CN101466380A - 治疗帕金森病的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明特征为通过施用7－氯－4－氨基喹啉化合物如阿莫地喹或格拉非宁治疗或抑制帕金森病发展的方法和试剂盒。干细胞也在本发明方法中有用，且可与7－氯－4－氨基喹啉化合物分开或一起施用。本发明进一步特征为识别在治疗或抑制帕金森病发展中有用的另外化合物的方法。

Description

治疗帕金森病的方法和组合物
发明背景
帕金森病(PD)为慢性、进行性运动系统疾病。每年约50,000美国人诊断有PD。该神经退行性疾病的主要症状为震颤、僵硬、运动迟缓和平衡破坏。另外，很多PD患者经历多种其它症状，包括情感变化、记忆损失、言语问题或睡眠困难。
PD由特定的进行性中脑多巴胺(DA)神经元的神经元损失导致。通常，这些神经元产生多巴胺，一种负责传递黑质和纹状体间信号的化学信使，其引起光滑、有目的的肌肉活动。然而，多巴胺损失导致纹状体神经细胞以未控制的方式兴奋(fire)，给患者指挥和控制他们行动的能力以损坏。
目前对PD的疗法主要依靠通过给患者口服剂量的多巴胺前体L-DOPA(L-二羟苯-丙氨酸)来补充多巴胺。该治疗需要随着治疗的继续增加剂量，且其最终引发严重的副作用。需要另外的PD治疗法。
发明内容
申请人已开发新的帕金森病疗法、引起干细胞分化为多巴胺能神经元的方法和用于识别治疗帕金森病化合物的筛选方法。
从而，在一个例子中本发明特征为治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括如下步骤：(a)确定患者是否具有或有风险发展帕金森病，且(b)如果所述患者具有或有风险发展帕金森病，则施用足以治疗或抑制帕金森病发展的量的或可选择性地足以活化在所述患者细胞中Nurr1的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物，如阿莫地喹或格拉非宁给所述患者。
在另一个例子中，本发明特征为试剂盒，其包括7-氯-4-氨基喹啉化合物，和用于施用所述化合物给被诊断具有或有风险发展帕金森病的患者的说明书。
本发明进一步特征为引起体外干细胞如人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，所述方法通过使所述干细胞与以足以诱导所述干细胞分化的量存在的7-氯-4-氨基喹啉化合物接触。
另外本发明特征为治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括如下步骤：(a)注射含干细胞的组合物到患者的脑中；且(b)接着步骤(a)，施用给患者足以诱导所述干细胞分化的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物。
本发明进一步特征为通过注射含干细胞和7-氯-4-氨基喹啉化合物的组合物到患者脑中来治疗或抑制帕金森病发展的方法。
在另一个例子中，本发明特征为含干细胞和7-氯-4-氨基喹啉化合物的药物组合物。
另外本发明特征为识别在帕金森病中作治疗用途的化合物的方法，其包括如下的步骤：(a)用含Nurr1基因结构域的第一质粒和含可操作性连接到报告基因的启动子的第二质粒来共转染哺乳动物细胞，如，SK-N-BE(2)C细胞；(b)使所述细胞接触候选化合物；(c)测量产生的报告基因的表达水平；且(d)与对照值比较报告基因的表达水平，这样，如果所述表达水平比对照值高至少20％，则识别所述候选化合物为在帕金森病中作治疗用途的化合物。在一些例子中，在步骤(c)前培养步骤(b)中产生的混合物18个小时。第一质粒与第二质粒的摩尔比率可为任何比率，如0.1和10间。第二质粒可包括所有或部分酪氨酸羟化酶启动子，如，酪氨酸羟化酶启动子的100个碱基或2,600个碱基。可使用任何报告基因，如萤火虫荧光素酶。在一些例子中，第一质粒包含可操作性连接到Nurr1基因结构域的GAL4DNA结合域，且第二质粒包含可操作性连接到报告基因的GAL4结合位点。
本发明进一步特征为识别用于在帕金森病中作治疗用途的化合物的方法，其包括如下步骤：(a)提供能产生多巴胺的哺乳动物细胞和使用本发明方法识别的化合物；(b)使所述细胞与这样识别的化合物接触；(c)测量产生的酪氨酸羟化酶或多巴胺表达水平；且(d)与对照值比较所述表达水平，这样，如果所述表达水平比对照值高至少20％，则识别所述化合物为在帕金森病中作治疗用途的化合物。步骤(c)的测量可包括例如：使用实时PCR或免疫染色定量酪氨酸羟化酶，或使用HPLC分析定量多巴胺。步骤(a)的识别可包括化合物识别的任何方法的使用；如，可使用包括如下步骤的方法：(i)用含Nurr1基因结构域的第一质粒和含可操作性连接到报告基因的启动子的第二质粒来共转染哺乳动物细胞，如，SK-N-BE(2)C细胞；(ii)使所述细胞接触候选化合物；(iii)测量产生的报告基因表达水平；且(iv)与对照值比较报告基因的表达水平，这样如果所述表达水平比对照值高至少20％，则识别所述候选化合物为在帕金森病中作治疗用途的化合物。
在任何本发明方法、组合物和试剂盒中，所使用的7-氯-4-氨基喹啉化合物可为，如阿莫地喹或格拉非宁。适用于任何本发明方法、组合物和试剂盒的干细胞包括，如人胚胎干细胞。
如上面描述的，本发明的一些方法采用7-氯-4-氨基喹啉化合物。这些化合物具有下式：
Figure A200780012800D00081
其中R1、R2和R3每一个独立选自H、OH、OC(O)-R4、C(O)-O-R5、卤素、C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基和C1-7杂烷基；且R4和R5每一个独立选自C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基和C1-7杂烷基。可如在美国专利第2，474,821号和第3,232,944号中描述地制备这种化合物，其中每一个在此通过引用并入。示例性商业可获得的7-氯-4-氨基喹啉化合物为阿莫地喹和格拉非宁：
Figure A200780012800D00091
阿莫地喹
Figure A200780012800D00092
格拉非宁
可在本发明方法和试剂盒中使用其它7-氯-4-氨基喹啉化合物，包括4-(3′-N-哌啶基甲基-4′-羟苯胺基)-7-氯醌；4-(3′-二乙氨基甲基-4′-羟苯胺基)-7-氯醌；4-(3′-乙氨基乙基-4′-羟苯胺基)-7-氯醌；4-(3′-二-n-丁基氨基甲基-4′-羟苯胺基)-7-氯醌；4-(3′-N-哌啶基甲基-4′，6′-二羟苯胺基)-7-氯醌；4-(3′-二乙氨基甲基-4′-羟苯胺基)-7-氯醌；2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-苯甲酸；苯甲酸，2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-，甲酯；和苯甲酸，2-((7-氯-4-喹啉基)氨基)-，乙酯。
在本发明化合物类别描述中，在取代基团中特定种类原子数目通常给作一个范围，如，包含从1到7个碳原子的烷基基团或C1-7烷基。对这个范围的提及意为包括具有在所指定范围内每个整数个原子的基团。如，从1到7个碳原子的烷基基团包括C1，C2，C3，C4，C5，C6和C7中每一个。C1-7杂烷基如包括除了一个或多个杂原子外从1到6个碳原子。可以相似的方式指示其他原子数目和其它原子种类。
