CN115485388A - 药物有效成分的筛选方法、制造方法和设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供选择有用的药物化合物的新型的筛选技术。解决上述课题的本发明是具备以下的A工序、B工序和/或C工序、及D工序的药物的有效成分的筛选方法。[A工序]向动物(不包括人)给予候补物质的工序。[B工序]对经过前述A工序的前述动物中的未分化细胞进行观察的工序。[C工序]对经过前述A工序的前述动物中的分化细胞进行观察的工序。[D工序]选择与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞的量的候补物质、或者选择提高前述分化细胞的量或由前述分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为前述有效成分的工序。

Description

药物有效成分的筛选方法、制造方法和设计方法
技术领域
本发明涉及药物有效成分的筛选方法、药物的制造方法、药物的设计方法。
背景技术
成体干细胞(Adult stem cells)是在身体所有组织中发现的罕见的未分化细胞。通常保持静止的非分裂状态，但这些细胞可以增殖和分化以替代组织内的自然死亡的细胞、或在损伤时修复创伤。成体干细胞由于其增殖性和组织再生能力而不仅具有能够治疗衰老的潜力而且能够治疗各种退行性疾病(非专利文献1)。
例如已知心脏中存在具有分化为心脏系统的所有细胞的能力的心脏干细胞/心脏祖细胞(Cardiac stem cell，CSC)(非专利文献2)。
另外，研究了具有将细胞保持未分化状态的作用的转录因子SOX9的定位，结果报道了：对于SOX9，在肠道内在包含作为干细胞的Lgr5阳性细胞的隐窝(crypt)中表达，在胰腺中，表达仅限于胰管及作为其终端导管细胞的泡心细胞(centroacinar)中，在肝脏中，表达仅限于胆管细胞中(非专利文献3)。
在成熟的哺乳动物中，通常神经细胞不具有分裂能力。因此，一旦受到障碍，则障碍长期持续。特别是自古以来普遍认为脑、脊髓之类的中枢神经系统完全没有再生能力。据说中枢神经系统没有再生能力也是脊髓损伤等外源性的伤害所导致的瘫痪无法医治的原因之一。
另一方面，外周神经具有再生能力，即使一旦被切割后，轴突也会再生并恢复功能。然而，即使在这种情况下，再生所需的时间也会长达数月至1年以上的时间。因此，给患者的QOL改善带来很大负担。另外，由于神经的再生需要长时间，因此在此期间神经细胞经常会死亡而无法恢复功能。
近些年的研究表明，在成人脑中存在成体神经干细胞(adult neuralstemcells)，其负责神经发生。成体神经干细胞是具有结构可塑性特征的特异性的细胞亚群。哺乳动物中，神经发生存在于2个发芽区域。在整个生命过程中在SVZ和SGZ这2个发芽区域进行神经发生。迄今为止，已经发现了在成年海马体的神经发生的进展中以多个阶段策略表达的各种标记物。
存在于SGZ的放射性胶质样神经干细胞/祖细胞通常处于相对休眠状态，但可以被内部和外部刺激激活。这些细胞通过对称和不对称分裂构成了成神经细胞库。该库内的一部分细胞分化为未成熟的神经元(非专利文献4)。
神经细胞的再生诱导由于其医疗的重要性而被非常广泛地研究。在体外，以将体细胞重新返回到多能细胞的技术(诱导多能干细胞、iPS细胞)的开发为契机(专利文献1)，在全世界进行了使神经干细胞增殖的基因、化合物的探索和鉴定(例如专利文献2、专利文献3)。另外，与此同时，也进行了将神经干细胞、未分化的神经祖细胞分化诱导为成熟的神经细胞的基因、化合物的探索和鉴定(专利文献4)。
目前，通过将自患者采集的体细胞初始化而获得干细胞，通过自我复制使其扩增后，分化诱导为期望的细胞后再次移植至患者体内来治疗疾病的方法处于临床阶段(例如非专利文献5、非专利文献6、非专利文献7)。
另外，推测出中枢神经系统难以再生的原因在于中枢神经系统中存在阻碍神经伸长的物质。可期待：用抗体等抑制该存在于中枢神经系统中的神经再生抑制物质时，在中枢神经系统中发生部分神经再生，还可观察到功能的恢复。
最近，作为该中枢神经再生抑制因子，发现了Nogo(非专利文献8、非专利文献9)。然而，通过抑制Nogo而再生的神经纤维仅为一部分，认为可能还存在其它再生抑制物质。
另外，推测导向蛋白(セフォマリン)也为体内抑制神经再生的因子之一(非专利文献10、非专利文献11)。
另外，本发明人等报道了：BRD7、Ikaros为CRBN的下游因子，它们是抑制中枢神经系统发育的因子，以及BRD7与Ikaros的拮抗剂和CRBN的激活因子能够促进中枢神经系统的再生(专利文献5)。
此外，已知在成体的体内存在如下细胞：源自骨髓、具有分化为所有血细胞的能力的造血干细胞；在成熟的肌肉中可见、且存在于基底膜和肌纤维膜之间，向肌纤维供给新细胞的卫星细胞；产生新的毛囊、长期维持毛囊的所有细胞系统的毛囊干细胞；成为在青春期和妊娠期间乳腺生长的细胞来源的乳腺干细胞；源自骨髓间质、能够分化为各种组织的间充质干细胞；分化为血管内皮且负责血管的再构建的内皮干细胞；可以从嗅黏膜采集、具有分化为多种不同细胞的能力的嗅黏膜干细胞；能够分化为神经细胞、雪旺细胞、成肌纤维细胞、软骨细胞、和黑素细胞的神经嵴干细胞等各种各样的成体干细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2007/069666号公报
专利文献2：WO2016/002854号公报
专利文献3：日本特开2015-071565号公报
专利文献4：日本特开2017-145215号公报
专利文献5：WO2015/127351号公报
非专利文献
非专利文献1：Ann N Y Acad Sci.2020Feb：1462(1)：27-36.
非专利文献2：Oxid Med Cell Longev.2019：2019：5813147.
非专利文献3：Nature Genetics,43,34-41(2011)
非专利文献4：Biomed Res Int.2015；2015：727542.
非专利文献5：New England Journal of Medicine 2017：376：1038-1046
非专利文献6：日本白内障学会刊2015年27卷1号p.32-34
非专利文献7：再生医疗：日本再生医疗学会杂志14(4)＝62：2015.11p.319-329
非专利文献8：Nature 403,434,2000.
非专利文献9：Nature 403,439,2000.
非专利文献10：Cell 75,217,1993.
非专利文献11：Cell 75,1389,1993.
非专利文献12：Marine Biotechnology 8(3)：295-303 2006
非专利文献13：J Neurochem.2001Jan；76(1)：173-81.
非专利文献14：J Cancer Res 2011Jun：23(2)：140-146
非专利文献15：PLOS ONE,October 2014Volume9 Issue10 e109588
非专利文献16：Endocrine Reviews.28(3)：339-63.
非专利文献17：Development.124(10)：1887-97.
非专利文献18：Neuron.40(6)：1105-18.
非专利文献19：Semin Cell Dev Biol.2012Jun；23(4)：473-480.
非专利文献20：炎症·再生VOL.22NO.3MAY 2002 195-200
非专利文献21：Sci Signal.2009Jan27；2(55)：ra1.
非专利文献22：Development 2016 143：3050-3060
非专利文献23：Development 2019 146：dev167643
非专利文献24：Stem Cells Int.2017：2017：1610691.
非专利文献25：Cell Research volume 18,pages523-527(2008)
非专利文献26：J Clin Invest.2018；128(9)：3872-3886.
非专利文献27：Proc Natl Acad Sci USA.2005Apr26；102(17)：6068-73
非专利文献28：Cancer Cell,30,792-805(2016)
发明内容
发明要解决的问题
迄今为止，认为干细胞的自我复制和分化诱导分别是由不同的因素所诱导的。由于存在这样的技术常识，因此在体外试验系统中分别筛选了引起干细胞的自我复制的因子和引起分化诱导的因子。具体而言，将培养干细胞暴露于候补物质，以其增殖促进效果作为指标筛选引起自我复制的因子，另一方面，将培养干细胞暴露于候补物质，以分化诱导为期望的成熟细胞的效果作为指标筛选引起分化诱导的因子。
然而，通过这种两阶段体外筛选试验系统选择出的因子仅是在体外证实了效果。因此，作为其用途，主要目的在于使用了ES细胞、iPS细胞等的再生医疗、即在体外应用于干细胞扩增过程和分化诱导过程。
现有技术中，未想到存在利用单一试剂在生物体内引起未分化细胞的自我复制和分化诱导的物质、并对其进行筛选。
鉴于这样的情况，本发明的课题在于提供选择有用的药物化合物的新型的筛选技术。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入研究，结果发现：通过对给予了候补物质的生物体内的未分化细胞或分化细胞进行观察，从而能够筛选出可以通过单一试剂在生物体内实现“再生医疗”的化合物。此外，证实了通过该使用了生物体的方法所筛选出的有效成分在成体中发挥组织再生效果。进而，还证实了相同的有效成分具有能够将癌细胞强制分化诱导为正常细胞的能力。通过上述发现而完成了本发明。
即，解决上述课题的本发明为用于治疗或预防疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法，其具备：以下的A工序；B工序和/或C工序；及D工序。
[A工序]向动物(不包括人)给予候补物质的工序。
[B工序]对经过前述A工序的前述动物中的未分化细胞进行观察的工序。
[C工序]对经过前述A工序的前述动物中的分化细胞进行观察的工序。
[D工序]选择与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞的量的候补物质、或者选择提高前述分化细胞的量或由前述分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为前述有效成分的工序。
本发明使用动物活体作为筛选工具。此外，对给予了候补物质的动物中的未分化细胞和/或分化细胞进行观察。根据具备该技术特征的本发明，能够有效地筛选在生物体内、且通过单一试剂实现再生医疗的有效成分。另外，根据本发明，能够筛选具有将癌细胞强制分化为正常细胞的效果的有效成分。
本发明的优选方式中，其为再生药物和/或抗癌药的有效成分的筛选方法。根据本发明，能够有效地筛选再生药物或抗癌药的有效成分。
本发明的优选方式中，其为用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。根据本发明，能够有效地筛选用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分。
本发明的优选方式中，其为用于治疗血液癌的有效成分的筛选方法。根据本发明，能够有效地筛选血液癌治疗药的有效成分。
本发明的优选方式中，前述候补物质为选自低分子化合物、蛋白质、肽和核酸中的1种或2种以上。能够供于本发明的筛选方法的候补物质的种类没有限定。
本发明的优选方式中，具备前述B工序和前述C工序。通过在给予候补物质后对未分化细胞和分化细胞这两者进行观察，从而能够精度更良好地筛选有效成分。
本发明的优选方式中，前述动物为脊椎动物。
本发明的更优选方式中，前述动物为哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物或两栖动物。
本发明的优选方式中，前述动物为斑马鱼或小鼠。
通过使用这些动物作为筛选工具，从而能够更有效地筛选在人体中发挥药理作用的有效成分。
本发明的优选方式中，前述A工序中，向动物胚胎给予候补物质。通过对给予了候补物质的动物胚胎中的未分化细胞和/或分化细胞的量或功能进行观察，从而能够筛选在成体中有效的有效成分。
本发明的优选方式中，前述动物为斑马鱼的胚胎。斑马鱼胚胎由于透明且操作容易等原因，因此作为筛选工具是有用的。利用使用了斑马鱼胚胎的筛选系统筛选出的有效成分在哺乳动物中也显示出药效。
本发明的优选方式中，前述A工序中，向前述动物局部给予前述候补物质。通过进行局部给予，后续的B工序和/或C工序中的细胞的观察位置是确定的，故而优选。
本发明的优选方式中，前述A工序中，向前述动物的胚胎局部给予前述候补物质。通过观察实施了局部给予的部位在胚胎发育过程中的未分化细胞和/或分化细胞的状态，从而能够实现高精度的筛选。
本发明的优选方式中，前述A工序中，向前述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予前述候补物质。通过对特定组织在胚胎发育过程中的未分化细胞和/或分化细胞的状态进行观察，从而能够实现高精度的筛选。
本发明的优选方式中，前述B工序中，对前述特定组织的未分化细胞进行观察。通过对特定组织的未分化细胞进行观察，从而能够评价候补物质对未分化细胞的自我复制能力的影响。
本发明的优选方式中，前述C工序中，对前述特定组织的分化细胞进行观察。通过对特定组织的分化细胞进行观察，从而能够评价候补物质的分化诱导效果。
本发明的优选方式中，前述A工序包括对斑马鱼的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予前述候补物质的步骤，前述B工序包括对前述特定组织的未分化细胞进行观察的步骤，前述C工序包括对前述特定组织的分化细胞进行观察的步骤。
如上所述，斑马鱼胚胎是透明的，且操作容易，因此能够实现效率良好的筛选。
本发明的优选方式中，前述特定组织为神经系统、心脏或胰腺。如此也可以向外胚层、内胚层、中胚层中的任意胚层系统的组织给予。
本发明的优选方式中，前述神经系统为中枢神经系统。
通过设为以直接作用于中枢神经系统的形态给予候补物质的方式，从而能够有效地筛选出发挥无法再生或极难再生的中枢神经系统的再生效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述中枢神经系统为脑、脊髓或视神经。
通过设为以直接作用于脑、脊髓或视神经的形态给予候补物质的方式，从而能够有效地筛选出发挥属于无法再生或极难再生的中枢神经系统的脑、脊髓或视神经的再生效果的有效成分。
本发明的优选方式中，其为用于治疗或预防与前述特定组织相同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。通过设成这样的方式，从而能够有效地筛选特定组织的疾患等的治疗药的有效成分。
本发明的优选方式中，其为用于治疗或预防与前述特定组织不同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。通过本发明的筛选方法选择出的有效成分在筛选系统中的作为候补物质的给予位置的组织以外的组织中也显示出药效。
本发明的优选方式中，前述动物为导入了在前述未分化细胞和/或前述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物。通过观察报告基因而能够容易地观察未分化细胞和/或分化细胞，故而优选。
本发明的优选方式中，前述动物是导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，前述B工序中，对在前述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
通过采用上述方式，从而能够容易地观察未分化细胞。
本发明的优选方式中，前述动物是导入了在分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
前述C工序中，对在前述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
通过采用上述方式，从而能够容易地观察分化细胞。
本发明的优选方式中，前述报告基因编码荧光蛋白、或荧光蛋白与其它蛋白的融合蛋白。
通过对荧光蛋白的荧光进行观察，从而能够容易地观察报告基因的表达。
本发明的优选方式中，通过观察前述荧光蛋白的荧光，从而对前述报告基因的表达进行观察。
本发明的优选方式中，前述B工序中，对未分化细胞标记物进行观察。
通过采用上述方式，从而能够容易地观察未分化细胞。
本发明的优选方式中，前述C工序中，对分化细胞标记物进行观察。
通过采用上述方式，从而能够容易地观察分化细胞。
本发明的优选方式中，前述未分化细胞标记物和/或前述分化细胞标记物的观察手段为免疫染色或原位杂交。
通过采用这些观察手段，从而能够容易地对标记物进行观察。
本发明的优选方式中，前述动物为导入了在前述未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，前述B工序中，对在前述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察，前述C工序中，对分化细胞标记物进行观察。
可以利用其它手段对未分化细胞和分化细胞进行观察。
本发明的优选方式中，前述动物为导入了在前述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，前述B工序中，对未分化细胞标记物进行观察，前述C工序中，对在前述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
可以利用其它手段对未分化细胞和分化细胞进行观察。
本发明的优选方式中，前述动物为导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因、和导入了在分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，前述B工序中，对在前述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察，前述C工序中，对在前述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
本发明的优选方式中，前述候补物质包含选自5-HT受体抑制剂、AChR抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、AhR激活剂、Akt抑制剂、ALK抑制剂、ATPase抑制剂、自噬抑制剂、钙通道抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、Cdc42抑制剂、CDK抑制剂、COX抑制剂、脱氢酶抑制剂、DHFR抑制剂、EGFR抑制剂、ERK抑制剂、雌激素/孕激素受体抑制剂、γ分泌酶抑制剂、谷氨酸受体配体(增强剂)、GSK-3抑制剂、HDAC激活剂、HDAC抑制剂、Hedgehog/Smoothened激动剂、IGF-IR抑制剂、白细胞介素受体抑制剂、IRAK抑制剂、JAK/STAT抑制剂、MAO抑制剂、MEK抑制剂、线粒体自噬抑制剂、NF-kB抑制剂、NF-kB-AMPK-酪氨酸激酶通路抑制剂、Notch-1抑制剂、P450抑制剂、PAEF抑制剂、PDE抑制剂、PPAR抑制剂、TGF-β受体抑制剂、TGF-beta/Smad抑制剂、TNF受体抑制剂、Wnt/β-连环蛋白通路激活剂中的1种或2种以上。
通过将这种具有主要作用的物质作为候补物质，从而能够有效地筛选有效成分。
本发明的优选方式中，前述候补物质包含利用in silico法推测出是选自下述组中的1种或2种以上的物质：5-HT受体抑制剂、AChR抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、AhR激活剂、Akt抑制剂、ALK抑制剂、ATPase抑制剂、自噬抑制剂、钙通道抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、Cdc42抑制剂、CDK抑制剂、COX抑制剂、脱氢酶抑制剂、DHFR抑制剂、EGFR抑制剂、ERK抑制剂、雌激素/孕激素受体抑制剂、γ分泌酶抑制剂、谷氨酸受体配体(增强剂)、GSK-3抑制剂、HDAC激活剂、HDAC抑制剂、Hedgehog/Smoothened激动剂、IGF-IR抑制剂、白细胞介素受体抑制剂、IRAK抑制剂、JAK/STAT抑制剂、MAO抑制剂、MEK抑制剂、线粒体自噬抑制剂、NF-kB抑制剂、NF-kB-AMPK-酪氨酸激酶通路抑制剂、Notch-1抑制剂、P450抑制剂、PAEF抑制剂、PDE抑制剂、PPAR抑制剂、TGF-β受体抑制剂、TGF-beta/Smad抑制剂、TNF受体抑制剂、Wnt/β-连环蛋白通路激活剂。
发挥上述主要作用的化合物已知有很多，而且，作为化合物的主要作用点的蛋白质的三维结构、药效团模型等见解也积累了知识。因此，通过计算机的运算处理，能够容易地探索预测可能发挥上述主要作用的化合物。通过将经这种预测的化合物作为候补物质供于本发明的筛选方法，从而能够实现更有效的筛选。
本发明的优选方式中，前述候补物质是正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质。
已知这些蛋白质诱导自我复制能力和多能性的维持。通过将正调控这些的表达的物质作为候补物质，从而能够有效地筛选有效成分。
本发明的优选方式中，前述候补物质是利用in silico法推测出正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质。
正调控上述4种蛋白质的表达的化合物主要在体外被研究且发现了很多，包括其主要作用点在内积累了很多见解。因此，通过计算机的运算处理，能够容易地探索预测可能发挥上述的表达控制作用或主要作用的化合物。通过将经这种预测的化合物作为候补物质供于本发明的筛选方法，从而能够实现更有效的筛选。
本发明的优选方式中，前述候补物质是作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路的物质。
作用于这些信号通路的物质在生物体内发挥未分化细胞和分化细胞的增加作用的可能性高。因此，通过将这些物质作为候补物质而能够改善筛选效率。
本发明的优选方式中，前述候补物质是利用in silico法推测出作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路的物质。
这些信号通路的拮抗剂和激动剂已知有很多，包括其主要作用点在内已经积累了相当多的见解。因此，通过计算机的运算处理，能够容易地探索预测可能发挥上述作用的化合物。通过将经这种预测的化合物作为候补物质供于本发明的筛选方法，从而能够实现更有效的筛选。
本发明的优选方式中，前述in silico法为SDBB法和/或LBDD法。实现SDBB法和LDBB法的软件有偿提供或无偿提供，实施容易。
本发明的优选方式中，前述A工序包括向前述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予前述候补物质的步骤，前述C工序包括对前述特定组织的功能进行观察的步骤。
通过对功能的改善效果进行观察，从而可以进行高精度的筛选。
前述A工序包括向前述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予前述候补物质的步骤，
前述C工序包括对前述特定组织的运动功能或前述特定组织所分泌的物质的分泌量进行观察的步骤。
本发明的优选方式中，前述A工序包括向前述动物的胚胎中的能发育为心脏的区域或其附近局部给予前述候补物质的步骤，前述C工序包括对心脏的运动功能进行观察的步骤。
根据这种方式的本发明，能够有效地筛选对于治疗心脏疾病有效的有效成分。
本发明的优选方式中，前述A工序包括向前述动物的胚胎中的能发育为胰腺的区域或其附近局部给予前述候补物质的步骤，前述C工序包括对β细胞的胰岛素的产生量或分泌量进行观察的步骤。
根据这种方式的本发明，能够有效地筛选对于治疗糖尿病之类的胰腺疾病有效的有效成分。
本发明的优选方式中，前述动物为前述神经系统的疾患、障碍或疾病的模型动物。
通过使用疾患等的模型动物，从而能够有效地筛选对该疾患发挥效果的有效成分。
本发明的优选方式中，为用于治疗或预防青光眼的有效成分的筛选方法。
本发明的优选方式中，前述A工序为向前述动物的视网膜给予候补物质的工序，前述B工序为对视网膜神经节细胞的祖细胞或能分化为该细胞的神经干细胞进行观察的工序，前述C工序为对视网膜神经节细胞进行观察的工序。
通过采用这样的方式，从而能够精度良好地筛选具有青光眼的治疗或预防效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述动物为青光眼模型。
通过使用青光眼模型作为筛选工具，从而能够有效地筛选具有青光眼的治疗或预防效果的有效成分。
本发明的优选方式中，为用于治疗脊髓损伤的有效成分的筛选方法。
本发明的优选方式中，前述A工序为向前述动物的脊髓给予候补物质的工序，前述B工序为对脊髓中的未分化细胞进行观察的工序，前述C工序为对脊髓中的分化细胞进行观察的工序。
通过采用这样的方式，从而能够精度良好地筛选具有精髄损伤的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述动物为脊髓损伤模型。
通过使用脊髓损伤模型作为筛选工具，从而能够有效地筛选具有脊髓损伤的治疗效果的有效成分。
另外，本发明还涉及用于治疗或预防疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法，其具备以下的E工序、F工序和G工序。
[E工序]向疾患、障碍或疾病的模型动物(不包括人)给予候补物质的工序。
[F工序]判定经过前述E工序的前述动物中的前述神经系统的疾患、障碍或疾病的治疗效果的工序。
[G工序]选择具有治疗效果的候补物质作为前述有效成分的工序。
通过直接观察疾患等的模型动物中的治疗效果，从而能够精度良好地筛选对该疾患等具有治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，其为再生药物和/或抗癌药的有效成分的筛选方法。
其为用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
本发明的优选方式中，前述E工序中，向青光眼模型动物的视网膜给予候补物质，前述F工序中，判定青光眼的治疗效果。
通过采用这样的方式，从而能够有效地筛选对青光眼具有治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述F工序中，对视网膜神经节细胞有无增加进行观察。通过采用这样的方式，可以通过使青光眼中有损伤或功能减退的视网膜神经节细胞再生而有效地筛选产生青光眼的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述F工序中，通过观察前述动物的行动来判定视力是否恢复，由此判定青光眼的治疗效果。
本发明的优选方式中，能够有效地筛选具有青光眼的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述E工序中，向脊髓损伤模型动物中的脊髓损伤部位给予候补物质，
前述F工序中，判定脊髓损伤的治疗效果。
通过采用这样的方式，从而能够有效地筛选发挥脊髓损伤的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述F工序中，判定前述脊髓损伤部位的脊髓再生效果。
通过采用这样的方式，从而能够更有效地筛选具有脊髓损伤的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述F工序中，通过观察前述动物的行动来判定运动能力是否恢复，由此判定脊髓损伤的治疗效果。
通过采用这样的方式，从而能够有效地筛选发挥脊髓损伤所导致的运动障碍的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述E工序中，向癌症模型动物的血管内注射候补物质，前述F工序中，判定癌症的治疗效果。
通过采用这样的方式，从而能够有效地筛选抗癌药。
本发明的优选方式中，前述E工序中，向白血病模型动物给予候补物质，前述F工序中，观察血管内皮是否增厚或癌变。
通过采用这样的方式，从而能够筛选通过将癌细胞强制分化为正常的血管内皮细胞而发挥抗癌作用的有效成分。
本发明的优选方式中，前述E工序中，向白血病模型动物给予候补物质，前述F工序中，观察前述动物的存活率。
通过采用这样的方式，从而能够有效地筛选抗癌药的有效成分。
本发明还涉及用于治疗或预防疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法，所述方法利用具备上述的A工序、B工序和/或C工序、D工序的筛选方法进行一次筛选，将通过一次筛选作为有效成分选择出的候补物质供于利用具备上述的E工序、F工序和G工序的筛选方法的二次筛选。
通过如此进行一次筛选和二次筛选，从而能够精度更良好地筛选具有疾患等的治疗效果的有效成分。
本发明的优选方式中，在一次筛选的A工序中，向正常动物给予候补物质。
如此，通过采用一次筛选使用正常动物、二次筛选使用疾患模型动物的方式，从而能够实现高效且高精度的筛选。
本发明的优选方式中，前述候补物质为以下的通式(I)、通式(II)或通式(III)中包含的化合物或其盐或它们的水合物。
Figure BDA0003918123640000151
通式(I)中，
环A为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～8元的、
单环式或稠合双环式的基团；
L为任选被取代基R3取代的、C1～10的饱和或不饱和的烃链，或者L不存在；
前述取代基R3为任选被卤素原子取代的、任选具有环状结构的、C1～10的、饱和或不饱和的烃基；
R1为：
-C≡N、-COOH、-CHO、-COOCH3、-NO2、或卤素原子，或为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～8元的、
单环式或稠合双环式的基团；
R2为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～20元的、单环式或稠合双环式的基团。)
Figure BDA0003918123640000161
通式(II)中，
R1为：
氢原子、
卤素原子，或
饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、C1～20的烃基；
L1为以下任意的结构：
Figure BDA0003918123640000171
L2为：
饱和或不饱和的、
任选被：选自C1～3的烃基、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的氨基、任选被C1～3的烃基取代的硫酸基、任选被C1～3的烃基取代的磷酸基和卤素原子中的基团取代的、
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
C1～30的烃链；
R2为：任选被C1～3的烃基取代的羧基、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的异羟肟酸基、任选被C1～3的烃基取代的磺基、任选被C1～3的烃基取代的硼酸基、任选被C1～3的烃基取代的氨基甲酰基、任选被C1～3的烃基取代的氨磺酰基、任选被C1～3的烃基取代的亚砜亚胺基、氰基或四唑基。
Figure BDA0003918123640000181
通式(III)中，
环A、环B和环C各自独立地为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烃基、卤素原子、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的氨基、任选被C1～3的烃基取代的硫酸基或任选被C1～3的烃基取代的磷酸基取代的、
3～8元的、
单环式的环；
R1为选自以下中的基团：
Figure BDA0003918123640000182
R3～R6各自独立地为：
氢原子、C1～3的烃基、任选被C1～3的烃基取代的羟基或任选被C1～3的烃基取代的氨基，
R7为氢原子、C1～3的烃基或任选被C1～3的烃基取代的氨基，
n表示1～4的整数；
L1、L2各自独立地为：
C1～3的亚烷基或亚烯基、-N(H)-或-O-，
这些2价基团中，除-O-以外的基团进而任选被饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的C1～30的烃基取代；
R2为：饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的C1～30的烃基。
如此通过将通式(I)～通式(III)中包含的化合物作为筛选的候补物质，从而能够以高概率筛选对神经系统的疾患等具有效果的有效成分。
本发明的优选方式中，前述候补物质为以下的化合物1～7中的任意者的衍生物或其盐或它们的水合物。
Figure BDA0003918123640000201
上述7种化合物是利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的化合物。通过将以这些化合物作为基础对结构进行取代、添加、削除等而得到的衍生物作为筛选的候补物质，从而能够以高概率筛选有效成分。
另外，本发明还涉及药物组合物的制造方法，其具备将利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质和药物添加剂混合并制剂化的制剂化工序。
根据本发明的制造方法，能够制造有效的药物组合物。
本发明的优选方式中，前述筛选方法是将上述的通式(I)～(III)中包含的化合物作为候补物质的筛选方法或将上述的7种化合物的衍生物作为候补物质的筛选方法。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为再生药物和/或抗癌药。
