KR20050115245A

KR20050115245A - 글루타메이트 운반 조절 화합물 및 방법

Info

Publication number: KR20050115245A
Application number: KR1020057015591A
Authority: KR
Inventors: 제프리 디. 로쓰스타인
Original assignee: 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2004-02-25
Publication date: 2005-12-07
Also published as: MXPA05009134A; CA2516619A1; EP1611238A2; PL377896A1; AU2004214938B2; DK1611238T3; DE602004021574D1; WO2004076675A3; AU2004214938A1; JP2006524637A; EP1611238A4; ES2328811T3; WO2004076675A2; EP1611238B1; ATE433993T1; US20060121488A1

Abstract

흥분성 아미노산 운반체(EAAT) 단백질 발현을 조절하는 방법, 질병 및 질병 증상을 치료하는 방법, EAAT 단백질 발현을 조절하는 화합물을 식별하는 방법, 및 EAAT 단백질 발현을 조절하고 질병 및 질병 증상을 치료하는데 유용한 화합물에 대해 상세히 설명된다.

Description

글루타메이트 운반 조절 화합물 및 방법{Glutamate Transport Modulatory Compounds and Methods}

본 출원은 미가출원 일련번호 제 60/450,227(2003, 2, 26)의 우선권을 주장한다. 본 출원의 전체 내용은 참고문헌으로 편입된다.

본 명세서에 기술된 작업은 국립보건원으로부터의 인증에 의해 지지된다(인증 번호 NS33958). 따라서, 미 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.

신경학적 질환은 중추신경계(CNS) 및 작동 뉴런 유니트를 현저한 영향을 미칠 수 있다. 예를들어, CNS의 특정 신경학적 질환은 뇌 및 관련 구조에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 작동 뉴런 유니트에 영향을 미치는 신경학적 질환은 작동 뉴런 질환 및 주변 신경장해로 나누어진다. 참조 Kandel, E.R. et atl; (1991) Principles of Neuroscience, Appleton & Lange, Norwalk, CT; 및 Rowland, L.P.(ed)(1982) Human Motor Neuron Diseases. New York. Raven Press.

모든 예시적인 작동 뉴런 질환은 근위축성 측삭 경화증(ALS)이다. ALS는 인지된 임상적 명시를 갖는 만성 신경근육 질환인 것으로 보고된 바 있다. 예를들어, 이는 피질 및 척추/구근 작동 뉴런의 퇴행이 질환의 중요 역할을 하는 것으로 제시된 바 있다. ALS는 거의 항상 치명적이다. 모든 ALS의 약 95%는 산발적이며 나머지의 대부분은 상염색체 우성 형질 유전성을 나타낸다(참조 예, Kuncl R.W. et al., (1992) Motor Neuron Diseases In Diseases of the Nervous System, Asbury et al. eds. (Philadelphia W.B.Saunders)pp. 1179-1208; Brown, R.H., (1996) Amer. Neurol. 30:145; Siddique, T. 및 Deng., H.X.(1996) Hum. Mol. Genetics 5:1465).

특정 CNS 질환이 또한 설명된다. 특히, 일부는 콜린성, 도파민성, 아드레날린성, 세로토닌성 결핍 또는 이들의 조합에 기인한다. 중증의 CNS 질환은 프리-세닐 치매(종종 알츠하이머 질병(AD) 또는 초기-발병 알츠하이머 질병으로 불리움), 세닐 치매(알츠하이머 타입의 치매), 파킨슨병(PD), 및 헌팅톤병(HD, 종종 헌팅톤 무도병이라 불리움)을 포함한다. 이러한 CNS 질환은 사람집단에서 잘 나타난다. 참고; Gusella, J.F. et al.(1983) Nature 306: 234; Borlauer. W. 및 Jprmuloewoca. P.(eds.)(1976); Adv. in Parkinsonism: Biochemistry, Physiology, Treatment. Fifth International Symposium on Parkinson's Disease(Vienna) Basel: Roche.