如这里使用的，术语“烷基”和前缀“烷-”包括直链和支链基团两者和环状基团，即环烷基。环状基团可为单环或多环，且优选地具有从3到6个环碳原子包含在内。示例性环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。C1-7烷基可为取代的或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤化物、羟基、氟代烷基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、双取代氨基、季氨基、羟基烷基、羧基烷基和羧基。C1-7烷基包括但不限于：甲基；乙基；n-丙基；异丙基；环丙基；环丙基甲基；环丙基乙基；n-丁基；异丁基；仲丁基；叔丁基；环丁基；环丁基甲基；环丁基乙基；n-戊基；环戊基；环戊基甲基；环戊基乙基；1-甲基丁基；2-甲基丁基；3-甲基丁基；2，2-二甲基丙基；1-乙基丙基；1，1-二甲基丙基；1，2-二甲基丙基；1-甲基戊基；2-甲基戊基；3-甲基戊基；4-甲基戊基；1，1-二甲基丁基；1，2-二甲基丁基；1，3-二甲基丁基；2，2-二甲基丁基；2，3-二甲基丁基；3，3-二甲基丁基；1-乙基丁基；2-乙基丁基；1，1，2-三甲基丙基；1，2，2-三甲基丙基；1-乙基-1-甲基丙基；1-乙基-2-甲基丙基；和环己基。
“C2-7烯基”表示包括一个或多个双键且具有从2到7个碳原子的支链或未分支的烃基团。C2-7烯基可任选包括单环或多环，其中每个环按需要具有从3到6个成员。C2-7烯基可为取代的或未取代的。示例性取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤化物、羟基、氟代烷基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、双取代氨基、季氨基、羟基烷基、羧基烷基和羧基。C2-7烯基包括但不限于乙烯基；烯丙基；2-环丙基-1-乙烯基；1-丙烯基；1-丁烯基；2-丁烯基；3-丁烯基；2-甲基-1-丙烯基；2-甲基-2-丙烯基；1-戊烯基；2-戊烯基；3-戊烯基；4-戊烯基；3-甲基-1-丁烯基；3-甲基-2-丁烯基；3-甲基-3-丁烯基；2-甲基-1-丁烯基；2-甲基-2-丁烯基；2-甲基-3-丁烯基；2-乙基-2-丙烯基；1-甲基-1-丁烯基；1-甲基-2-丁烯基；1-甲基-3-丁烯基；2-甲基-2-戊烯基；3-甲基-2-戊烯基；4-甲基-2-戊烯基；2-甲基-3-戊烯基；3-甲基-3-戊烯基；4-甲基-3-戊烯基；2-甲基-4-戊烯基；3-甲基-4-戊烯基；1，2-二甲基-1-丙烯基；1，2-二甲基-1-丁烯基；1，3-二甲基-1-丁烯基；1，2-二甲基-2-丁烯基；1，1-二甲基-2-丁烯基；2，3-二甲基-2-丁烯基；2，3-二甲基-3-丁烯基；1，3-二甲基-3-丁烯基；1，1-二甲基-3-丁烯基和2，2-二甲基-3-丁烯基。
“C2-7炔基”表示包括一个或多个三键且具有从2到7个碳原子的支链或未分支的烃基团。C2-7炔基可任选包括单环，双环或三环，其中每个环按需要具有5或6个成员。C2-7炔基可为取代的或未取代的。示例性取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤化物、羟基、氟代烷基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、双取代氨基、季氨基、羟基烷基、羧基烷基和羧基。C2-7炔基包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、5-己烯-1-炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基；1-甲基-2-丙炔基；1-甲基-2-丁炔基；1-甲基-3-丁炔基；2-甲基-3-丁炔基；1，2-二甲基-3-丁炔基；2，2-二甲基-3-丁炔基；1-甲基-2-戊炔基；2-甲基-3-戊炔基；1-甲基-4-戊炔基；2-甲基-4-戊炔基；和3-甲基-4-戊炔基。
“C1-7杂烷基”表示除了独立选自N、O、S和P组成的组的1、2、3或4个杂原子外具有从1到7个碳原子的支链或未分支的烷基、烯基或炔基。杂烷基包括但不限于叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、腙、亚胺、磷酸二酯、氨基磷酸酯、磺酰胺和二硫化物。杂烷基可任选包括单环，双环或三环，其中每个环按需要具有从3到6个成员。杂烷基可为取代的或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤化物、羟基、氟代烷基、全氟代烷基、氨基、氨基烷基、双取代氨基、季氨基、羟基烷基、羟基烷基、羧基烷基和羧基。
“施用”表示将剂量药物给患者的方法。在本发明方法中使用的组合物可通过选自但不限于如下途径施用：吸入、眼部、肠胃外、皮肤、经皮、口腔、直肠、舌下、舌周(Perilingual)、鼻、局部给药和口服给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内给药。优选的给药方法可根据多种因素变化，如，被施用的组合物的组分和被治疗的病症的严重度。
“足以治疗的量”表示以临床相关的方式改善、抑制或缓解患者病症或疾病症状所需的化合物的量。患者中任何改善认为足以实现治疗。用以实施本发明的、足以帕金森病治疗的活性化合物的量根据给药方式、患者的年龄、体重和患者一般健康而变化。最终，处方药师或研究者会决定合适的量和给药方案。
“足以活化细胞中Nurr1的量”表示以可检测和可重复的方式增加可操作性连接到酪氨酸羟化酶启动子的基因在细胞中的转录所需的本发明化合物的量。希望地，相比参考或对照水平的转录增加为至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。所述基因可为酪氨酸羟化酶或报告基因，如萤火虫荧光素酶。因为酪氨酸羟化酶启动子为Nurr1直接靶，所以酪氨酸羟化酶活化指示Nurr1水平增加。
“足以诱导分化的量”的干细胞表示引起未分化的干细胞分化为如神经元的需要的细胞类型所需的本发明化合物的量。
“候选化合物”表示通过采用这里描述的测定方法中一个测定其改变基因或蛋白质表达水平或基因或蛋白质的生物活性的任何化合物。候选化合物包括如，肽、多肽、合成有机分子、天然存在的有机分子、核酸分子和它们的组分。
“分化”表示未特化干细胞获得如神经细胞的特化细胞特征的过程。分化也可指细胞自我更新潜力的限制，且通常与所述细胞的功能能力改变相关。可通过本领域熟知方法确定干细胞分化，包括分析与指定分化状态细胞相关的细胞标志物或形态学特征。这种标志物和特征的例子包括测量糖蛋白、碱性磷酸酶和癌胚抗原表达，其中这些蛋白质任一的增加指示分化。
“作治疗用途的化合物”表示在正确医学判断范围内适合用于与人组织接触，而没有过分的毒性、刺激，过敏反应及类似反应；与合理的收益/风险比相称；且对它们预期用途有效的化合物以及本发明组合物可能的两性离子形式。
“胚胎干细胞”表示衍生自胚泡期胚胎或在细胞实质分化为三胚层前的细胞，其可自我更新且展示未分化细胞的形态学特征，将其与胚胎或成体来源的分化细胞区别开来。示例性形态学特征包括高核/质比和显微镜下明显的核仁。在本领域技术人员已知的合适条件下，胚胎干细胞可分化为如下三胚层的细胞或组织：内胚层，中胚层和外胚层。用于识别胚胎干细胞的测定包括在合适宿主中形成畸胎瘤或染色如Oct-4未分化细胞标志物的能力。