根据本发明，能够制造再生药物和/或抗癌药。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗或预防青光眼。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗脊髓损伤。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗血液癌。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗白血病。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为液体制剂，
前述制剂化工序包括将前述有效成分与水性介质混合的步骤。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为注射剂。
另外，本发明的优选方式中，前述药物组合物为滴眼药。
前述药物组合物为冷冻干燥制剂，前述制剂化工序包括将前述有效成分溶解于溶剂中并对其进行冷冻干燥的步骤。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为软膏，前述制剂化工序包括将前述有效成分和基材混合的步骤。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为眼部软膏。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为鼻腔给药用制剂。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为经口给药用制剂。
另外，本发明还涉及药物组合物的设计方法，其具备：选择与利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质组合的药物添加剂的工序。
根据本发明，能够设计有效的药物组合物。
本发明的优选方式中，前述药物组合物为再生药物和/或抗癌药。
根据上述方式的本发明，能够设计再生药物和/或抗癌药。
本发明的优选方式中，前述药物组合物用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状。
根据本发明，能够设计用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的药物组合物。
本发明的优选方式中，包括选择前述药物组合物的适应症的工序。可以根据所选择的适应症来选择药物添加剂。
本发明的优选方式中，前述适应症为神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状，或者为癌症。
本发明的优选方式中，具备选择前述药物组合物的剂型的工序。可以根据所选择的剂型来选择药物添加剂。
本发明的优选方式中，包括选择液体制剂作为前述剂型、并选择要与前述有效成分混合的水性介质的步骤。
本发明的优选方式中，选择注射剂作为前述剂型。
本发明的优选方式中，选择滴眼药作为前述剂型。
本发明的优选方式中，选择冷冻干燥制剂作为前述剂型。
本发明的优选方式中，包括选择软膏作为前述剂型、并选择要与前述有效成分混合的基材的步骤。
本发明的优选方式中，选择眼部软膏作为前述剂型。
本发明的优选方式中，选择鼻腔给药用制剂作为前述剂型。
本发明的优选方式中，选择经口给药用制剂作为前述剂型。
另外，本发明还涉及一种方法，其包括如下步骤：利用上述的方法设计药物组合物，准备利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质，利用上述的制造方法制备药物组合物，对由临床试验中给予了所述药物组合物的人获取的数据集进行统计处理。
发明的效果
根据本发明的筛选方法，能够筛选药物的有效成分、更详细而言能够筛选对神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的治疗或预防具有效果的有效成分，或者抗癌药。
根据本发明的制造方法，能够制造对治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状具有效果的药物组合物，或者抗癌药。
附图说明
图1是示意性示出本发明的筛选方法的工序的图。
图2是示意性示出具备A工序、B工序和D工序的方式的图。
图3是示意性示出具备A工序、C工序和D工序的方式的图。
图4是示意性示出具备A工序、B工序、C工序和D工序的方式的图。
图5是整理了具备A工序、B工序、C工序和D工序的方式的图。(a)表示以A工序、B工序、C工序和D工序的顺序实施的方式。(b)表示以A工序、C工序、B工序和D工序的顺序实施的方式。(c)表示在A工序后同时进行B工序和C工序、然后进行D工序的方式。
图6是示出试验例1中的化合物1和2的结果的照片。是将观察表示中脑神经干细胞的GFP的荧光的荧光图像与明视野图像重叠的照片。上半部分是斑马鱼胚胎的头部俯视的照片，下半部分是头部侧视的照片。
图7是示出试验例1中的化合物3～5的结果的照片。是将观察表示中脑神经干细胞的GFP的荧光的荧光图像与明视野图像重叠的照片。上半部分是斑马鱼胚胎的头部俯视的照片，下半部分是头部侧视的照片。
图8是示出试验例1中的化合物6和7的结果的照片。是将观察表示中脑神经干细胞的GFP的荧光的荧光图像与明视野图像重叠的照片。上半部分是斑马鱼胚胎的头部俯视的照片，下半部分是头部侧视的照片。
图9是示出表示试验例1中的对照、化合物2和7的sox2的表达量的定量PCR的结果的图。
图10是示出表示给予了对照和化合物2、以及试验例1中未观察到神经未分化细胞增加和神经系统分化细胞增加的比较化合物时的sox1α、sox2、sox3和her6的表达量的定量PCR的结果的图。
图11是示出试验例2中的化合物1和2的结果的照片。上半部分是明视野图像。下半部分是观察示出神经的细胞体簇(端脑/间脑)和连接它们的轴突束的荧光的荧光图像。
图12是示出试验例2中的化合物3～5的结果的照片。是将观察示出神经的细胞体簇(端脑/间脑)和连接它们的轴突束的荧光的荧光图像与明视野图像重叠的照片。
图13是示出试验例2中的化合物6和7的结果的照片。上半部分是明视野图像。下半部分是观察示出神经的细胞体簇(端脑/间脑)和连接它们的轴突束的荧光的荧光图像。
图14是示出试验例5中的化合物7的结果的照片。上半部分是处置前、下半部分是处置后的染色图像。黑色箭头所示的部分(观察到绿色荧光的部分)为视网膜神经节细胞。
图15是示出试验例6中的化合物2的结果的照片。右边示出染色图像，左边示出表示对浦肯野细胞的个数进行计数的结果的柱状图。
图16是示出试验例6中的化合物5的结果的照片。右边示出染色图像，左边示出表示对浦肯野细胞的个数进行计数的结果的柱状图。
图17是示出试验例6中的化合物7的结果的照片。右边示出染色图像，左边示出表示对浦肯野细胞的个数进行计数的结果的柱状图。
图18是示出试验例7中注入了化合物5的斑马鱼的中脑神经细胞的荧光的照片。
图19是示出试验例8中注入了化合物2、5、7的斑马鱼中的心肌细胞的染色照片。
图20是示出试验例8中对注入了化合物7的斑马鱼中的血细胞的一次输出量进行计数的结果。
图21是示出试验例8中拍摄注入了化合物7的斑马鱼的心脏搏动视频的抓取图像。
图22是拍摄试验例9中的胰腺β细胞GFP表达转基因斑马鱼胚胎的荧光照片。
图23是试验例9中注入了待检化合物的斑马鱼的原位杂交的胰岛素的染色照片。示出注入了化合物2、5、6和7的结果。
图24是试验例9中的抗胰岛素抗体的免疫染色照片。示出以100nM或5nM的浓度分别注入了化合物2和6的结果。对于各条件，示出3次的试验结果。
图25是对图24的结果进行定量的柱状图。纵轴表示平均荧光强度。
图26是示出试验例10中对注入了化合物7或E3林格液(对照)的T细胞型急性淋巴细胞性白血病模型斑马鱼的血管内皮细胞进行荧光观察的结果的图。下图是低倍率照片，上图是放大了下图中用方形包围的部分的照片。箭头表示在形态上为血细胞状但正与血管内皮融合的细胞。虚线圆圈表示增厚、或同样地与血管内皮融合的血细胞。
图27是示出试验例10中的对照和药剂注入个体的存活率的图。
具体实施方式
以下，边适宜参照附图边对本发明的实施方式进行详细地说明。需要说明的是，本发明的范围不限定于以下说明的实施方式。
[1]第一筛选方法
基于本发明人进行了深入研究努力而发现的事实、即基于在生物体内存在多种通过单一试剂实现未分化细胞的自我复制和分化诱导的化合物的事实，从而完成了本发明的筛选方法。
本发明的筛选方法基于本发明人的发现，使用动物作为筛选工具，将未分化细胞和/或分化细胞的增殖或功能促进效果作为指标而筛选药物的有效成分。
此处所谓的“药物的有效成分”不限定于应由监管机构(日本厚生劳动省、美国的美国食品药品监督管理局等)获得制造销售许可的“药品”的有效成分，为广泛包括具有有用的生理活性的成分的概念。例如，本申请说明书的“药物的有效成分”中不仅包括基于西洋医学方法的药品的有效成分，还广泛包括基于东方医学的方法的中药等药品、健康食品、补充剂等的有效成分。
本发明的一个实施方式中，本发明为再生药物和/或抗癌药的有效成分的筛选方法。此处所谓的再生药物是指：作用于干细胞、祖细胞等并促进其增殖/分化，由此使出现障碍的组织、器官的功能再生的药品。另外，抗癌药不限定于癌细胞的增殖抑制、诱发细胞死亡的药物。具有作用于癌细胞且将其分化为无害的正常细胞的作用的药物也包括在抗癌药中。
本发明的一个实施方式为用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
以下，也将“疾患、障碍或疾病”称为“疾患等”。
作为神经系统的疾患等，可列举出帕金森氏病；阿尔茨海默氏症；库贾氏病；朊病毒病；皮质基底节变性；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；多发性硬化症；进行性运动无力；免疫神经病变；脑损伤、脊髓损伤、视神经损伤、嗅神经损伤等中枢神经系统的损伤；伴随帕金森症的阿尔茨海默氏症；运动迟缓；运动不能；精细运动控制和手指灵活性受损的运动障碍；发音困难；言语单调；僵硬；肌张力障碍；与帕金森氏病相关的炎症；面部、颚、舌、姿势性震颤；帕金森氏病样步态；滑步步态；小步步态；加速步态；情绪、认知、感觉、睡眠障碍；痴呆；抑郁；药物导致的帕金森症；血管性帕金森症；多系统萎缩；进行性核上性麻痹；具有原发性tau病变的障碍；皮质基底核神经节改性症；伴有痴呆的帕金森症；多动症；舞蹈病；亨廷顿氏舞蹈病；肌张力障碍；血铜蓝蛋白缺乏症；Tourette综合症；特发性震颤；肌阵挛；延迟运动障碍：精神分裂症；双相障碍和自闭症谱系障碍等。
作为心脏的疾患等，可列举出心绞痛、心肌梗塞、瓣膜病、心肌病、心房间隔缺损、心脏肿瘤、心力衰竭、心律不齐等。
作为胰腺的疾患等，可列举出1型糖尿病、2型糖尿病、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、产黏蛋白肿瘤等。
本发明的一个实施方式中，其为用于治疗血液癌的有效成分的筛选方法。作为血液癌，可列举出急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等白血病；经典的霍奇金淋巴瘤、-结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤等霍奇金淋巴瘤、B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、T细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、滤胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、皮肤的淋巴瘤(蕈样霉菌病、塞扎里综合征)等恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤症状、良性单克隆高γ球蛋白血症、无症状骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤等多发性骨髓瘤。
利用本发明的筛选方法选择出的有效成分发挥通过将癌细胞强制分化为正常细胞(血管内皮细胞)而无害化的作用。本发明在能够利用这样的新型作用机制筛选发挥抗癌作用的有效成分方面是有效的。
本发明的特征在于具备：以下的A工序；B工序和/或C工序；及D工序(图1)。
[A工序]向动物(不包括人)给予候补物质的工序。
[B工序]对经过前述A工序的前述动物中的未分化细胞进行观察的工序。
[C工序]对经过前述A工序的前述动物中的分化细胞进行观察的工序。
[D工序]选择与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞的量的候补物质、或者选择提高前述分化细胞的量或由前述分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为前述有效成分的工序。
本发明中，只要实施B工序和C工序中的任意者足矣。
因此，可以是具备A工序、B工序和D工序的实施方式(图2)，也可以的具备A工序、C工序和D工序的实施方式(图3)。
图2所示的实施方式中，D工序中，选择与未给予候补物质的情况相比提高未分化细胞的量的候补物质作为前述有效成分(图2)。
另一方面，图3所示的实施方式中，D工序中，选择与未给予候补物质的情况相比提高分化细胞的量的候补物质、或者选择提高由分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为前述有效成分(图3)。
另外，当然也可以是执行B工序和C工序这两者的实施方式(图4)。
在此情况下，D工序中，选择与未给予候补物质的情况相比提高神经未分化细胞和神经系统分化细胞的量的候补物质作为前述有效成分(图4)。
采用执行B工序和C工序这两者的实施方式时，上述2个工序没有特定的顺序。
即，可以以A工序、B工序、C工序、D工序的顺序执行(图5的(a))，也可以以A工序、C工序、B工序、D工序的顺序执行(图5的(b))。
另外，也可以采用同时执行B工序和C工序的实施方式(图5的(c))。
以下对各工序进行详述。
[1-1]A工序
[1-1-1]动物
A工序中，向动物给予候补物质。由于使用人类作为筛选工具在伦理上存在问题，因此向不包括人的动物给予候补物质。
A工序中给予候补物质的动物只要不是人就没有特别限定，可以是分类为扁形动物、触手冠动物、轮形动物、线形动物、鳃曳动物、泛节肢动物、棘皮动物、半索动物、头索动物、尾索动物、脊椎动物、异无腔动物等中的任一动物。
其中，优选使用具有由脑和脊髓构成的中枢神经系统的脊椎动物作为筛选工具的实施方式。
作为脊椎动物，可以是哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物和两栖动物中的任意者。
其中，优选使用作为模型生物通用的动物。具体而言，作为哺乳动物，可列举出小鼠、豚鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫。作为鱼类，可列举出斑马鱼、鳉鱼、红鳍东方鲀。作为鸟类，可列举出鸡、鹌鹑。作为爬行动物，可列举出壁虎，作为两栖动物，可列举出青蛙、蝾螈。
从简便迅速地筛选能应用于人的有效成分的观点出发，优选使用：多产、生命周期短、且具有透明～半透明的躯体、能观察到在体内表达的荧光蛋白的荧光的斑马鱼。
另外，从简便地筛选对于人的应用性更高的有效成分的观点出发，优选使用作为多产且生命周期短的哺乳动物的小鼠。
使用斑马鱼(包括成体和胚胎)作为筛选工具时，优选使用多孔板。在每个孔中配置给予了彼此不同的候补物质的斑马鱼。如此通过在多孔板上培育给予了多种候补物质的斑马鱼，从而能够容易地实施后续的B工序和/或C工序。即能够实现高通量筛选。
特别优选采用：使用基因重组了荧光蛋白的报告基因的转基因系统的斑马鱼胚胎，将其在多孔板上培育的实施方式。通过采用这样的实施方式，从而能够在B工序和/或C工序中通过荧光酶标仪批量观察未分化细胞和/或分化细胞。
多孔板的孔数没有特别限制，优选为6孔以上、更优选为12孔以上、进一步优选为24孔以上、进一步优选为48孔以上、进一步优选为96孔以上。
A工序中使用的动物的生长的程度没有特别限定。优选使用细胞分裂、分化发育活跃的胚胎。以下对使用动物的胚胎作为筛选工具的实施方式加以说明。
[1-1-1-1]使用了胚胎的筛选
所使用的胚胎的动物种类没有特别限定，但由于胎生动物的胚胎存在于母体的子宫内且难以操作，因此优选使用卵生动物的胚胎。具体而言，优选使用鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类的胚胎。优选使用：蛋壳是透明的、包封于柔软的卵中的胚胎作为筛选工具。由于透明、容易操作且能够大量准备的这样的优点，因此优选使用鱼类的胚胎，特别优选使用斑马鱼的胚胎。
对胚胎给予候补物质的给予方法没有特别限定。一个实施方式中，将胚胎浸渍于溶解或分散有候补物质的液体中，将整个胚胎暴露于候补物质中。
更优选的实施方式中，向胚胎的一部分局部给予候补物质。在此情况下，向动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予候补物质。
需要说明的是，“附近”是指：候补物质可以通过体液的扩散或分散而到达目标区域的程度的范围。
向动物胚胎的局部给予可以使用显微操作仪并利用常规方法来进行。另外，对于局部给予通过离子化等而具有负电荷的分子而言，采用本发明人开发的体内脂质体法有时是有效的(非专利文献12)。
上述的“特定组织”没有特别限定。也可以是源自外胚层、内胚层、中胚层中的任意者的组织。
也可以将候补物质给予至发育为皮肤表皮、毛发、指(趾)甲、皮肤腺体(包括乳腺、汗腺)、感觉器官(包括口腔、咽喉、鼻、直肠的末端部的上皮)、唾液腺、晶状体、脑、脊髓等外胚层系统中的任意组织的区域或其附近。
也可以将候补物质给予至发育为从食道到大肠的消化道(不包括口腔/咽喉、直肠的末端部)、肺、甲状腺、胰腺、肝脏、开口于消化道的分泌腺的细胞、腹膜、胸膜、喉、咽鼓管、气管、支气管、泌尿道(膀胱、大部分尿道、一部分输尿管)等内胚层系统中的任意组织的区域或其附近。
也可以将候补物质给予至发育为体腔和支撑其的中皮、肌肉、骨架、皮肤真皮、结缔组织、心脏、血管(也包括血管内皮)、血液(也包括血细胞)、淋巴管、脾脏、肾脏和输尿管、性腺(睾丸、子宫、性腺上皮)等内胚层系统中的任意组织的区域或其附近。
需要说明的是，在将候补物质给予至发育为特定组织的区域或其附近的实施方式中，所选择的有效成分并非仅对该特定组织有效的成分。利用本实施方式的筛选方法选择出的有效成分也是对与该特定组织不同的组织有效的成分。即，利用本发明的筛选方法选择出的有效成分可以用作应用范围没有限制的再生药物和/或抗癌药。因此，本发明可以采用以下那样的实施方式。
本发明的一个实施方式中，是用于治疗或预防与局部注入候补物质的特定组织相同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
本发明的一个实施方式中，是用于治疗或预防与局部注入候补物质的特定组织不同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
例如，将候补物质局部给予至胚胎中的能发育为神经系统的区域或其附近，观察到神经未分化细胞/神经系统分化细胞的增加时，该候补物质不应视为仅对神经系统的疾患等有效的成分。在此情况下，该候补物质应理解为作为除神经系统以外的组织/器官的再生药物也有效的成分。另外，该候补物质应理解为作为抗癌药也有效的成分。由后述的试验例的结果可证实这点。
以下分别详细说明向能发育为神经系统、心脏、胰腺的区域或其附近给予候补物质的实施方式。
[1-1-1-1-1]向能发育为神经系统的区域或其附近的局部给予
本发明的一个实施方式中，将前述候补物质向前述动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域或其附近局部给予。以下在简便地对胚胎发育期中的神经系统的发育过程进行说明后，对该实施方式进行说明。
海胆、果蝇、鱼类、青蛙、小鼠、人等几乎所有的动物都会在胚胎早期经历被称为原肠胚形成的过程。在原肠胚形成期间，多能细胞向胚胎中心内陷(原肠胚内陷)。如此迁移的细胞随后形成作为分化了的胚细胞的中胚层和内胚层的层。中胚层形成血管和肌肉骨骼系统，内胚层形成消化道及与其相关联的内脏。另一方面，命运注定外胚层区域要通过成骨蛋白4(BMP4)的活性分化为表皮。然而，在原肠胚形成期间源自形成体的BMP抑制分子所作用的外胚层区域命运注定为未来的神经组织，从该区域形成神经板。
神经板上描绘了未来脑的地图。在哪里创建大脑、间脑、中脑、小脑之类的脑各区域，依据该地图确定细胞的行为，由此就形成脑。将该区域依赖性命运决定机制称为“区域化”或者“图案形成”。该现象涉及：由源自局部组织导体的分子所诱导的特异性转录因子的表达、转录因子彼此的表达抑制机制、及依赖于由转录因子诱导的细胞表面分子的功能的细胞选择机制。
神经板的正中部凹陷而成为神经沟，其两侧向羊膜腔侧隆起，最终在该尖端融合而形成神经管。神经管形成始于胚胎的颈部区域，并向前后两个方面发展。前部闭合也开始于头部侧端。在该过程中，尚未闭合并通向羊膜腔的部分称为颅神经孔，该神经孔逐渐变小。在该时期，观察到前神经管比后神经管大。该隆起被称为脑泡(初级脑泡)，由于具有3个隆起部，因此也将该发育阶段称为三囊阶段(初级脑泡阶段)。隆起由前面的前脑泡、中脑泡、菱形脑泡(或者后脑泡)组成。隆起的壁使神经组织分化，内腔成为脑室。
然后，前脑泡分为端脑泡和间脑泡，菱形脑泡分为后脑泡和髄脑泡，形成次级脑泡。端脑泡向左右突出，内腔成为侧脑室。间脑泡内腔、后脑泡内腔分别成为第三脑室、第四脑室。中脑泡内腔成为中脑导水管而不会表现出较大的形态变化。端脑的背侧成为大脑皮质，大脑基底核等从腹侧分化。上丘脑、丘脑、下丘脑从间脑泡区域分化。后脑泡区域的背侧形成小脑，腹侧形成脑桥。髄脑区域成为延髄，与由神经管后部形成的脊髓连接。
需要说明的是，在形态发生的初始阶段，一对空腔从前脑的侧面开始发育。该空腔在神经管的前端闭合之前开始形成作为眼睛的原基的视泡，在神经管的闭合结束后就形成了视泡。
鉴于以上的情况，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出在原肠胚内陷期间的神经板预定形成区域。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至原肠胚内陷期间的神经板预定形成区域或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出神经板。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至神经板或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出神经管。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至神经管或其附近的实施方式。
在此情况下，可以局部给予至具有神经孔的状态、即未完全闭合的神经管，也可以局部给予至完全闭合的神经管。
另外，局部给予至神经管的方式的情况下，可以局部给予至神经管前方的脑预定区域，也可以局部给予至后神经管的脊髓预定区域。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出初级脑泡。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至初级脑泡或其附近的实施方式。
局部给予的初级脑泡也可以是前脑泡、中脑泡、菱形脑泡中的任意者。另外，也可以局部给予至初级脑泡的内腔(脑室)。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出次级脑泡。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至次级脑泡或其附近的实施方式。
局部给予的次级脑泡也可以是端脑泡、间脑泡、后脑泡、髄脑泡中的任意者。另外，也可以局部给予至作为次级脑泡的内腔的侧脑室、第三脑室、第四脑室或中脑导水管。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为神经系统的区域”的一个方式，可列举出视泡。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至视泡或其附近的实施方式。
[1-1-1-1-2]向能发育为心脏的区域或其附近的局部给予
本发明的一个实施方式中，将前述候补物质局部给予至前述动物的胚胎中的能发育为心脏的区域或其附近。以下对胚胎发育期中的心脏的发育过程进行简要说明后，对该实施方式进行说明。
心脏发育首先始于原结中的左右轴的确定，该信息被传递至左右的侧板中胚层。在颅侧部分的心脏原基(预定心脏区域、cardiogenic region)，未成熟的中胚层细胞分化为表达心肌特异性转录因子的心肌祖细胞(cardiac progenitor cells)。心肌祖细胞进一步分化的同时逐渐向胚胎的中央移动而成为心肌细胞(cardiac myocytes)，在正中间形成1根原始心管(primitive heart tube)。原始心管以蠕动的方式收缩，逐渐开始有节奏的收缩，且向胚胎右侧进行弯曲循环(cardiac looping)而形成心脏的外形。原始心管中，从尾侧朝向头侧按静脉洞(sinus venosus)、原始心房(atrium)、原始心室(ventricle)、心球(bulbus cordis)、动脉干(truncus arteriosus)的顺序将各组成部分确定为分段状。这些前后方向的分段伴随着心脏环的形成、特别是在心室部分转变为左右位置关系。同时随着心管的延伸心室下垂至下方，心房心室的上下关系被切换。另一方面，在原始心管的内部，在房室管部分上下左右4个心内膜垫(endocardial cushion)发育，形成2个房室瓣和心室心房间隔的一部分。另外，流出路线中，2个(最初4个)的锥形躯干肿胀(conotruncalswelling)发育，并将肺动脉和大动脉分割为螺旋状。进而房间隔和室间隔发育完成。
在迄今为止的研究中，证实了表达称为MESP1的转录因子的一部分中胚层细胞分化为心肌。然而，可知：表达MESP1的细胞不仅分化为心肌细胞，而且还分化为包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、以及构成胎盘的胚体外中胚层等在内的心脏以外的细胞。证实了：表达该MESP1的中胚层细胞中，随后表达称为NKX2.5的转录因子的细胞群体将产生心肌细胞。该细胞群体基本上有助于未来的心脏，因此这些NKX2.5阳性的中胚层成分被认为是心脏祖细胞。
进而，作为在心脏发育中发挥重要作用的转录因子，已经证实了TBX5、GAT A家族、ISLET-1、HAND1/2、MEF2C等多种转录因子在相互作用的同时参与心肌细胞分化。
鉴于以上情况，作为“动物的胚胎中的能发育为心脏的区域”的一个方式，可列举出在发育初期形成的心脏原基。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至心脏原基或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为心脏的区域”的一个方式，可列举出分化为心肌祖细胞的未成熟的中胚层细胞局部存在的区域、或心肌祖细胞局部存在的区域。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至分化为心肌祖细胞的未成熟的中胚层细胞局部存在的区域、或心肌祖细胞局部存在的区域或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为心脏的区域”的一个方式，可列举出原始心管。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至原始心管或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中的能发育为心脏的区域”的一个方式，可列举出原始心管。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至原始心管或其附近的实施方式。
[1-1-1-1-3]向能发育为胰腺的区域或其附近的局部给予
本发明的一个实施方式中，将前述候补物质局部给予至前述动物的胚胎中能发育为胰腺的区域或其附近。以下对胚胎发育期中的胰腺的发育过程进行简要说明后，对该实施方式进行说明。
胰腺由作用完全不同的两种组织构成。一种是产生/分泌消化酶并通过导管将其释放至消化道的外分泌组织，另一种是产生/分泌激素并释放至循环血液中的内分泌组织。已知：虽然在每个组织中存在多种细胞，但在发育方面均由共同的祖细胞分化而来。
在发育早期出现的由一层片状的细胞即内胚层形成管状的原始肠道。构成胰腺的所有细胞均来源于Pdx1阳性细胞。更详细而言，构成胰腺的所有细胞源自由存在于原始肠道的后前肠(原始肠道前肠)的内胚层上皮细胞形成的胰芽(胰原基)。胰芽(胰原基)从后前肠的背侧出现，稍迟一些从腹侧隆起而出现。胰芽细胞增殖并形成高度分支的胰腺上皮。胰腺上皮随后分化为内分泌细胞(α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞等)、胰管细胞、外分泌细胞(泡心细胞)。从后前肠的背侧和腹侧隆起而出现的胰芽旋转、融合并最终成为一个胰腺。
鉴于以上情况，作为“动物的胚胎中能发育为胰腺的区域”的一个方式，可列举出胰芽(胰原基)。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至胰芽或其附近的实施方式。
另外，作为“动物的胚胎中能发育为胰腺的区域”的一个方式，可列举出胰腺上皮。即，A工序中，也可以是将候补物质局部给予至胰腺上皮或其附近的实施方式。
[1-1-1-2]使用了成体等的筛选
本发明的一个实施方式中，使用完成了发育全部过程的动物胚胎的发育后期到新生儿期、及该动物的年轻个体到成体作为筛选工具。
在此情况下，A工序中，向该动物给予候补物质。作为给予方式，可列举出基于注射等的局部给予、经口给予、经皮给予、经肠给予等。在优选的实施方式中，将候补物质局部给予至该动物。
局部给予候补物质时，其给予部位没有特别限定。优选列举出向神经系统、心脏、胰腺局部给予的实施方式。以下对向神经系统的局部给予进行特别说明。
作为神经系统，也可以是中枢神经系统和外周神经系统中的任意者。需要说明的是，中枢神经系统一旦受损，则几乎无法再生，且障碍会维持。为了筛选这种在现有的常识中认为无法再生的中枢神经系统的再生药物，A工序中，优选将候补物质局部给予至中枢神经系统。
作为A工序中局部给予候补物质的中枢神经系统，也可以是脑、脊髓、视神经、嗅神经中的任意者。优选为将候补物质局部给予至脑、脊髓或视神经、或其附近。
需要说明的是，局部给予至脑时，更具体而言优选局部给予至脑室内的方式。向脑的局部给予优选采用基于注射的给予方式。也可以通过手动进行注射，但优选在使用注入泵控制给药量的基础上进行注射。另外，所注射的动物小时，也可以使用显微操作仪。
向脊髓的局部给予优选采用基于注射的给予方式。也可以通过手动进行注射，但优选在使用注入泵控制给药量的基础上进行注射。另外，所注射的动物小时，也可以使用显微操作仪。
局部给予至视神经的情况下、更优选局部给予至视网膜神经节细胞或其附近的方式。通过向眼球内注射也可以给予至视网膜神经节细胞或其附近，但优选通过向眼球内滴加或涂抹来给予候补物质的方式。给予候补物质的动物为陆生动物(更具体而言哺乳动物、更具体而言小鼠)时，优选通过滴眼来给予。
[1-1-1-3]疾患模型
本发明的一个实施方式中，向未患有疾患等的正常动物给予候补物质。与后述的疾患模型相比，正常动物能够容易且廉价地大量获得，因此在筛选大量的候补物质组时是有利的。
另外，本发明的一个实施方式中，也可以是疾患等模型动物。作为疾患模型动物，可以是遗传模型，可以是药物诱导型的模型，或者也可以是组织/器官/细胞受到物理损伤的损伤模型。
通过使用疾患模型动物，从而能够有效地筛选用于该疾患时发挥效果的有效成分。
作为中枢神经系统疾患的模型动物，可列举出获得性无助模型(小鼠)、嗅球去除抑郁模型(大鼠)等抑郁模型动物；Tg2576小鼠、APP&PS1双转基因(PSAPP)小鼠、甲基苯丙胺/利眠宁诱发运动过度运动模型(小鼠)、胆碱能核破坏模型(小鼠)、药物引起的记忆力减退模型(小鼠)、脑局部破坏模型(大鼠)等痴呆模型动物；新生儿期苯环己哌啶(phencyclidine，PCP)给予小鼠、NR1敲除小鼠、G蛋白偶联受体(SREB2)敲除小鼠、SREB2过表达小鼠、药物引起强直性昏厥(大鼠)等精神分裂症模型动物；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)引起的帕金森氏病模型(小鼠)等帕金森氏病模型动物；惊厥模型(小鼠)、杏仁核或海马体点燃模型(大鼠)等癫痫模型；基于脊髓挤压的脊髓损伤模型(大鼠、小鼠、斑马鱼)、基于坐骨神经夹伤或者截肢的神经损伤模型(大鼠、小鼠)等神经损伤模型；基于中脑动脉阻塞的脑梗塞模型(小鼠)等。
另外，作为视神经的疾患模型动物，可列举出Vav基因缺陷模型(小鼠)、GLAST缺陷正常眼压青光眼模型(小鼠)、基于上巩膜静脉的烧灼的高眼压模型(大鼠)等青光眼模型动物等。
脊髓损伤的模型动物可以通过对正常的动物的脊髓施加物理压力、或刺穿脊髓来容易地制作。
[1-1-2]候补物质
A工序中向动物给予的候补物质没有限制。候补物质也可以是低分子化合物、蛋白质、肽、核酸中的任意者。
本发明的一个实施方式中，候补物质为低分子化合物。需要说明的是，本说明书中“低分子化合物”是指分子量2000以下的化合物、更优选为分子量1500以下的化合物、更优选为分子量1000以下的化合物。
本发明的一个实施方式中，候补物质为蛋白质。蛋白质的种类没有特别限定。也可以是从细胞中提取的蛋白质，也可以是利用基因工程方法制作的蛋白质。另外，可以是使多种蛋白质融合而成的融合蛋白，也可以是包含非天然氨基酸作为组分的蛋白质。