중요 관심분야는 작동 뉴런 질환의 병인론을 이해하는 것에 관련되어 왔다. 예를들어, 특정 흥분독성 신경전달물질의 비정상적 수준은 많은 작동 뉴런 질환에 악영향을 주는 것으로 보고된 바 있다. 특히, 글루타메이트-매개 흥분독성은 ALS에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 참조 예, Rothstein J.D. et al., (1990) Ann. Neurol. 28: 18.; Rothstein J.D. et al.(1992) N. Engl. Med. 326: 1464; Rothstein J.D. et al.(1993) PNAS(USA) 90: 6591; 및 Lacomblez, L. et al., (1996) Lancet 347: 1179.

성상 아교 세포성 운반체 GLAST(EAAT1) 및 GLT-1(EAAT2)은 전뇌에서 글루타메이트의 가장 큰 퍼센트를 책임진다. 이와 같이 이들은 모두 발현 조절, 및 이에 따른 신경퇴행, 발병 및 뇌종양 성장을 포함하는 질병 진전을 저해하기위한 제제로서 흥미있는 표적이다.

신경 시스템에서 글루타메이트 수준을 감소시키는 메카니즘을 이해하는 것과 관련된 실질적인 노력이 이루어져 왔다. 예를들어, 고-친화성, 소디움-의존성 글루타메이트 운반은 글루타메이트를 불활성화시키는 보고된 한 수단이다. 특히, 별세포성 흥분 아미노산 운반체 2(EAAT2) 단백질은 이러한 불활성화에서 실질적인 작용을 하는 것으로 여겨진다. 참조 예, Rothstein J.D. et al., (1994) Neuron 28: 18; Rothstein J.D. et al., (1995) Ann. Neurol. 38: 78.

특히, EAAT2는 현저한 글루타메이트 운반체인 것으로 제시된 바 있다. 보다 상세하게, 특정 안티센스 녹다운 연구는 EAAT2 소실은 흥분성 신경 퇴행 및 진전성 작동자 손상을 일으킬 수 있는 것으로 보고되었다. ALS 및 다른 신경퇴행성 질환의 연구는 EAAT2 단백질의 손실에 대한 감소된 글루타메이트 운반과 관련되었다. 특히, 산발적 ALS 환자의 최고 60 내지 70%는 EAAT2 단백질의 30-95% 손실을 갖는 것으로 조사되었다. 참조 예, Haugeto et al.; Rothstein J.D., et al., (1996) Neuron 16: 675; Bristol, L.A. 및 Rothstein, J.D.(1996) Ann. Neurol. 39:676.

CNS 및 작동 뉴런 유니트의 신경질환을 치료 혹은 예방하기 위한 시도가 이루어져 왔다. 그러나, 대부분의 현 치료는 고통받는 환자에서 질환의 전개 또는 강도를 항상 막는 것은 아니다. 참조 예, Rowell, (1987) Adv. Behav. Biol. 31: 191; Rinne, et al. Brain Res.(1991) 54: 167; 미국 특허 제 5,210,076(Berliner); Yurek, D.M.(1990) Ann. Rev. Neurosci. 13:415, 및 Rowland et al.

이에 따라, 신경질환 치료에 효과적인 치료법이 당분야에 요구된다.

도 1은 EAAT2 프로모터 서열인 SEQ ID NOs: 1-4에 대한 서열 목록이다.

도 2A는 시험 화합물과 함께 배양된 척수 배양물을 나타내며; 2B는 조직 균질화액의 시료 슬롯 블롯이며; 2C는 대표적인 스크리닝 슬롯 블롯을 나타내며; 2D는 시험 화합물 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타내며; 2E는 종류별로 카테고리화된 여러가지 화합물 처리로부터 얻어진 발현 결과를 나타내며; 2F는 세프트리악손에 대한 EAAT2 발현의 투여량-반응 분석을 나타낸다.

도 3A-3E는 마우스 뇌에서 EAAT2 프로모터 프레그먼트의 발현을 나타내며; 3F는 EAAT1 프로모터 리포터의 성상 세포를 나타내며, 그리고 3G는 트랜스제닉 마우스에서 피질 발현을 나타낸다.