在筛选化合物上下文中“击中(hit)”表示在给定测定中试验阳性的候选化合物。如，在其中通过报告基因活性升高指示阳性结果的筛选中，如果其引起在指定阈值以上的报告基因活性水平，如，高于活性对照水平10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％或甚至500％，则候选化合物认为是击中。
“Nurr1生物活性”表示已知通过Nurr1多肽体内或体外引起的任何活性。如，这种活性可包括活化酪氨酸羟化酶转录。
本文可互换地使用“Nurr1核酸”和“Nurr1基因”，且指编码所有或部分Nurr1多肽或与所有或部分GenBank登陆号AB017586(Ichinose等人，Gene 230：233-239，1999)的核酸序列或其类似物大致相同的核酸。
“Nurr1多肽”表示与所有或部分GenBank登陆号BAA75666的多肽序列或其类似物大致相同，且具有Nurr1生物活性的多肽。
“可操作性地连接”表示当如转录激活蛋白的合适的分子结合到调控元件时允许基因表达的基因和一个或多个调控元件的结合。
“患者”表示接受内科治疗的任何人。
“启动子”表示促进可操作连接的编码区域转录起始的基因调控元件。
“报告基因”表示编码如酶的报告分子的基因序列。报告分子可在包括但不限于以下任何检测系统中检测：荧光、酶(如，ELISA，还有基于酶的组织化学测定)，放射性的和发光系统。示例性报告基因包括萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、大肠杆菌β-半乳糖苷酶或葡糖醛酸糖苷酶、人胎盘碱性磷酸酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT)；其它报告基因在本领域已知，且可按需要采用。
“干细胞”表示具有自我更新潜力并在合适的条件下分化为专用祖先细胞或特定细胞或组织的任何细胞。干细胞可为多能性的(pluripotent)或多能的(multipotent)。干细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞和脐带血细胞。
“大致相同”表示多肽或核酸展示与参考氨基酸或核酸序列至少75％，85％，90％，95％或甚至99％同一性。对于多肽，比对序列长度通常为至少35个氨基酸、45个氨基酸、55个氨基酸或甚至70个氨基酸。对于核酸，比对序列长度通常为至少60个核苷酸、90个核苷酸或甚至120个核苷酸。
通常使用公开可获得的计算机程序测定序列同一性。测定两条序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，NucleicAcids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用来确定同一性。BLAST程序可从NCBI和其它来源(如，BLAST手册，Altschul等，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD20894)公开获得。这些软件程序通过对各种置换、缺失和其它修改指定同源程度来匹配相似序列。氨基酸比对的保守置换通常包括在以下组中的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“酪氨酸羟化酶启动子”表示能够通过促进转录起始来调控酪氨酸羟化酶基因表达的酪氨酸羟化酶基因上游元件。酪氨酸羟化酶启动子可操作性的连接到任何基因以调控该基因的表达。可在本发明中使用任何酪氨酸羟化酶启动子，如，如在Kim等，J.Neurochem，85：622-634，2003中提供的。
本发明方面提供了多种优点。如，用7-氯-4-氨基喹啉化合物治疗帕金森病患者可减轻如下的症状：平衡和协调的破坏；臂、颌、腿或脸的节律震颤；肌肉强直；和运动徐缓，即，自主动作的缓慢。另外，用干细胞和7-氯-4-氨基喹啉化合物两者治疗帕金森病患者可提供增加治疗功效或降低以其他方式实现治疗所需要的7-氯-4-氨基喹啉化合物剂量的进一步优点。这里描述的筛选测定也是有利的，因为它们提供识别在治疗帕金森病中可为有用的其他化合物的方法。
通过下面具体描述和权利要求，本发明其它特征和优点将是明显的。
附图说明
图1为表示Nurr1在多巴胺神经元发育中作用的图解。
图2为表示Nurr1、酪氨酸羟化酶和多巴胺间关系的图解。
图3为表示发现和试验Nurr1激活子方法的流程图。
图4为表示在SK-N-BE(2)C细胞中瞬时转染分析结果的图表。通过分别与2.6kb-TH启动子和6.0-TH启动子共转染来测量SK-N-BE(2)C细胞中瞬时表达的Nurr1活性。在每个实验中，用来转染的效应质粒对报告质粒的摩尔比为0.5。荧光素酶活性被测定并标准化为作为内参的β-半乳糖苷酶活性。
图5A为表示用小化学药品文库的初步筛选数据的图表。在与每个化合物孵育18小时后通过具有2.6-TH启动子的荧光素酶活性测量在SK-N-BE(2)C细胞中瞬时表达的Nurr1活性。基于细胞的测定系统产生阳性的击中候选物，弗司扣林，其表示相比具有DMSO的对照荧光素酶活性明显升高。每列具有八个不同的化合物。图5B为表示利用小化学药品文库进一步初步筛选数据的图表。与每个化合物孵育18小时后通过具有2.6-TH启动子的荧光素酶活性测量在SK-N-BE(2)C细胞中瞬时表达的Nurr1活性。基于细胞的测定系统产生阳性的击中候选物，二磷酸氯喹，其表示相比具有DMSO的对照荧光素酶活性明显升高。每列具有八个不同的化合物。
图6包括表示利用初步击中候选物重复的初步筛选数据的图表。每个化合物与pcDNA-Nurr1构建体孵育18小时后通过荧光素酶活性测量在SK-N-BE(2)C细胞中瞬时表达的Nurr1活性。识别了两个击中候选物，阿莫地喹和格拉非宁。
图7包括表示利用初步击中化学药品第二次筛选数据的图表。每个化合物与融合有Nurr1-LBD的GAL4-DBD构建体孵育18小时后通过荧光素酶活性测量在SK-N-BE(2)C细胞中瞬时表达的Nurr1活性。识别了两个击中候选物，阿莫地喹和格拉非宁。也表示了激活萤火虫荧光素酶报告基因的GAL4-DBD-Nurr1-LBD融合构建体图示。
图8A为表示瞬时转染报告测定的图解。图8B为表示瞬时转染报告测定的图解，其中Nurr1为效应基因，启动子来自TH基因且萤火虫荧光素酶为报告基因。
图9A为表示瞬时转染报告测定的图解，其中pcDNA-Nurr1为效应基因，所述启动子来自TH基因上游2.6Kb且萤火虫荧光素酶为报告基因。图9B为表示瞬时转染报告测定的图解，其中在2.6Kb TH启动子和萤火虫荧光素酶报告基因存在时没有加入效应基因。确定在该系统中显示升高的荧光素酶活性的击中化合物为假阳性。
图10A为表示接受间接免疫组织化学测定(TH+/Tuj 1+染色)的胚胎干细胞(ES)衍生的神经元的一对照片。利用抗β-微管蛋白III和抗-TH免疫标记ES衍生的神经元。在荧光显微镜下两种蛋白质叠印显示为白色。使用DMSO作为对照。图10B为表示体外ES细胞分化过程中阿莫地喹相比对照DMSO增加了TH+细胞数目的条线图。
发明详述