一个实施方式中，候补物质为抗体。抗体可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体。可以根据该实施方式筛选抗体药物。
本发明的一个实施方式中，候补物质为肽。构成肽的氨基酸数没有特别限定，例如可以列举出由2～100个氨基酸构成的肽。
肽可以为从细胞中提取的肽，也可以为通过基因工程方法或化学合成而制得的肽。另外，也可以包含非天然氨基酸作为构成肽的氨基酸。
本发明的一个实施方式中，候补物质为核酸。作为核酸，也可以为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或这些嵌合核酸中的任意者。
本发明的一个实施方式中，候补物质为表达蛋白质、RNA的表达载体。
本发明的一个实施方式中，候补物质为在细胞内通过RNA干扰抑制特定蛋白的表达的敲除载体。
本发明的一个实施方式中，候补物质为肽核酸(PNA)。
另一个实施方式中，候补物质不包含核酸。另外，一个实施方式中候补物质不包含蛋白质。另外，一个实施方式中候补物质不包含肽核酸。
本发明的一个实施方式中，候补物质为包含选自下述A组中的1种或2种以上。
[A组]
5-HT受体抑制剂、AChR抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、AhR激活剂、Akt抑制剂、ALK抑制剂、ATPase抑制剂、自噬抑制剂、钙通道抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、Cdc42抑制剂、CDK抑制剂、COX抑制剂、脱氢酶抑制剂、DHFR抑制剂、EGFR抑制剂、ERK抑制剂、雌激素/孕激素受体抑制剂、γ分泌酶抑制剂、谷氨酸受体配体(增强剂)、GSK-3抑制剂、HDAC激活剂、HDAC抑制剂、Hedgehog/Smoothened激动剂、IGF-IR抑制剂、白细胞介素受体抑制剂、IRAK抑制剂、JAK/STAT抑制剂、MAO抑制剂、MEK抑制剂、线粒体自噬抑制剂、NF-kB抑制剂、NF-kB-AMPK-酪氨酸激酶通路抑制剂、Notch-1抑制剂、P450抑制剂、PAEF抑制剂、PDE抑制剂、PPAR抑制剂、TGF-β受体抑制剂、TGF-beta/Smad抑制剂、TNF受体抑制剂、Wnt/β-连环蛋白通路激活剂。
如本说明的试验例所示，利用本发明的筛选方法作为有效成分选择出的化合物具有上述的主要作用。只要是与本说明的试验例中作为有效而选择出的化合物的主要作用相同的化合物，则利用本发明的筛选方法作为有效的化合物而选择出的概率高。因此，将具有上述的主要作用的化合物作为候补物质供于A工序的方式可实现高效率筛选，是优选的。
作为候补物质，可以使用具有上述的主要作用的已知的化合物。化合物的主要作用点(靶点)被整理在各种数据库中，并以可检索的状态注册，因此优选利用这些数据库。作为这样的化合物数据库，可列举出PubChem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、ChemBank(http：//chembank.broadinstitute.org/welcome.htm)、myPresto(http：//presto.protein.osaka-u.ac.jp/myPresto4/)、LigandBox(http：//ligandbox.protein.osaka-u.ac.jp/ligandbox/)、ZINC(http：//zinc.docking.org/)、ChEBI(http：//www.ebi.ac.uk/chebi/)、ChEMBL(https：//www.ebi.ac.uk/chembl/)、CTDComparative Toxicogenomics Database(http：//ctd.mdibl.org/)、ChemSpider(http：//www.chemspider.com/)、ChemCupid(http：//www.namiki-s.co.jp/chemcupid/)、日化辞(http：//nikkajiweb.jst.go.jp/nikkaji_web/pages/top.html)、KEGG LIGAND(http：//www.genome.jp/kegg/ligand.html)、DrugBank(http：//www.drugbank.ca/)、SuperDrug(http：//bioinformatics.charite.de/superdrug2/)、SuperTarget(http：//bioinf-apache.charite.de/supertarget/)、SuperNatural(http：//bioinformatics.charite.de/supernatural2/)、PharmGKB(http：//www.pharmgkb.org/)、Het-PDB Navi、STITCH(http：//hetpdbnavi.nagahama-i-bio.ac.jp/)、GLIDA(http：//pharminfo.pharm.kyoto-u.ac.jp/services/glida/)、HIC-Up(http：//xray.bmc.uu.se/hicup/)、Dundee Prodrg2(http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg/)等。
本发明的一个实施方式中，候补物质包含利用in silico法推测出是选自上述A组中的1种或2种以上的物质。
使用了培养细胞或实验动物的筛选由于花费成本和时间，因此将所有能利用的化合物文库作为候补物质供于筛选是不切实际的。因此，在现代药物开发中广泛使用利用了计算机的in silico筛选。本发明中也优选：将利用insilico推测出是具有上述主要作用的化合物的化合物作为候补物质。
对基于in silico法的推测进行详述。为了进行in silico药物开发，需要使用一些理论在现实世界中的生物体内、细胞内、或试管内对药品引起的现象进行模型化(modeling，建模)。根据所利用的建模理论的种类进行分类，可以大致分为信息学方法和模拟方法。
信息学方法主要利用药品(配体)侧的结构活性相关信息，因此也被称为LBDD法(Ligand-Based Drug Discovery，基于配体的药物发现)，通过基于相似性指标、统计理论的机器学习实现模型化。机器学习也是人工智能的一项基本技术。
模拟方法是使用蛋白质的结构信息并基于古典分子力场、量子力学、分子动力学等理论在计算机上模拟蛋白质和药品的相互作用的方法，由于其基于蛋白质的结构，因此被称为基于结构的药物发现(SBDD：Structure-Based DrugDiscovery)。
需要说明的是，蛋白质的三维结构的信息例如注册在PDBj(https：//pdbj.org/)、RCSB DB(https：//www.rcsb.org/)、BMRB(https：//bmrb.io/)、PDBe(https：//www.ebi.ac.uk/pdbe/)等数据库中，因此可以利用这些数据库。另外，也可以新实施NMR、X射线晶体结构解析等来对三维结构进行解析。另外，也可以从氨基酸序列预测蛋白质的三维结构，将其用于SBDD法。
本发明的一个实施方式中，候补物质包含：利用LBDD法推测出是选自上述A组中的1种或2种以上的物质。即，将具有如下结构的化合物作为候补物质，所述结构为：参照以已知具有上述A组的主要作用的多种化合物(配体)为基础的结构活性相关信息而预测具有相同的主要作用的结构。结构活性相关信息可以通过基于各种相似性指标(分子量、官能团的结构、电子密度、疏水性、亲水性、骨架等)、统计理论的机器学习来实现模型化。
基于LBDD法的药物开发已广泛实施，在实施本发明时也可以利用无偿提供或有偿提供的各种软件。
本发明的一个实施方式中，候补物质包含：利用SBDD法推测出是选自上述A组中的1种或2种以上的物质。即，准备成为A组的主要作用靶点的蛋白质的立体结构座标，利用计算机，利用该立体结构信息对口袋进行解析，选择推测与其结合的化合物作为候补物质。目前，可以使用性能极高的超级计算机，因此优选利用其来实施SBDD法。
本发明的一个实施方式中，候补物质包含：利用LBDD法和SBDD法推测出是选自上述A组中的1种或2种以上的物质。
LBDD法(信息学方法)和SBDD法(模拟方法)是相辅相成的关系。信息化设计具有如下优点：计算时间短，准确率等精度稳定而不太依赖于所利用的建模研究者的熟练度。另一方面，具有如下缺点：只能面向与所利用的已知药剂具有相同的结合位点、结合模式的化合物。
若利用模拟，则具有能够根据物理定律预测精密的结合自由能、能够以蛋白质的所有可能的结合位点为对象来展开药物开发的优点，具有弥补信息学缺点的可能性。然而，模拟也取决于水平，有计算时间非常长的缺点、及计算的设定不适合的情况下存在完全失败的风险。
基于以上的理由，优选将LBDD法和SBDD法组合使用来选择候补物质的实施方式。
通过将Oct3/4、Klf4、c-Myc、和Sox2之类的转录因子导入体细胞，从而能够由体细胞得到诱导多能干细胞(iPS细胞)。这4种因子在维持干细胞的自我复制能力和多分化特性方面发挥极其重要的作用。可以说能够提高这4种因子的表达的化合物能用作再生药物的可能性高。实际上如后述的试验例所示，确认利用本发明的筛选方法选择出的有效成分具有提高这些转录因子的表达的作用。
根据以上，本发明中，优选前述候补物质为正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质。通过采用这样的实施方式，从而能够实现高效的筛选。
本实施方式中，可以将已知正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质设为候补物质。具有这种表达控制作用的物质可以通过参照化合物数据库来选择。
本发明中，可以将已知在体外正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质设为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将利用in silico法推测出正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质作为候补物质。
如上所述，已知有很多正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的化合物，包括其主要作用点的信息在内存储在化合物数据库中。另外，成为其主要作用点的蛋白质的三维结构也有很多注册在蛋白质数据库中。若以这些信息为基础应用SBDD法、LBDD法等in silico法，则能够容易地探索推测发挥上述表达控制作用的物质。
本发明的一个实施方式中，前述候补物质为正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子的激动剂。
通过参照整理并存储了已知的蛋白质的功能等的蛋白质数据库等而能够容易地把握该因子。此外，对于该因子的激动剂，通过参照上述的化合物数据库而能够容易地把握。
通过将这样的激动剂设为候补物质，从而能够有效地筛选再生药物的有效成分。
本发明的一个实施方式中，候补物质为负调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子的拮抗剂。
通过参照整理并存储了已知的蛋白质的功能等的蛋白质数据库等而能够容易地把握该因子。此外，对于该因子的拮抗剂，通过参照上述的化合物数据库而能够容易地把握。
通过将这样的拮抗剂设为候补物质，从而能够有效地筛选再生药物的有效成分。
需要说明的是，整理并存储了已知的蛋白质的功能等的蛋白质数据库通常以可利用的方式提供。这样的数据库中存储有由公开的学术论文等对于蛋白质彼此的相互作用信息通过文本挖掘进行自动提取而成的信息、或对此进行手动记录的信息。另外，收集大量的微阵列数据，存储与表达状况具有相关性的蛋白质彼此的关联信息。作为这样的数据库，例如可列举出ASEdb(http：//nic.ucsf.edu/asedb/)、Bacteriome.org(http：//www.compsysbio.org/bacteriome/)、BioGRID(http：//www.thebiogrid.org/)、DACSIS(http：//cib.cf.ocha.ac.jp/DACSIS/)、DIP(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/)、DroID(http：//www.droidb.org/)、HCPIN(http：//nesg.org：9090/HCPIN/index.jsp)、HPID(http：//wilab.inha.ac.kr/hpid/)、HPRD(http：//www.hprd.org/)、HUGE ppi(http：//www.kazusa.or.jp/huge/ppi/)、IntAct(http：//www.ebi.ac.uk/intact/)、Pathguide(http：//www.pathguide.org/)、POINT(http：//point.bioinformatics.tw/Welcome.do)、ProNIT(http：//gibk26.bio.kyutech.ac.jp/jouhou/pronit/pronit.html)、Protein-Protein Interaction Panel(http：//genome.gsc.riken.go.jp/ppi/)、STRING(http：//string.embl.de/)等。
本发明的一个实施方式中，候补物质为通过计算机推测出正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子的激动剂的物质。
本实施方式可以通过存储蛋白质的相互作用信息的上述的数据库与基于上述的LBDD法、SBDD法的in silico法的组合来实施。即，通过参照存储蛋白质的相互作用信息的上述的数据库而能够确定正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子。接着，选择利用in silico法推测为该因子的激动剂的化合物作为候补物质。
这样的候补物质通过正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上而具有作为再生药物的潜在可能性。因此，根据本实施方式的筛选方法，能够有效地选择有效成分。
本发明的一个实施方式中，候补物质为通过计算机推测出负调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子的拮抗剂的物质。
本实施方式可以通过存储蛋白质的相互作用信息的上述的数据库与基于上述的LBDD法、SBDD法的in silico法的组合来实施。即，通过参照存储蛋白质的相互作用信息的上述的数据库而确定负调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的因子。接着，选择利用in silico法推测为该因子的拮抗剂的化合物作为候补物质。
这样的候补物质通过正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上而具有作为再生药物的潜在可能性。因此，根据本实施方式的筛选方法，能够有效地选择有效成分。
另外，本发明的一个实施方式中，候补物质是通过计算机推测出对生物体的毒性低的物质。
现代的药物开发中，广泛进行了利用in silico法的化合物的安全性评价。本实施方式中，由于以经过了基于in silico法的安全性评价的物质作为候补物质，因此能够提高将作为筛选结果而选出的有效成分作为药物提供的可能性。
Notch信号传递是多细胞生物中进化上保守性良好的通路，在发育过程中决定细胞的命运，维持成体组织的稳定性。Notch通路介导细胞接触型的信号传递。在该传递通路内，输送信号的细胞和接收信号的细胞这两者受到配体与受体串扰的影响，由此可控制神经系统、心脏系统、免疫系统和内分泌系统的发育过程中的一系列的细胞命运决定机制。Notch受体为单跨膜型蛋白，由功能性胞外域(NECD)、跨膜结构域(TM)、和胞内结构域(NICD)组成。Notch受体中存在1至4这4组。Notch受体在信号接收细胞的内质网、高尔基体中经过切割(S1切割)、糖链修饰等加工，产生通过Ca2+稳定化的异源二聚体，其由插入膜内的TM-NICD和以非共价键的方式结合的NECD构成。加工后的Notch受体通过内体输送至细胞膜，受Deltex的控制和受NUMB的抑制，由此能够与配体结合。
Delta-like的成员(DLL1、DLL3、DLL4)、Jagged家族(JAG1、JAG2)作为Notch信号传递受体的配体发挥作用。若与配体结合，则NECD从TM-NICD结构域被TACE(TNF-αADAM金属蛋白酶转化酶)切割(S2切割)。在NECD与配体结合的状态下，在信号发送细胞内通过Mib进行泛素化依赖性内吞/再循环。在信号接收细胞内，γ-分泌酶从TM中释放NICD(S3切割)。由此NICD转移至核内，在此与CSL(CBF1/Su(H)/Lag-1)转录因子复合体结合，诱导作为Notch的标准靶基因的Myc、p21、HES家族等的激活。
报道了：抑制Notch信号会抑制癌干细胞的自我复制(Self-renewal)和干性(Stemness)维持(非专利文献13、非专利文献14)。另外，Notch信号通路在心脏发育过程中发挥各种作用，但还有在体外促进或损害心肌形成这一看似矛盾的证据(非专利文献15)。
据称Notch信号对于发育过程中的脑中维持神经祖细胞(NPC)至关重要，Notch信号通路的激活使NPC维持增殖状态，但通路的重要的构成要素中的功能丧失型突变引起早熟的神经元分化和NPC耗尽(非专利文献16)。Notch信号的调节器、例如Numb蛋白可以对抗Notch效果，导致细胞周期的停止和NPC的分化(非专利文献17、非专利文献18)。如此，Notch信号通路控制NPC的自我复制和细胞命运。
另外，已知：Notch信号的过度激活突变导致T细胞急性淋巴细胞性白血病，Notch信号的活性降低型突变导致皮肤癌之一的基底细胞癌。如此，Notch信号根据其所作用的组织而具有可以作为癌症基因以及癌症抑制基因发挥作用的两面性(非专利文献19)。
如上所述，已知：Notch信号的激活促进NPC的增殖，抑制分化。另外，已知：在血细胞中，Notch信号的激活对于造血干细胞的自我复制和未分化能力的维持是重要的。然而，还已知Notch信号的激活诱导表皮细胞的分化(非专利文献20)。即，Notch信号根据细胞所处的状态而具有诱导未分化细胞的自我复制、未分化能力的维持、或相反诱导分化这种两面性。
还报道了：Notch信号同时激活基因的表达和该基因的抑制因子的表达。该报道启示出Notch信号的激活后的响应能力可能具有瞬时性。进而，Notch信号传递通路的靶点由正调节因子和负调节因子这两者构成，因此可以说细胞已经为这两种结果做好了准备。这被认为是Notch信号所显示的两面性(未分化细胞的自我复制/未分化能力的维持和分化诱导)的重要因素(非专利文献21)。
如此Notch信号通路具有控制未分化细胞的维持和控制分化的重要功能。特别重要的是：Notch信号根据细胞所处的状态而具有与未分化细胞的自我复制/未分化能力的维持和诱导分化看似相反的作用。强烈推测：通过单一试剂引起未分化细胞的自我扩增和分化诱导这两者的利用本发明的筛选方法发现的有效成分的作用起因于Notch信号所具有的两面性。实际上如后述的试验例中所示，依据本发明的筛选方法，作为有效成分筛选出多种Notch信号传递通路的抑制剂(Notch-1抑制剂、γ分泌酶抑制剂)。基于该情况，通过将Notch信号传递通路作为靶标，极有可能能够实现更有效的有效成分的筛选。
即，本发明的一个实施方式中，将作用于Notch信号通路的物质、或推测作用于Notch信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为Notch信号通路的抑制剂的物质、或推测作为Notch信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1、JAG2中的1种或2种以上的Notch配体的表达抑制剂、选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1、JAG2中的1种或2种以上的Notch配体抑制剂、选自Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4中的1种或2种以上的Notch受体的抑制剂、S1切割的抑制剂(弗林蛋白(PACE)抑制剂)、S2切割的抑制剂(TACE抑制剂)、S3切割的抑制剂(γ-分泌酶抑制剂)、以及NICD的核内中的转录因子复合体的形成抑制剂等。
这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为Notch信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为Notch信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，依据本发明的筛选方法，筛选了Notch信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为Notch信号通路的激动剂的物质、或推测作为Notch信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1、JAG2中的1种或2种以上的Notch配体的表达提高剂、选自Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4中的1种或2种以上的Notch受体的激动剂等。
这些激动剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为Notch信号通路的激动剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为Notch信号通路的激动剂的化合物。
另外，mTOR感知葡萄糖、氨基酸等营养源，是发挥细胞的增殖、代谢、存活中的调节因子作用的丝氨酸/苏氨酸激酶。作为抗生素纳巴霉素的靶分子发现的这种酶，近些年证实了：形成由mTOR、Raptor、mLST8(GβL)构成的mTORC1及由mTOR、Rictor、mLST8(GβL)、Sin1构成的mTORC2这两种复合体，具有独立的网络。
复合体mTORC1除了被前述的营养源活化之外，还被生长因子、激素、应激等激活，使4EBP1、p70S6K之类的与蛋白质合成、细胞增殖相关的分子磷酸化，参与mRNA的翻译、自噬的抑制、核糖体的生物合成等。
另一方面，复合体mTORC2不受营养源的调节，被受到生长因子刺激的PI3K激活，使Akt、SGK、PKC磷酸化，参与凋亡的抑制、细胞的生长、细胞骨架的控制等。
其中，PI3K/AKT/mTOR信号通路在大部分癌症中被激活，因此作为抗癌药的靶标进行了深入研究。PI3K是使磷脂酰肌苷(PtdIns)的肌醇环的3’-羟基磷酸化的独特的细胞内脂质激酶家族，分为3类。研究最多的是I类的PI3K，其促进与膜结合的磷脂酰肌醇-(4,5)-二磷酸(PIP2)转化为磷脂酰肌醇-(3,4,5)-三磷酸(PIP3)。PIP3作为第二信使发挥作用，促进PI3K依赖性激酶-1(PDK1)等具有PH结构域的激酶的募集和激活。PIP3的信号传递受PTEN控制，所述PTEN与PI3K的活性相反。也已知作为蛋白激酶B(PKB)的丝氨酸/苏氨酸激酶AKT具有PH结构域，与PDK1一起被募集到细胞膜上。通过PDK1和mTORC2使氨基酸残基T308和S473的磷酸化对于AKT的完全激活至关重要。
被激活的AKT使大多数靶标蛋白质、特别是糖原合成酶激酶3(GSK3)、结节性硬化症2(TSC2)、胱天蛋白酶9、PRAS40(AKT1S1)磷酸化，发挥促进细胞的增殖、分化、凋亡、血管新生、代谢的相对广谱的下游效果。
PI3K/AKT/mTOR信号通路的构成要素缺失时，大多数情况导致胚胎死亡，从而使得在发育过程中的该通路的研究很难。然而，随着ES细胞和iPS细胞的出现，该问题在一定程度上得到缓解。作为其结果，证实了：PI3K/AKT/mTOR信号通路在胚胎发育方面是重要的，对于iPS细胞的自我复制是至关重要的。在人ES细胞和小鼠ES细胞中，尽管培养、增殖所需的信号种类有较大差异，但由使用了激酶抑制剂、遗传学方法的研究证实了，哪种类型的ES细胞均需要激活PI3K/AKT信号以维持未分化的性质。用通常的PI3K抑制剂或p110β特异的抑制剂对小鼠ES细胞进行处理时，其多能性会受损，PI3K基因的缺损也会导致小鼠ES细胞的多能性丧失。同样地，在人ES细胞中抑制PI3K时，同时发生多能性标记物的下调和系统特异性基因的上调，这些均强烈启示出多能性的丧失。为了支持这点，在小鼠ES细胞和人ES细胞这两者中敲除Pten时，可促进这些细胞的增殖和存活(非专利文献22)。
另外，在研究中广泛使用的ES细胞的培养中添加LIF，获知LIF受体激活PI3K/AKT信号通路。LIF之前被鉴定为IL-6家族的一种细胞因子，在ES细胞的培养中被用作分化抑制剂(全能性的维持)。
如此，PI3K/AKT/mTOR信号通路在干细胞的自我复制和多能性的维持和分化控制中担负重要的作用。因此，本发明的筛选方法也可以是以PI3K/AKT/mTOR信号通路作为靶标的实施方式。
即，本发明的一个实施方式中，将作用于PI3K/AKT/mTOR信号通路的物质、或推测作用于PI3K/AKT/mTOR信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂的物质、或推测作为PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出PI3K抑制剂、AKT抑制剂、mTOR抑制剂、mTORRC1抑制剂、mTORC2抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K/mTOR抑制剂等。这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，通过本发明的筛选方法筛选了PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为PI3K/AKT/mTOR信号通路的激动剂的物质、或推测作为PI3K/AKT/mTOR信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出PTEN抑制剂、PI3K激活剂等。
这些抑制剂、激活剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂和激活剂利用信息学方法能够容易地把握推测为PI3K/AKT/mTOR信号通路的激动剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为PI3K/AKT/mTOR信号通路的激动剂的化合物。
JAK/STAT信号通路是将来自细胞外的化学信号传递至细胞核、引起DNA的转录和表达的信息转导系统。参与免疫、细胞增殖、分化、凋亡、致癌等。JAK/STAT信号级联主要由存在于细胞表面的干扰素、白细胞介素、生长因子等细胞因子的受体、JAK和STAT这3种因子构成。
其机制是：首先，配体(干扰素、白细胞介素、生长因子等)结合时受体激活JAK，并表达该激酶活性。激活JAK使受体的酪氨酸残基磷酸化，生成具有受体的SH2结构域的蛋白质的结合位点。具有SH2结构域的STAT与被JAK磷酸化的酪氨酸位点结合，STAT本身被JAK磷酸化。酪氨酸残基被磷酸化的活性型STAT形成异源或同源二聚体，移动至细胞核中，引起靶基因的转录。需要说明的是，STAT也可以直接被受体的酪氨酸激酶(上皮细胞生长因子受体等)酪氨酸磷酸化，也可以被非受体的细胞质内的酪氨酸激酶(c-src等)酪氨酸磷酸化。
该JAK/STAT信号通路在多个阶段受到负调控。蛋白质酪氨酸去磷酸化酶使细胞因子受体、被激活的STAT去磷酸化、失活。另外，已知：细胞因子信号抑制物质(SOCS)与JAK结合，抑制JAK与STAT的结合和磷酸化、或竞争性抑制细胞因子受体的磷酸化酪氨酸。STAT通过激活STAT抑制蛋白(PIAS)在核内被负调控。例如，PIAS1、PIAS3通过与DNA结合并抑制，从而抑制基于STAT1、STAT3的转录激活。
在最近的研究中，示出了在果蝇中生殖细胞系统和成体干细胞的重要的稳态过程、以及包括性腺、肠道、附属器在内的一些组织的再生过程中进行调节(非专利文献23)。另外，报道了哺乳动物的视网膜中基于JAK/STAT和MAPK信号通路的Muller细胞的干细胞特性的调节(非专利文献24)。
另外，已知：研究中广泛使用的ES细胞的培养中，作为分化抑制剂添加LIF，但LIF受体激活JAK/STAT信号通路。
如此，JAK/STAT信号通路在干细胞的调控中担负重要作用。另外，如后述的试验例所述，通过本发明的筛选方法筛选了多种JAK/STAT抑制剂。
因此，本发明的筛选方法也可以是以JAK/STAT信号通路为靶标的实施方式。
即，本发明的一个实施方式中，将作用于JAK/STAT信号通路的物质、或推测作用于JAK/STAT信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为JAK/STAT信号通路的抑制剂的物质、或推测作为JAK/STAT信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出JAK抑制剂、STAT抑制剂等。这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为JAK/STAT信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为JAK/STAT信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，通过本发明的筛选方法筛选了JAT/STAT信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为JAK/STAT信号通路的激动剂的物质、或推测作为JAK/STAT信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出PIAS抑制剂、SOCS抑制剂、PTP抑制剂等。
这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为JAK/STAT信号通路的激动剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为JAK/STAT信号通路的激动剂的化合物。
有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的构成要素传递、调节细胞外刺激，所述细胞外刺激用于控制、微调节包括从酵母到人类的真核生物中的增殖、细胞分裂、代谢、运动性、自然免疫、细胞应激反应、凋亡、和存活功能等极其重要的细胞功能。已知：MAPK信号通路存在4种主要的分支通路和十几种MAPK酶，至少分为7种不同的组。
MAPK级联的特征在于：由双特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(MAPK、MAPK激活因子(MEK、MKK、或MAPK激酶)、以及MEK激活因子(MEK激酶[MEKK]或MAPK激酶激酶)介导的3种蛋白激酶所产生的连续激活。经典的MAPK通路的激活始于细胞膜，在此通过低分子量GTP酶和各种蛋白激酶使MAPKKK磷酸化而将其激活。接着，MAPKKK使MAPKK直接磷酸化，被激活的MAPKK使MAPK磷酸化。被激活的MAPK与多个细胞质内底物相互作用而进行磷酸化，最终调节诱导状态特异性基因表达的转录因子。
在被生长因子激活的通路中，作为MAPKKK已知A-Raf、B-RAF、Mos和Tpi-2，作为MAPKK已知MEK1/2，作为MAPK已知ERK1/2，作为其下游因子已知Elk-1、Ets-2、RSK、MNK、MSK、cPLA2等。
通过应激、细胞因子、生长因子等被激活的通路中，作为MAPKKK，已知MLK3、TAK1、MEKK4和ASK1，作为MAPKK，已知MKK3/6，作为MAPK，已知p38α/β/γ/5，作为其下游因子，已知CHOP、ATF2、MNK、MSK、MEF2、Elk-1。
通过应激、细胞因子、生长因子被激活的通路中，作为MAPKKK，已知MEKK1/4、DLK、MLK1-4、LZK、TAK1、ASK1和ZAK，作为MAPKK已知MKK4/7，作为MAPK，已知JKK1、2、3，作为其下游因子，已知JUN、ATF2、RNPK、p53、NFAT4、Shc等。
通过应激、生长因子被激活的通路中，作为MAPKKK，已知MEKK2/3，作为MAPKK已知MEK5，作为MAPK已知ERK5，作为其下游因子，已知MEF2。
另外，研究中广泛使用的ES细胞的培养中，作为分化抑制剂添加LIF，但已知LIF受体激活MAPK信号通路(RAS-RAF-MEK-ERK通路)。已知该信号通路是维持自我复制和全能性所必须的。
如此，MAPK信号通路在干细胞的调控中担负重要作用。另外，如后述的试验例所述，通过本发明的筛选方法而筛选了多种MAPK信号通路抑制剂。
因此，本发明的筛选方法也可以是以MAPK信号通路为靶标的实施方式。
