckgläschen. Am nächsten Morgen wurde das Medium abgesaugt und nach zweimaligen Waschen mit DMEM (herkömmliches Zellkultur-Medium) durch Kultivierungsmedium ersetzt.
Anheftungsmedium: DMEM/M-199 (4/1); 10 % Pferdeserum; 5 % Fötales Kälberserum; 1 mM Natrium-Pyruvat; Penizillin, Streptomyzin, Amphoterizin B Kultivierungsmedium: DMEM/M-199 (4/1); 1 mM Natrium-Pyruvat
4. Stimulation von isolierten neonatalen Kardiomvozvten
Die Stimulation der Zellen erfolgte zwei bis sechs Stunden nach dem Mediumwechsel. Hierzu wurden die Kardiomyozyten mit verschiedenen Stimulanzien oder Kombinationen von Stimulanzien (siehe Tabelle 1) für 48 Stunden behandelt und anschließend analysiert. Der Verlauf der Einmal-Stimulation konnte dabei anhand der morphologischen Veränderungen der Zellen (Hypertrophie) beobachtet werden. Neben den morphologischen Veränderungen dienten auch Immunfluoreszenzanalysen zur Bestimmung von Hypertrophie-Parametern (DCMAG-1 Re- krutierung).
5. Immunfluoreszenzanalvse von stimulierten, neonatalen Kardiomvozvten
Zur Immunfluoreszenzanalyse wurden die stimulierten Kardiomyozyten zweimal mit kaltem PBS gewaschen und für 20 Minuten mit 3% Paraformaldehyd-Lösung in PBS fixiert. Nach nochmaligem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen zweimal mit 100 mM Ammoniumchlorid in PBS, jeweils für 10 min. bei Raumtemperatur, inkubiert. Es folgten ein weiterer Waschschritt mit kaltem PBS und eine Inkubation mit 0,2 % Triton-X 100 in PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Nach zweimaligem Waschen mit 0,1 % Gelatine in PBS folgte die Inkubation mit dem ersten Antikörper bei 37 °C in einer dem Fachmann bekannten „feuchten Kammer". Der Erstantikörper (gegen die zweite Domäne von DCMAG-1) wurde 1/500 in Inkubationslösung (0,5 % Tween-20; 0,5 % BSA; in PBS) verdünnt. Nach einer Stunde folgten drei Waschschritte mit PBS für jeweils 5 min. bei Raumtemperatur. Der Zweitantikörper (aus Ziege gewonnen, gegen Kaninchen gerichtet, Cy3-gekoppelt; Dianova, Hamburg) wurde 1/200 in Inkubationslösung verdünnt und ebenfalls für eine Stunde bei 37 °C mit den fixierten Zellen inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten mit PBS für jeweils 5 min. bei Raumtemperatur und einem kurzen Eintauchen in entsalztes Wasser wurden die Präparate mit Histosafe (Linaris, Wertheim-Bettingen) überschichtet und auf Objektträ- ger aufgebracht. Die Auswertung erfolgte mikroskopisch (Axiovert 100S, Cy3- Filtersatz, Zeiss, Göttingen).
Unstimulierte Kardiomyozyten zeigen eine diffuse, sarkoplasmatische Färbung für DCMAG-1 (Fig. 1). Ebenso ist das DCMAG-1 für mit PE oder LIF einfach- stimulierte Zellen gleichmäßig über das Sarkoplasma verteilt, allerdings zeigen die LIF-stimulierten Zellen eine langgezogene Form. ET-1 stimulierte Zellen zeigen DCMAG-1 in Filament-artigen Strukturen. Mit ET-1 und PE zweifachstimulierte Zellen zeigen ein schwaches sarkoplasmatisches Muster, wohingegen mit ET-1, ISO und LIF dreifach-stimulierte Zellen ein deutlich sichtbares, ge- streiftes Muster aufweisen (Fig. 2).