本发明特征为帕金森病独特疗法。该治疗方法特征为施用足以治疗疾病的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物；其通常包括以足以激活被治疗患者细胞中Nurr1的量施用。在本发明其它的治疗方面还可使用干细胞；如，可使用胚胎干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞和外周血干细胞中的每一种。另外本发明特征为引起胚胎干细胞分化为多巴胺神经元的方法，这种方法特征为使用7-氯-4-氨基喹啉化合物。本发明进一步特征为用于识别治疗帕金森病的化合物的筛选方法。所述识别方法特征为筛选用于激活一个或多个转录因子的小分子，所述转录因子在促进DA神经元存活和/或保持中发挥作用。如，Nurr1，中脑多巴胺神经元中关键的命运决定转录因子，是本发明筛选测定中有用的靶。
7-氯-4-氨基喹啉化合物
上面定义的7-氯-4-氨基喹啉化合物在本发明的方法、试剂盒和组合物中有用。在本发明方法中使用的示例性化合物为阿莫地喹，其为具有裂殖体杀灭活性的抗疟化合物，和格拉非宁，其为具有麻醉性质、用于减轻疼痛的邻氨基苯甲酸衍生物。
治疗
本发明治疗可单独或与另一个治疗联合实行，且可在家、医生办公室、诊所、医院门诊部或医院被提供。治疗通常在医院开始，以便医生可密切的观察疗法的效果和作出任何需要的调整。所述疗法持续时间取决于患者的年龄和状况、患者帕金森病的阶段和患者对治疗如何响应。另外，具有更大发展帕金森病风险的人(如，遗传上易罹患的人)可接受预防性治疗来抑制或延迟疾病症状。
诊断患者患有或有风险患有帕金森病的方法在本领域为熟知的。如，可以使用一个或多个以下症状的存在作为PD诊断的部分：震颤，如一条臂或一条腿非自主的节律的震颤；肌肉强直、僵硬或不适；在日常生活的任何活动中通常的缓慢，如运动不能或运动徐缓；行走、平衡或作姿势困难；书写改变；情感变化；记忆损失；言语问题；和睡眠困难。观察患者症状、活动、药物治疗、共存的医疗问题或可能的毒性暴露可在做PD诊断中为有用的。另外，可检测患者基因突变的存在或不存在，所述基因突变指示增加的患帕金森病的可能性。例如，可利用在NURR1、α-突触核蛋白、帕金蛋白、MAPT、DJ-1、PINK1、SNCA、NAT2、或LRRK2基因中一个或多个特定突变或多态性的存在来诊断患者是患者或有风险患有帕金森病。见，如美国专利申请公布第2003-0119026号和第2005-0186591号；Bonifati，Minerva Med.96：175-186，2005；和Cookson等，Curr.Opin.Neurol.18：706-711，2005，其中每一个在此通过引用并入。
药物组合物的配制
以本领域熟练技术人员已知的方式制备本发明药物组合物，如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或成型方法。制造制剂的本领域熟知方法示于如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，A.R.Gennaro编，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(制药技术百科)，J.Swarbrick和J.C.Boylan编，1988-1999，Marcel Dekker，New York。
合适的给药方式包括但不限于：口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、局部或经皮、阴道和眼。
本发明组合物给药可通过产生有效治疗或抑制(如，通过延迟)帕金森病发展的化合物浓度的任何合适方法。所述化合物与合适的载体物质混合，所述载体物质如，保持给药的化合物治疗性质的药学可接受赋形剂。一个示例性药学可接受赋形剂为生理盐水。合适载体物质通常以组合物总重量的1到95％重量的量存在。可以适合如下给药的剂量形式提供所述组合物：口服、直肠的、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、鼻、局部或经皮、阴道或眼给药。这样，所述组合物可为如下的形式：如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、混悬液、乳剂、溶液、包括水凝胶的凝胶、糊剂、软膏剂、乳油、膏药、灌服剂(Drenches)、递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入剂、喷雾剂或气溶胶。
可使用控制释放的制剂将根据本发明的药物组合物配制为基本上在给药时即刻或在给药后任何预定的时间段释放活性化合物。
化合物以控制释放制剂给药在下述情况中是有用的：单独或联合施用的化合物具有(i)窄的治疗指数(如，导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度和导致治疗效果的血浆浓度之间差异小；通常定义治疗指数，TI，为半数致死剂量(LD50)与半数有效剂量(ED50)之间的比率)；(II)在胃肠道中窄的吸收窗；或(iii)短的生物半衰期，以致于需要在一天中频繁给药以使血浆水平保持在治疗水平。
寻求很多策略来获得其中释放速率超过治疗性化合物新陈代谢速率的控制释放。如，可通过适当选择包括如合适的控制释放组合物和包衣的制剂参数和成分来获得控制的释放。合适的制剂对本领域的技术人员是已知的。例子包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、混悬液、乳剂、微胶囊、微球、纳米颗粒、贴剂(Patches)和脂质体。
口服用固体制剂
口服用制剂包括在具有无毒药学可接受赋形剂混合物中包含活性成分的片剂。这些赋形剂可为如，惰性稀释剂或填充物(如，蔗糖和山梨醇)，润滑剂，助流剂和抗黏合剂(如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
也可提供口服用制剂作可咀嚼片剂或硬明胶胶囊，其中所述活性成分与惰性固体稀释剂混合，或作软明胶胶囊，其中所述活性成分与水或油介质混合。
剂量
本发明方法中使用的化合物的合适剂量取决于几个因素，包括给药方法、帕金森病严重程度和待治疗患者的年龄、体重和患者健康。另外，关于特定患者的药学基因组(基因型对药物的药代动力学、药效学或功效特征的影响)信息可影响使用的剂量。
可不需要连续每日施用在本发明方法中使用的化合物。治疗方案可需要期间没有给药的周期，或基于需要提供治疗。
如上面描述的，可以片剂、胶囊、酏剂或糖浆形式口服或以栓剂形式直肠施用所讨论的化合物或组合物。化合物的胃肠外给药适合例如以生理盐水溶液或所述化合物包入脂质体的形式进行。当所述化合物本身不具有足以溶解的溶解性时，可应用如乙醇的增溶剂。
本领域熟练技术人员可容易地确定在本发明方法中使用的任何化合物的剂量。希望地，本发明方法中使用的任何化合物的剂量会足以缓解患者中帕金森病症状。可选择性地，所述剂量会足以激活患者细胞中的Nurr1。对包括体外干细胞分化的本发明方法，希望所述剂量会足以诱导干细胞分化。
下面，为说明性目的描述了阿莫地喹和格拉非宁的剂量。本领域熟练技术人员能够容易地确定其它7-氯-4-氨基喹啉化合物和在本发明方法中有用的其它化合物的合适的剂量。
口服给药
对普通成年人阿莫地喹总的每天口服剂量可为约1-600mg(0.02-8.5mg/kg)，优选地约25-400mg(0.35-5.7mg/kg)，且更优选地约100-300mg(1.4-4.2mg/kg)的总的日剂量。给药可为一天到一年中每天一到三次，且甚至可在患者生命中每天给药。慢性、长期给药适应很多情况。达到600mg的每天剂量可能是必要的。