도 4A는 여러가지 시험 화합물에 의한 EAAT2 프로모터의 (화합물류에 의한)활성화를 나타내며; 4B는 투여량-반응 결과를 나타낸다.

도 5A는 GLT-1 및 GLT-1B 발현에 대한 세프트리악손 영향의 웨스턴 블롯을 나타내며; 5B는 GLT-1 및 GLT-1B 발현에 대한 세프트리악손의 영향을 나타내며; 5C는 GLAST, EAAC1 및 EAAT4 발현에 대한 세프트리악손 영향의 웨스턴 블롯을 나타내며; 5D는 GLAST, EAAC1 및 EAAT4 발현에 대한 세프트리악손의 영향을 나타낸다.

도 6은 글루타메이트 운반에 대한 여러가지 항생제의 영향을 나타낸다.

도 7A는 허혈 내성에 대한 세프트리악손의 영향을 나타내며; 7B는 작동 뉴런 퇴행에 대한 세프트리악손의 영향을 나타내며; 7C는 (생체내 모델에서) 그립(쥐기) 강도에 대한 세프트리악손의 영향을 나타내며; 7D는 G93A 마우스에서 생존에 대한 세프트리악손의 영향을 나타낸다.

발명의 요약

일 견지로, 본 발명은 세포를 적어도 하나의 EAAT2 발현 촉진제와 접촉시키는 단계를 포함하는 EAAT2 단백질 발현 증가방법에 관한 것이다. 다른 견지로, 상기 EAAT2 발현 촉진제는

a) cDNA 분자 및 SEQ ID NO:1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 프로모터리스 리포터 벡터, 또는 이들의 컴플리먼트, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포로부터 mRNA 발현을 지시할 수 있는 핵산 분자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 mRNA 또는 상기 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물이며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별한다. 상기 방법은 생체내에서 EAAT2 단백질 발현이 증가하거나 혹은 시험관내에서 EAAT2 단백질 발현이 증가하는 것일 수 있다.

상기 방법의 다른 견지는 상기 EAAT2 발현 촉진제가 항생제, 항-고혈압제, 신경전달물질, 항균제, 항-염증제, 스테로이드 유도체, 혹은 항-패혈제인 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 적어도 하나의 고리 황원자, 삼차 아민, 사차 암모늄염, 스테로이드, 폴리올, 폴리케타이드, 구아니딘, 우레아, 또는 아르세네이트를 갖는 헤테로사이클로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 삼차 아민, 사차 암모늄염, 폴리케타이드, 스테로이드성 고리 시스템 및 하나 또는 두개의 고리를 갖는 헤테로사이클, 적어도 하나의 황 고리 원자 또는 0, 1, 또는 2 질소 고리원자로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 비-조절 생산에 비해 200%이상 EAAT2 생산을 증가시키는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 비-조절 생산에 비해 300%이상 EAAT2 생산을 증가시키는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 비-조절 생산에 비해 600%이상 EAAT2 생산을 증가시키는 경우이다.

다른 견지로, 상기 방법은 상기 EAAT2 발현 촉진제가 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 갈라민, 페릴릭 산(-), 아미트립틸린 하이드로클로라이드, 테트라카인 하이드로클로라이드, 디소피라마이드 포스페이트, 시소마이신 설페이트, 케타민 하이드로클로라이드, 실라진, 비큐큘린, 플루비프로펜, 세파드록실, 바캄피실린 하이드로클로라이드, 티아프리드 하이드로클로라이드, 노르에틴드론 아세테이트, 베르갑텐, 카리소프로돌, 시티올론, 피록시캄, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 퍼리그길레이트 소디움, 알벤다졸, 이하이드로스트렙토마이신 설페이트, 알로인, 페노프로펜, 플루타마이드, 암피실린 소디움, 암프로리움, 스파테인 설페이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 알렉시딘 하이드로클로라이드, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 세팔로틴 소디움, 데이드제인, 메클리진 하이드로클로라이드, 린단, 브로모프라이드, N-(3-트리플루오로메틸페닐)피퍼라진 하이드로클로라이드(TFMPP), 에녹솔론, 이프라트로피움 브로마이드, 부펙사막, 글루코노락톤, 리팜핀, 하이드록시클로로퀸, 콜레오포르신, 클로록신, 옥시도파민 하이드로클로라이드, 캄토테신, 나프실린 소디움, 미아세린 하이드로클로라이드, 아세타르솔, 프릴로카인 하이드로클로라이드, 디페록사민 메실레이트, 헥사메토늄 브로마이드, 메테나민, 파락산틴, 하말올 하이드로클로라이드, 피리티온 아연, 하이드로코르티손 부티레이트, 아세타졸아미드, 아미노글루테티미드, 메클로펙녹세이트 하이드로클로라이드, 2-펜프로필아미노-5-니트로벤조산(NPPB), 아미오다론 하이드로클로라이드, 아코니틴, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 및 디오스민으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것으로 기술된다.