Für die quantitative Auswertung dieser Stimulationsexperimente wurde somit die Rekrutierung von DCMAG-1 in das Sarkom er gemessen und wie folgt kategori- siert: (-) weniger als 2 Zellen pro Deckglas
(+) 2 bis 5 Zellen pro Deckglas
(++) ca. 10 % der gesamten Zellen
(+++) mehr als 10 % der gesamten Zellen Tabelle 1
Anmerkung zu Tabelle 1: einfache Dosierung: PE:100 μM; LIF: 1 ng/ml; ET-1: 10 nM; ISO: 10 μM; IN: 100 nM
Die Ergebnisse der Stimulationsexperimente, die in Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß eine einfache Stimulation nahezu keine Rekrutierung von DCMAG-1 in das Sarkomer bewirkt. Lediglich hohe Konzentrationen von ISO erzielen einen geringen Effekt (siehe 1. Spalte). Bei einer Stimulation mit zwei Stimulanzien führt insbesondere die Kombination aus ET-1 und PE zu einer gewissen Rekrutierung von DCMAG-1 in das Sarkomer. Andere Kombinationen von zwei Stimulanzien zeigen keinen oder nur einen geringen Effekt (siehe 2. Spalte). Die größte Rekrutierung von DCMAG-1 in das Sarkomer wird durch die dreifache Stimulation mit ET-1, LIF und ISO erreicht. In allen Stimulationsexperimenten, die eine Rekrutierung von DCMAG-1 in das Sarkomer zeigten, konnte die Lokaiisation von DCMAG-1 in der Z-Bande als auch in der M-Linie beob- achtet werden.
6. Stimulation von isolierten neonatalen Kardiomvozvten durch Phorbolester
Neben den oben aufgeführten Rezeptor-Stimulanzien wurde überraschenderweise weiterhin festgestellt, daß auch die Inkubation von neonatalen Rattenkardiomyo- zyten mit dem PKC-Aktivator Phorbol-myristate-12,13 actetate (PMA, Sigma) zur Translokation von DCMAG-1 vom Sarkoplasma zu Sarkomerstrukturen bewirkt. In diesen Experimenten wurden die Kardiomyozyten wie oben beschrieben präpariert und auf Deckgläsern ausgesät. Die Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von PMA wurde über 48 Stunden durchgeführt, die Zellen wurden fixiert, wie oben beschrieben angefärbt und bezüglich einer DCMAG-1- Translokation untersucht. Die Zellen wurden optisch klassifiziert und gezählt. Die Zählung von 6 unabhängigen Experimenten (± SEM) ergab folgende Daten für die Lokaiisation von DCMAG-1:
Tabelle 2
Die in Tabelle 2 aufgeführten Daten zeigen, daß bereits mit der sehr geringen Menge von 1 nM PMA das DCM AG- 1 Protein ins Sarkomer transloziert. Darüber hinaus zeigen mehr Zellen DCMAG-1 im Sarkomer nach PMA-Stimulation als nach der Dreifachstimulation mit LIF/ISO/ET-1.