对适以口服给药以全身应用的格拉非宁而言，每天剂量可为约0.1-60mg(0.002-0.85mg/kg)，优选地约2.5-40mg(0.035-0.57mg/kg)，且更优选地约10-30mg(0.14-0.42mg/kg)的总的每天剂量。类似于阿莫地喹，格拉非宁可在一天到一年中，甚至患者生命中给药。达到60mg的每天剂量可能是必要的。
另外的给药途径
对阿莫地喹的静脉内、肌肉内、皮下、直肠、吸入、局部、阴道或眼部给药而言，总的每天剂量可为约1-600mg(0.02-8.5mg/kg)，优选地约25-400mg(0.35-5.7mg/kg)，且更优选地约100-300mg(1.4-4.2mg/kg)。格拉非宁总的每天剂量可为约0.1-60mg(0.002-0.85mg/kg)，优选地约2.5-40mg(0.035-0.57mg/kg)，且更优选地约10-30mg(0.14-0.42mg/kg)。通过这些途径，阿莫地喹或格拉非宁的给药为每天一到四次。
干细胞
可在本发明所述方法、试剂盒和组合物中与7-氯-4-氨基喹啉化合物结合使用干细胞。如，本发明特征为通过使干细胞接触7-氯-4-氨基喹啉化合物而引起体外干细胞分化为多巴胺能神经元的方法。本发明特征还为使用干细胞的体内方法，如与施用7-氯-4-氨基喹啉化合物一起注射干细胞到患者脑中。这样，考虑到本发明，干细胞提供了治疗患包括多巴胺能神经元损失或损坏病症如帕金森病患者的强有力工具。
干细胞为独特的具有如下能力细胞群：在不确定时间段中和正确的条件或信号下分裂(自我更新)，分化为很多组成生物体的不同细胞类型。衍生自胚泡内细胞团的干细胞已知为胚胎干(ES)细胞。衍生自原始生殖细胞且一般发育为成熟配子(卵子和精子)的干细胞已知为胚胎生殖(EG)细胞。这两种干细胞已知为多能细胞，因为它们有分化为所有三个胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)衍生物的独特能力。
所述多能干细胞可进一步特化为另一种通常衍生自成体组织的多能干细胞。多能干细胞也能经过自我更新和分化，但不同于胚胎干细胞，其负责产生具有特定功能的细胞。成体干细胞例子包括能增殖分化产生淋巴细胞和骨髓细胞种类的造血干细胞(HSC)；能分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝细胞、心肌细胞和神经元的骨髓衍生干细胞(BMSC)；能分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的神经干细胞(NSC)；和外周血干细胞。多能干细胞也衍生自上皮和脂肪组织和脐带血(UCB)。
识别衍生自预移植胚胎内细胞团的ES细胞为最多能干细胞群，且因而为本发明方法优选的细胞。这些细胞能体外无限制的增殖，同时保持分化为多种体细胞组织和胚胎外组织能力。ES细胞可为雄性(XY)或雌性(XX)；优选雌性ES细胞。
也可在本发明方法中使用多能、成体干细胞。优选的成体干细胞包括整个生命中能增殖和分化产生淋巴细胞和骨髓细胞种类的造血干细胞(HSC)；能分化为包括脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝细胞、心肌细胞和神经元各种细胞类型的骨髓衍生干细胞(BMSC)；和能分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的神经干细胞(NSC)。在本发明方法中也可使用衍生自上皮和脂肪组织和脐带血细胞的多能干细胞。
干细胞可衍生自包括但不限于小鼠、人和灵长类的任何哺乳动物。在采集干细胞后，可在本发明方法中直接使用这些细胞；如，可以足以直接用于治疗目的的量获得脐带血细胞。可选择性地，可首先扩增干细胞用来增加可获得细胞数目，参见如，美国专利第6,338,942号。优选的用于干细胞制备的小鼠株包括129，C57BL/6和杂交株(Brook等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：5709-5712(1997)，Baharvand等，In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.40：76-81(2004))。制备小鼠、人或灵长类干细胞方法在本领域已知并描述于如Nagy等，Manipulating the mouse embryo：Alaboratory manual(操作鼠胚胎：实验室手册)，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(2002)；Thomson等，Science 282：1145-1147(1998)，Marshall等，Methods Mol Biol.158：11-18(2001)；Thomson等，TrendsBiotechnol 18：53-57(2000)；Jones等，Semin.Reprod.Med.18：219-223(2000)；Voss等，Exp.Cell Res.230：45-49(1997)；和Odorico等，Stem Cells19：193-204(2001)。
ES细胞可直接衍生自胚泡或任何其它发育早期阶段，或可为衍生自体细胞核转移和其它类似程序的“克隆”干细胞系。可在题为“Stem cells：Scientific Progress and Future Research Directions(干细胞：科学进展和未来研究指导)”(2001年6月)的关于干细胞的NIH报告的附录C中找到培养来自胚泡的小鼠、人或灵长类ES细胞的通常方法。如在第一步，预移植胚泡的内细胞团从围绕其的滋养外胚层去除。(对于人ES细胞培养物，通过体外受精产生胚泡并赠送作研究。)用来培养细胞的小塑料培养皿包含添加有胎牛血清的生长培养基，有时涂有不分裂细胞的“喂养”层。所述喂养细胞通常为已化学失活使它们不分裂的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。也可加入另外试剂，如细胞因子白血病抑制因子(LIF)，到小鼠ES细胞的培养基中。第二步，几天到一周后去除并分散细胞增殖集落到新培养皿中，其每个可包含或可不包含MEF喂养层。如果所述细胞为了用于人治疗目的，优选不包括MEF喂养层。在这些体外的条件下，所述ES细胞聚集形成集落。在产生ES细胞系所需的第三个主要步骤中，分离并转皿所述单独、不分化集落到新培养皿，称为传代的步骤。该转皿过程建立ES细胞“系”。如果单独ES细胞产生它，所述细胞系称为“克隆的”。可用限制稀释方法来产生克隆的ES细胞系。干细胞培养需要的试剂可商业途径获自如Invitrogen，Stem Cell Technologies，R&D Systems和Sigma Aldrich，且描述于如美国专利公布第2004/0235159号和第2005/0037492号和NIH报告附录C，“Stem cells：Scientific Progress and Future Research Directions(干细胞：科学进展和未来研究指导)”，同上。
使用由此描述的干细胞的方法可用于治疗可通过移植衍生自ES细胞的分化细胞治疗的疾病。本发明的或用本发明方法生产的干细胞可用来治疗任何患者、优选人的帕金森病，其它神经退行性疾病如阿尔海默茨病，或对大脑或脊髓创伤性损伤。