即，本发明的一个实施方式中，以作用于MAPK信号通路的物质、或推测作用于MAPK信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为MAPK信号通路的抑制剂的物质、或推测作为MAPK信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出选自A-Raf抑制剂、B-RAF抑制剂、Mos抑制剂、Tpi-2抑制剂、MEK1/2抑制剂、ERK1/2抑制剂、Elk-1抑制剂、Ets-2抑制剂、RSK抑制剂、MNK抑制剂、MSK抑制剂、cPLA2抑制剂、MLK3抑制剂、TAK1抑制剂、MEKK4抑制剂、ASK1抑制剂、MKK3/6抑制剂、p38α/β/γ/5抑制剂、CHOP抑制剂、ATF2抑制剂、MNK抑制剂、MSK抑制剂、MEF2抑制剂、Elk-1抑制剂、MEKK1/4抑制剂、DLK抑制剂、MLK1-4抑制剂、LZK抑制剂、TAK1抑制剂、ASK1抑制剂、ZAK抑制剂、MKK4/7抑制剂、JKK1,2,3抑制剂、JUN抑制剂、FOS抑制剂、ATF2抑制剂、RNPK抑制剂、p53抑制剂、NFAT4抑制剂、Shc抑制剂、MEKK2/3抑制剂、MEK5抑制剂、ERK5抑制剂、MEF2抑制剂中的1种或2种以上。这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为MAPK信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为MAPK信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，通过本发明的筛选方法筛选了MAPK信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为MAPK信号通路的激动剂的物质、或推测作为MAPK信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出白细胞介素受体激活剂等。
这些激活剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为MAPK信号通路的激动剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为MAPK信号通路的激动剂的化合物。
转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)、Nodal、激活蛋白、BMP等是属于TGF-β超家族的细胞因子，调节细胞的各种功能。通过TGF-β超家族所控制的生命现象涉及到细胞的增殖抑制、分化、细胞死亡、血管新生、免疫、细胞外基质产生、老化等多种。受到在细胞外发挥作用的TGF-β超家族的刺激的细胞在细胞膜上将该刺激转换为转录因子SMAD的磷酸化。TGF-β超家族大致分为由TGF-β/Nodal/激活蛋白构成的组、及由BMP构成的组，但TGF-β/Nodal/激活蛋白的刺激转换为SMAD2和SMAD3(SMAD2/3)的磷酸化，BMP的刺激转换为SMAD1、SMAD5和SMAD8(SMAD1/5/8)的磷酸化。这些SMAD(SMAD1/2/3/5/8)称为R-SMAD(receptor-regulated SMAD、调节型SMAD)。已知的是，以依赖于TGF-β超家族的刺激的方式被磷酸化的R-SMAD与被称为Co-SMAD(common-mediator SMAD、通用型SMAD)的SMAD4形成异源三聚体，转移至核内，进行各种基因表达的调节(激活、抑制)。另外，与R-SMAD、Co-SMAD不同地，也存在负调控TGF-β超家族的功能的I-SMAD(inhibitory SMAD、抑制型SMAD，SMAD6 SMAD7)。
干细胞的领域中，BMP-4是血清来源的重要因子，与LIF一起将小鼠的ES细胞维持在未分化的状态，理解该作用需要激活细胞内的特定的信息传递通路(Smad通路)。然而，随着包括人的ES细胞在内的其它干细胞的见解积累，还指出BMP大多数情况会促进干细胞的分化。
如此，TGFβ/SMAD信号通路在干细胞的调控中担负重要作用。另外，如后述的试验例所述，通过本发明的筛选方法而筛选了多种TGFβ/SMAD抑制剂。
因此，本发明的筛选方法也可以是以TGFβ/SMAD信号通路为靶标的实施方式。
即，本发明的一个实施方式中，将作用于TGFβ/SMAD信号通路的物质、或推测作用于TGFβ/SMAD信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为TGFβ/SMAD信号通路的抑制剂的物质、或推测作为TGFβ/SMAD信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出Tβ受体抑制剂、Nodal受体抑制剂、激活蛋白受体抑制剂、BMP受体抑制剂、SMAD抑制剂等。这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为TGFβ/SMAD信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为TGFβ/SMAD信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，通过本发明的筛选方法而筛选了TGFβ/SMAD信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为TGFβ/SMAD信号通路的激动剂的物质、或推测作为TGFβ/SMAD信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出Tβ受体激动剂、Nodal受体激动剂、激活蛋白受体激动剂、BMP受体激动剂、SMAD激活剂等。
这些激动剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述激动剂利用信息学方法能够容易地把握推测为TGFβ/SMAD信号通路的激动剂的化合物。另外，基于上述激动剂的目标蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为TGFβ/SMAD信号通路的激动剂的化合物。
人中迄今为止已经鉴定出19种WNT基因。其中的一部分基因选择性地被剪接，作为基因产物的Wnt蛋白具有多个亚型。Wnt蛋白主要与作为7次跨膜型受体蛋白的Frizzled受体结合，向细胞内传递信号。Frizzled受体由10种左右的蛋白质/家族构成，这些蛋白质的表达根据细胞种类而不同，有助于细胞种类和信号传递的特异性。
β-连环蛋白(β-Catenin)的细胞内量在Wnt信号关闭状态下维持在较低水平。在该状态下，β-连环蛋白被引入由结肠腺瘤样息肉基因(Adenomatous Polyposis Coli，APC)等构成的分解复合体，通过作为丝氨酸/苏氨酸激酶的酪蛋白激酶1(Casein kinase 1，CK1)、糖原合成酶3β(Glycogen synthase 3b，GSK3β)磷酸化，然后，通过β转导重复相容蛋白(β-Transducin repeat containing protein，bTrCP)被泛素化，通过蛋白酶体被分解。
另一方面，Wnt信号被激活的情况下，Dishevelled募集使GSK3β从分解复合体上脱离的GBP/Frat-1，起到保护β-连环蛋白的作用。此时Frodo和β-拘留蛋白与Dishevelled一起发挥作用。另一方面，Dapper作为Dishevelled的拮抗剂发挥作用。另外，作为低密度脂蛋白受体相关蛋白家族的LRP5/LRP6作为介导β-Catenin的Wnt信号传递标准通路的偶联受体发挥作用。
介导β-Catenin的标准通路(Canonical cascade)中，Wnt信号被激活后，使β-Catenin稳定化，并转移至核内。在核内，激活TCF、Lymphoid Enhancer D1、PPARd、Twin等靶基因的转录。另一方面，Wnt信号处于关闭状态下，TCF/LEF与Groucho等转录调控因子结合，被非活性化。通过对基因进行转录调控的组蛋白脱乙酰化酶(Histone Deactylases；HDAC)来介导Groucho的转录调控活性。
ICAT、Duplin与β-连环蛋白结合，并抑制β-连环蛋白与TCF/LEF的相互作用，由此负调控标准通路。进而β-连环蛋白也参与细胞粘附，与E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白等I型经典钙粘蛋白的胞内结构域结合，进而与α-连环蛋白形成复合体。认为该钙黏蛋白/连环蛋白复合体借助其它分子与肌动蛋白细胞骨架相互作用。
在作为非标准级联之一的PCP(Planar Cell Polarity)通路的信号传递中，控制肌动蛋白细胞骨架、非对称的细胞骨架形成，并调节细胞的极性。若Wnt与Frizzled受体结合，则Dishevelled激活作为小分子GTPase的Rho、Rac。在经由Rho的信号传递中，Daam-1与Dishevelled和Rho形成复合体，激活Rho激酶ROCK。另一方面，在经由Rac的信号传递中，激活Jun激酶(JNK)而不与Daam-1相互作用。
在作为另一个非标准级联的Wnt/钙通路中，若Wnt与Frizzled受体结合，则在细胞质内释放出钙。作为Frizzled的偶联受体的Knypek、Ror2参与其中。另外，作为该通路的细胞内第二信使，已知异源三聚体G蛋白质、磷脂酶C(PLC)、蛋白激酶C(PKC)等。报道了Wnt/钙通路对细胞间粘附、原肠胚形成时的细胞动力学很重要。
Wnt信号的拮抗剂被分类为分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled RelatedProtein，sFRP)类和Dickkopf(Dkk)类这两类。sFRP类包括：作为sFRP家族的sFRP1-5、Wnt抑制因子-1(WIF-1)、Cerberus。这些拮抗剂直接与Wnt结合，抑制Wnt与受体的结合。另一方面，Dkk类中包含的Dkk1-4与LRP5/LRP6的胞外域结合，抑制Wnt信号。Kremen与跟LRP5/LRP6结合的Dkk结合，通过内吞将Dkk-LRP复合体引入细胞内部，由此使LRP在细胞表面上的露出消失。其结果，Wnt无法与受体结合，信号传递得到抑制。因此理论上，sFRP类的拮抗剂在Wnt信号传递中，抑制经由β-连环蛋白的标准通路和非标准通路这两者，Dkk类的拮抗剂仅选择性抑制标准通路。
分离的Wnt蛋白在神经干细胞、乳腺干细胞、胚胎干细胞等各种干细胞中显示出活性。通常，Wnt蛋白以维持干细胞的未分化状态的方式发挥作用(非专利文献25)。
如此，Wnt信号通路在干细胞的调控中担负重要的作用。另外，如后述的试验例所述，通过本发明的筛选方法Wnt/β-连环蛋白筛选了多种。
因此，本发明的筛选方法也可以是以Wnt信号通路为靶标的实施方式。
即，本发明的一个实施方式中，将作用于Wnt信号通路的物质、或推测作用于Wnt信号通路的物质作为候补物质。
本发明的一个实施方式中，将作为Wnt信号通路的抑制剂的物质、或推测作为Wnt信号通路的抑制剂的物质作为候补物质。
作为这样的抑制剂，可列举出Wnt抑制剂、Frizzled受体抑制剂。上述抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为Wnt信号通路的抑制剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为Wnt信号通路的抑制剂的化合物。
如后述的试验例中所示，通过本发明的筛选方法而筛选了Wnt信号通路的抑制剂作为有效成分。
本发明的一个实施方式中，将作为Wnt信号通路的激动剂的物质、或推测作为Wnt信号通路的激动剂的物质作为候补物质。作为这样的激动剂，可列举出GSK-3抑制剂、CK1抑制剂、bTrCP抑制剂、Pan-Proteasome抑制剂等。这些抑制剂存在大量公知者，可以通过参照化合物数据库来把握。另外，基于公知的上述抑制剂利用信息学方法能够容易地把握推测为Wnt信号通路的激动剂的化合物。另外，基于成为上述抑制剂的靶标的蛋白质的结构，通过模拟方法能够容易地把握推测为Wnt信号通路的激动剂的化合物。
需要说明的是，Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路通常被认为促进干细胞的自我复制、全能性的维持。然而，如后述的试验例中所示，在生物体内引起未分化细胞和分化细胞这两者的增加的化合物组包括这些信号通路的抑制剂和激活剂。由此可以说，任何作用于这些通路的物质，无论其是抑制剂还是激活剂，在生物体内诱发未分化细胞和分化细胞这两者增加的可能性均较高。
因此，在本发明的优选的实施方式中，将作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路(包括抑制和激活)的物质作为筛选的候补物质。
基于同样的理由，在本发明的优选的实施方式中，将利用in silico法推测作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路(包括抑制和激活)的物质作为筛选的候补物质。
另外，一个实施方式中，将后述的通式(I)、通式(II)、通式(III)中包含的化合物或其盐或其水合物作为候补物质向动物给予。
需要说明的是，作为盐，优选为药学上可接受的盐。作为盐，例如可列举出无机酸盐、有机酸盐、无机碱盐、有机碱基盐、酸性或碱性氨基酸盐等。
作为无机酸盐的优选的例子，例如可列举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等，作为有机酸盐的优选的例子，例如可列举出乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐等。
作为无机碱盐的优选的例子，例如可列举出钠盐、钾盐等碱金属盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、铝盐、铵盐等，作为有机碱盐的优选的例子，例如可列举出二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐等。
作为酸性氨基酸盐的优选的例子，例如可列举出天冬氨酸盐、谷氨酸盐等，作为碱性氨基酸盐的优选的例子，例如可列举出精氨酸盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐等。
以下对通式(I)～(III)进行详述。
[1-1-2-1]通式(I)
本发明的一个实施方式中，将以下的通式(I)中包含的化合物或其盐或其水合物作为候补物质向动物给予。
Figure BDA0003918123640000591
通式(I)中，环A可以为单环式的环，也可以为稠合双环式的环。
环A为单环式的环时，环A优选为3～8元、更优选为4～6元、更优选为5～6元、更优选为5元的环。
环A为稠合双环式的环时，环A优选为4～8元、更优选为5～8元、更优选为5～7元、更优选为5～6元的环。
优选的实施方式中，环A为单环式的环。
环A任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，环A中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为1～2个。
优选环A为不饱和。更优选环A为芳香环。
环A任选包含杂原子。
环A中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为2～3个、更优选为2个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择2～3个、更优选选择2个。
环A优选为包含杂原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的单环式芳香族杂环。
作为环A，具体而言，可列举出氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
作为环A的更优选方式，可列举出吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑、噻唑啉、异噻唑、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、吡啶、吡喃、硫代吡喃、二嗪、噁嗪、噻嗪、二噁英、二噻烷、三嗪、四嗪。
作为环A的更优选方式，可列举出吡咯、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、三唑、吡啶、二嗪、三嗪、四嗪。
作为环A的更优选方式，可列举出咪唑、吡唑、三唑、吡啶、二嗪、三嗪。
进一步优选环A为吡唑。
环A为吡唑时，R2与吡唑环的优选第3位～第5位中的任意者结合、更优选与第4位结合。
另外，由-L-R1组成的基团与吡唑环的优选第1位、第3位或第5位结合、更优选与第1位或第3位结合。
需要说明的是，吡唑环的编号基于以下所示的例子。
Figure BDA0003918123640000611
环A进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代。
此处所谓的C1～3的烷基可以为直链状或支链状。具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、甲基乙基等。
另外，作为此处所谓的卤素原子，优选列举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
优选的是，环A的氢原子中，任选1～3个、更优选1～2个、更优选1个被取代。
通式(I)中，L为任选被取代基R3取代的、C1～10的饱和或不饱和的烃链。
该烃链优选为C1～9、更优选为C1～8、更优选为C1～7、更优选为C1～6、更优选为C1～5、更优选为C1～4、更优选为C1～3、更优选为C1～2。
作为该烃链，具体可列举出-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH＝CHCH2CH2-、-CH2CH＝CHCH2-、-CH2CH2CH＝CH-、-CH＝CHCH＝CH-等。
该烃链任选被取代基R3取代。
取代基R3为任选被卤素原子取代的、任选具有环状结构的、C1～10的饱和或不饱和的烃基。
作为此处所谓的卤素原子，优选列举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
取代基R3优选为C1～10、更优选为C2～9、更优选为C3～8、更优选为C4～6。
取代基R3可以为直链状，也可以为支链状。
另外，取代基R3任选具有环状结构。在此情况下，该环优选为3～10元、更优选为4～8元、更优选为4～7元、更优选为4～6元、更优选为5～6元、更优选为5元的环。
另外，通式(I)中，L任选不存在。
通式(I)中，R1为以下定义的R1-1或R1-2。
R1-1：-C≡N、-COOH、-CHO、-COOCH3、-NO2、或卤素原子
R1-2：任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～8元的、
单环式或稠合双环式的基团。
R1-1更优选为-C≡N或-NO2。
R1-2可以为单环式的环，也可以为稠合双环式的环。
R1-2为单环式的环时，R1-2优选为3～8元、更优选为4～6元、更优选为5～6元、更优选为6元的环。
R1-2为稠合双环式的环时，R1-2优选为4～8元、更优选为5～8元、更优选为5～7元、更优选为5～6元的环。
优选的实施方式中，R1-2为单环式的环。
R1-2任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，R1-2中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为2～3个。
R1-2优选为不饱和。R1-2更优选为芳香环。
R1-2任选包含杂原子。
R1-2中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择1～2个、更优选选择1个。
R1-2优选为包含杂原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的单环式芳香族杂环。
作为R1-2，具体而言，可列举出氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
作为R1-2的更优选方式，可列举出吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑、噻唑啉、异噻唑、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、吡啶、吡喃、硫代吡喃、二嗪、噁嗪、噻嗪、二噁英、二噻烷、三嗪、四嗪。
作为R1-2的更优选方式，可列举出吡咯、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、三唑、吡啶、二嗪、三嗪、四嗪。
作为R1-2的更优选方式，可列举出咪唑、吡唑、三唑、吡啶、二嗪、三嗪。
进一步优选R1-2为吡啶。
R1-2进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代。
此处所谓的C1～3的烷基可以为直链状或支链状。具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、甲基乙基等。
另外，作为此处所谓的卤素原子，优选列举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
优选的是，R1-2的氢原子中，任选1～3个、更优选1～2个、更优选1个被取代。
优选的实施方式中，R1为R1-1的情况下，优选L存在。
另外，R1为R1-2的情况下，优选L不存在或未被前述R3取代。
通式(I)中，R2优选为3～20元、更优选为4～18元、更优选为6～16元、更优选为6～14元、更优选为6～12元、更优选为8～12元的环。
R2可以为单环式，也可以为稠合双环式。
R2为单环式的环时，R2优选为3～12元、更优选为4～10元、更优选为5～8元、更优选为5～6元的环。
R2为稠合双环式的环时，R2优选为5～20元、更优选为6～18元、更优选为8～16元、更优选为8～12元、更优选为8～10元、更优选为9～10元的环。
R2为稠合双环式的环时，R2优选为4元环与4元环、4元环与5元环、4元环与6元环、5元环与5元环、5元环与6元环、或者6元环与6元环的稠环。
R2任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，双键的数量优选为1～6个、更优选为2～6个、更优选为3～6个、更优选为4～5个。
R2优选为芳香环、更优选为稠合双环芳香环。
R2任选包含杂原子。
R2中包含的杂原子的数量优选为1～6个、更优选为1～5个、更优选为1～4个、更优选为1～3个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～6个、更优选选择1～5个、更优选选择1～4个、更优选选择1～3个。
R2优选为包含杂原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的稠合双环芳香族杂环。
R2优选为以下结构中的任意者。
Figure BDA0003918123640000651
上述式中的X表示碳原子或氮原子。由X表示的原子中，氮原子的总数为1～6个、更优选为1～5个、更优选为1～4个、更优选为1～3个，其余为碳原子。
[1-1-2-2]通式(II)
[1]本件化合物
本发明的一个实施方式中，将以下的通式(II)中包含的化合物或其盐或其水合物作为候补物质向动物给予。
Figure BDA0003918123640000652
通式(II)中，R1为氢原子、卤素原子或C1～20的烃基。
此处，作为卤素原子，优选列举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
以下对于R1为烃基的方式的情况进行更详细地说明。
此处，R1优选为C1～18、更优选为C1～16、更优选为C1～14、更优选为C1～12、更优选为C1～10。
R1任选为饱和或不饱和的。另外，R1可以为直链状或支链状。R1任选包含杂原子。杂原子优选选自氧原子、氮原子和硫原子。更优选R1包含氮原子。R1任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个杂原子。
另外，R1任选具有环状结构。该环状结构优选为3～8元环、更优选为4～7元环、更优选为5～6元环。
R1优选为以下的R1-1或R1-2的方式。
R1-1：为饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选被卤素原子取代的、C1～20的烃基。
R1-2：任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、任选被卤素原子或C1～3的烃基取代的、饱和或不饱和的、3～8元的环。
R1-1更优选为C1～18、更优选为C1～16、更优选为C1～14、更优选为C1～12、更优选为C1～10、更优选为C1～8、更优选为C1～6、更优选为C1～4、更优选为C1～3、更优选为C1～2。
另外，R1-1任选被氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子取代。
卤素原子的取代数可以优选为1～3、更优选为1～2、更优选为1。
R1-2优选为单环式的环或稠合双环式的环、更优选为单环式的环。
R1-2为单环式的环时，R1-2优选为3～8元、更优选为4～6元、更优选为5～6元、更优选为6元的环。
R1-2为稠合双环式的环时，R1-2优选为4～8元、更优选为5～8元、更优选为5～7元、更优选为5～6元的环。
R1-2任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，环中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为2～3个、更优选为3个。
R1-2优选为不饱和。R1-2更优选为芳香环。
R1-2任选包含杂原子。
R1-2中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择1～2个、更优选选择1个。
一个实施方式中，R1-2优选为包含杂原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的单环式芳香族杂环。
另外，另一实施方式中，R1-2为不含杂原子的芳香环、更优选为不含杂原子的单环式芳香环。
作为R1-2，具体而言，可列举出环丙烷、环丙烯、环丁烷、环丁烯、环丁二烯、环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
作为R1-2的更优选方式，可列举出环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑、噻唑啉、异噻唑、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、吡啶、吡喃、硫代吡喃、二嗪、噁嗪、噻嗪、二噁英、二噻烷、三嗪、四嗪。
作为R1-2的更优选方式，可列举出苯、吡咯、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、三唑、吡啶、二嗪、三嗪、四嗪。
作为R1-2的更优选方式，可列举出苯、咪唑、吡唑、三唑、吡啶、二嗪、三嗪。
进一步优选R1-2为苯或吡啶。
R1-2进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代。
此处所谓的C1～3的烷基可以为直链状或支链状。具体而言，可列举出甲基、乙基、丙基、甲基乙基等。
另外，作为此处所谓的卤素原子，优选列举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
优选的是，R1-2所构成的环的氢原子中，任选1～3个、更优选1～2个、更优选1个被取代。
通式(II)中，L1为以下中任意的2价基团。
Figure BDA0003918123640000691
更优选L1是以下所列举的任意的2价基团。这些彼此处于生物学等价值体的关系。
Figure BDA0003918123640000692
更优选L1是以下所列举的任意的2价基团。
Figure BDA0003918123640000693
更优选L1是以下的2价基团。
Figure BDA0003918123640000694
通式(II)中，L2为C1～30的烃基。L2更优选为C1～28、更优选为C1～26、更优选为C1～24、更优选为C1～22、更优选为C1～20、更优选为C1～18、更优选为C1～16、更优选为C1～14、更优选为C1～12、更优选为C1～10、更优选为C1～8。
L2为直链状。另外，L2任选为饱和或不饱和的。
另外，L2任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·C1～3的烃基
·任选被C1～3的烃基取代的羟基
·任选被C1～3的烃基取代的氨基
·任选被C1～3的烃基取代的硫酸基
·任选被C1～3的烃基取代的磷酸基
·卤素原子
更具体而言，L2任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·甲基、乙基、丙基或异丙基
·羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基
·氨基、或者氨基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基氨基
·硫酸基、甲基硫酸基、乙基硫酸基、丙基硫酸基或异丙基硫酸基
·磷酸基、或者磷酸基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基磷酸基
更优选L2任选被选自甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、氨基、硫酸基、磷酸基中的1种或2种以上的取代基取代。
更优选L2任选被选自甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、氨基、硫酸基、磷酸基中的1种或2种以上的取代基取代。
更优选L2任选被选自甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、氨基中的1种或2种以上的取代基取代。
更优选L2任选被选自甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基中的1种或2种以上的取代基取代。
更优选L2任选被氨基取代。
L2的取代数优选为1～3、更优选为1～2、更优选为1。
通式(II)中，R2为以下列举的任意的基团。
·任选被C1～3的烃基取代的羧基
·任选被C1～3的烃基取代的羟基
·任选被C1～3的烃基取代的异羟肟酸基
·任选被C1～3的烃基取代的磺基
·任选被C1～3的烃基取代的硼酸基
·任选被C1～3的烃基取代的氨基甲酰基
·任选被C1～3的烃基取代的氨磺酰基
·任选被C1～3的烃基取代的亚砜亚胺基
·氰基
·四唑基
更优选R2为以下列举的任意的基团。
·羧基、或者羧基的氢原子被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基
·异羟肟酸基、或者异羟肟酸基的氢原子被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·磺基、或者磺基的氢原子被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·硼酸基、或硼酸基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·氨基甲酰基、或者氨基甲酰基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·氨磺酰基、或者氨磺酰基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·亚砜亚胺基、或者亚砜亚胺基的氢原子被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的基团
·氰基
·四唑基
一个实施方式中，R2为羧基、羟基、异羟肟酸基、磺基、硼酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、亚砜亚胺基、氰基或四唑基。
更优选R2为羧基或异羟肟酸基。
一个实施方式中，R2为：任选被C1～3的烃基取代的羧基、或任选被C1～3的烃基取代的异羟肟酸基。
[1-1-2-3]通式(III)
本发明的一个实施方式中，将以下的通式(III)中包含的化合物或其盐或其水合物作为候补物质向动物给予。
Figure BDA0003918123640000721
通式(III)中，环A、环B和环C为3～8元的环、更优选为4～6元的环、更优选为5～6元的环、更优选为6元的环。
环A、环B和环C任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，环中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为2～3个、更优选为3个。
优选环A、环B和环C中至少1个、更优选至少2个、更优选全部为不饱和的。更优选环A、环B和环C为芳香环。
环A、环B和环C任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·卤素原子
·C1～3的烃基
·任选被C1～3的烃基取代的羟基
·任选被C1～3的烃基取代的氨基
·任选被C1～3的烃基取代的硫酸基
·任选被C1～3的烃基取代的磷酸基
更具体而言，环A、环B和环C任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·氟原子、氯原子、溴原子或碘原子
·甲基、乙基、丙基或异丙基
·羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基
·氨基、或者氨基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基氨基
·硫酸基、甲基硫酸基、乙基硫酸基、丙基硫酸基或异丙基硫酸基