다른 견지로, 상기 방법은 상기 EAAT2 발현 촉진제가 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 및 옥시메타졸린 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 및 반코마이신 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 경우; 상기 EAAT2 발현 촉진제가 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 및 퀴나프릴로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 경우가 설명된다.

다른 견지는 적어도 하나의 EAAT2 발현 촉진제를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 세포외 글루타메이트 농도를 감소시키는 방법이다. 상기 발현 촉진제는

를 포함하며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물일 수 있다. 상기 방법은 EAAT2 단백질 발현이 생체내에서 증가되거나; 또는 EAAT2 단백질 발현이 시험관내에서 증가되는 것일 수 있다. 이러한 방법에서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 항생제, 항-고혈압제, 신경전달물질, 항균제, 항-염증제, 스테로이드 유도체, 혹은 항-패혈제이며; 상기 EAAT2 발현 촉진제는 적어도 하나의 고리 황원자, 삼차 아민, 사차 암모늄염, 스테로이드, 폴리올, 폴리케타이드, 구아니딘, 우레아, 또는 아르세네이트를 갖는 헤테로사이클로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하며; 상기 EAAT2 발현 촉진제는 삼차 아민, 사차 암모늄염, 폴리케타이드, 스테로이드성 고리 시스템 및 하나 또는 두개의 고리를 갖는 헤테로사이클, 적어도 하나의 황 고리 원자 및 0, 1, 또는 2 질소 고리원자로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함한다.

다른 견지로, 상기 방법은 포유류가 영장류이며 그리고 포유류가 사람인 경우이다.

상기 방법은 또한 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 50% 감소되거나, 혹은 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 75% 감소된다.

다른 견지는 변환된 글루타메이트 전달과 관련된 질환 또는 질병으로부터 고통받거나 민감한 포유류를 치료하는 방법이며, 상기 방법은 ETTAT2 발현을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 EAAT 발현 촉진제를 치료학적 량으로 포유류에 투여하는 단계를 포함한다. 변환된 글루타메이트 전달과 관련된 질환 또는 질병은 신경질환(예, 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 다중 경화증, 근위축성 측삭경화증, 급성 신경질환, 간질, 척수외상, 뇌외상, 글라우코마, 또는 정신의학 질환)일 수 있다. 상기 방법은 EAAT2 발현 촉진제가

를 포함하며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 것일 수 있다.

다른 견지로, 본 발명은 EAAT2 발현 촉진제가

a) EAAT2를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 시험 화합물의 존재하에서 시험 화합물의 부재하에 비해 상기 세포에서 EAAT2의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 따라 EAAT2의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 어느 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 EAAT2 발현 촉진제가 β-락탐 항생제인 것일 수 있으며; 또는 상기 EAAT2 발현 촉진제가 페니실린류, 세팔로스포린류, 카바페남류 또는 모노박탐류 화합물인 것일 수 있다.

다른 견지는 글루타메이트 신경전달을 조절하는 포유류 치료방법이며, 상기 방법은 EAAT2 발현을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 EAAT 발현 촉진제를 치료 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 다른 견지로, 상기 방법은 포유류가 학습 또는 기억과 관련된 컨디션을 위한 치료가 요구되는 경우이거나 혹은 투여가 학습, 기억 향상 또는 인지력 향상을 위한 것일 수 있다.