本发明还可用于研究分化或发育的研究目的，和用于产生用于研究目的的转基因动物。由此描述的干细胞和它们使用方法可用于例如产生和试验帕金森病或其它神经病症的动物模型。还可用本发明干细胞和方法来研究特定化合物对干细胞分化、发育和组织产生或再生的作用。
检测Nurr1活化的测定和筛选
Nurr1为对中脑多巴胺神经元重要的命运决定转录因子(图1)，且从而其为在本发明筛选测定中有用的靶。Nurr1以细胞特异性方式直接反式激活酪氨酸羟化酶(TH)基因启动子活性(Kim等，J.Neurochem.，85：622-634，2003)(图2)。另外，多巴胺能表型标志物年龄相关下降与在黑质中Nurr1表达下调相关。因而，激活Nurr1功能分子可通过增加TH基因表达而促进DA神经元的神经元存活和增加多巴胺生产。可根据本发明方法使用小分子文库的筛选如高通量筛选(HTS)。
本发明特征为测定激活Nurr1功能化合物，因此通过升高TH基因表达促进DA神经元的神经元存活且增加多巴胺生产。在本发明的一个测定中，利用包含可操作性连接到天然或修饰的酪氨酸羟化酶启动子部分的报告基因的报告质粒共转染包含全部或部分Nurr1基因的效应质粒。在单独候选化合物或化合物文库存在和不存在时实行报告基因测定。包括但不限于质粒比率、在效应质粒中存在的Nurr1基因部分、TH启动子长度和序列、报告基因、细胞系和报告基因测定的各种参数可单独或联合地变化来优化筛选条件。
如，所述效应质粒包括与编码另一结构域(如GAL4DNA结合域(DBD))的基因融合的编码Nurr1或其结构域(如LBD(配体结合域))的基因。相应的上游DNA激活区域，如GAL4结合位点，可操作性连接到报告质粒中的报告基因。在候选化合物存在和不存在下，效应质粒和报告质粒共转染到细胞，且基于报告基因测定结果识别击中候选物。
希望地，在一体外测定中试验候选化合物文库，且在第二个不同体外测定中试验该测定产生的击中候选物，以去除假阳性击中候选物。
识别一组击中候选化合物的体外筛选或其它研究后，希望在体内实行研究以验证所述击中候选物。如，可施用候选化合物给试验受试者，如小鼠；接着，可在来自试验受试者中脑多巴胺能神经元实行研究以确定击中候选化合物相比对照实验是否升高了多巴胺表达。
图3提供了在创建基于细胞测定中包括的过程的综述，使用它们识别和确定(refine)击中候选化合物，且在体内试验这些化合物。以下描述了筛选和测定试验的具体实施例。
实施例
提供以下的实施例作说明本发明的目的，且不该理解为限制。
实施例1.Nurr1基于细胞测定系统
创建利用Nurr1激活TH的基于细胞系统以开发识别Nurr1激活化合物的测定。使用SK-N-BE(2)C(TH表达)细胞作宿主细胞系，表明Nurr1效应子对转染中报告质粒明确应答。另外，选择瞬时转染，而非使用稳定细胞系转染，来支持化合物对所述报告基因最大应答性，以检测在第一次筛选中低亲和性的击中化学药品。考虑的另一个参数为选择具有所有重要NBRE(Nurr1结合)样基序而非某一特定种类的NBRE基序的短长度天然TH启动子，基于如下的假设：天然启动子比人工复制启动子产生更接近的生物学筛选条件，且因为其它不相关转录因子相互作用的假阳性化学药品可通过有效的第二筛选方法容易地排除。
为了开发该新的Nurr1基于细胞测定系统，尝试包括效应基因启动子、内参基因启动子、TH启动子大小、内参基因启动子、瞬时转染条件、血清浓度和DMSO效果的多种参数的几个组合。如，考察TH启动子大小对报告基因的影响(图4)，表示在SK-N-BE(2)C细胞中，外源Nurr1表达强烈地反式激活由2.6kb-TH驱动的报告基因表达好于由6.0kb-TH驱动的报告基因表达。
利用小化学药品文库实行在部分优化条件下初步筛选Nurr1激活子。如在图5A-5B和6中表示，一些候选化合物显示相比对照荧光素酶活性几倍的升高。
使用该方法，识别几个初步击中候选物为使用Nurr1效应子和融合到萤火虫荧光素酶2.6-TH启动子起始筛选的Nurr1激活子。作为第二筛选体系，使用GAL4 DNA结合域(DBD)构建体，其分开地融合全部Nurr1、Nurr1-配体结合域(LBD)或Nurr1-DNA结合域到酵母GAL4 DBD。如，在表7中表示初步击中候选物对具有GAL4 DBD-Nurr1 LBD报告基因的作用，其表示该第二体系可从初步击中候选物筛选出假阳性。使用6-MP作该实验中阴性对照，其通过在氨基终端区域调控Nurr1。识别阿莫地喹和格拉非宁为在该第二测定中的击中候选化合物。
该实验系列表明使用初步和第二筛选两者的值来识别可用作治疗帕金森病的先导化合物。
实施例2.7-氯-4-氨基喹啉化合物相对活性测定
在添加有10％胎牛血清(Hyclone)、100μg/mL链霉素和100单位/mL青霉素的Dulbecco修饰Eagle培养基中培养人成神经细胞瘤SK-N-BE(2)C细胞，且在转染前一天以在无抗生素的上述培养基中25,000细胞/孔加入96孔板。以1：1摩尔比的包含Nurr1基因的效应质粒与包含报告基因的报告构建体转染每个96孔板(图8A-8B和9A-9B)。通过脂质体(Lipofectamine)方法执行转染，且利用Qiagen柱(Qiagen Co.，SantaClarita，CA，USA)制备转染用质粒。每个96孔板使用的总DNA量为0.2μg，且0.02μg pRSV-b-gal用作内参。在转染日，在25μl Opti-MEM I减少的血清培养基中稀释0.2μg DNA，且在对每个96孔板的25μl Opti-MEM培养基中稀释0.5μl脂质体。培养五分钟后，合并稀释的DNA和稀释的脂质体，且在室温培养四十分钟来允许形成DNA-脂质体复合物。
在去除50μl DNA-脂质体复合物后，加入三种化合物(阿莫地喹、格拉非宁和二磷酸氯喹)且过夜培养，每种化合物在有3％活性炭处理的胎牛血清的DMEM培养基中稀释到合适浓度。然后用50μl裂解缓冲液裂解来自每个96孔板的细胞，所述裂解缓冲液包含25mM Tris磷酸盐(pH7.8)、2mM DTT、2mM CDTA(1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸)、10％甘油和1％ Triton X-100。接着，加入等体积的萤火虫荧光素酶底物，且使用光度计板读数器测量所述荧光素酶活性，且如在下表表示，将其标准化作β-半乳糖苷酶活性：
 
衍生物(+：REL.活性) 溶于DMSO 溶于1×PBS
阿莫地喹(4E) ++++ ++++
格拉非宁(11D) +++ +++
二磷酸氯喹 - ++
实施例3.建立体外功能体系来研究击中候选物
可建立体外功能研究体系来选择作进一步治疗帕金森病药物先导开发的最佳击中候选物。一个可能的Nurr1激活子功能研究系统由以下组成：通过实时PCR检测TH基因表达的升高、通过HPLC的多巴胺量的检测和在多巴胺能细胞系中TH蛋白质的免疫染色。