7. Lokaiisation von DCMAG-1 nach PMA- oder Dreifachstimulation
Nachdem PMA ebenso eine Translokation von DCMAG-1 in die Sarkom ere bewirkt wie die Aktivierung von drei Signaltransduktionswegen über deren Rezeptoren, wurde untersucht, in welche sarkomerischen Strukturen DCMAG-1 bei der PMA- bzw. Dreifachstimulation translozierte. Hierzu wurden Ko-Lokalisations- versuche durchgeführt. Rattenkardiomyozyten wurden wie oben beschrieben auf Deckgläschen ausgesät, entsprechend stimuliert, fixiert und angefärbt. Bei den Färbungen wurde anti-DCMAG-1 Antikörper (polyklonal) mit entweder mono- klonalem α-Actinin (Sigma, 1 :500) oder monoklonalem anti-Myosin (heavy chain, MHC, Sigma, 1 :500) gemischt. Als Sekundärantikörper wurden FITC-anti- mouse (1 :250) und Texas Red-anti-rabbit (1 :50; beide von Dianova) verwendet. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops, einer Fuji-CCD Kamera und Aida Software oder mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops (Pascal von Zeiss) und LSM Software (Zeiss). Dabei zeigte sich, daß die Dreifachstimu- lation mit ET-1/LEF/ISO für die DCMAG-1 Färbung ein Muster aus Punkten bzw. Streifen ergab, bei dem DCMAG-1 perlschnurartig entlang der Sarkomere aufgereiht ist. Im Vergleich zu der Actinin-Färbung, die ebenfalls ein Muster aus Punkten bzw. Streifen zeigt, gibt es doppelt so viele Punkte/Streifen für DCMAG- 1 wie für Actinin, wobei jeder zweite Punkt/Streifen ko-lokalisiert. Da Actinin spezifisch die Z-Bande färbt, ist DCMAG-1 nach dieser Dreifachstimulation in der Z-Bande und in der M-Linie zu finden.
Die Stimulation der Kardiomyozyten mit PMA bewirkte hingegen ein verändertes Färbemuster. Die Doppelfärbung von α-Actinin und DCM AG- 1 führte zu abwechselnd roten und grünen Querstreifen, was bedeutet daß α-Actinin und DCMAG-1 in diesem Fall nicht ko-lokalisierten. Die Doppelfärbung von MHC und DCMAG-1 führte zu einem Bild, das sich als Abfolge einer schwarzen Linie, einer grünen Bande, einer gelben Linie, einer grünen Bande und abschließend nochmals einer schwarzen Linie beschreiben läßt. Derartige Einheiten waren perlenschnurartig angeordnet und durchzogen das Sarkoplasma. Dies zeigt, daß DCMAG-1 nach der PMA-Stimulation mit der M-Linie ko-lokalisiert und dabei jeweils in der Mitte der M-Linie zu finden ist. Somit transloziert DCMAG-1 nach Stimulation mit PMA in die M-Linie. (Auswertung mit konfokalem Mikroskop: Axiovert 100 und LSM 410 Software von Zeiss)
DCMAG-1 kann demnach, abhängig von dem einwirkenden Stimulanz in unterschiedlichen Strukturen im Sarkomer zu finden sein. 8. Messung der Wirkung von Inhibitoren auf die DCMAG-1 Translokation im Immunfluoreszenz Test in Kardiomvozvten aus der neonatalen Ratte
Neonatale Ratten-Kardiomyozyten wurden gemäß Beispiel 3 präpariert und in einer Dichte von lxlO5 Zellen pro 1,5 cm Well (Reaktionsraum in der Zellkultur- schale) ausgesät. Die Zellkulturschalen enthielten 1,5 cm Deckgläser (Schubert und Weiß), die mit 1% Gelatine-Lösung beschichtet waren. Die Zellen wurden nach 24 Stunden mit DMEM und anschließend in Maintenance Medium mit oder ohne Stimulus (LIF/ISO und ET-1, Konzentrationen wie oben für einfache Dosierung) für 48 Stunden inkubiert.
Um die Signaltransduktionswege zu bestimmen, die zur Translokation von DCMAG-1 benötigt werden, wurden die stimulierten Zellen mit Inhibitoren, nämlich 30 μM LY294002 (Sigma), 50 μM SB 203580 (Sigma), 15 nM Gö 6976 (Alexis) oder 50 μM PD98059 (NEB) für 48 h inkubiert (nach 24 h wurden Medi- um und Inhibitoren aufgrund der auf 24 h in wässriger Lösung beschränkten Aktivität der Inhibitoren, erneuert).