·磷酸基、或者磷酸基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基磷酸基
环A、环B和环C任选包含杂原子。
环A、环B和环C中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为2个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择1～2个、更优选选择1个。
一个实施方式中，环A、环B和环C中的任意者优选为包含杂原子的芳香族杂环、更优选为包含氮原子的芳香族杂环。
另外，另一实施方式中，环A、环B和环C中的任意者为不含杂原子的芳香环。
一个实施方式中，环A、环B和环C全部为芳香环，其中环B为包含杂原子的芳香族杂环，环A和环C为不含杂原子的芳香环。
一个实施方式中，环A为进而任选被C1～3的烃基或卤素原子取代的、环己烷、环己烯、环己二烯或苯。
一个实施方式中，环B为包含1～3个氮原子的、饱和或不饱和的、进而任选被C1～3的烃基或卤素原子取代的、6元的单环式杂环。
一个实施方式中，环C为进而任选被C1～3的烃基、卤素原子或任选被C1～3的烃基取代的羟基取代的环己烷、环己烯、环己二烯或苯。
作为环A、环B和环C的具体例，可列举出环丙烷、环丙烯、环丁烷、环丁烯、环丁二烯、环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
作为环A、环B和环C的更优选方式，可列举出环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑、噻唑啉、异噻唑、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、吡啶、吡喃、硫代吡喃、二嗪、噁嗪、噻嗪、二噁英、二噻烷、三嗪、四嗪。
作为环A、环B和环C的更优选方式，可列举出苯、吡咯、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、三唑、吡啶、二嗪、三嗪、四嗪。
作为环A、环B和环C的更优选方式，可列举出苯、咪唑、吡唑、三唑、吡啶、二嗪、三嗪。作为二嗪，优选嘧啶。
进一步优选环A、环B和环C为苯或嘧啶。进一步优选环A和环C为苯，环B为嘧啶。
一个实施方式中，环A为环己烷、环己烯、环己二烯或苯。更优选环A为苯。
在此情况下，优选采用分别在环A的第1位和第2位的碳原子上分别结合有R1和L1的方式。
一个实施方式中，环B为包含1～3个氮原子的、饱和或不饱和的、被卤素原子取代的、6元的单环式杂环。更优选环B为被卤素原子取代的嘧啶。更优选环B为被氯原子取代的嘧啶。
在此情况下，优选采用分别在环B的第4位的碳原子上结合有L1、在第2位上结合有L2、在第5位上结合有氯原子的方式。
一个实施方式中，环C为被C1～3的烷氧基取代的环己烷、环己烯、环己二烯或苯。更优选环C为被甲氧基取代的环己烷、环己烯、环己二烯或苯。更优选环C为被甲氧基取代的苯。
在此情况下，优选采用分别在环C的第1位结合有L2、在第4位结合有R2、在第2位结合有甲氧基的方式。
通式(III)中，R1为选自以下的基团。
Figure BDA0003918123640000751
R1更优选为选自以下的基团。
Figure BDA0003918123640000752
此处，R3～R6各自独立地为以下任意的基团。
·氢原子
·C1～3的烃基
·任选被C1～3的烃基取代的羟基
·任选被C1～3的烃基取代的氨基
更优选R3～R6各自独立地为以下任意的基团。
·氢原子
·甲基、乙基、丙基或异丙基
·羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基
·氨基、或者氨基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基氨基
更优选R3～R6各自独立地为以下任意的基团。
·甲基、乙基、丙基或异丙基
·氨基、或者氨基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基氨基
更优选R3～R6各自独立地为甲基或单甲基氨基。
R7为氢原子、C1～3的烃基或任选被C1～3的烃基取代的氨基。
R7更优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、单甲基氨基、单乙基氨基、单丙基氨基或单异丙基氨基。
R7更优选为甲基或单甲基氨基。
n表示1～4的整数、更优选为1～3的整数、更优选为1～2的整数、更优选为1。
通式(III)中，L1、L2分别独立地为C1～3的亚烷基或亚烯基、-N(H)-或-O-。
更优选L1、L2分别独立地为C1～2的亚烷基或亚烯基、-N(H)-或-O-。
更优选L1、L2分别独立地为C1～2的亚烷基或亚烯基或-N(H)-。
上述的2价基团中，除-O-以外的基团、即C1～3的亚烷基或亚烯基和-N(H)-进而任选被C1～30的烃基取代。该C1～30的烃基任选为饱和或不饱和的。另外，该C1～30的烃基可以为直链状，也可以为支链状。另外，该C1～30的烃基任选具有环状结构，任选被卤素原子取代。进而，该C1～30的烃基也可以包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子。
通式(III)中，R2为C1～30、更优选为C2～28、更优选为C2～26、更优选为C2～24、更优选为C2～22、更优选为C2～20的烃基。
R2任选为饱和或不饱和的。另外，R2可以为直链状，也可以为支链状。
R2任选具有环状结构。R2的结构中包含的环结构的数量优选为1～3个、更优选为1～2个。该环结构可以为3～8元环，可以优选为4～7元环、可以更优选为5～6元环。
R2任选被卤素原子取代。作为卤素原子，可优选列举出氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。所取代的卤素原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。
R2任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个、优选为1～5个、更优选为1～4个杂原子。作为杂原子，可以优选示例出氮原子。
R2优选为以下所示的结构。
Figure BDA0003918123640000771
环D为3～8元的环、更优选为4～6元的环、更优选为5～6元的环、更优选为6元的环。
环D任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，环中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为2～3个、更优选为3个。优选环D为饱和的。
环D任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·卤素原子
·C1～3的烃基
·任选被C1～3的烃基取代的羟基
·任选被C1～3的烃基取代的氨基
·任选被C1～3的烃基取代的硫酸基
·任选被C1～3的烃基取代的磷酸基
更具体而言，可列举出环D任选被以下列举的1种或2种以上的取代基取代。
·氟原子、氯原子、溴原子或碘原子
·甲基、乙基、丙基或异丙基
·羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基或异丙氧基
·氨基、或者氨基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基氨基
·硫酸基、甲基硫酸基、乙基硫酸基、丙基硫酸基或异丙基硫酸基
·磷酸基、或者磷酸基中的1个或2个氢原子各自独立地被甲基、乙基、丙基或异丙基取代的烷基磷酸基
环D任选包含杂原子。
环D中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为2个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择1～2个、更优选选择1个。
作为环D的具体例，可列举出环丙烷、环丙烯、环丁烷、环丁烯、环丁二烯、环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
环D优选为被C1～3的烃基取代的哌嗪、更优选为被甲基取代的哌嗪。
L3为C1～20的2价烃基、更优选为C1～18、更优选为C1～16、更优选为C1～14、更优选为C1～12、更优选为C1～10、更优选为C1～8的2价烃基。
L3任选为饱和或不饱和的。另外，L3可以为直链状，也可以为支链状。
L3任选具有环状结构。L3的结构中包含的环结构的数量优选为1～2个、更优选为1个。该环结构可以为3～8元环，可以优选为4～7元环、可以更优选为5～6元环、可以更优选为6元环。
L3任选被卤素原子取代。作为卤素原子，可优选列举出氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。所取代的卤素原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。
L3任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个、优选为1～5个、更优选为1～4个杂原子。作为杂原子，可以优选示例出氮原子。
L3优选为以下所示结构的2价基团。
Figure BDA0003918123640000791
此处，m、l分别独立地表示1～4、优选为1～3、更优选为1～2的整数。更优选为m和l为1。
环E为3～8元的环、更优选为4～6元的环、更优选为5～6元的环、更优选为6元的环。
环E任选为饱和或不饱和的。为不饱和时，环中包含的双键的数量优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。优选环E为饱和的环。
环E也可以为杂环。在此情况下，环E中包含的杂原子的数量优选为1～4个、更优选为1～3个、更优选为1～2个、更优选为1个。
作为杂原子，可列举出氧原子、氮原子和硫原子，更优选列举出氮原子。
杂原子从氧原子、氮原子和硫原子中独立地选择1～4个、更优选选择1～3个、更优选选择1～2个、更优选选择1个。
作为环E的具体例，可列举出环丙烷、环丙烯、环丁烷、环丁烯、环丁二烯、环戊烯、环戊二烯、环己烯、环己二烯、苯、环戊烷、环庚烯、环庚二烯、环庚三烯、环辛烷、环辛烯、环辛二烯、环辛三烯、氮丙啶、吖丙因、环氧乙烷、环氧乙烯、磷杂环丙烷、磷杂环丙烯、硫杂环丙烷、硫杂环丙烯、二氮杂环丙烷、二氮丙啶、氮氧丙啶、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烯、硫杂环丁烷、硫杂环丁烯、二氮杂环丁烷、二氮杂环丁烯、二氧杂环丁烷、二氧杂环丁烯、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烯、吡咯烷、吡咯、四氢呋喃、呋喃、四氢噻吩、噻吩、咪唑烷、吡唑烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、噁唑烷、异噁唑烷、噁唑、噁唑啉、异噁唑、噻唑烷、异噻唑烷、噻唑、异噻唑、二氧戊环、二硫杂环戊烷、三唑、呋咱、噁二唑、噻二唑、二噁唑、二噻唑、四唑、噁四唑、噻四唑、五唑、哌啶、吡啶、吡啶鎓阳离子、四氢吡喃、吡喃、吡喃鎓阳离子、硫化环戊烷、硫代吡喃、硫代吡喃鎓阳离子、哌嗪、二嗪、吗啉、噁嗪、硫代吗啉、噻嗪、二氧杂环己烷、二噁英、二硫化环戊烷、二噻烷、六氢-1,3,5-三嗪、三嗪、三氧杂环己烷、三硫化环戊烷、四嗪、五嗪、氮杂卓、吖庚因、氧杂环庚烷、氧杂环庚三烯、硫杂环庚烷、硫杂卓、二氮杂卓、二吖庚因、硫氮杂卓、环庚亚胺、吖辛因、氧杂环辛烷、氧杂环辛烯、硫杂环辛烷、硫杂环辛烯、氮杂环壬烷、氮杂环壬烯、氧杂环壬烷、氧杂环壬烯、硫杂环壬烷、硫杂环壬烯等。
优选环E为环己烷或哌啶、更优选为哌啶。
另外，一个实施方式中，L3不存在。
[1-1-2-4]特定化合物的衍生物
本发明的一个实施方式中，将以下的化合物1～7的衍生物或其盐或它们的水合物作为候补物质向动物给予。
化合物1：3-环戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈化合物2：4-[3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]喹啉
化合物3：2-氨基-5-(乙基氨基)-5-氧代戊酸
化合物4：N1-羟基-N8-苯基辛二酰胺
化合物5：4-[(5-溴代吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸
化合物6：5-氯-2-N-{4-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-基]-2-甲氧基苯基}-4-N-[2-(二甲基磷酰基)苯基]嘧啶-2,4-二胺
化合物7：2-[[5-氯-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]嘧啶-4-基]氨基]-N-甲基苯磺酰胺
以下示出这7种化合物的结构。
Figure BDA0003918123640000821
这7种化合物在后述的实施例中已经确认对神经系统的疾患等具有治疗或预防效果。因此，只要是对这7种化合物的结构添加任意的基团、或将一部分结构置换为任意的结构、或删除一部分结构而成的衍生物，与这7种化合物同样地对神经系统的疾患等具有治疗或预防效果的可能性高。
因此，通过将这7种化合物的衍生物作为候补物质，从而能够有效地筛选对神经系统的疾患等发挥治疗或预防效果的有效成分。
需要说明的是，将这7种化合物的衍生物作为候补物质的情况下，可以是具备以下的A’工序；B工序和/或C工序；及D’工序的实施方式。
[A’工序]选择前述7种化合物中的任意者作为先导化合物，将该先导化合物的衍生物作为候补物质向动物(不包括人)给予的工序。
[B工序]对经过前述A工序的前述动物中的神经未分化细胞进行观察的工序。
[C工序]对经过前述A工序的前述动物中的神经系统分化细胞进行观察的工序。
[D’工序]与给予了前述先导化合物的情况相比，具有神经未分化细胞和/或神经系统分化细胞的增殖作用时，选择前述候补物质作为前述有效成分的工序。
通过这样的实施方式，从而将前述7种化合物作为先导化合物，能够进行其最适化。
[1-2]B工序
B工序是对经过A工序的前述动物中的未分化细胞进行观察的工序。
需要说明的是，本说明书中，“未分化细胞”包括干细胞和祖细胞这两者。
对未分化细胞进行观察的手段没有特别限定。可以适宜示例出对未分化细胞的标记物进行观察的手段、和对未分化细胞中特异性表达的报告基因进行观察的手段。以下对各手段的详情进行说明。
首先，说明对未分化细胞的标记物进行观察的手段。细胞根据其发育过程具有不同的形态/功能性特征。如此该特征在发育过程中发生变化源于各种基因的表达在每个发育过程中受到时间/空间上的控制的事实。具体而言，分化程度最低的干细胞中表达的大多是对于抑制分化、维持全能性的状态下自我复制而言所必需的基因。若分化进行，则维持全能性的基因的表达受到抑制，而变得大量表达采用某种特定的形态、发挥某种特定的功能所需的基因。
在胚胎学中，作为用于追踪该发育过程的方法，广泛进行了观察在某个发育阶段特异性表达的“标记物基因”的表达的技术。
本发明的优选的实施方式中，B工序中观察在未分化细胞中特异性表达的标记物。以下对标记物基因的种类进行概述。
作为神经干细胞(神经上皮细胞)的标记物，可列举出Nestin、SOX2、Notch1、HES1、HES3、闭合蛋白(Occludin)、E-钙黏蛋白、SOX10等。
另外，使用斑马鱼作为筛选工具时，可以优选示例出Her-5作为神经干细胞标记物(Development 133(21)：4293-303·December 2006)。
作为雪旺祖细胞的标记物，可以优选示例出SOX10、GAP43、BLBP、MPZ、Dhh、P75NTR等。
作为放射状胶质细胞的标记物，可列举出波形蛋白(Vimentin)、PAX6、HES1、HES5、GFAP、EAAT1/GLAST、BLBP、TN-C、N-钙黏蛋白、巢蛋白(Nestin)、SOX2等。
作为少突细胞祖细胞的标记物，可列举出PDGFRA、NG2。
作为中间祖细胞的标记物，可列举出TBR2、MASH1。
作为视网膜干细胞或视网膜祖细胞的标记物，可列举出Pax6、Sox2、巢蛋白、波形蛋白、musashi、Chx10(Vsx2)。
作为心脏未分化细胞的标记物，可列举出Mesp1、Nkx2.5等。
作为胰腺未分化细胞的标记物，可列举出Pdx1、Ptfla等。
需要说明的是，上述的标记物中的几种也在分化细胞中表达。本发明如此也可以采用将在未分化细胞和分化细胞这两者中表达的基因用作标记物的实施方式。此时，相当于同时进行B工序和C工序的方式(图5的(c))。
作为对这些标记物进行观察的手段，可以优选示例出使用针对作为各种基因产物的蛋白质的抗体进行免疫染色。免疫染色的具体的方法没有特别限定，可以利用常规方法进行。
另外，也可以通过利用作为各基因的转录产物的mRNA与具有互补的碱基序列的单链核酸分子(探针)的杂交的原位杂交来观察标记物。原位杂交的具体的方法没有特别限定，可以利用常规方法进行。
接着，对使用导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物的方法进行说明。
报告基因是指：用于可视化细胞内的某种基因的表达的外源基因。通过将编码荧光蛋白等的碱基序列插入希望将表达可视化的基因的表达控制区域下，从而将细胞设计成与该基因的表达同步地发出荧光。
本发明的一个实施方式中，使用导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物作为筛选工具。在此情况下，B工序中对未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
这样的转基因动物可以通过一直以来使用的已知的基因编辑技术来制作。
在未分化细胞中特异性正向控制表达的启动子为公知的情况下，通过将在该启动子的下游连接有报告基因序列的碱基序列插入基因组中，从而能够制作在特定的细胞中特异性表达的转基因动物。
另外，如上所述未分化细胞的标记物基因是已知的，因此通过将报告基因导入该标记物基因的基因座中，从而能够制作转基因动物。由此，与前述标记物基因的表达同步地表达报告基因。
作为报告基因，可以示例出编码Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、GFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2 Red、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGR等荧光蛋白、LacZ之类催化显色反应的蛋白质等的基因。
报告基因导入的具体设计方法没有限定，优选使用以如下方式设计的转基因动物，所述设计是：在标记物基因的开放阅读框的任意位置、更优选在不破坏作为该标记物基因的产物的蛋白质的功能、拓扑结构的任意位置导入报告基因的cDNA序列，表达标记物基因和报告基因的融合蛋白。
已经建立了多种这样的导入有在未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因系统，可以使用能利用的任何系统。以下示出关于导入了在神经未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因系统的一些例子，但不用说本发明的实施方式不限定于这些。
·Her5-GFP转基因斑马鱼系统(Development.2003Sep；130(18)：4307-23.)
·Nestin-GFP转基因斑马鱼系统(Developmental Dynamics 2009Feb；238(2)：475-86.)
·Gfap-GFP转基因斑马鱼系统(Developmental Dynamics 2009Feb；238(2)：475-86.)
·Nestin-GFP转基因小鼠系统(The Journal of comparative neurogy，Volume469，Issue39 February 2004，Pages 311-324)
报告基因为荧光蛋白时，观察通过对转基因动物照射该荧光蛋白的激发波长的光所发出的荧光。
荧光可以利用荧光显微镜进行观察。基于荧光部的亮度和面积，可以对动物体内的未分化细胞的增殖进行定量。
报告基因为荧光蛋白时，能够在作为筛选工具的转基因动物存活的状态下经时且动态地将未分化细胞可视化，故而优选。
为了使上述效果最大化，转基因动物优选为体色浅或透明～半透明的动物。作为这样的动物，可列举出斑马鱼。
使用斑马鱼胚胎的情况，为了抑制黑色素的生成，优选在A工序中向培养液中添加黑色素产生抑制剂(例如苯基硫脲)。
[1-3]C工序
C工序是对经过A工序的前述动物中的分化细胞进行观察的工序。更具体而言，观察分化细胞的定量参数、定性参数。定量参数可列举出细胞数、组织的大小/范围等。作为定性参数，可列举出由该分化细胞构成的组织的功能、形状等。对组织的功能进行观察时，根据该所观察的组织的种类选择应观察的功能。例如，在观察心脏的情况下，通过对输出量等进行观察，从而能够评价心脏功能。另外，在观察胰腺的情况下，通过对作为胰腺的分泌物的胰岛素的量等进行观察，从而能够评价胰腺的功能。
需要说明的是，本说明书中“分化细胞”是指没有自我复制能力的细胞。
称为“神经系统分化细胞”时，包括各种神经细胞和胶质细胞。另外，本说明书中未成熟神经细胞分为分裂性神经祖细胞和非分裂性神经祖细胞，前者包括在神经未分化细胞中，后者包括在神经系统分化细胞中。
对分化细胞进行观察的手段没有特别限定。可以适宜示例出对分化细胞的标记物进行观察的手段、和对在分化细胞中特异性表达的报告基因进行观察的手段。以下对各手段的详情进行说明。
本发明的优选的实施方式中，C工序中对在分化细胞中特异性表达的标记物进行观察。以下对标记物基因的种类进行概述。
未成熟神经细胞中被分类为非分裂性神经祖细胞者与同为未成熟的神经系统的细胞的神经干细胞、放射状胶质细胞不同，不会发生进一步的细胞分裂。是在神经系统中移动并到达目的地后使神经突延伸而建立突触结合、最终成为神经网络成员的细胞。
作为分类为非分裂性神经祖细胞的未成熟神经细胞的标记物，可列举出双皮质素(Doublecortin)、NeuroD1、TBR1、βIII微管蛋白(Beta III tubulin)、抑微管装配蛋白(Stathmin)1等。
乙酰化微管蛋白是经稳定化的微管的标记物。此外，存在于神经细胞中已伸长的轴突的细胞体附近的微管由稳定且寿命长的乙酰化微管蛋白构成。
因此，作为轴突已伸长的成熟神经细胞的标记物，乙酰化微管蛋白是有用的。
另外，作为成熟神经细胞的标记物，可列举出NeuN、MAP2、βIII微管蛋白、160kD神经丝、200kD神经丝、NSE、PSD93、PSD95等。
更具体而言，作为谷氨酸能神经细胞的标记物，可列举出vGluT1、vGluT2、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、NMDAR1、NMDAR2B等。
作为GABA能神经细胞的标记物，可列举出GABA转运蛋白1(GABA transporter 1)、GABAB受体1(GABAB Receptor 1)、GABAB受体2、GAD65、GAD67、ABAT等。
作为多巴胺能神经细胞的标记物，可列举出酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase)、多巴胺转运体(Dopamine Transporter)、FOXA2、GIRK2、LMX1B、Nurr1等。
作为血清素能神经细胞的标记物，可列举出色氨酸羟化酶(TryptophanHydroxylase)、血清素转运蛋白(Serotonin Transporter)、Pet1等。
作为胆碱能神经细胞的标记物，可列举出乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase)、ChAT、VAChT等。
另外，作为胶质细胞的标记物，具体可列举出以下者。
作为髓鞘形成雪旺细胞的标记物，可列举出SOX10、S100、EGR2、MBP、MPZ等。
作为非髓鞘形成雪旺细胞的标记物，可列举出SOX10、S100、GAP43、NCAM、P75NTR等。
作为少突细胞的标记物，可列举出Olig1、Olig2、Olig3、OSP、MBP、MOG、SOX10等。
作为星形细胞的标记物，可列举出GFAP、EAAT1/GLAST、EAAT2/GLT-1、谷氨酰胺合成酶、S100 beta、ALDH1L1等。
作为视网膜神经节细胞的标记物，可列举出Thy-1、Sdk1、Sdk2等。
另外，作为心肌细胞的标记物，可列举出GATA-4、α-肌节肌动蛋白(α-SarcomericActin)、α-肌节辅肌动蛋白(α-Sarcomeric Actinin)、慢肌球蛋白重链(Slow MyosinHeavy Chain)、肌钙蛋白(Troponin)T-C、MYL-2等。
作为成熟胰腺β细胞标记物，可列举出胰岛素、C-肽、MAFA、NKX6.1、PDX1、Fltp等。
需要说明的是，上述标记物中的一些也在未分化细胞中表达。本发明如此也可以采用将在未分化细胞和分化细胞这两者中表达的基因用作标记物的实施方式。此时，相当于同时进行B工序和C工序的方式(图5的(c))。
作为对这些标记物进行观察的手段，可以适宜示例出免疫染色、原位杂交。基于这些观察手段的分化细胞的观察可以利用常规方法进行。
本发明的一个实施方式中，使用导入了在分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物作为筛选工具。在此情况下，C工序中，对分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
这样的转基因动物与上述B工序的说明项目中叙述的内容同样地，可以通过一直以来使用的已知的基因编辑技术制作。关于报告基因的种类，也与上述B工序的说明项目中叙述的内容同样。
已经建立了各种导入了在分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因系统，可以使用能利用的任何系统。以下示出导入了在神经系统分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因系统的一些例子，但不用说本发明的实施方式不限定于这些。
·Huc-GFP转基因斑马鱼系统(Developmental Biology 227,279-293(2000))
·Ggaf-GFP转基因斑马鱼系统(Developmental Dynamics 2009Feb；238(2)：475-86.)
报告基因为荧光蛋白时，观察通过对转基因动物照射该荧光蛋白的激发波长的光所发出的荧光。
荧光可以利用荧光显微镜进行观察。基于荧光的亮度，可以对动物的体内的分化细胞的增殖进行定量。
报告基因为荧光蛋白时，能够在作为筛选工具的转基因动物存活的状态下经时且动态地将分化细胞可视化，故而优选。
为了使上述效果最大化，转基因动物优选为体色浅或透明～半透明的动物。作为这样的动物，可列举出斑马鱼。
使用斑马鱼胚胎的情况，为了抑制黑色素的生成，优选在A工序中向培养液中添加中黑色素产生抑制剂(例如苯基硫脲)。
[1-4]实施B工序和C工序这两个工序的方式
本项目中，对B工序和C工序这2个工序均进行的实施方式(图4)进行进一步说明。参照图5进行说明，B工序和C工序的顺序没有特别限定，并且可以同时进行这些工序。
另外，可以采用对同一动物个体进行B工序和C工序的方式，也可以采用对不同动物个体进行B工序和C工序的方式。后者的情况，针对分别供于B工序和C工序的动物个体的实验条件尽可能相同地来进行。
本发明的优选方式中，B工序和C工序对同一动物个体进行。以下对针对同一动物个体进行B工序和C工序的实施方式进行说明。
本发明的一个方式中，B工序中，对未分化细胞标记物进行观察，C工序中也对分化细胞标记物进行观察。
上述方式中，优选采用：为了染色而将经过A工序的动物固定，通过针对未分化细胞标记物和分化细胞标记物的抗体/探针进行多重染色的实施方式。通过进行多重染色，从而能够同时观察未分化细胞和分化细胞。
进行多重染色的情况下，根据常规方法，针对未分化细胞标记物和分化细胞标记物的抗体/探针的标记设计成不会混淆。荧光标记的情况，使用激发波长与荧光波长互不相同的标记。
本发明的一个方式中，使用导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物。此外，B工序中，对报告基因的表达进行观察，C工序中，对分化细胞标记物进行观察。
在此情况下，优选采用如下实施方式：首先进行能够在动物存活的状态下进行观察的B工序(荧光观察等)，然后，进行C工序(免疫染色等)。
通过采用上述方式，能够经时地追踪观察未分化细胞的自我复制，评价作为未分化细胞增殖的结果的、分化细胞增殖的效果。
本发明的一个方式中，使用导入了在分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物。此外，B工序中，对未分化细胞标记物进行观察，C工序中，对分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
在此情况下，优选采用如下实施方式：首先进行能够在动物存活的状态下进行观察的C工序(荧光观察等)，然后，进行B工序(免疫染色等)。
通过采用上述方式，能够经时地追踪观察分化细胞的增殖，评价未分化细胞自我复制而导致的分化细胞增殖的效果。
本发明的另一方式中，作为筛选工具使用的动物是导入了在未分化细胞中特异性表达的报告基因、和在分化细胞中特异性表达的报告基因这两者的转基因动物。此外，B工序中，对在未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察，C工序中，对在分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
通过使用如此导入了未分化细胞的报告基因和分化细胞的报告基因这2个的转基因动物，从而能够在动物存活的状态下经时且动态地执行B工序和C工序这两个工序。另外，能够同时进行B工序和C工序，因此对动物的负担也小。
报告基因为荧光蛋白基因时，未分化细胞的报告基因和分化细胞的报告基因优选为编码具有激发波长和荧光波长彼此不同的荧光蛋白的基因。
[1-5]D工序
D工序是对B工序和/或C工序的观察结果进行评价并选择有效成分的工序。详细而言，D工序是选择与未给予候补物质的情况相比未分化细胞和/或分化细胞量的和/或质得到提高的候补物质作为有效成分的工序。
实施B工序时，D工序中，选择与未给予候补物质的情况相比提高未分化细胞的量的候补物质作为有效成分。
实施C工序时，D工序中，选择与未给予候补物质的情况相比提高分化细胞的量的候补物质作为有效成分。另外，选择与未给予候补物质的情况相比改善由分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为有效成分。
促进未分化细胞和/或分化细胞的增殖的效果的评价可以根据B工序和C工序的具体实施方式适宜进行。
例如，B工序和/或C工序中进行免疫染色或原位杂交时，通过将染色图像中的荧光或显色的强度及其范围作为指标，从而能够评价前述细胞的增殖效果。即，染色图像中的荧光或显色的强度及其范围较强或较宽广时，可以判断候补物质具有促进未分化细胞和/或分化细胞的增殖的效果。
未分化细胞和/或分化细胞的增殖效果优选将在除未给予候补物质以外的相同条件下实施的对照实验的结果作为比较对象进行评价。
对照实验可以同时进行A工序～D工序，也可以采用记录实施一次的对照实验的结果，并参照其进行评价的方式。
[1-6]两阶段筛选
如上所述，本发明具备：A工序；B工序和/或C工序；及D工序。也可以采用进行2次以上A工序～D工序的实施方式。即，可以将实施作为一次筛选的A工序～D工序并选择的有效成分作为候补物质，进而供于作为二次筛选的A工序～D工序。在此情况下，优选变更一次筛选和二次筛选的条件。
例如也可以采用：一次筛选使用胚胎、二次筛选使用成体的实施方式。
另外，也可以采用在二次筛选中使用比一次筛选中使用的动物更高级的动物的方式。具体而言，可列举出一次筛选使用鱼类、二次筛选使用哺乳动物的实施方式。
本发明的一个实施方式中，作为A工序包括以下的A1工序和A2工序，作为B工序包括以下的B1工序和B2工序，作为C工序包括以下的C1工序和C2工序，作为D工序包括以下的D1工序和D2工序。可以实施B1工序和C1工序中的任意一个或两个工序，可以实施B2工序和C2工序中的任意一个或两个工序。
[A1工序]向动物的胚胎给予候补物质的工序。
[B1工序]对经过前述A1工序的前述动物的胚胎中的未分化细胞进行观察的工序。
[C1工序]对经过前述A1工序的前述动物的胚胎中的分化细胞进行观察的工序。
[D1工序]选择前述B1工序和/或前述C1工序的结果是与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞和/或前述分化细胞的量的候补物质作为有效成分的工序。
[A2工序]对动物的成体给予前述D1工序中选择的有效成分的工序。
[B2工序]对经过前述A2工序的前述动物的成体中的未分化细胞进行观察的工序。
[C2工序]对经过前述A2工序的前述动物的成体中的分化细胞进行观察的工序。
[D2工序]选择前述B2工序和/或前述C2工序的结果是与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞和/或前述分化细胞的量的候补物质作为有效成分的工序。
A1～D1工序是使用了胚胎的一次筛选，后半部分的A2～D2工序是使用了动物的成体的二次筛选。通过如此进行两阶段的筛选，从而能够精度更良好地筛选有效成分。
优选：A1～D1工序是使用了鱼类胚胎的一次筛选，后半部分的A2～D2工序是使用了哺乳动物的成体的二次筛选。一次筛选中通过使用鱼类胚胎而能够简便且大量地进行一次筛选。此外，二次筛选中通过使用哺乳动物成体而能够选择对人有效的可能性高的有效成分。