본 명세서에서 상기 방법은 본 명세서에 기재된 화합물 또는 본 명세서에 기재된 조성물을 그 효과가 산출되기에 효과적인 량으로 대상자(이러한 치료가 요구되는 것으로 확인된 대상자 포함)에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료가 요구되는 대상자를 확인하는 것은 대상자 또는 건강관리 전문가의 판단에 이루어질 수 있으며 주관적(예, 의견)이거나 혹은 객관적(예, 시험 또는 진단법에 의한 측정)일 수 있다.

표 1은 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 화합물(또는 이들의 염이나 용매화합물)을 나타낸다.

표 1-β-락탐 화합물

페니실린	세팔로스포린 및 세파마이신	다른 베타 락탐
벤질페니실린(페니실린 g)프로카인 벤질페니실린(프로카인 페니실린)페녹시메틸페니실린(페니실린 v)벤자틴 페니실린헤타실린클록사실린카베니실린플루클록사실린암피실린아목시실린코-아목시클래브카복시페니실린티카실린티멘틴타조신(베타-락타메이즈 인히비터 타조박탐을 갖는 우레이도페니실린 피퍼라실린)피퍼라실린피브메실리남아목시실린-클래벌라네이트피퍼라실린옥사실린	세팍클로세파드록실세파딜세팔렉신세파만돌세파졸린세프디토렌세페핌세파타메트세프디너세픽심세피족스세폭탁심세프메타졸세포비드세포니시드세포페라존세포탄세포테탄세폭시틴세프피롬세프포독심세프포독심 프록세틸세프프로질세프라딘세프트라지딤세프티부텐세프티도렌세프틴세프티족심세프트리악손세프록심세프록심 악세틸세팔렉신세프질세팔로틴	아즈트레오남이미페넴메트로페넴에타페넴FK-037

본 발명은 적어도 부분적으로 EAAT2 프로모터 서열의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 EAAT2 프로모터를 포함하는 핵산 분자 뿐만아니라 EAAT2 프로모터의 활성을 조절하는 화합물을 식별하는데 유용한 스크리닝 어세이, 및 EAAT2 프로모터 조절제의 투여를 포함하는 신경학적 및 정신의학적 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

산성 아미노산 글루타메이트(Glu) 및 아스파테이트는 포유류 중추신경계(CNS)에서 현저한 흥분성 신경전달물질이다. 이들은 뇌에서 이러한 흥분성 아미노산(EAAs)의 밀리몰 농도로 존재하나, 세포외 농도는 저 마이크로몰 범위로 유지되어 활발한 시냅스 전달을 촉진하며 이러한 EAAs의 신경독성적 잠재력을 제한한다. Na⁺-의존성 고 친화 운반체의 일 과(family)는 세포외 EAAs의 조절 및 제거를 책임진다.

글루타메이트 및 아스파테이트는 길항제 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA), a-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이스옥사졸프로피오네이트(AMPA), 및 카이네이트로 명명되는 리간드-게이트 이온채널을 활성화시킨다. 이러한 이온통로성 EAA 수용체는 신속한 시냅스 탈분극을 매개하며 그리고 시냅스 유연성 및 시냅스 발달을 포함하는 다수의 다른 생리학적 공정에 중요하다. EAAs는 또한 G-단백질을 통해 제 2 메신저 시스템이나 이온 채널에 결합된 일 과의 대사통로성 수용체를 활성화시킨다. EAAs는 일반적인 뇌 기능에 상당히 중요한 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, EAAs의 세포외 축적 및 EAA 수용체의 과도한 활성화 또한 CNS의 급성 손상시 관찰되는 신경세포사에 기여하는 실질적인 증거이다. "흥분독성"으로 알려진 공정이 또한 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함하는 만성 신경퇴행성 질환에서 관찰되는 신경 손상에 기여할 수 있다.