通过实时PCR定量THmRNA。多巴胺细胞系MN9D提供有用的研究击中候选物功能的体外模型。通过来自小鼠胚胎14日中脑嘴侧被盖部和成神经细胞瘤细胞系N18TG2的初级神经元体细胞融合产生MN9D(Choi等，Brain Res.，552：67-76，1991)。MN9D细胞合成儿茶酚胺，具有胚胎性质，表达神经元特异性标志物，且对DA细胞毒素N-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP)敏感(Kim等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，286：659-665，2001)。在这些实验中，MN9D细胞在添加10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中在37℃、5％ CO2下培养。利用TriReagent、接着DNA酶I处理来制备来自暴露于候选化合物MN9D细胞的总RNA。利用5μg RNA以及用于RT-PCR的SuperScriptTM第一链合成系统获得cDNA。产生的cDNA用作PCR反应的模板。可使用以下的引物组合作实时PCR分析：
肌动蛋白：5′-GGCATTGTGATGGACTCCGG-3′和
5′-TGCCACAGGATTCCATACCC-3′(358bp)；
TH：5′-TTGGCTGACCGCACATTTG-3′和
5′-ACGAGAGGCATAGTTCCTGAGC-3′(336bp)；
GAD：5′-GGGTTTGAGGCACACATTGATAAG-3′和
5′-GCGGAAGAAGTTGACCTTGTCC-3′(279bp)；
Nurr1：5′-CATGGACCTCACCAACACTG-3′和
5′-GAGACAGGTGTCTTCCTCTG-3′(383bp)。
可实行实时PCR以定量表达水平。可使用DNA发动机OpticonTM(MJResearch，Waltham，MA)在包含0.5μM每个引物、0.5×SYBR Green I(Molecular Probes)和2μl 10倍稀释cDNA的25μl体积中实行扩增。所述PCR反应由使用以下温度特征的50个循环组成：95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒和79℃ 5秒。确定每个PCR产物的熔解温度。每个PCR循环后，在79℃检测荧光信号以熔解引物二聚体(这里使用的所有引物二聚体的Tm为低于79℃)。然后通过凝胶电泳确定每个PCR产物纯度(定义为单个特异条带的出现)。使用GAPDH质粒DNA(从103到108分子)构建标准曲线。然后将来自特异PCR产物的荧光信号相比肌动蛋白的荧光信号标准化。对每个基因，分析两个独立样品，且应该重复所有的反应至少两次。
通过HPLC定量多巴胺。在暴露于候选化合物后用细胞裂解物实行HPLC分析多巴胺。来自6个孔的细胞裂解物收集到一起，并通过加入200μl高氯酸(PCA)和EDTA(终浓度分别为0.33M和0.17mM)沉淀蛋白质。在14,000×g离心10分钟后，分离细胞内组分(上清液)和细胞沉淀，分别作细胞内DA和蛋白质分析。如在Andersson等，Neurotoxicology，16：201-210，1995描述的，使用反相分离柱来实行用电化学检测的HPLC分析。
免疫染色TH蛋白质。在化合物处理后，用4％甲醛(Electron MicroscopySciences，Ft.Washington，PA)固定MN9D细胞30分钟，用PBS洗涤，然后用封闭缓冲液[PBS，10％正常猴血清(NDS)或正常羊血清(NGS)，0.1％Triton X-100]孵育十分钟。利用在包含2％NDS或NGS的PBS中稀释的初级抗体，在4℃培养细胞过夜。可使用多种初级抗体，如兔抗β-微管蛋白(1:2000；Covance，Richmond，CA)、羊抗-TH(1:200；Pel-Freez，Rogers，Arkansas)、羊抗-AADC(1:200；Chemicon，Temecula，CA)、鼠抗-DAT(1：1000；Chemicon)或兔抗-5-羟色胺(HT)(1:3000；Diasorin，Stillwater，MN)。然后使用抗-γ-氨基丁酸(GABA)(1:5000；Sigma)沉淀所述蛋白。用PBS洗涤后，用荧光标记的二抗在含2％ NDS或NGS的PBS中室温下孵育盖玻片30分钟，所述二抗如Alexa Fluor 488(绿色)或Alexa Fluor 568(红色)-标记的驴/山羊IgG(1:500；Molecular Probes，OR)。在PBS中冲洗3×10分钟后，然后利用Gel/Mount(
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 Corp.，Foster City，CA)将盖玻片装到载玻片上。可使用装有氪、氪/氩和氦激光器的Leica TCS/NT共聚焦显微镜检查细胞。可根据在Chung等，Eur.J.Neurosci.，16：1829-1838，2002描述的实验设计或其修改版计数细胞。
实施例4.多巴胺能神经元细胞分化
对于体外ES细胞分化，我们使用5阶段方法，其在本领域已知(见，如，Lee等，Nat.Biotechnol.18：675-679，2000)且用于分辨ES细胞发育进展的每个阶段。根据本领域熟知方法(见，如，Deacon等，Exp.Neurol.，149：28-41，1998，和Chung等，Stem Cells，20：139-145，2002)繁殖和保持小鼠胚泡衍生的ES细胞系D3和J1。产生小鼠ES细胞为在如下组成的生长培养基中非黏附细菌皿上四天的胚状体(EB)：添加有2mM L-谷氨酰胺、0.001％ β-巯基乙醇、1×非必需氨基酸(全部来自Invitrogen)和10％ FBS(Hyclone)的DMEM。然后所述EB铺板到黏附组织培养皿表面。在培养24小时后，在无血清ITSFn培养基中实行选择巢蛋白阳性细胞。选择十天后，通过如下扩增巢蛋白阳性细胞：经由胰蛋白酶消化离解所述细胞和随后在补充有层粘连蛋白(1μg/ml)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)(10ng/ml)(Invitrogen)的N2培养基中铺于聚L-鸟氨酸/纤连蛋白涂层的盖玻片上。通过从包含层粘连蛋白的N2培养基撤去bFGF来诱导神经元前体细胞分化。为了观察阿莫地喹(4E)效果，我们加入每个2μM4E化合物到在ES衍生神经元阶段第五天的ES衍生神经元持续四天的一段时间。
细胞在1×PBS的4％的低聚甲醛中固定，装到玻璃载玻片上且用包括抗-TH(Pelfreeze)和抗-β-微管蛋白III(Covance)的初级抗体染色(图10A到10B)。使用合适的Alexa488-和Alexa555-标记的第二抗体(MolecularProbes)和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚复染色来显像。
其它实施方案
在以上说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入。所述本发明方法和体系的各种调整和变化对本领域技术人员而言将是明显的，而不偏离本发明的范围和精神。尽管已结合具体实施方案描述了本发明，但应理解，所要求保护的发明不应不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对本领域技术人员明显的、用于实施本发明的所述方式的各种调整预期在本发明的范围内。
其它的实施方案在权利要求中。

Claims (35)

1.一种用于治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括如下步骤：