优选：A1～D1工序是使用了斑马鱼胚胎的一次筛选，后半部分的A2～D2工序是使用了小鼠的成体的二次筛选。一次筛选中通过使用斑马鱼胚胎而能够简便且大量地进行一次筛选。此外，二次筛选中通过使用小鼠成体而能够选择对人有效的可能性高的有效成分。
本发明的一个实施方式中，作为A工序包括以下的A1工序和A2工序，作为B工序包括以下的B1工序和B2工序，作为C工序包括以下的C1工序和C2工序，作为D工序包括以下的D1工序和D2工序。可以实施B1工序和C1工序中的任意一个或两个工序，可以实施B2工序和C2工序中的任意一个或两个工序。
[A1工序]对鱼类的胚胎给予候补物质的工序。
[B1工序]对经过前述A1工序的前述动物的胚胎中的未分化细胞进行观察的工序。
[C1工序]对经过前述A1工序的前述动物的胚胎中的分化细胞进行观察的工序。
[D1工序]选择前述B1工序和/或前述C1工序的结果是与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞和/或前述分化细胞的量的候补物质作为有效成分的工序。
[A2工序]对哺乳动物给予前述D1工序中选择的有效成分的工序。
[B2工序]对经过前述A2工序的前述哺乳动物中的未分化细胞进行观察的工序。
[C2工序]对经过前述A2工序的前述哺乳动物中的分化细胞进行观察的工序。
[D2工序]选择前述B2工序和/或前述C2工序的结果是与未给予候补物质的情况相比提高前述未分化细胞和/或前述分化细胞的量的候补物质作为有效成分的工序。
A1～D1工序是使用了鱼类胚胎的一次筛选，后半部分的A2～D2工序是使用了哺乳动物的二次筛选。通过如此进行两阶段的筛选，从而能够精度更良好地筛选有效成分。也可以采用A2工序中使用哺乳动物的成体和胚胎中任意者的实施方式。
一次筛选中通过使用鱼类胚胎而能够简便且大量地进行一次筛选。此外，二次筛选中通过使用哺乳动物而能够选择对人有效的可能性高的有效成分。
[2]第二筛选方法
接着，对第二筛选方法的实施方式进行说明。
第二筛选方法具备以下的E工序～G工序。
[E工序]向疾患、障碍或疾病的模型动物(不包括人)给予候补物质的工序。
[F工序]判断经过E工序的前述动物中的疾患、障碍或疾病的治疗效果的工序。
[G工序]选择具有治疗效果的候补物质作为前述有效成分的工序。
[2-1]E工序
第二筛选方法的特征在于使用疾患等的模型动物(E工序)。优选使用神经系统、心脏或胰腺的疾患等的模型动物。另外，也优选使用癌症的模型动物。
对于E工序的具体的实施方式，上述的A工序的说明是合适的，特别是关于疾患等模型动物的说明其本身是合适的。
需要说明的是，作为癌症的模型动物，没有特别限定，不仅可以使用利用基因工程方法使癌抑制基因缺失者，也可以使用将肿瘤细胞或肿瘤组织移植到免疫缺陷动物中而制作的模型动物。各种种类的癌症模型动物可以有偿或免费使用，可以根据目的没有限制地使用这些。
对于血液癌、特别是白血病的模型动物，例如可列举出T细胞性急性淋巴细胞性白血病模型小鼠(p53null，Ezh2条件性KO)(非专利文献26)、具有条件性myc诱导性的T细胞成急性淋巴细胞白血病的Cre/lox调节性转基因斑马鱼模型(非专利文献27)等。
作为糖尿病的模型动物，可列举出NOD/ShiJcl等1型糖尿病模型小鼠、KK/TaJcl、KK-Ay/TaJcl、BKS.Cg-m+/+Leprdb/Jcl、GK/Jcl、SDT/Jcl、SDT fatty/Jcl等2型糖尿病模型小鼠。另外，可以使用被链脲佐菌素(STZ)诱发的大鼠、小鼠、斑马鱼的1型糖尿病模型等之类的药物诱导型糖尿病模型动物。
作为心肌损伤的模型动物，可列举出通过引起心脏毒性、特别是左室功能障碍的阿霉素(DOX)诱导了心肌损伤的小鼠、大鼠、斑马鱼等。
E工序中，优选采用将候补物质局部给予至由于疾患发作而已经损伤或功能减退的部位或其附近的方式。此外，也可以将候补物质以经口给予、经皮给予、经肠给予等方式给予。给予方式可以根据疾病的种类进行适宜设计。
向青光眼模型给予时，优选在视网膜上滴加或涂布候补物质。
向脊髓损伤模型给予时，优选向脊髓损伤部位给予候补物质。
向血液癌模型、糖尿病模型、心肌损伤模型给予时，优选向血管注射给予候补物质。
[2-2]F工序
F工序中，判断经过E工序的动物的疾患、障碍或疾病的治疗效果。
治疗效果的判定的方法包括：疾患模型动物的外观/行动的观察、解剖学/病理学诊断等，根据疾患模型动物所患疾患等的性质进行适宜设计。
作为疾患模型的外观/行动的观察的具体例，可以列举出以下例子。
例如抑郁模型中的治疗效果可以通过强迫游泳试验(小鼠、大鼠)、悬尾试验(小鼠)进行判定。
焦虑模型中的治疗效果可以通过Vogel型冲突试验(大鼠)、社交互动作用试验(大鼠)进行判定。
脊髓损伤模型中的治疗效果可以通过将因脊髓损伤而丧失的运动功能是否恢复作为指标进行判定。
青光眼模型中的治疗效果通过如下方式进行判定，以水的逃逸反应为指标的的二选型视觉辨别任务(Prusky，West，&Douglas(2000))、食物奖励渴望情况下的辨别任务(Gianfranceschi，Fiorentini，&Maffei(1999))、使用视运动反应的试验(Douglas，Alam，Silver，Mcgill，Tschetter，&Prusky，2005)等进行判定。
糖尿病模型中的治疗效果基于胰岛素分泌量的测定、血糖值的测定等指标来进行判定。
心肌损伤模型中的治疗效果基于输出量等指标来对因障碍而减弱的心肌功能的恢复、即心脏功能的恢复进行判定。
癌症的治疗效果可以将肿瘤的缩小效果、在血液中漏出的肿瘤标记物等作为指标进行判定。
另外，利用上述的第一筛选方法所选择的有效成分通过将癌细胞强制分化为正常细胞而发挥抗癌作用。因此，可以以观察癌细胞是否分化为正常细胞为指标，对治疗效果进行判定。
上述的第一筛选方法中选择的有效成分若应用于白血病等血液癌，则促进癌细胞向血管内皮细胞的强制分化。由此，使有害的癌细胞无害化。因此，特别是血液癌、例如白血病的治疗效果是观察血管内皮是否增厚或癌变。另外，对于血行转移、淋巴转移等显示液体位移的癌症，也观察血管内皮或淋巴管内皮是否增厚或癌变。
作为解剖学/病理学诊断的具体例，可以示例出以下例子。
青光眼模型中的治疗效果通过对已损伤的视网膜神经节细胞有无增加进行观察来进行判定。对于视网膜神经节细胞是否增加的观察方法的具体的实施方式，上述第一筛选方法的项目中的说明原样是合适的。
脊髓损伤模型中的治疗效果通过利用显微镜、MRI等观察破碎的脊髓、将其再生效果作为指标进行判定。
为了精度更良好地进行治疗效果的判定，优选进行对照实验。对照实验优选以除了未给予候补物质以外的条件相同的方式实施。对照实验可以与E工序和F工序同时并行来实施，也可以预先记录一次获得的对照实验的结果，参照其在F工序中进行治疗效果的判定。
[2-3]G工序
G工序是将在F工序中判断为具有治疗效果的候补物质作为有效成分选择出的工序。
[3]2阶段筛选方法
本发明还涉及：利用第一筛选方法进行一次筛选，将在一次筛选中作为有效成分选择出的候补物质供于第二筛选方法的2阶段筛选方法。
第一筛选方法和第二筛选方法的实施方式如上所述。
优选在第一筛选方法的A工序中，使用正常动物而不使用疾患模型动物。即，第一筛选方法中，使用能够廉价且大量获得的正常动物低成本地对大量的候补物质执行一次筛选。此外，在通过一次筛选缩小候补物质的数量后，执行使用了疾患模型的二次筛选。如此通过进行2阶段的筛选，从而能够高效/经济地筛选对神经系统的疾患等具有效果的有效成分。
本发明的一个实施方式中，使用胚胎作为第一筛选中的筛选工具。
本发明的一个实施方式中，第一筛选中使用鱼类的胚胎、更优选使用斑马鱼的胚胎作为筛选工具，第二筛选中使用哺乳动物、更优选使用小鼠或大鼠作为筛选工具。
本发明的一个实施方式中，也可以采用将第一筛选的结果、即作为有效成分选择出的候补物质供于第二筛选方法的方式。在此情况下，也可以采用基于通过其它机制实施的第一筛选的结果来执行第二筛选方法的方式。即，可以采用本发明的实施者仅执行第二筛选方法的方式。
[4]制造方法
本发明还涉及药物组合物的制造方法，其具备将利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质和药物添加剂混合并制剂化的制剂化工序。
本发明的制造方法的实施者可以自己实施上述的筛选方法。另外，也可以采用基于其他人实施上述筛选方法的结果而实施制造方法的发明的方式。
即，本发明的一个实施方式中，具备：利用上述的筛选方法筛选有效成分的筛选工序。筛选工序的实施方式如上所述。
另外，本发明的一个实施方式中，使用已经利用上述筛选方法判定为有效成分的物质，实施制造方法的发明。
以下对将筛选中作为有效成分选择出的物质和药物添加剂混合并制剂化的制剂化工序进行详细地说明。
药物组合物可以根据希望治疗或预防的疾患等适宜设计其剂型和组成。
药物组合物包含上述的有效成分和任意的药物添加剂。将药物组合物制成固体制剂的形态时，可以适宜选择颗粒剂、干糖浆剂、细粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、丸剂的剂型。这些剂型的制剂化方法基于常规方法。
将药物组合物制成固体制剂的形态时也可以含有稳定剂。作为稳定剂，可列举出氯化钠和氯化钾甲酸、草酸、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸和富马酸、Miglyol(中链脂肪酸甘油三酯)、柠檬酸三乙酯和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、三乙酸酯(三乙酸甘油酯)、甘油脂肪酸酯、酰基甘油、甘油单酯衍生物和聚甘油脂肪酸酯。
药物组合物制成固体制剂的形态时也可以含有赋形剂。作为赋形剂，可列举出异麦芽糖、赤藻糖醇、D-甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、还原麦芽糖糖浆(麦芽糖醇)、乳糖醇、寡聚糖醇、木糖、葡萄糖(glucose)、果糖(frutose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、果糖、海藻糖、异构糖、糖浆、精制白糖、白糖、精制白糖球状颗粒、无水乳糖、白糖/淀粉球状颗粒、寡聚糖、糊精、淀粉等之类的多糖类、半消化体淀粉、葡萄糖水合物、结晶纤维素、微晶纤维素、普鲁兰多糖、β-环糊精、氨基乙基磺酸、糖果粉、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甘氨酸、葡萄糖酸钙、L-谷氨酰胺、酒石酸、酒石酸氢钾、碳酸铵、葡聚糖40、糊精、乳酸钙、聚维酮、聚乙二醇(polyethylene glycol)1500、聚乙二醇1540、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、柠檬酸酐、DL-苹果酸、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、L-天冬氨酸、藻酸、羧甲基纤维素钠、含水二氧化硅、交联聚维酮、甘油磷酸钙、铝硅酸镁、硅酸钙、硅酸镁、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、小麦粉、小麦淀粉、小麦胚芽粉、小麦胚芽油、米粉、米淀粉、乙酸苯二甲酸纤维素、氧化钛、氧化镁、二羟基铝氨基乙酸酯、磷酸三钙、滑石、碳酸钙、碳酸镁、沉淀碳酸钙、天然硅酸铝、玉米淀粉、玉米淀粉造粒物、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、无水磷酸氢钙、无水磷酸氢钙造粒物、磷酸二氢钙等。
也可以是如下方法：将药物组合物制成固体制剂的形态，将该固体制剂悬浮于水中并服用该悬浮液。在此情况下，作为悬浮化剂，有：羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素/羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素(羟丙甲基纤维素)、甲基纤维素、羧甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、富马酸/硬脂酸/聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酯/羟丙甲基纤维素混合物等纤维素系高分子、丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物分散液、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、甲基丙烯酸共聚物、2-甲基-5-乙烯基吡啶甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸共聚物、干燥甲基丙烯酸共聚物、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物等丙烯酸系高分子、聚乙烯基吡咯烷酮、交联聚维酮、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯乙缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇/甲基丙烯酸甲酯/丙烯酸共聚物和聚乙烯醇共聚物等乙烯基系高分子、藻酸钠、卡拉胶、羧基乙烯基聚合物、干燥氢氧化铝凝胶、黄原胶、硅酸铝镁、聚磷酸钠、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000等，可以优选使用羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素/羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮，更优选使用羟丙甲纤维素等。
将药物组合物制成固体制剂的形态时，为了改善润滑性，也可以配混润滑剂。作为润滑剂，可列举出轻质无水硅酸、含水二氧化硅、蔗糖脂肪酸酯、硬脂醇、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠、滑石等。
将药物组合物制成固体制剂时，为了添加到苦味等令人不快的药物中来矫正味道，也可以配混矫味剂。作为矫味剂，可列举出抗坏血酸、天冬氨酸、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甘氨酸、氯化钠、氯化镁、盐酸、稀盐酸、柠檬酸及其盐、柠檬酸酐、L-谷氨酸及其盐、琥珀酸及其盐、乙酸、酒石酸及其盐、碳酸氢钠、富马酸及其盐、苹果酸及其盐、冰乙酸、肌苷酸二钠、蜂蜜、还原麦芽糖糖浆(麦芽糖醇)、甘草粉等。
将药物组合物制成固体制剂时，也可以含有结合剂。作为结合剂，可列举出羟丙基纤维素、玉米淀粉、预胶化的淀粉、部分预胶化的淀粉、阿拉伯胶、阿拉伯胶末、明胶、琼脂、糊精、普鲁兰多糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、结晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素等。
将药物组合物制成固体制剂时，也可以含有崩解剂。作为崩解剂，可列举出交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、低取代度羟丙基纤维素等。
将药物组合物制成固体制剂时，也可以含有着色剂。作为着色剂，可列举出氧化铁、焦油色素和天然色素等。作为氧化铁，可列举出三氧化二铁、氧化铁黄、三氧化二铁黄、氧化铁黑等。
将药物组合物制成固体制剂时，进而根据需要也可以添加香料、甜味剂。
作为香料，具体而言，可列举出橙香精、橙油、焦糖、樟脑、肉桂油、留兰香油、草莓香精、巧克力香精、樱桃香精、云杉油、松油、薄荷油、香草香精、草莓香精、苦味香精、水果香精、薄荷香精、混合香精、薄荷香精、薄荷醇、柠檬粉、柠檬油、玫瑰油等。
作为甜味剂，具体而言，可列举出阿斯巴甜、还原麦芽糖糖浆(麦芽糖醇)、甘草、木糖醇、甘油、糖精、三氯蔗糖、D-山梨糖醇、丁磺氨钾、甜菊糖、索马甜、爱德万甜等。
另外，药物组合物可以采用非经口给药剂的剂型。例如可以是静脉内注射、脑内注射、髄腔内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、注肠、经口性肠溶剂、滴眼药、眼部软膏液体制剂、软膏等具有流动性的剂型。这种具有流动性的剂型在采用将有效成分直接给予至患部的方式时是有利的。
作为液体制剂，优选采用注射剂或滴眼药的方式。另外，作为软膏，优选采用眼部软膏的方式。
将药物组合物制成注射剂时，作为水性介质，除水(即，注射用水)之外，可列举出将水混合性溶剂混合于水中者。作为这样的水混合性溶剂，例如可列举出醇类(例如，脂肪族醇(例如，甲醇、乙醇等)或芳基醇)、多元醇类、酯类、卤化烷基类、醚类、氰化物类/腈类、酮类、醛类、胺类、酰胺类、甲酰胺类、硫醚类、亚砜类和羧酸类。
将药物组合物制成注射剂时，也可以添加pH调节剂。作为pH调节剂，可以使用注射剂中通常使用的pH调节剂。具体而言，倾向于酸性时，可以使用乙酸、乳酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、盐酸、葡萄糖酸、硫酸等酸性物质，倾向于碱性时，可以使用氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等碱性物质。
将药物组合物制成注射剂时，可以添加等渗剂。作为等渗剂，例如可以示例出葡萄糖、麦芽糖、α-海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇等糖类、糖醇类、甘油、丙二醇、聚乙二醇等多元醇类、氯化钠等电解质等。
将药物组合物制成注射剂时，可以添加缓冲剂。作为缓冲剂，例如可以示例出柠檬酸缓冲剂、乙酸缓冲剂(例如，乙酸钠水合物)、磷酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂等。
将药物组合物制成注射剂时，可以在注射剂中添加通常使用的配混成分。作为这样的配混成分，例如可列举出稀释剂、无痛化剂、防腐剂等。
药物组合物也可以采用通过添加水性介质而能够制备注射剂的冷冻干燥注射剂的方式。冷冻干燥形态的注射剂用药物组合物可以通过利用常规方法对上述说明的水性溶液形态的注射剂用药物组合物进行冷冻干燥而制造。
更具体而言，药物组合物优选采用脑内给药用注射剂、脑室内给药用注射剂、脊髓给药用注射剂的方式。
药物组合物可以采用滴眼药的方式。制成滴眼药的形态时，也可以添加葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、核糖、核酮糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、脱氧核糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、纤维素二糖、乳糖、普鲁兰多糖、乳果糖、棉子糖、麦芽糖醇等糖类。
将药物组合物制成滴眼药的形态时，也可以添加乙二胺的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物加成物(例如，泊洛沙胺Poloxamines)、单月桂酸POE(20)失水山梨醇(聚山梨醇酯20)、单油酸POE(20)失水山梨醇酯(聚山梨醇酯80)等POE失水山梨醇脂肪酸酯类、POE(60)氢化蓖麻油等POE氢化蓖麻油、POE(9)月桂醚等POE烷基醚类、POE(20)POP(4)十六烷基醚等POE/POP烷基醚类、POE(10)壬基苯基醚等POE烷基苯基醚类等非离子性表面活性剂；烷基二氨基乙基甘氨酸等甘氨酸型、月桂二甲基氨基乙酸甜菜碱等乙酸甜菜碱型、咪唑啉型等两性表面活性剂；POE(10)月桂醚磷酸钠等POE烷基醚磷酸及其盐、月桂酰基甲基丙氨酸钠等N-酰基氨基酸盐、烷基醚羧酸盐、N-椰油基甲基牛磺酸钠等N-酰基牛磺酸盐、四癸烯磺酸钠等磺酸盐、月桂醇硫酸酯钠等烷基硫酸盐、POE(3)月桂醚硫酸钠等POE烷基醚硫酸盐、α-烯烃磺酸盐等阴离子表面活性剂；烷基胺盐、烷基季铵盐(苯扎氯铵、苄索氯铵等)、烷基吡啶鎓盐(氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓等)等阳离子表面活性剂等。
将药物组合物制成滴眼药时，也可以添加防腐剂、杀菌剂或抗菌剂。具体而言，可列举出山梨酸或其盐(山梨酸、山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸三氯卡班等)、对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、利凡诺、结晶紫、苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、溴化十六烷基吡啶鎓、氯己定、聚六亚甲基双胍、烷基聚氨基乙基甘氨酸、苄醇、苯乙醇、氯丁醇、异丙醇、乙醇、苯氧基乙醇、磷酸锆的银等负载体、硫柳汞、脱氢醋酸、氯二甲酚、氯苄酚、间苯二酚、百里酚、桧木醇、氨磺酰、溶菌酶、乳铁蛋白、三氯生、8-羟基喹啉、十一烯酸、辛酸、丙酸、苯甲酸、丙酸、卤卡班、噻苯哒唑、多粘菌素B、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、聚赖氨酸、过氧化氢、泊利氯铵、Glokill(商品名例如Glokill PQ、Rhodia公司制)、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚[氧乙烯(二甲基亚氨基)乙烯-(二甲基亚氨基)二氯乙烯、聚乙烯多胺/环氧氯丙烷二甲胺缩聚物(商品名例如Busan1157、Bachmann公司制)等。
将药物组合物制成滴眼药的形态时，也可以添加pH调节剂。作为pH调节剂，可列举出无机酸(盐酸、硫酸、磷酸、聚磷酸、硼酸等)、有机酸(乳酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、丙酸、乙酸、天冬氨酸、ε-氨基己酸、谷氨酸、氨基乙基磺酸等)、葡萄糖内酯、乙酸铵、无机碱(碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等)、有机碱(单乙醇胺、三乙醇胺、二异丙醇胺、三异丙醇胺、赖氨酸等)、硼砂等。
将药物组合物制成滴眼药时，也可以添加等渗剂。作为等渗剂，可列举出葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等糖类、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫代硫酸钠、乙酸钠等无机盐类。
将药物组合物制成眼部软膏时，可以使用任意的软膏基剂来制备。作为软膏基剂，没有特别限定，通常可以使用作为疏水性基剂的油脂类、蜡、烃化合物等。具体而言，可列举出黄色凡士林、白色凡士林、石蜡、液体石蜡、塑料基底、有机硅等矿物性基剂、蜜蜡、动植物性油脂等动植物性基剂等。
另外，已知：在鼻腔内，存在所给予的物质通过鼻腔粘膜层而不经由血液地直接转移至脑脊髓液(cerebrospinal fluid：CSF)或者脑中的途径(Illum L.,Eur.J.Pharm.Sci.,11,1-18(2000).、Frey W.H.,Drug Deliv.Technol.,2,46-49(2002).、Lochhead J.J.,Thorne G.,Adv.Drug Deliv.Rev.,64,614-628(2012).、DjupeslandP.G.,Messina J.C.,Mahmoud R.A.,Ther.Deliv.,5,709-733(2014).)。
因此，为了使有效成分到达脑，可以将药物组合物制成鼻腔给予制剂的方式。作为鼻腔给予制剂，可列举出滴鼻药、液体鼻喷雾器、粉末鼻喷雾器、鼻腔粘膜注射剂、凝胶状制剂、软膏等剂型。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加表面活性剂。作为表面活性剂，例如可列举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚丙烯烷基醚、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯聚合物等非离子性表面活性剂、烷基甜菜碱、烷酰胺甜菜碱、烷基磺基甜菜碱、咪唑啉等两性表面活性剂、饱和高级脂肪酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚磺酸盐、烷基醚磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚磷酸盐等阴离子性表面活性剂等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加增稠剂。作为增稠剂，可列举出羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素、甲基纤维素等纤维素类、部分α化淀粉等加工淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、交联聚维酮、聚乙二醇、羧基乙烯基聚合物、丙烯酸/甲基丙烯酸烷基共聚物、黄原胶、卡拉胶、藻酸及其盐、阿拉伯胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、普鲁兰多糖、明胶、聚丙烯酸钠等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加油性成分。作为油性成分，可列举出棕榈油醇、油醇、二十油醇、反油醇、亚油基醇等不饱和脂肪族醇类、油酸、反油酸、亚油酸、十一烯酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸、乌药酸、月桂烯酸、粗租酸、岩芹酸、反-11-十八碳烯酸(日文：バセニン酸)、巨头鲸鱼酸等不饱和脂肪酸类、甘油单油酸酯、甘油二油酸酯、油酸辛酯十二烷基酯、油酸油酯等不饱和脂肪酸酯类、辛酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯等饱和脂肪酸酯类、油醇、反油醇、液体石蜡、凡士林、微晶蜡等烃类、甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、二甲基环聚硅氧烷等硅油类、蜜蜡等蜡类、鲸蜡醇、硬脂醇等高级醇类、胆甾醇等甾醇类、硬脂酸铝、硬脂酸镁等金属皂类、鳄梨油、棕榈油、牛油、荷荷巴油等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加等渗剂。作为等渗剂，例如可列举出山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等糖类、甘油、聚乙二醇、丙二醇等多元醇、氯化钠、氯化钾等无机盐等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加pH调节剂。作为pH调节剂，例如可列举出乙酸、甲酸、乳酸、酒石酸、草酸、乙二醇酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、磷酸、盐酸、硝酸、硫酸和它们的盐、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、精氨酸、甲基胺、乙基胺、丙基胺、二甲基胺、二乙胺、二丙基胺、三甲基胺、三乙胺、三丙基胺、单甲醇胺、单乙醇胺、单丙醇胺、二甲醇胺、二乙醇胺、二丙醇胺、三甲醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、二异丙醇胺、三丙醇胺、氨水、碳酸胍、碳酸氢钠、碳酸铵等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加缓冲剂。作为缓冲剂，例如可列举出硼酸及其盐、磷酸盐、乙酸盐、氨基酸盐等。
将本发明的药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加螯合剂。作为螯合剂，例如可列举出依地酸、草酸、柠檬酸、焦磷酸、六偏磷酸、葡萄糖酸和它们的盐等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加香料/清凉化剂。作为香料/清凉化剂，例如可列举出薄荷油、薄荷白油、肉桂油、丁香油、茴香油、蓖麻油、松节油、桉树油、橙油、薰衣草油、柠檬油、玫瑰油、柠檬草油、大茴香油、百里香油、河豚油、石芥苎油、桐花油(日文：トウカ油)、佛手柑油、香茅油、樟脑油、迷迭香、鼠尾草等香料、l-薄荷醇、樟脑、百里酚、N-乙基-对孟烷-羧酰胺、对孟烷-3,8-二醇、l-异胡薄荷醇、l-薄荷基甘油醚等清凉化剂。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加抗氧化剂。作为抗氧化剂，例如可列举出抗坏血酸、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、去甲二氢愈创木酸、生育酚、乙酸生育酚等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加防腐剂。作为防腐剂，可列举出百里酚、异丙基甲基苯酚、苯甲酸及其盐、苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苄醇、苯扎氯铵、苄索氯铵等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加吸收促进剂。作为吸收促进剂，可列举出己二酸二异丙酯、卵磷脂、角鲨烷、角鲨烯、l-薄荷醇、聚乙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、二甲基亚砜、薄荷油、桉叶油、d-柠檬烯、dl-柠檬烯等。
将药物组合物制成滴鼻药时，也可以添加悬浮化剂。作为悬浮化剂，可列举出甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙甲基纤维素等纤维素类、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物等合成高分子化合物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚丙烯烷基醚、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧丙烯聚合物等非离子性表面活性剂、烷基甜菜碱、烷酰胺甜菜碱、烷基磺基甜菜碱、咪唑啉等两性表面活性剂、饱和高级脂肪酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚磺酸盐、烷基醚磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚磷酸盐等阴离子性表面活性剂等。
将药物组合物制成液体制剂的剂型，将其填充于喷雾器中，可以制成液体鼻喷雾器制剂。在此情况下，用于填充本发明的药物组合物的喷雾器没有特别限定，例如可以适宜用于治疗过敏性鼻炎的液体鼻喷雾器制剂中利用的喷雾器。另外，作为填充于喷雾器中的液体制剂的具体形态，上述的滴鼻药的说明是合适的。
另外，将药物组合物制成粉末形态，将其填充于喷雾器中，可以制成粉末鼻喷雾器制剂。在此情况下，用于填充本发明的药物组合物的喷雾器没有特别限定，例如可以适宜用于治疗过敏性鼻炎的粉末鼻喷雾器制剂中利用的喷雾器。另外，填充于喷雾器中的药物组合物的粉末可以利用冷冻干燥法、喷雾干燥法等来制造。
将药物组合物制成粉末鼻喷雾器制剂时，也可以添加任意的赋形剂。作为赋形剂，例如可以列举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、和果糖；淀粉或淀粉衍生物；糊精、环糊精、和它们的衍生物等寡聚糖；聚乙烯基吡咯烷酮、藻酸、Tylose、硅酸、纤维素、纤维素衍生物(例如纤维素醚)；甘露糖醇、山梨糖醇、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、葡聚糖等糖醇；碳酸钙、磷酸钙、乳糖、乳糖醇、葡萄糖结合剂(dextrates)、葡萄糖(Dextrose)、麦芽糊精等。
将药物组合物制成作为鼻腔给药用制剂的鼻腔粘膜注射剂的形态时，对于其具体方式，针对上述的注射剂的具体方式的说明是合适的。
将药物组合物制成作为鼻腔给药用制剂的软膏的形态时，对于其具体方式，针对上述的眼部软膏的具体方式的说明是合适的。
将本发明的药物组合物制成凝胶状制剂时，可以通过添加增稠剂而制成凝胶状。对于其它具体方式，针对上述的滴鼻药的具体方式的说明是合适的。
[5]设计方法
本发明还涉及药物组合物的设计方法，其具备选择与利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质组合的药物添加剂的工序。
本发明的设计方法的实施者可以自己实施上述的筛选方法。另外，也可以采用基于其他人实施上述筛选方法的结果来实施制造方法的发明的方式。
即，本发明的一个实施方式中，具备：利用上述的筛选方法筛选有效成分的筛选工序。筛选工序的实施方式如上所述。
另外，本发明的一个实施方式中，使用已经利用上述的筛选方法判定为有效成分的物质来实施设计方法的发明。
根据本发明，能够设计再生药物和/或抗癌药。
本发明的优选方式中，包括选择药物组合物的适应症的工序。作为适应症，可列举出神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状，或者癌症。这些适应症的具体内容如上文中详述。
本发明的优选方式中，具备选择药物组合物的剂型的工序。本发明的优选方式中，选择液体制剂作为剂型，选择应与有效成分混合的水性介质。本发明中，可以选择注射剂作为剂型。本发明中，可以选择滴眼药作为剂型。本发明中，可以选择冷冻干燥制剂作为剂型。本发明中，可以采用选择软膏作为剂型、选择与有效成分混合的基材的方式。也可以选择眼部软膏作为剂型。本发明中，可以采用选择鼻腔给药用制剂作为剂型的方式。本发明中，可以选择经口给药用制剂作为剂型。