글루타메이트(5-10mM) 및 아스파테이트(1-5mM)의 세포내 농도는 이의 세포외 농도(<1-10μM)보다 1000-배 내지 10,000-배 높다. 다수의 다른 신경전달물질과 달리, 글루타메이트 또는 아스파테이트가 세포외적으로 대사된다는 증거가 없다. 대신, 이들은 뉴런 및 성상 세포내로의 이송에 의해 세포외 공간으로부터 제거된다.

여러가지 타입의 Na⁺-의존성 글루타메이트 운반체는 약학적 전략 및 cDNA 클로닝을 통해 확인되었다. Na⁺-의존성 글루타메이트 운반체를 발현하는 5가지 명백한 cDNA 클론은 본 명세서에서 GLT-1/EAAT2, EAAC1/EAAC1/EAAT3, GLAST/EAAT1, EAAT4, 및 EAAT5로 칭하여진다. 또한 택일적인 mRNA 스플라이싱으로부터 기원하는 GLT-1 및 GLAST의 부가적인 이질성에 대한 증거가 존재한다.

이러한 두 운반체, GLT-1 및 GLAST의 발현은 일반적으로 성상교세포에 한정된다. 다른 두 운반체, EAAC1 및 EAAT4의 발현은 일반적으로 뉴런에 한정되며, 그리고 EAAT5는 망막에 한정되는 것으로 여겨진다. 전뇌에서 발견되는 이러한 세가지 운반체(GLT-1, GLAST, 및 EAAC1)중, GLT-1은 뇌조직에 특이적인 운반체인 것으로 보여지며 이는 GLT-1 발현이 뇌 특이적 메카니즘에 의해 조절됨을 제시한다.

종래에, 시냅스 전 운반체는 시냅스 전달도중 EAA의 제거에 주요 역할을 하는 것으로 여겨져 왔다. 이는 활성이 미토콘드리아 또는 미엘린에 풍부한 분획에 비해 시냅토조말 멤브레인 제조물에서 2-배 풍부한 증거에 기초한 것이다. 그러나, 이러한 멤브레인 제조물은 방출된 글리얼 멤브레인 및 거대한 양의 GLT-1 단백질을 함유하는 것으로 현재 알려져 있다. 또한, 특정 구심의 병소는 표적 영역에서 Na⁺-의존성 운반의 감소를 일으키는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 예를들어, 선조체에 대한 피질 프로젝션의 병소는 선조체 시냅토좀에서 감소된 흡수를 일으킨다. 이러한 타입의 연구는 시냅스 전 말단내로의 현저한 운반이 존재함을 제시하지만, 보다 최근 연구는 이러한 병소는 글리얼 운반체의 발현을 감소시킨다는 것을 제시한다.

여러가지 상호보완적 전략으로부터 얻어진 증거는 GLT-1이 CNS에서 다량의 EAAs의 Na⁺-의존성 운반을 매개함을 제시한다. 예를들어, GLT-1의 약리학적 특성은 랫트 뇌 멤브레인에서 관찰되는 현저한 활성 성분에 상당한다. 균질성을 위해 GLT-1을 정제하는데 요구되는 농축도 기준으로, GLT-1은 전체 뇌 단백질의 약 1%를 나타낸다. 용해화된 전뇌 조직으로부터 GLT-1의 선택적인 면역침전 및 리포좀내 잔류 단백질의 재구성은 GLT-1이 운반 활성의 90%를 매개함을 제시한다. GLT-1의 안티-센스 녹-다운은 여러가지 전뇌 부위에서 시냅토조말 운반체 활성의 극적인 감소를 일으킨다. 유전적으로 GLT가 제거된 마우스에서 시냅토조말 흡수는 정상의 5%이다. 결국, 뇌 제조물에서 운반체 매개 전류의 전기생리학적 기록은 GLT-1이 여러가지 전 뇌 부위에서 시냅스 운반도중 글루타메이트의 제거에 중요한 역할을 하는 것임을 제시한다.