(a)确定患者是否具有或有风险发展帕金森病；和
(b)如果所述患者具有或有风险发展帕金森病，则施用足以治疗或抑制帕金森病发展的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物给所述患者。
2.一种治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括如下步骤：
(a)确定患者是否具有或有风险发展帕金森病；和
(b)如果所述患者具有或有风险发展帕金森病，则施用足以激活所述患者细胞中Nurrl的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物给所述患者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述化合物为阿莫地喹。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述化合物为格拉非宁。
5.一种试剂盒，其包括：
(a)7-氯-4-氨基喹啉化合物；和
(b)有关施用所述化合物到被诊断具有或有风险发展帕金森病的患者的说明书。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述化合物为阿莫地喹。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述化合物为格拉非宁。
8.一种用于引起体外干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，所述方法包括使所述体外干细胞与以足以诱导所述干细胞分化的量存在的7-氯-4-氨基喹啉化合物接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述干细胞为人胚胎干细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述化合物为阿莫地喹。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述化合物为格拉非宁。
12.一种用于治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括如下步骤：
(a)注射包括干细胞的组合物到患者脑中；和
(b)接着步骤(a)，施用足以诱导所述干细胞分化的量的7-氯-4-氨基喹啉化合物给所述患者。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述干细胞为人胚胎干细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物为阿莫地喹。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物为格拉非宁。
16.一种用于治疗或抑制帕金森病发展的方法，其包括注射包含干细胞和7-氯-4-氨基喹啉化合物的组合物到患者脑中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述干细胞为人胚胎干细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述化合物为阿莫地喹。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述化合物为格拉非宁。
20.一种药物组合物，其包括：
(a)干细胞；和
(b)7-氯-4-氨基喹啉化合物。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述干细胞为人胚胎干细胞。
22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述化合物为阿莫地喹。
23.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述化合物为格拉非宁。
24.一种用于识别在帕金森病中作治疗用途的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)用包含Nurrl基因结构域的第一质粒和包含可操作连接到报告基因的启动子的第二质粒共转染哺乳动物细胞；
(b)以候选化合物接触所述细胞；
(c)测定所得到的所述报告基因的表达水平；和
(d)将所述水平与对照值比较，其中，如果所述水平比所述对照值高至少20％，则识别所述候选化合物为在帕金森病中作治疗用途的化合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在步骤(c)之前培养在步骤(b)中产生的混合物18小时。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞为SK-N-BE(2)C细胞。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一质粒和所述第二质粒的摩尔比率为0.1到10。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二质粒包括酪氨酸羟化酶启动子的100个碱基。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二质粒包括酪氨酸羟化酶启动子的2,600个碱基。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述报告基因是萤火虫荧光素酶。
31.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一质粒包括可操作性连接到所述Nurrl基因结构域的GAL4 DNA结合域，且其中所述第二质粒包括可操作性连接到所述报告基因的GAL4结合位点。
32.一种用于识别在帕金森病中作治疗用途的化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)提供：
(i)能够产生多巴胺的哺乳动物细胞；和
(ii)利用权利要求24所述方法识别的化合物；
(b)以所述化合物接触所述细胞；
(c)测定所得到的酪氨酸羟化酶或多巴胺的表达水平；和
(d)将所述水平与对照值比较，其中，如果所述水平比所述对照值高至少20％，则识别所述化合物为在帕金森病中作治疗用途的化合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述测定包括使用实时PCR定量酪氨酸羟化酶。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述测定包括使用HPLC分析定量多巴胺。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述测定包括使用免疫染色定量酪氨酸羟化酶。
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C10 Entry into substantive examination
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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