需要说明的是，对于与筛选中作为有效成分选择出的物质组合的药物添加剂、药物组合物的剂型等，可以直接利用上述的本发明的制造方法中的说明。
[6]关于临床试验的方法
本发明还涉及一种方法，其包括如下步骤：利用上述的方法设计药物组合物，准备利用上述的筛选方法作为有效成分选择出的物质，利用上述的制造方法制备药物组合物，对由临床试验中给予了所述药物组合物的人获取的数据集进行统计处理。
为了使包含利用上述的筛选方法筛选出的有效成分的药品获得监管机构的批准而制品化，本发明的方法的实施是必须的。
本发明的一个实施方式中，对临床试验中由给予了前述药物组合物的人(试验组)、和给予了对照药的人(对照组)获得的数据集进行比较并统计处理。
由此对分别由试验组和对照组获得的数据集进行统计处理，来判定两组之间在统计上是否具有显著性差异。
本发明的一个实施方式中，还涉及一种方法，其包括对由给予了前述药物组合物的健康的人获得的数据集进行统计处理的操作。该实施方式涉及在日本制药实践中进行被称为“第1阶段临床试验”的临床试验的情况。
作为所获得的数据集，可列举出药物的给药量、给药次数、给药时间，给药期间、给药后有效成分的血药浓度或其时间的推移、尿液中的有效成分或其代谢物的浓度等数据集。
本发明的一个实施方式中，还涉及一种方法，其包括对由给予了前述药物组合物的、前述药物组合物的适应症的患者获得的数据集进行统计处理的操作。该实施方式涉及在日本制药实践中“第2阶段临床试验”或“第3阶段临床试验”。
作为所获得的数据集，可列举出药物的给药量、给药次数、给药时间，给药期间、给药后有效成分的血药浓度或其时间的推移、尿液中的有效成分或其代谢物的浓度、或安全性、副作用、与针对适应症的有效性相关的生理数据。
统计处理优选利用计算机来实施。另外，统计处理的具体方法可以基于临床试验的试验计划进行适宜选择。
[7]药物组合物
本发明还涉及：包含利用上述的筛选方法筛选出的有效成分的药物组合物、利用上述的制造方法制得的药物组合物、进而利用上述的设计方法设计出的药物组合物。
以下对本发明的药物组合物进行详述。
本发明的药物组合物的成为对象的动物没有特别限制，优选脊椎动物。具体而言，可以应用于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类中的任意种类。更具体而言，本发明的对象例如可列举出人、或不包括人的非人动物。非人动物例如可列举出斑马鱼等鱼类、小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊、马、猫、山羊、猴子、和豚鼠等非人哺乳动物等。
本发明的药物组合物具有促进未分化细胞的自我复制的作用。因此，本发明的药物组合物可以用于使未分化细胞自我复制的用途。
本发明的药物组合物用于使成体干细胞自我复制的用途。本发明的药物组合物用于选自神经系统、心脏、胰腺中的1种或2种以上的组织的成体干细胞的自我复制的用途。
另外，本发明的药物组合物具有将未分化细胞分化诱导为各种细胞的作用。因此，本发明的药物组合物可以用于未分化细胞的分化诱导。
另外，本发明的药物组合物可以用于将成体干细胞分化诱导的用途。
另外，本发明的药物组合物可以用于将选自神经系统、心脏、胰腺中的1种或2种以上的组织的成体干细胞分化诱导的用途。
本发明的药物组合物用于“未分化细胞的自我复制”和“未分化细胞的分化诱导”这2个用途中的任一者或两者。
本发明的优选的实施方式中，用于“未分化细胞的自我复制”和“未分化细胞的分化诱导”这两者的用途。
现有的再生医疗的过程中，自我复制工序和分化诱导工序在体外(在培养皿上或试管内)执行。
本发明的药物组合物可以在生物体内完成这2个工序。即，本发明可以用于生物体内的未分化细胞的自我复制和分化诱导。
本发明的一个实施方式中，为再生药物和/或抗癌药。
本发明的一个实施方式中，为基于未分化细胞的自我复制和未分化细胞的分化诱导的再生药物。
本发明的一个实施方式中，为用于将癌细胞分化诱导为正常细胞的药物组合物。更优选的实施方式中，为基于将癌细胞分化诱导为正常细胞的癌症治疗用的药物组合物。
根据本发明的药物组合物，可以促进神经未分化细胞的自我复制、继而促进扩增的神经未分化细胞的分化。即，根据本发明，能够实现迄今为止被认为无法再生或难以再生的神经系统的再生或增强。
如上所述，本发明的药物组合物能够分化诱导为构成神经系统的各种细胞。即，本发明的药物组合物能够将神经未分化细胞分化诱导为神经细胞和胶质细胞。
本发明的药物组合物通过神经未分化细胞的分化诱导而可以用于谷氨酰胺能神经细胞、GABA能神经细胞、多巴胺能神经细胞、血清素能神经细胞、胆碱能神经细胞等成熟神经细胞的增殖。
另外，本发明的药物组合物可以用于视网膜神经节细胞、浦肯野细胞的增殖。
本发明的药物组合物通过神经未分化细胞的分化诱导而可以用于星形细胞(星形胶质细胞)、少突细胞(少突胶质细胞/乏突胶质细胞/稀突胶质细胞)、室管膜细胞、雪旺细胞(鞘细胞)、卫星细胞等胶质细胞的增殖。
本发明的药物组合物可以用于中枢神经系统和外周神经系统中的任意者。针对任何神经系统，本发明的药物组合物均发挥神经未分化细胞的自我复制和/或分化诱导的作用。
中枢神经系统一旦受损则无法再生/极难再生。因此，本发明的药物组合物优选用于中枢神经系统的神经未分化细胞的自我复制和/或分化诱导。
作为可以适宜使用本发明的中枢神经系统，可列举出脑、脊髓、视神经、嗅神经中的任意种。特别是脑、脊髓、视神经的障碍会导致使患者的QOL显著降低的严重疾病，因此优选将本发明的药物组合物用于脑、脊髓、视神经的神经未分化细胞的自我复制和/或分化诱导。
如上所述，本发明的药物组合物发挥神经未分化细胞的自我复制和/或分化诱导的效果。由此，本发明能够实现被认为无法再生或极难再生的神经系统的再生。
由于该作用，本发明通过应用于神经系统的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状而发挥它们的治疗或预防的效果。
即，本发明的药物组合物优选用于神经系统的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的治疗或预防。
本发明对中枢神经系统和外周神经系统中任意的神经系统的疾患等也是有效的。
作为中枢神经系统的疾患等，可列举出脑、脊髓、视神经和/或嗅神经的疾患等。
作为外周神经系统的疾患等，可列举出躯体神经系统和自主神经系统的疾患等。
作为中枢神经系统的疾患等，可列举出帕金森氏病；阿尔茨海默氏症；库贾氏病；皮质基底节变性；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；多发性硬化症；进行性运动无力；免疫神经病变；脑损伤、脊髓损伤、视神经损伤、嗅神经损伤等中枢神经系统的损伤；伴随帕金森症的阿尔茨海默氏症；运动迟缓；运动不能；精细运动控制和手指灵活性受损的运动障碍；发音困难；言语单调；僵硬；肌张力障碍；与帕金森氏病相关的炎症；面部、颚、舌、姿势性震颤；帕金森氏病样步态；滑步步态；小步步态；加速步态；情绪、认知、感觉、睡眠障碍；痴呆；抑郁；药物导致的帕金森症；血管性帕金森症；多系统萎缩；进行性核上性麻痹；具有原发性tau病变的障碍；皮质基底核神经节改性症；伴有痴呆的帕金森症；多动症；舞蹈病；亨廷顿氏舞蹈病；肌张力障碍；血铜蓝蛋白缺乏症；Tourette综合症；特发性震颤；肌阵挛；延迟运动障碍：精神分裂症；双相障碍和自闭症谱系障碍等。
作为外周神经系统的疾患等，可列举出：表现出“手、脚无法用力”、“经常丢东西”、“无法良好行走、跑步”、“无法良好站立”、“脚趾下垂、容易绊倒”等症状的运动障碍；手、脚出现“刺痛感”、“麻木痛感”、“感觉丧失”等症状的感觉障碍；出现“手、脚的皮肤冰冷”、“下半身不出汗”等症状的自主神经障碍等。
本发明的药物组合物通过促进神经未分化细胞的自我复制和/或分化诱导而具有诱发神经系统的再生的作用。因此，本发明的药物组合物对于起因于神经系统的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
另外，本发明的药物组合物对于起因于神经细胞或胶质细胞的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
另外，本发明的药物组合物对于起因于细胞体、髓鞘、轴突、肌神经接点的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
本发明的药物组合物对于起因于谷氨酰胺能神经细胞、GABA能神经细胞、多巴胺能神经细胞、血清素能神经细胞、胆碱能神经细胞等成熟神经细胞的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
另外，本发明的药物组合物对于起因于视网膜神经节细胞、浦肯野细胞的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
本发明的药物组合物对于起因于星形细胞(星形胶质细胞)、少突细胞(少突胶质细胞/乏突胶质细胞/稀突胶质细胞)、室管膜细胞、雪旺细胞(鞘细胞)、卫星细胞等胶质细胞的损伤或功能减退的疾患等是有效的。
需要说明的是，此处所谓的“功能减退”中，除了细胞本身的功能已减退的状态之外，还包括由于细胞的数降低而观察到组织整体的功能减退。
以下对本发明的适应症中青光眼和脊髓损伤进行更详细地说明。
本发明的药物组合物对于青光眼的治疗或预防是有效的。本发明对于高眼压青光眼和正常眼压青光眼中的任意者均是有效的。
高眼压青光眼由高眼压导致视网膜的视神经逐渐萎缩、溶胀而损伤，是存在于视网膜中的一种神经细胞即视网膜视神经节细胞因凋亡而死亡、继而引起视神经乳头部凹陷、视野逐渐变窄、最终导致视力丧失的疾患。
正常眼压青光眼在临床上普遍认为可见以下5种类别的临床表现：(1)眼压在10～21mmHg这一正常值范围内、(2)视神经乳头边缘部狭窄和凹陷、(3)视网膜视神经纤维层缺损、(4)筛板(筛骨眶板)部位的视神经变形/后偏、(5)视神经节细胞和胶质细胞的降低，因此是导致特异性视神经病变的疾患。
本发明的药物组合物通过使在高眼压青光眼和正常眼压青光眼中的任意者中观察到的已损伤或减少的视神经(视网膜视神经节细胞、胶质细胞)再生，从而发挥治疗效果。
脊髓不会自发再生。因此，脊髓一旦受损就不可能完全治愈。
本发明的药物组合物发挥神经系统的再生效果。因此，本发明的药物组合物对于脊髓损伤的治疗是非常适合的。根据本发明的药物组合物，也能使脊髓的损伤部位中的神经再生，能够改善或根治与脊髓损伤相关的运动障碍等。
能应用本发明的药物组合物的脊髓损伤除了起因于交通事故、运动事故、跌倒等由事故所致的外伤之外，还包括起因于脊髓肿瘤、疝气等疾病的情况。
本发明的药物组合物优选给予至生物体内的神经未分化细胞的存在部位或其附近而使用。通过采用这样的给予方式，从而通过本发明的药物组合物的效果有效地引起神经未分化细胞的自我复制和分化诱导。
需要说明的是，“附近”是指：药物组合物中包含的有效成分通过体液的扩散或分散而能够达到神经未分化细胞的存在位置的程度的范围。
本发明的药物组合物优选给予至生物体内的中枢神经系统的神经未分化细胞的存在部位或其附近而使用。通过采用这样的给予方式，从而通过本发明的药物组合物的效果有效地引起中枢神经系统的神经未分化细胞的自我复制和分化诱导。
本发明的药物组合物优选向脑、脊髓或眼球给予而使用。通过采用这样的给予方式，从而能够实现脑、脊髓或视神经的再生或新生。
需要说明的是，担负成体脑中的神经元新生的干细胞被称为成体神经干细胞，已知至少存在于以下两个部位：侧脑室周围的脑室下区和海马体的齿状回颗粒细胞下区。
因此，本发明的药物组合物也可以采用向存在成体神经干细胞的侧脑室和/或海马体给予而使用的实施方式。
更具体而言，本发明的药物组合物也可以采用向侧脑室周围的脑室下区和/或海马体的齿状回颗粒细胞下区给予而使用的实施方式。
本发明的药物组合物优选向神经系统的损伤部位或功能减退部位给予而使用。由此，能够有效地进行该损伤部位或功能减退部位中的神经系统的再生，能够有效地治疗疾患等。
另外，本发明的药物组合物优选向观察到神经细胞或胶质细胞的损伤或功能减退的部位给予而使用。由此，能够有效地进行该部位中的神经元或胶质细胞的再生，能够有效地治疗疾患等。
另外，本发明的药物组合物优选向观察到细胞体、髓鞘、轴突或肌神经接点的损伤或功能减退的部位给予而使用。由此，能够有效地进行已经损伤或功能减退的细胞体、髓鞘、轴突或肌神经接点的再生，能够有效地治疗疾患等。
本发明的药物组合物优选向观察到谷氨酰胺能神经细胞、GABA能神经细胞、多巴胺能神经细胞、血清素能神经细胞、胆碱能神经细胞等成熟神经细胞的损伤或功能减退的部位给予而使用。由此，能够有效地进行已经损伤或功能减退的成熟神经细胞的再生，能够有效地治疗疾患等。
另外，本发明的药物组合物优选向观察到视网膜神经节细胞、浦肯野细胞的损伤或功能减退的部位给予而使用。由此，能够有效地进行已经损伤或功能减退的视网膜神经节细胞、浦肯野细胞的再生，能够有效地治疗疾患等。
本发明的药物组合物优选向观察到星形细胞(星形胶质细胞)、少突细胞(少突胶质细胞/乏突胶质细胞/稀突胶质细胞)、室管膜细胞、雪旺细胞(鞘细胞)、卫星细胞等胶质细胞的损伤或功能减退的部位给予而使用。由此，能够有效地进行已经损伤或功能减退的胶质细胞的再生，能够有效地治疗疾患等。
另外，本发明的药物组合物可以用于由心肌细胞的障碍/功能减退引起的疾患等的治疗。本发明的药物组合物作用于存在于心脏内的心脏干细胞/心脏祖细胞，诱发其自我复制和分化诱导，由此能使受损或功能减退的心肌细胞再生。
本发明的药物组合物可以用于心绞痛、心肌梗塞、瓣膜病、心肌病、心房间隔缺损、心脏肿瘤、心力衰竭、心律不齐等心脏的疾患等的治疗。
本发明的药物组合物用于心脏的疾患等的治疗时，可以是向心脏的局部给药、经口给药、向血管的注射、静脉注射等给药方式。
另外，本发明的药物组合物可以用于以胰腺细胞的障碍/功能减退为原因的疾患等的治疗。作为胰腺细胞，可列举出分泌胰岛素的β细胞等。本发明的药物组合物作用于存在于胰管内的胰腺干细胞/胰腺祖细胞，诱发其自我复制和分化诱导，由此能使受损或功能减退的胰腺细胞再生。
本发明的药物组合物可以用于1型糖尿病、2型糖尿病、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、产黏蛋白肿瘤等胰腺的疾患等的治疗。
本发明的药物组合物在用于治疗心脏的疾患等时，可以是向胰腺的局部给药、经口给药、向血管的注射、静脉注射等给药方式。
本发明的药物组合物可以用于血液癌的治疗。作为血液癌，可列举出急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等白血病；经典的霍奇金淋巴瘤、-结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤等霍奇金淋巴瘤、B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、T细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、滤胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、皮肤的淋巴瘤(蕈样霉菌病、塞扎里综合征)等恶性淋巴瘤；多发性骨髓瘤症状、良性单克隆高γ球蛋白血症、无症状骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤等多发性骨髓瘤。
本发明的药物组合物可以用于将存在于血液中的癌细胞分化诱导为血管内皮细胞的用途。
本发明的一个实施方式中，可以用于通过将存在于血液中的癌细胞分化诱导为血管内皮细胞来治疗血液癌。
对于给药量而言，以有效成分的重量计，每1kg体重一次可以优选为0.0001mg以上、更优选为0.001mg以上、更优选为0.01mg以上、更优选为0.1mg以上。另外，每1kg体重一次可以优选为10000mg以下、更优选为1000mg以下、更优选为100mg以下。
另外，对于给药量而言，以有效成分的重量计，每位患者可以优选为0.01mg以上、更优选为0.1mg以上、更优选为1mg以上、更优选为10mg以上。另外，每位患者可以优选为100000mg以下、更优选为10000mg以下、更优选为1000mg以下、更优选为100mg以下。
另外，给予时间表可以边进行病状的观察和血液检测值的动向的观察边在例如3次/天～1次/月、例如1次/天～1次/周之间进行调整。
以下对脑神经系统的疾患等的治疗或预防、青光眼的治疗或预防、以及脊髓损伤的治疗中的、本发明的药物组合物的用法进行更具体地说明。
进行脑神经系统的疾患等的治疗或预防时，优选通过脑内注射、更具体而言脑室内注射给予本发明的药物组合物而使用。
在此情况下，优选使用脑内给药系统，所述脑内给药系统包括：具备填充有包含本发明的药物组合物的注射液的注射器和注入泵的注入设备、及通过延长线与该注入设备连接的脑室访问设备。通过在颅骨上穿孔将脑室访问设备插入脑内，并将注射器刺入脑内的给药目标部位。然后，启动注入泵，将注射液以优选为0.1mL/小时～10mL/小时、更优选为1mL/小时～5mL/小时的速度注入。
脑内注射可以优选以1次/天～1次/1个月、更优选以1次/3天～1次/3周的频率进行。
另外，已知在鼻腔内存在所给予的物质不经由血液而通过鼻腔粘膜层直接转移至脑脊髓液或者脑中的路径。
因此，为了使本发明的药物的有效成分到达脑，可以优选示例出鼻腔内给予的方式。
在此情况下，本发明的药物可以通过以粉末鼻喷雾器、液体鼻喷雾器的形态向鼻腔内喷雾而给予。
另外，本发明的药物可以通过以滴鼻药的形态向鼻腔内滴加而给予。
另外，本发明的药物可以以凝胶状制剂、软膏的剂型的形式借助管或导管向鼻腔内给予。
另外，本发明的药物可以以注射剂的剂型的形式通过向鼻腔粘膜的粘膜下注入而给予至鼻腔内。
给药频率可以优选为1次/天～1次/周、更优选为2次/天～1次/3天。
进行青光眼的治疗或预防时，优选将本发明的药物组合物以滴眼药或眼部软膏的剂型的形式滴加或涂布至眼球。
给药频率可以优选为1次/天～1次/周、更优选为2次/天～1次/3天。
进行脊髓损伤的治疗时，优选将本发明的药物组合物以注射剂的剂型直接注射至脊髓损伤部位。
注射也可以通过手动间歇地进行，但优选使用微型泵和与其连接的导管等连续地向损伤部给予。
优选在损伤后尽可能快地开始给药，优选在损伤后至少1周、进一步优选至少2周持续给药。
进行心脏的疾患等的治疗时，也可以采用将本发明的药物组合物以注射剂的剂型的形式直接向心脏给药的方式。另外，也可以采用将本发明的药物组合物以注射剂的剂型的形式进行静脉注射的方式。另外，也可以采用将本发明的药物组合物以经口给药剂的剂型的形式进行经口给药的方式。
进行胰腺的疾患等的治疗时，也可以采用将本发明的药物组合物以注射剂的剂型的形式直接向胰腺给药的方式。另外，也可以采用将本发明的药物组合物以注射剂的剂型的形式进行静脉注射的方式。另外，也可以采用将本发明的药物组合物以经口给药剂的剂型的形式进行经口给药的方式。
将本发明的药物组合物制成血液癌的治疗剂时，也可以采用以注射剂的剂型的形式进行静脉注射的方式。另外，也可以采用将本发明的药物组合物以经口给药剂的剂型的形式进行经口给药的方式。
另外，本发明还涉及将通式(I)、通式(II)、通式(III)中包含的化合物或其盐或其水合物作为有效成分的药物组合物。其具体方式如上所述，因此此处省略说明。
本发明的一个实施方式中，本发明的有效成分为选自上述的化合物1～7中的化合物或其盐或它们的水合物。其具体方式如上所述，因此此处省略说明。
实施例
[试验例1]神经干细胞的增殖试验
<使用动物>
在中脑的神经干细胞中特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因系统斑马鱼的胚胎
<待检化合物>
化合物1：(3R)-环戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基]丙腈磷酸盐
化合物2：4-[3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]喹啉
化合物3：2-氨基-5-(乙基氨基)-5-氧代戊酸
化合物4：N1-羟基-N8-苯基辛二酰胺
化合物5：4-[(5-溴代吡啶-2-基)氨基]-4-氧代丁酸
化合物6：5-氯-2-N-{4-[4-(二甲基氨基)哌啶-1-基]-2-甲氧基苯基}-4-N-[2-(二甲基磷酰基)苯基]嘧啶-2,4-二胺
化合物7：2-[[5-氯-2-[2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基]嘧啶-4-基]氨基]-N-甲基苯磺酰胺
(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
<实验方法>
制备将待检化合物溶解于E3林格液(斑马鱼生理盐水)中的溶液(100μM)。将该溶液在显微镜下注入受精后24小时胚胎的脑室中，在28.5℃下培养至受精后72小时。
需要说明的是，为了抑制会干扰荧光显微镜观察的黑色素合成，在培养液中添加了0.2mM的苯基硫脲(PTU)。
另外，在显微注入时将胚胎用0.02％ MS-222(托利卡因)/E3林格液麻醉后，将头部背侧朝上保持在棺材(在塑料制的板上刻有固定用的V字型的槽)上，在松果体附近插入玻璃毛细管。此外，施加氮气气压(15picosiemens)15～45毫秒并注入到脑室内。
此时，混入0.025％(最终浓度)酚红作为注入液的示踪剂。
施加脉冲气压调节注入的量直至使前脑室、间脑和中脑室变为均匀的淡红色。
作为对照实验(对照)，仅向脑室内给予相同量的E3林格液。
将培养至受精后72小时的个体在3％甲基纤维素/E3林格液/0.02％托利卡因溶液中固定于载玻片上后，用488nm激发光使GFP发光并用CCD相机进行拍摄(图6～8)。
在使用了各待检化合物的实验中，样品数为80(N＝80)。
另外，将实施了各处置的斑马鱼个体的脑解剖，用灭菌蒸馏水清洗后，在500μl的Sepasol-RNA I Super G(Nacalai Tesque)中进行吹打或用18G～24G针的1ml注射器抽吸排出进行破碎。用当量的苯酚/氯仿处理进行1次、用氯仿处理进行1次脱蛋白操作，对于上清液，用RNA纯化柱(RNeasy Plus Mini Kit，Qiagen)将RNA纯化。使用随机六聚体和寡聚-dT的混合引物以37℃15分钟、98℃5分钟将洗脱物逆转录(ReverTra Ace qPCR Kit，TOYOBO)，进行作为神经干细胞的标记物的sox1α、sox2、sox3和her6的表达量的定量PCR。定量PCR利用SYBER Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)进行。PCR反应使用ABI PRISM7700或Roche Diagnostics K.K.的LightCycler。对于同一样品中的一个，在3个孔中进行定量(n＝3)。使用标准化器(β肌动蛋白/GAPDH/18S等)，利用ΔΔCt法对得到的数据进行比较定量。为了确认定量反应是可靠的，通过琼脂糖电泳确认了扩增产物形成了条带。
<结果>
如图6～8所示，注入了待检化合物的斑马鱼胚胎中，观察到表示中脑神经干细胞的GFP的荧光的范围与对照相比显著增大。
该结果示出：作为待检化合物的化合物1～7显示出具有显著促进神经干细胞的自我复制的作用。
另外，在所有样品中均未确认肿瘤的发生。该结果示出：能够促进神经细胞的自我复制，而不会引起作为再生医疗的风险之一的癌变。
另外，定量PCR的结果中，观察到神经未分化细胞的增殖的斑马鱼个体的脑中，观察到作为神经干细胞的标记物的sox1α、sox2、sox3和her6的表达量显著上升。图9和图10示出给予了化合物2和7的个体中的定量PCR的结果。
[试验例2]神经系统分化细胞的增殖试验
<实验方法>
将试验例1中进行了待检化合物的脑室内给药的个体培养至胚胎40小时，用4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)进行90分钟常温固定后，用作为分化的神经细胞的标记物的抗乙酰化微管蛋白抗体(单克隆、x1/3000稀释)和Alexa 488抗小鼠IgG二次抗体进行免疫荧光标记，用488nm的激发光进行观察(图11～图13)。
在使用了各待检化合物的实验中，样品数为10(N＝10)。
<结果>
图11～图13中观察到绿色荧光的部分为分化的神经细胞、更具体而言，为神经的细胞体簇(端脑/间脑)和连接它们的轴突束。如图11～图13所示，注入了待检化合物的斑马鱼胚胎中，表示分化的神经的细胞体簇的趋势范围和强度与对照相比显著增大。
另外，在所有样品中未观察到肿瘤的发生。
若一并考察试验例1和2的结果，作为待检化合物的化合物1～7促进神经未分化细胞的自我复制，由此对已增殖的神经未分化细胞诱发分化诱导，可以说具有使神经系统分化细胞增殖的作用。
再生医疗常识认为：未分化细胞的自我复制和分化诱导必须由不同的因素诱发。
然而，试验例1和2的结果证实了一个令人惊讶的事实，通过单一试剂能够实现未分化细胞的自我复制和分化诱导这2个过程(而且不会引起癌变)。
[试验例3]使用了斑马鱼胚胎的筛选
准备结构完全不同的化合物文库，依据试验例1和试验例2进行筛选。其结果，观察到37种化合物使神经未分化细胞和神经分化细胞增加。表1汇总神经未分化细胞和神经系统分化细胞的增加得到确认的化合物的主要作用。
[表1]
[表1]
Figure BDA0003918123640001221
如表1所示，通过筛选被判断为有效成分的化合物集中在作用于与干细胞的自我复制、全能性维持或分化/发育诱导相关的信号传递通路(Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路)上。这些信号通路参与干细胞的自我复制和分化诱导的控制。
有趣的是，在之前的体外试验的报告中认为具有干细胞的自我复制/全能性的维持或促进作用的化合物、和认为具有促进分化/发育的作用的化合物分别通过单一试剂引起了神经未分化细胞和神经分化细胞的增加。
该结果示出：在体外的试验中，仅阐明了干细胞的特性调控的一个方面。即，表明：体外试验系统仅可以观察到“干细胞的自我复制/多能性的维持”和“分化诱导”中任意的单方面作用。
另一方面，本发明的使用生物体的体内筛选系统能够呈现出反映细胞间/组织间的复杂的信息传递的、极其有效的结果。
[试验例4]化合物对斑马鱼成鱼的脊髓损伤个体的再生诱导效果
<使用动物>出生后一个月大的斑马鱼
<待检化合物>
化合物1～7(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
<实验方法>
将出生后1个月大的斑马鱼个体用0.02％托利卡因麻醉后，通过玻璃毛细管的刺入使脊髓受损。损伤后喂养1天，将使100μM的待检化合物溶解于0.1％-0.3％琼脂糖/E3林格液中而得到者注入损伤部位。此时，混入0.025％(最终浓度)酚红作为示踪剂。在可见光下利用立体显微镜进行观察，确认酚红存留在脊髓损伤部周边，喂养3天。
作为对照实验(对照)，也进行了注入不含待检化合物的0.1％-0.3％琼脂糖/E3林格液的实验。
一组用0.02％托利卡因直接在生物体中进行轻微麻醉，保持在低温溶解型琼脂糖1％/E3林格液/0.02％托利卡因内后，在2.0mL腔室中在回流状态下进行MRI成像。成像后，进行去麻醉治疗(从口强制灌注E3林格液，确认恢复自主呼吸)，在28.5℃下继续喂养，1个月后用4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)进行2天常温固定，然后再次进行MRI成像。
另一组在脊髓损伤后立即在4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)中进行2天常温固定，然后进行MRI成像。
实施了脊髓损伤处置的个体在喂养期间1天3次强制经口给予人工饲料来进行营养补给。
<结果>
在脊髓损伤后，为了确认导入脊髓中的损伤，立即通过MRI进行成像。其结果，利用上述实验方法确认对斑马鱼个体造成了脊髓损伤。
对将化合物注入脊髓损伤部位3天后和1个月后所拍摄的MRI图像进行了比较。其结果，确认对照的斑马鱼个体中脊髓的损伤原样保留而没有得到治愈。另一方面，注入了待检化合物的斑马鱼个体中，未观察到脊髓的损伤。即，观察到脊髓在损伤部位的再生。
另外，对照的斑马鱼在脊髓损伤后，持续丧失了游泳能力。另一方面，注入了待检化合物的斑马鱼中，观察到因脊髓损伤而丧失的游泳能力得到了明显的恢复。
该结果示出：作为待检化合物的化合物1～7具有脊髓损伤的治疗效果。
若一并考察试验例1～3的结果，可以说化合物1～7具有如下作用：促进神经未分化细胞的自我复制，对由此而增殖出的神经未分化细胞诱发分化诱导，由此使损伤的神经系统再生。
[试验例5]基于滴眼的小鼠视网膜神经细胞的再生诱导效果
<使用动物>
高眼压型青光眼模型小鼠(在视网膜神经节细胞中特异性表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因系统)
<待检化合物>
化合物1～7(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
<实验方法>
对高眼压型青光眼模型小鼠的成体的两眼以滴眼给予将待检化合物100μM溶解于1％甲基纤维素/生理盐水中而得到的溶液，1天3次，每次500μl。在滴眼10天～1个月后进行处死处理，制作视网膜组织切片，以488nm激发光通过荧光显微镜观察视网膜神经节细胞，用CCD相机进行拍摄。
作为对照实验(对照)，也进行了将不含待检化合物的1％甲基纤维素/生理盐水滴眼的实验。
<结果>
将经作为待检化合物的化合物1～7滴眼的高眼压型青光眼模型小鼠与对照相比，观察到视网膜神经节细胞显著扩增(图14示出化合物7的结果)。另外，进行了待检化合物滴眼的高眼压型青光眼模型小鼠中，从其行动确认了视力得到了明显恢复。
该结果示出：作为待检化合物的化合物1～7具有青光眼的治疗效果或预防效果。
若一并考察试验例1～5的结果，则可以说化合物1～7具有如下作用：促进神经未分化细胞的自我复制，对由此增殖的神经未分化细胞诱发分化诱导，由此使已损伤的神经系统再生。
[试验例6]基于脑室内给予的成体小鼠的浦肯野细胞的增加
<使用动物>
E11.5小鼠胚胎
<待检化合物>
化合物1～7(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
<实验方法>
将使待检化合物100μM溶解于生理盐水中而制得的溶液注入E11.5的小鼠胚胎脑室内。将生长成成体的小鼠个体的脑固定，将小脑浦肯野细胞层的切片用作为浦肯野细胞的细胞体和神经突的标记物的抗d-钙结合蛋白抗体进行免疫染色。染色后，对浦肯野细胞数进行计数，计算出其平均值。
作为对照实验(对照)，使用不含待检化合物的生理盐水进行了同样的实验。
化合物1～7、对照的样品数分别为10(N＝10)。
<结果>
胚胎时注入了待检化合物的成体小鼠的小脑浦肯野细胞层中的浦肯野细胞数与对照相比显著增多(图15、图16、图17分别示出化合物2、5、7的结果)。
该结果示出：通过作为待检化合物的化合物1～7能够实现脑神经系统的再生和增强。即，可以说化合物1～7对脑神经系统的疾患等具有治疗效果。
[试验例7]基于脑室内给予的成体斑马鱼的神经干细胞的增加
<使用动物>
在中脑神经干细胞中特异性表达绿色荧光蛋白的报告基因转基因系统的斑马鱼
<待检化合物>
化合物1～7(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
制备将待检化合物(100μM)溶解于E3林格液(斑马鱼生理盐水)中的溶液(0.1％DMSO)。在显微镜下将该溶液注入用绿色荧光蛋白标记了中脑神经干细胞的1个月大幼年成鱼个体的脑室中，在28.5℃下培养1周。
作为对照实验(对照)，以相同量向脑室内仅给予E3林格液(0.1％DMSO+0.025％酚红)。
与上述的方法不同，将待检化合物包封于脂质体中并将脂质体转染至脑室区(Marine Biotechnology 8(3)：295-303 2006)。具体而言，将待检化合物(0.1％ DMSO)10μl与10μl OPTI-MEM1培养基(Invitrogen)、5μl 0.8％酚红混合(管A)。同时另行准备混合了3μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen)和7μl的OPTI-MEM1培养基的溶液(管B)，将管B进行5分钟常温静置。然后将管A和管B进行等量混合，在常温下进行20分钟包封反应后，利用与上述的方法相同的方法注入个体中。
利用该脂质体法注入的待检化合物的效果进一步局部化，向细胞内的渗透性也上升。
作为对照实验(对照)，使用仅用E3代替待检化合物进行反应后的溶液。
需要说明的是，在上述2个方法的显微注入时，用0.02％ MS-222(托利卡因)/E3林格液将个体麻醉后，将头部背侧朝上保持在棺材(在塑料制的板上刻有固定用的V字型的槽)上，在松果体附近插入玻璃毛细管。此外，施加氮气气压(15picosiemens)15～45毫秒并注入到脑室内。此时，混入0.025％(最终浓度)酚红作为注入液的示踪剂。施加脉冲气压调节注入的量直至使前脑室、间脑和中脑室变为均匀的淡红色。
培养后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的荧光，由此评价了局部给予了待检化合物的斑马鱼的神经干细胞的量。具体而言，将注入后培养7天的个体在3％甲基纤维素/E3林格液/0.02％托利卡因溶液中保持在载玻片上，然后在488nm激发光下使GFP发光并用CCD相机进行拍摄。另外，利用亮度解析软件，测定以荧光表达部为中心吻端朝上的宽度100μm、高度50μm的长方形内的绿色荧光蛋白的平均荧光亮度。
大多数的情况下，这些操作过程中个体的自主呼吸消失而处于窒息状态，因此通过带有200μL用的枪头的微量移液器通过手操作使E3经口反复流入，持续复苏作业至自主呼吸恢复。
需要说明的是，为了抑制会干扰荧光显微镜观察的黑色素的合成，在培养液中添加了0.2mM的苯基硫脲(PTU)。
<结果>
荧光观察的结果，在采用了任意注入方法的情况下，与对照相比均较强地检测出表示注入了待检化合物的成体斑马鱼的脑中存在中脑神经干细胞的荧光。图18示出在E3林格液中稀释化合物5并给药时的结果。