GLT-1/EAAT2의 발현은 극적으로 생체내 및 시험관내 모두에서 조절된다. GLT-1이 성체 CNS에서 현저한 운반체임에도 불구하고, 랫트 및 사람 모두에서 발달시 초기에 낮고 시냅토제네시스도중 증가한다. 상기한 바와 같이, 특정 표적 핵에 대한 프로젝션의 병소는 글리얼 운반체, GLT-1 및 GLAST 모두의 감소된 발현을 일으킨다. 이러한 데이타는 뉴런의 존재는 글리얼 운반체의 발현을 유도하거나 그리고/또는 유지함을 제시한다.

여러가지 다른 그룹은 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상을 포함하는 CNS에 대한 급성 손상의 동물 모델에서 GLT-1 및/또는 GLAST의 감소된 발현을 나타내었다. GLT-1 발현의 손실은 ALS를 갖는 환자에서 나타났다. 또한, 알츠하이머병 및 헌팅톤병을 포함하는 만성 신경퇴행성 질환을 갖는 사람에서 이러한 운반체의 감소된 발현의 증거가 존재한다. GLT-1의 손실은 또한 치명적 뇌 종양, 신경교아 세포종 멀티포마의 한 특징이다.

근위축성 측삭 경화증(ALS)은 성체 작동 뉴런 질환의 가장 일반적인 형태이며 이는 피질에서 상위 작동 뉴런 및 뇌 줄기와 척수에서 하위 작동 뉴런 모두의 점진적 퇴행이다. ALS 캐이스의 대부분(95%)은 명백히 산발성(SALS)이나, 약 5%는 가족성(FALS)이다. Cleveland DW, Rothstein JD., Nat.Rev.Neurosci.(2001); 2:806-819; Kuncl RW, Crawford TO, Rothstein JD, Drachman DB. Motor neuron diseases. In: Asbury AK et al., editors. Diseases of the Nervous System. 2ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 1992:1179-1208. FALS 캐이스는 SOD-1에서 돌연변이와 관련된 것으로 밝혀졌다. Andersen PM et al. Genetics of amyotrophic lateral sclerosis: an overview. In: Brown RH, Jr., Meininger V, Swash M, editors. Amyotrophic lateral sclerosis. London: Martin Dunitz, 2000:223-250; Brown RH, Jr. Amyotrophic lateral sclerosis. Insights from genetics. Arch Neurol 1997; 54:1246-1250; Cleveland DW, Rothstein JD. Nat.Rev.Neurosci. 2001; 2:806-819, the gene that encodes copper-zinc superoxide dismutase(CuZnSOD). SOD1 돌연변이는 모든 FALS의 약 15-20%로 여겨진다. SOD1 돌연변이는 트랜스제닉 마우스 모델을 생성하는데 사용되었으며; G93A, G37R, G86R 및 G85R SOD1 모두는 돌연변이 단백질을 과-발현하는 트랜스제닉 마우스에서 신뢰성있는 작동 뉴런 퇴행을 생성한다. Cleveland DW., Neuron 1999; 24:515-520; Cleveland DW et al., Nature 1995; 378:342-343; Cleveland DW, Rothstein JD. Nat.Rev.Neurosci. 2001; 2:806-819. 돌연변이 SOD1 독성의 병원성 이벤트 "다운스트림"은 흥분독성, 신경염증 및 세포사멸을 포함한다. 점진적으로, 이러한 다운스트림 이벤트는 질병 코스를 성공적으로 전환하는 일부 경우에서 약물요법의 표적이다. 여러가지 다른 유전자 또는 염색체 국소화가 다른 가족성 ALS 변이체에서 확인되었다.

가족성 ALS 및 산발성 ALS 모두의 공통점은 성상 아교 세포성 글루타메이트 운반체 EAAT2 단백질의 손실이다. 상기한 바와 같이, 성상 아교 세포성 운반체 EAAT2는 다량의 글루타메이트 시냅스 제거에 관여한다. 특히, EAAT2는 흥분독성 신경퇴화를 보호한다.