Nach 48 h wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd-Lösung fixiert, mit 0,2 % Triton-XIOO permeabilisiert und mit anti-DCMAG (polyklonal, eigene Herstel- lung, 1 :500) oder α-Actinin (als Kontrolle, Sigma, 1 :500) angefärbt und mit antiMaus oder anti-Rabbit Cy3 (Jackson Labs, USA) in der Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Um die Wirkung der Inhibitoren zu messen, wurden die Zellen optisch klassifiziert und gezählt.
Die Zählung von 6 unabhängigen Experimenten (± SEM) ergab folgende Daten für die Lokaiisation von DCMAG-1 : Tabelle 3
Kardiomyozyten % punktiertes Mu% filamentöses % in Z-Banden ster Muster unstimuhert 74,9 ± 7,2 23,6 + 6,2 0,1 ± 0,1 stimuliert 41,4 ± 4,2 38,4 ± 1,9 20,5 ± 3,8 stimuliert + LY 46,6 ± 5,3 42,1 ± 4,1 11,3 ± 2,0 stimuliert + PD 58,5 ± 10,7 31,6 ± 7,4 10,1 ± 3,4 stimuliert + Gö 29,0 ± 2,1 49,0 ± 0,0 22,0 ± 2,1 stimuliert + SB 22,5 ± 5.3 35,5 ± 0,3 41,0 ± 4,9 stimuliert + LY+PD 83,9 ± 7,2 15,7 ± 7,5 0,4 ± 0,2 stimuliert + LY+Gö 71,5 ± 0.4 28,0 ± 1,4 1,0 ± 0,7 stimuliert + LY+SB 65,0 ± 4,0 28,0 ± 4,0 6,0 ± 2,0 stimuliert + SB+PD 90,0 ± 5,6 9,3 ± 4,8 1,0 ± 0,7 stimuliert **= Stimulation mit LIF, ISO und ET-1 LY = Zugabe von LY294002 (Sigma) SB = Zugabe von SB 203580 (Sigma) Gö = Zugabe von Gö 6976 (Alexis) PD = Zugabe von PD98059 (NEB) Gesamtzahl aller gezählten Zellen = 5092;
Die Inhibitionsexperimente, zusammengefaßt in Tabelle 3, zeigen, daß verschie- dene Substanzen geeignet sind, die Translokation von DCMAG-1 in das Sarkomer zu vermindern (siehe letzte Spalte für LY, PD, Gö) bzw. Substanz- Kombinationen die Translokation nahezu vollständig zu verhindern (LY+PD, LY+Gö, SB+PD). Somit eignet sich dieses Testsystem dazu, Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen zu suchen, um die Translokation von DCMAG-1 in das Sarkomer zu vermindern bzw. zu verhindern.

Claims

Patentansprüche
1. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle, herstellbar aus gesundem Herzgewebe und/oder mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle nach einem i Verfahren enthaltend folgende Schritte:
(a) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle;
(b) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine.
2. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gesunde Herzgewebe von Vögeln, insbesondere von Hühnern, oder von Säugetieren, insbesondere von Menschen, Nagern, vorzugsweise Ratten, oder Kaninchen stammt.
3. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Herzmuskelzelle im wesentlichen gleichzeitig durch mindestens zwei, insbesondere drei verschiedene Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine stimuliert wird.
4. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine ausgewählt sind aus ET-1, ISO, PE und/oder LIF.
5. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen gleichzeitige Stimulation durch verschiedene Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine über zumindest teilweise unterschiedliche Ebenen der Signaltransduktions- Kaskaden der Zelle erfolgt.
6. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen gleichzeitige Stimulation über mindestens zwei, insbesondere mindestens drei Rezeptoren erfolgt, vorzugsweise über einen Gq-gekoppelten Rezeptor, insbesondere einen ET- 1 -Rezeptor, und/oder über einen ß-adrenergen Rezeptor, insbesondere einen durch ISO stimulierbaren Rezeptor, und/oder über einen Zyto- kin-Rezeptor, insbesondere einen LIF-Rezeptor (GP130).