该结果启示出：通过作为待检化合物的化合物1～7能够实现成体中的脑神经系统的再生和增强。即，可以说：利用本发明的筛选方法筛选出的有效成分对脑神经系统的疾患等发挥治疗效果。
[试验例8]心肌的增强
<使用动物>
斑马鱼胚胎
<待检化合物>
化合物1～7(后述的实验中分别使用了化合物1～7。)
<实验方法>
将受精后10小时的斑马鱼胚胎的头部背侧朝上保持在棺材(在塑料制的板上刻有固定用的V字型的槽)上，在头部和耳囊的中间的正中线(预定的心脏原基)插入玻璃毛细管。施加氮气气压(15picosiemens)15～45毫秒并注入到神经管正下方的间隙内。待检化合物浓度为100μM/E3，混入0.025％(最终浓度)酚红作为注入液的示踪剂。注入通过脚踏板以脉冲方式进行，持续进行至酚红从插入点开始呈长径200μm的椭圆形分布为止。注入后胚胎在28.5℃下、E3中培养14小时，用镊子去除绒毛膜后，用4％多聚甲醛/PBS进行常温1小时固定，依据常规方法在心肌标记物nkx2.5的DIG探针共存下、在65℃下进行原位杂交过夜，清洗后通过基于抗DIG抗体的碱性磷酸酶显色反应将心肌细胞染色。染色后胚胎用PBS清洗后，包埋于75％甘油/PBS中，定位后用落射光进行显微镜拍摄。各化合物的待检个体数统一为n＝80。
另外，将利用上述的方法注入了待检化合物的斑马鱼胚胎在28.5℃下培养至受精后48小时，包埋于3％甲基纤维素/E3中，进行视频拍摄。以延时方式以n＝15计数一次搏动所喷出的血细胞数，与林格液注入个体进行比较。
<结果>
原位杂交的结果，与对照相比，观察到注入了待检化合物的斑马鱼个体的心肌细胞量增加。图19示出注入了化合物2、5、7的个体的显微镜照片。
另外，注入了待检化合物的斑马鱼个体中，与对照的个体相比，观察到一次搏动所喷出的血细胞数的显著的增加。图20示出对注入了化合物7的个体中的血细胞的一次输出量进行计数的结果。
另外，由拍摄了注入了待检化合物的个体的心脏搏动的视频确认了血细胞的一次输出量得到显著提高。图21示出对注入了化合物7的个体的心脏的搏动进行拍摄的视频的抓取图像。
试验例8的结果示出：利用本发明的筛选方法筛选出的有效成分具有心肌的增强效果。即，证实了：该有效成分具有能够治疗由心肌细胞的障碍、功能降低所致的心脏疾患等的效果。
[试验例9]
<使用动物>
胰腺β细胞GFP表达转基因斑马鱼
<待检化合物>
化合物1～7
<实验方法1>荧光观察
使受精后10小时的胰腺β细胞GFP表达转基因斑马鱼胚胎的头部背侧朝上保持在棺材上，将玻璃毛细管插入从背侧到吻端-耳囊的约2倍的距离尾侧的正中线神经管正下方的间隙(预定胰腺原基)中。施加氮气气压(15picosiemens)15～45毫秒并注入了待检化合物。以待检化合物的浓度为100nM/E3，混入0.025％(最终浓度)酚红作为注入液的示踪剂。注入用脚踏板以脉冲方式进行，持续进行至酚红从插入点开始呈长径200μm的椭圆形分布为止。处理后胚胎在28.5℃下培养至48小时，用0.02％ MS-222(托利卡因)/E3林格液麻醉后，用488nm激发光观察胰腺β细胞特异性GFP(图22)。
<实验方法2>原位杂交
在棺材上将待检化合物(100nM)注入受精后10小时的胰腺β细胞GFP表达转基因斑马鱼胚胎中。注入后，将胚胎在28.5℃下、E3中培养14小时。用镊子去除绒毛膜后，用4％多聚甲醛/PBS进行常温1小时固定，依据常规方法在胰岛素(ins)的DIG探针共存下在65℃下进行原位杂交过夜，清洗后通过基于抗DIG抗体的碱性磷酸酶显色反应将β细胞染色。染色后，用PBS清洗胚胎后，包埋于75％甘油/PBS中，定位后用落射光进行显微镜拍摄。各待捡化合物的待检个体数统一为n＝100(图23)。
<实验方法3>抗胰岛素抗体的免疫染色
在棺材上将待检化合物(100nM或5nM)注入受精后10小时的胰腺β细胞GFP表达转基因斑马鱼胚胎中。注入后，将胚胎在0.2mM的苯基硫脲(PTU)存在下在28.5℃下、E3中培养20小时。用镊子去除绒毛膜后，用4％多聚甲醛/PBS进行常温1小时固定，依据常规方法，利用抗胰岛素抗体进行免疫组织化学反应后，用Alexa fluor 488抗小鼠IgG二次抗体进行反应。反应后用PBS清洗胚胎，包埋于75％甘油/PBS中，定位后用488nm激发光进行显微镜拍摄(图24)。各化合物的待检个体数统一为n＝10。对于胰岛素量，以荧光点为中心测定半径100μm的圆内的平均荧光强度并进行定量化(图25)。
<结果>
与对照的个体相比，确认了注入了被检化合物1～7的个体中的β细胞增加。图22示出化合物7的结果。
另外，与对照的个体相比，确认了注入了被检化合物1～7的个体中的β细胞胰岛素的产生量显著增加。图23示出注入化合物2、5、6和7时的原位杂交的胰岛素的染色照片。另外，图24和图25示出注入化合物2和6的抗胰岛素抗体的免疫染色照片及表示其平均荧光强度的柱状图。
该结果示出：作为待检化合物的化合物1～7具有胰腺干细胞和β细胞之类的分化的胰腺细胞的增加效果。即，可以说：利用本发明的筛选方法筛选出的有效成分对胰腺的疾患等发挥治疗效果。
[试验例10]抗癌作用的验证
<使用动物>
在血管内皮细胞中特异性表达GFP的、T细胞型急性淋巴细胞性白血病模型
<待检化合物>
化合物7
<实验方法>
在T细胞型急性淋巴细胞性白血病模型个体的受精后24小时的胚胎的体腹侧主血管中，在显微镜下注入在E3林格液中添加化合物调整为100μM的液体制剂。作为对照，同样地在显微镜下注入E3林格液。在显微注入时，将胚胎在载玻片上在3％甲基纤维素/E3林格液/0.02％托利卡因溶液中使体侧部朝上保持后，将玻璃毛细管从体壁与卵黄的边界插入沿着头部～尾部方向运行的腹部主血管中。此外，施加氮气气压(15picosiemens)30～45毫秒并注入血管内。此时，混入0.025％(最终浓度)酚红作为注入液的示踪剂。通过以脉动方式施加气体压力来调节注射量直至全身的粗血管因血流而变为均匀的淡红色。注入的药剂在1天内存储在肾脏，酚红得到局部化，因此在受精后36小时/48小时也在同样的条件下追加注入了化合物7或对照的E3林格液。受精后56小时将个体再次麻醉，用488nm激发光对血管内皮细胞进行荧光观察。
另外，对药剂注入个体和对照个体的存活率进行计数。存活率的验证试验进行3次。第1次/第2次/第3次每次试验个体数量是，对照为173/231/153个体、药剂处理为221/187/204个体。
<结果>
注入了化合物7的个体中，与对照个体相比，在全身的血管中观察到内皮的增厚/癌变(图26)。另外，对于第28天的存活率，对照为22.4％±4.56、注入了化合物7的个体为55.9％±6.07。即，与对照的个体相比，观察到注入了化合物7的个体的存活率显著上升(图27)。
这些结果示出：化合物7通过将血液中的癌细胞强制分化为正常的血管内皮细胞而发挥抗癌作用。
[考察]
如试验例1～8所示，首次发现了多种通过单一试剂实现在生物体内未分化细胞的自我复制和分化诱导的化合物。换言之，向动物给予候补物质，观察未分化细胞和/或分化细胞，将这些细胞的增殖效果作为指标，证实了能够筛选出对各种组织的疾患等有效的再生药物的有效成分。
另外，如试验例1和2所示，利用本发明的筛选方法筛选出的有效成分通过单一试剂实现未分化细胞的自我复制和分化诱导这2个过程，而且令人惊讶的是不会引起癌变。另外，如图6～8、11～19、21所示，注入了前述有效成分的个体未观察到形态异常等，可以理解发生了正常的发育/分化。这启示出：由于通过给予有效成分而可以促进自我复制的未分化细胞不会无限地持续自我复制，因受到存在于其周围环境中的组织、细胞的影响而在适合的时机切换为分化促进的方向。
以此为前提考察了试验例9的结果。急性白血病是在正常造血细胞的分化过程中的某个阶段发生分化停止和获得增殖能力而发生的造血系统肿瘤性疾患。急性白血病就如模仿正常造血干细胞系统一样，构成包含具有自我复制能力和分化为白血病母细胞的能力的白血病干细胞的白血病细胞群体。维持未成熟性的白血病干细胞表现出治疗抗性，成为复发的根本原因。众所周知，白血病干细胞和血管内皮细胞粘附、并受到由此形成的微环境(niche)的影响对于白血病的发病、维持、增殖是重要的(非专利文献28)。
如上所述，本发明中筛选出的有效成分在生物体内的周围环境下不会引起癌变，具有平衡良好地正常地促进未分化细胞的自我复制和分化诱导的作用。可以说有效成分所具有的该作用对白血病干细胞发挥作用时的输出是试验例9的结果。即，试验例9中的癌细胞向血管内皮细胞的强制分化，可以说是在与血管内皮细胞的粘附所形成的微环境的影响下，化合物7作用于白血病干细胞，促进向正常的血管内皮细胞的分化的结果。换言之，可以说：本发明中筛选出的有效成分用作于具有异常增殖能力的白血病干细胞和正常的血管内皮细胞通过物理接触进行的微环境下的信息传递(磷酸化/甲基化/乙酰化等)，具有促进将白血病干细胞分化为血管内皮细胞侧的细胞命运替换的效果。
根据以上结果，可以说向生物体给予时发挥未分化细胞和分化细胞的增殖作用的化合物是发挥在微环境的影响下促进癌细胞向正常细胞的强制分化的作用的化合物。换言之，通过本试验例证实了：向动物给予候补物质，观察未分化细胞和/或分化细胞，将这些细胞的增殖效果作为指标，则能够筛选具有将癌细胞强制分化诱导为正常细胞的作用的抗癌药的有效成分。
产业上的可利用性
本发明可以用于再生药物或抗癌药的有效成分的筛选。

Claims (97)

1.一种药物的有效成分的筛选方法，其具备：以下的A工序；B工序和/或C工序；及D工序，
[A工序]向动物给予候补物质的工序，所述动物不包括人，
[B工序]对经过所述A工序的所述动物中的未分化细胞进行观察的工序，
[C工序]对经过所述A工序的所述动物中的分化细胞进行观察的工序，
[D工序]选择与未给予候补物质的情况相比提高所述未分化细胞的量的候补物质、或者选择提高所述分化细胞的量或由所述分化细胞构成的组织的功能的候补物质作为所述有效成分的工序。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其为再生药物和/或抗癌药的有效成分的筛选方法。
3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其为用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的筛选方法，其为用于治疗血液癌的有效成分的筛选方法。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质为选自低分子化合物、蛋白质、肽和核酸中的1种或2种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的筛选方法，其具备所述B工序和所述C工序。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为脊椎动物。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其中，所述动物为哺乳动物、鱼类、鸟类、爬行动物或两栖动物。
9.根据权利要求8所述的筛选方法，其中，所述动物为斑马鱼或小鼠。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序中，向动物胚胎给予候补物质。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为斑马鱼的胚胎。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序中，向所述动物局部给予所述候补物质。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序中，向所述动物的胚胎局部给予所述候补物质。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序中，向所述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予所述候补物质。
15.根据权利要求14所述的筛选方法，其中，所述B工序中，对所述特定组织的未分化细胞进行观察。
16.根据权利要求14或15所述的筛选方法，其中，所述C工序中，对所述特定组织的分化细胞进行观察。
17.根据权利要求1～20中任一项所述的筛选方法，其中，
所述A工序包括对斑马鱼的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予所述候补物质的步骤，
所述B工序包括对所述特定组织的未分化细胞进行观察的步骤，
所述C工序包括对所述特定组织的分化细胞进行观察的步骤。
18.根据权利要求14～17中任一项所述的筛选方法，其中，所述特定组织为神经系统、心脏或胰腺。
19.根据权利要求18所述的筛选方法，其中，所述神经系统为中枢神经系统。
20.根据权利要求19所述的筛选方法，其中，所述中枢神经系统为脑、脊髓或视神经。
21.根据权利要求14～20中任一项所述的筛选方法，其为用于治疗或预防与所述特定组织相同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
22.根据权利要求14～20中任一项所述的筛选方法，其为用于治疗或预防与所述特定组织不同的组织的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
23.根据权利要求1～22中任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述动物为导入了在所述未分化细胞和/或所述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物。
24.根据权利要求1～23中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为导入了在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
所述B工序中，对在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
25.根据权利要求1～24中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为导入了在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
所述C工序中，对在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
26.根据权利要求23～25中任一项所述的筛选方法，其中，所述报告基因编码荧光蛋白、或荧光蛋白与其它蛋白的融合蛋白。
27.根据权利要求26所述的筛选方法，其中，通过观察所述荧光蛋白的荧光，从而对所述报告基因的表达进行观察。
28.根据权利要求1～27中任一项所述的筛选方法，其中，所述B工序中，对未分化细胞标记物进行观察。
29.根据权利要求1～28中任一项所述的筛选方法，其中，所述C工序中，对分化细胞标记物进行观察。
30.根据权利要求28或29所述的筛选方法，其中，所述未分化细胞标记物和/或所述分化细胞标记物的观察手段为免疫染色或原位杂交。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为导入了在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
所述B工序中，对在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察，
所述C工序中，对分化细胞标记物进行观察。
32.根据权利要求1～31中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为导入了在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
所述B工序中，对未分化细胞标记物进行观察，
所述C工序中，对在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
33.根据权利要求1～32中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为导入了在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因、和导入了在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的转基因动物，
所述B工序中，对在所述未分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察，
所述C工序中，对在所述分化细胞中特异性表达的报告基因的表达进行观察。
34.根据权利要求1～33中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质包含选自5-HT受体抑制剂、AChR抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、AhR激活剂、Akt抑制剂、ALK抑制剂、ATPase抑制剂、自噬抑制剂、钙通道抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、Cdc42抑制剂、CDK抑制剂、COX抑制剂、脱氢酶抑制剂、DHFR抑制剂、EGFR抑制剂、ERK抑制剂、雌激素/孕激素受体抑制剂、γ分泌酶抑制剂、谷氨酸受体配体(增强剂)、GSK-3抑制剂、HDAC激活剂、HDAC抑制剂、Hedgehog/Smoothened激动剂、IGF-IR抑制剂、白细胞介素受体抑制剂、IRAK抑制剂、JAK/STAT抑制剂、MAO抑制剂、MEK抑制剂、线粒体自噬抑制剂、NF-kB抑制剂、NF-kB-AMPK-酪氨酸激酶通路抑制剂、Notch-1抑制剂、P450抑制剂、PAEF抑制剂、PDE抑制剂、PPAR抑制剂、TGF-β受体抑制剂、TGF-beta/Smad抑制剂、TNF受体抑制剂、Wnt/β-连环蛋白通路激活剂中的1种或2种以上。
35.根据权利要求1～34中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质包含利用insilico法推测出是选自下述组中的1种或2种以上的物质：5-HT受体抑制剂、AChR抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂、AhR激活剂、Akt抑制剂、ALK抑制剂、ATPase抑制剂、自噬抑制剂、钙通道抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、Cdc42抑制剂、CDK抑制剂、COX抑制剂、脱氢酶抑制剂、DHFR抑制剂、EGFR抑制剂、ERK抑制剂、雌激素/孕激素受体抑制剂、γ分泌酶抑制剂、谷氨酸受体配体(增强剂)、GSK-3抑制剂、HDAC激活剂、HDAC抑制剂、Hedgehog/Smoothened激动剂、IGF-IR抑制剂、白细胞介素受体抑制剂、IRAK抑制剂、JAK/STAT抑制剂、MAO抑制剂、MEK抑制剂、线粒体自噬抑制剂、NF-kB抑制剂、NF-kB-AMPK-酪氨酸激酶通路抑制剂、Notch-1抑制剂、P450抑制剂、PAEF抑制剂、PDE抑制剂、PPAR抑制剂、TGF-β受体抑制剂、TGF-beta/Smad抑制剂、TNF受体抑制剂、Wnt/β-连环蛋白通路激活剂。
36.根据权利要求1～35中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质是正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质。
37.根据权利要求1～37中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质是利用insilico法推测出正调控选自c-Myc、Sox2、Klf4和Oct4中的1种或2种以上的表达的物质。
38.根据权利要求1～37中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质是作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路的物质。
39.根据权利要求1～38中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质是利用insilico法推测出作用于选自Notch信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路、TGFβ/SMAD信号通路、Wnt信号通路中的1种或2种以上的信号通路的物质。
40.根据权利要求35、38和39中任一项所述的筛选方法，其中，所述in silico法为SBDD法和/或LBDD法。
41.根据权利要求1～40中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序包括向所述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予所述候补物质的步骤，
所述C工序包括对所述特定组织的功能进行观察的步骤。
42.根据权利要求1～41中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序包括向所述动物的胚胎中的能发育为特定组织的区域或其附近局部给予所述候补物质的步骤，
所述C工序包括对所述特定组织的运动功能或所述特定组织所分泌的物质的分泌量进行观察的步骤。
43.根据权利要求1～42中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序包括向所述动物的胚胎中的能发育为心脏的区域或其附近局部给予所述候补物质的步骤，
所述C工序包括对心脏的运动功能进行观察的步骤。
44.根据权利要求1～43中任一项所述的筛选方法，其中，所述A工序包括向所述动物的胚胎中的能发育为胰腺的区域或其附近局部给予所述候补物质的步骤，
所述C工序包括对β细胞的胰岛素的生产量或分泌量进行观察的步骤。
45.根据权利要求1～44中任一项所述的筛选方法，其中，所述动物为所述神经系统的疾患、障碍、或疾病的模型动物。
46.根据权利要求1～45中任一项所述的筛选方法，其为用于治疗或预防青光眼的有效成分的筛选方法。
47.根据权利要求46所述的筛选方法，其中，所述A工序为向所述动物的视网膜给予候补物质的工序，
所述B工序为对视网膜神经节细胞的祖细胞或能分化为该细胞的神经干细胞进行观察的工序，
所述C工序为对视网膜神经节细胞进行观察的工序。
48.根据权利要求46或47所述的筛选方法，其中，所述动物为青光眼模型。
49.根据权利要求1～44中任一项所述的筛选方法，其为用于治疗脊髓损伤的有效成分的筛选方法。
50.根据权利要求49所述的筛选方法，其中，所述A工序为向所述动物的脊髓给予候补物质的工序，
所述B工序为对脊髓中的未分化细胞进行观察的工序，
所述C工序为对脊髓中的分化细胞进行观察的工序。
51.根据权利要求49或50所述的筛选方法，其中，所述动物为脊髓损伤模型。
52.一种用于治疗或预防疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法，其具备以下的E工序、F工序和G工序，
[E工序]向疾患、障碍或疾病的模型动物给予候补物质的工序，所述模型动物不包括人，
[F工序]判定经过所述E工序的所述动物中的疾患、障碍、或疾病的治疗效果的工序，
[G工序]选择具有治疗效果的候补物质作为所述有效成分的工序。
53.根据权利要求52所述的筛选方法，其为再生药物和/或抗癌药的有效成分的筛选方法。
54.根据权利要求52或53所述的筛选方法，其为用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法。
55.根据权利要求52～54中任一项所述的筛选方法，其中，所述E工序中，向青光眼模型动物的视网膜给予候补物质，
所述F工序中，判定青光眼的治疗效果。
56.根据权利要求55所述的筛选方法，其中，所述F工序中，对视网膜神经节细胞有无增加进行观察。
57.根据权利要求55或56所述的筛选方法，其中，所述F工序中，通过观察所述动物的行动来判定视力是否恢复，由此判定青光眼的治疗效果。
58.根据权利要求52～54中任一项所述的筛选方法，其中，所述E工序中，向脊髓损伤模型动物中的脊髓损伤部位给予候补物质，
所述F工序中，判定脊髓损伤的治疗效果。
59.根据权利要求58所述的筛选方法，其中，所述F工序中，判定所述脊髓损伤部位的脊髓再生效果。
60.根据权利要求58或59所述的筛选方法，其中，所述F工序中，通过观察所述动物的行动来判定运动能力是否恢复，由此判定脊髓损伤的治疗效果。
61.根据权利要求52～54中任一项所述的筛选方法，其中，所述E工序中，向癌症模型动物的血管内注射候补物质，
所述F工序中，判定癌症的治疗效果。
62.根据权利要求61所述的筛选方法，其中，所述E工序中，向白血病模型动物给予候补物质，
所述F工序中，观察血管内皮是否增厚或癌变。
63.根据权利要求61或62所述的筛选方法，其中，所述E工序中，向白血病模型动物给予候补物质，
所述F工序中，观察所述动物的存活率。
64.一种用于治疗或预防疾患、障碍或疾病、或者它们的症状的有效成分的筛选方法，其中，利用权利要求1～51中任一项所述的筛选方法进行一次筛选，将通过一次筛选作为有效成分选择出的候补物质供于利用权利要求52～63中任一项所述的筛选方法的二次筛选。
65.根据权利要求64所述的筛选方法，其中，在所述一次筛选的A工序中，向正常动物给予候补物质。
66.根据权利要求1～65中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质为以下的通式(I)、通式(II)或通式(III)中包含的化合物或其盐或它们的水合物，
Figure FDA0003918123630000091
通式(I)中，
环A为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～8元的、
单环式或稠合双环式的基团；
L为：任选被取代基R3取代的、C1～10的饱和或不饱和的碳链烃链，或者L不存在；
所述取代基R3为：任选被卤素原子取代的、任选具有环状结构的、C1～10的、饱和或不饱和的烃基；
R1为：
-C≡N、-COOH、-CHO、-COOCH3、-NO2、或卤素原子，或为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～8元的、
单环式或稠合双环式的基团；
R2为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烷基或卤素原子取代的、
3～20元的、单环式或稠合双环式的基团，
Figure FDA0003918123630000101
通式(II)中，
R1为：
氢原子、
卤素原子，或
饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、C1～20的烃基；
L1为以下任意结构：
Figure FDA0003918123630000102
L2为：
饱和或不饱和的、
任选被：选自C1～3的烃基、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的氨基、任选被C1～3的烃基取代的硫酸基、任选被C1～3的烃基取代的磷酸基和卤素原子中的基团取代的、
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
C1～30的烃链；
R2为：任选被C1～3的烃基取代的羧基、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的异羟肟酸基、任选被C1～3的烃基取代的磺基、任选被C1～3的烃基取代的硼酸基、任选被C1～3的烃基取代的氨基甲酰基、任选被C1～3的烃基取代的氨磺酰基、任选被C1～3的烃基取代的亚砜亚胺基、氰基或四唑基，
Figure FDA0003918123630000111
通式(III)中，
环A、环B和环C各自独立地为：
任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～4个杂原子的、
饱和或不饱和的、
进而任选被C1～3的烃基、卤素原子、任选被C1～3的烃基取代的羟基、任选被C1～3的烃基取代的氨基、任选被C1～3的烃基取代的硫酸基或任选被C1～3的烃基取代的磷酸基取代的、
3～8元的、
单环式的环；
R1为选自以下中的基团：
Figure FDA0003918123630000112
R3～R6各自独立地为：
氢原子、C1～3的烃基、任选被C1～3的烃基取代的羟基或任选被C1～3的烃基取代的氨基，
R7为氢原子、C1～3的烃基或任选被C1～3的烃基取代的氨基，
n表示1～4的整数；
L1、L2各自独立地为：
C1～3的亚烷基或亚烯基、-N(H)-或-O-，
这些2价基团中，除-O-以外的基团进而任选被饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的C1～30的烃基取代；
R2为：饱和或不饱和的、直链状或支链状的、任选具有环状结构的、任选被卤素原子取代的、任选包含独立地选自氧原子、氮原子和硫原子中的1～6个杂原子的C1～30的烃基。
67.根据权利要求1～66中任一项所述的筛选方法，其中，所述候补物质为以下的化合物1～7中的任意者的衍生物或其盐或它们的水合物，
Figure FDA0003918123630000131
68.一种药物组合物的制造方法，其具备如下工序：
将利用权利要求1～67中任一项所述的筛选方法作为有效成分选择出的物质和药物添加剂混合并制剂化的制剂化工序。
69.根据权利要求67所述的制造方法，其中，所述筛选方法为权利要求66或67所述的筛选方法。
70.根据权利要求68或69所述的制造方法，其中，所述药物组合物为再生药物和/或抗癌药。
71.根据权利要求68～70中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物用于治疗或预防神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状。
72.根据权利要求68～71中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物用于治疗或预防青光眼。
73.根据权利要求68～71中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物用于治疗脊髓损伤。
74.根据权利要求68～71中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物用于治疗血液癌。
75.根据权利要求68～71中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物用于治疗白血病。
76.根据权利要求68～75中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物为液体制剂，
所述制剂化工序包括将所述有效成分与水性介质混合的步骤。
77.根据权利要求76所述的制造方法，其中，所述药物组合物为注射剂。
78.根据权利要求76所述的制造方法，其中，所述药物组合物为滴眼药。
79.根据权利要求68～75中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物为冷冻干燥制剂，
所述制剂化工序包括将所述有效成分溶解于溶剂中并对其进行冷冻干燥的步骤。
80.根据权利要求68～75中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物为软膏，
所述制剂化工序包括将所述有效成分和基材混合的步骤。
81.根据权利要求80所述的制造方法，其中，所述药物组合物为眼部软膏。
82.根据权利要求68～75中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物为鼻腔给药用制剂。
83.根据权利要求68～75中任一项所述的制造方法，其中，所述药物组合物为经口给药用制剂。
84.一种药物组合物的设计方法，其具备：选择与利用权利要求1～67中任一项所述的筛选方法作为有效成分选择出的物质组合的药物添加剂的工序。
85.根据权利要求84所述的设计方法，其中，所述药物组合物为再生药物和/或抗癌药。
86.根据权利要求84或85所述的设计方法，其包括选择所述药物组合物的适应症的工序。
87.根据权利要求86所述的设计方法，其中，所述适应症为神经系统、心脏或胰腺的疾患、障碍或疾病、或者它们的症状，或者为癌症。
88.根据权利要求84～87中任一项所述的设计方法，其具备选择所述药物组合物的剂型的工序。
89.根据权利要求88所述的设计方法，其包括选择液体制剂作为所述剂型、并选择要与所述有效成分混合的水性介质的步骤。
90.根据权利要求89所述的设计方法，其选择注射剂作为所述剂型。
91.根据权利要求89所述的设计方法，其选择滴眼药作为所述剂型。
92.根据权利要求88所述的设计方法，其选择冷冻干燥制剂作为所述剂型。
93.根据权利要求88所述的设计方法，其包括选择软膏作为所述剂型、并选择要与所述有效成分混合的基材的步骤。
94.根据权利要求93所述的设计方法，其选择眼部软膏作为所述剂型。
95.根据权利要求88所述的设计方法，其选择鼻腔给药用制剂作为所述剂型。
96.根据权利要求88所述的设计方法，其选择经口给药用制剂作为所述剂型。
97.一种方法，其包括如下步骤：
利用权利要求84～96中任一项所述的方法设计药物组合物，
准备利用权利要求1～67中任一项所述的筛选方法作为有效成分选择出的物质，
利用权利要求68～83中任一项所述的制造方法制造药物组合物，
对由临床试验中给予了所述药物组合物的人获取的数据集进行统计处理。
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