7. Krankhaft veränderte Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen gleichzeitige Stimulation der Signaltransduktions-Kaskaden auf einer, der Rezeptorstimulation nachgeordneten Ebene, vorzugsweise durch Phorbolester, erfolgt.
8. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle aus gesundem Herzgewebe und/oder mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte enthält:
(i) Bereitstellen oder Isolieren von mindestens einer gesunden Herzmuskelzelle;
(ii) Stimulieren der isolierten Herzmuskelzelle durch geeignete Hormone, Hormonanaloga und/oder Zytokine; und gegebenenfalls (iii) Nachweis der mindestens einen krankhaft veränderten Herzmuskelzelle durch Bestimmen der Lokaiisation mindestens eines Signalmoleküls, vorzugsweise mindestens eines Proteins im Sarkomer.
Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lokaiisation des genannten Proteins gemäß Schritt (iii) auf Einzelzellebene erfolgt.
10. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lokaiisation des genannten Proteins gemäß Schritt (iii) in der Z-Bande und/oder in der M- Linie des Sarkomers bestimmt wird.
11. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein gemäß Schritt (iii) mit Strukturen des Sarkomers, insbesondere der M-Linie oder der Z-Bande assoziiert und zu charakteristischen Modifikationen von Sarkomerproteinen, insbesondere M-Linien- oder Z-
Bandenproteinen, vorzugsweise Tyrosin-, Serin- und oder Threonin- Phosphorylierungen führt.
12. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein gemäß Schritt (iii) Strukturmerkmale des Tropomodulins, insbesondere eine Tropomyosin-Bindedomäne aufweist.
13. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Protein gemäß Schritt (iii) die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine funktioneile Variante davon, insbesondere wenigstens eine Mutation und oder Deletion, aufweist.
14. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte funktioneile Variante eine Homologie zu SEQ ID NO: 1 von mindestens ca. 50 %, insbesondere von mindestens ca. 60 %, vor allem von mindestens ca. 70 % aufweist.
15. Verfahren zur Herstellung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine funktioneile Variante davon durch eine Nukleinsäure, vorzugsweise durch eine DNA oder RNA, besonders bevorzugt durch eine cDNA kodiert wird.
16. Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte enthält:
(i) Bereitstellen oder Isolieren mindestens einer Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7;
(ii) In-Kontakt-bringen der Herzmuskelzelle mit einer oder mehreren Prüfsubstanzen; und
(iii) Nachweis oder Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen durch Bestimmen der Lokaiisation mindestens eines Signalmoleküls, vorzugsweise mindestens eines Proteins im Sarkomer.
7 . Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Herzmuskelzelle eine krankhaft veränderte Herzmuskelzelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Prüfsubstanz eine pharmazeutisch wirksame Substanz ist.
19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Prüfsubstanz eine toxische Substanz ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Prüfsubstanz ein niedermolekulares, anorganisches oder organisches Molekül, eine exprimi erbare Nukleinsäure, vorzugsweise ein
Protein, ein natürliches oder synthetisches Peptid oder ein Komplex davon ist, das die Lokaiisation des Signalmoleküls in das Sarkomer, insbesondere in die M-Linie oder die Z-Bande vermindert und/oder im wesentlichen verhindert.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Prüfsubstanz ein niedermolekulares, anorganisches oder organisches Molekül, eine exprimierbare Nukleinsäure, vorzugsweise ein Protein, ein natürliches oder synthetisches Peptid oder ein Komplex davon ist, das die Lokaiisation des Signalmoleküls in das Sarkomer, insbesondere in die M-Linie oder die Z-Bande begünstigt und/oder im wesentlichen bewirkt.
22. Verwendung einer krankhaft veränderten Herzmuskelzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis oder zur Identifizierung einer oder mehrerer herzaktiver Substanzen.
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