ALS 환자에서 글루타메이트의 대뇌 유체 수준의 대증가의 발견으로부터 ALS에서 초기에 일어나는 글루타메이트 취급시 비정상의 증거는 산발성 ALS 환자의 ~40%로 보고되었다. Rothstein JD et al. Ann.Neurol. 1990; 28:18-25; Spreux-Varoquaux O et al. J Neurol Sci. 2002; 193:73-78. ALS에서 작용성 글루타메이트 운반의 측정은 영향을 받은 ALS 뇌 부위에서 현저한 감소를 나타내었다. 작용성 글루타메이트 운반체의 손실은 성상 아교 세포성 글루타메이트 운반체 단백질 EAAT2의 극적인 손실의 결과이며, 이는 산발성 ALS 환자의 최고 65%일 수 있다. Rothstein JD et al., Ann.Neurol. 1994; 36:282; Rothstein JD, et al. N Engl.J Med 1992; 326:1464-1468; Rothstein JD et al., Ann Neurol 1995; 38:73-84. 메카니즘에 관계없이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 EAAT2 감소는 운반 활성의 손실이 직접적으로 신경학적 사멸을 유발함을 입증하였다. 또한, 트랜스제닉 마우스에서 적어도 세가지(G85R, G93A, G37R) SOD1 돌연변이의 발현은 모두 EAAT2 단백질 및 그 기능의 손실을 일으킨다. Rothstein JD et al., Neuron 1996; 16:675-686; Rothstein JD et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:6591-6595. 총괄적으로, 이들 및 기타 연구는 (성상 세포 기능장애와 관련된) EAAT2의 기능적 손실은 유전성 및 산발성 ALS 모두에서 작동 뉴런의 손실에 기여함을 제시한다. 최근, 본 발명자들은 또한 상기 질병의 새로운 랫트 트랜스제닉 모델에서 GLT-1/EAAT2 단백질의 손실을 보고하였다. Howland DS et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2002; 99:1604-1609. Notably, loss of transporter protein precedes actual degeneration of motor neurons and their axons in the rat mdel.

최근 두 실험실에서 치료제로서 EAAT2의 중요성과 관련된 중요한 데이타를 제공하였다. Dr. Glen Lin은 트랜스제닉 마우스에서 EAAT2의 2배 발현은 시험관내에서 신경보호를 일으키며 ALS 마우스에서 질병의 발병을 지연시키는 것을 보고하였다. Guo, H. et al. Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532. 마찬가지로, Dr. Margaret Sutherland는 트랜스제닉 마우스에서 EAAT2의 5배 과발현은 G93A SOD1 마우스의 생존을 적어도 30일 (그리고 다른 여러 동물에서 보다 긴 수개월) 증가시킬 수 있다고 보고하였다. Maguire JL, et al. Soc Neurosci Abstr. 2001; 27:607.9; Sutherland M.L., et al. Soc Neurosci Abs. 2003. 또한, 그녀의 실험실은 증가된 EAAT2는 신경교종 이종이식 설치류에서 발병을 약화시킬 수 있으며 발병 및 종양 성장 모두를 줄일 수 있는 것으로 보고하였다. 하기에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 새로운 치료법을 이용하여 EAAT2의 과발현이 ALS 마우스에서 발병을 지연시킬 수 있음을 제시하는 데이타를 얻었다.

GLT-1 발현이 생체내에서 상당히 높음에도 불구하고, 배양시 유지되는 '정상' 성상세포는 실질적으로 검출가능한 mRNA나 단백질을 발현하지 않는다. 뉴런과 함께 성상세포의 동시배양은 GLT-1의 글리얼 발현을 유도하며, 이는 뉴런이 시험관내에서 GLT-1의 발현을 유도 및/또는 유지함을 제시한다. 이러한 뉴런의 영향은 적어도 부분적으로 가용성 분비 분자에 의해 중재된다. dbcAMP, 상피성장인자, 뇌하수체 아데닐레이트 시클라아제-활성 펩타이드, 및 이뮤노필린을 포함하는 여러가지 소분자는 이러한 뉴런의 영향을 모방한다. 이러한 모든 경우에서 GLT-1 단백질 발현의 증가는 GLT-1 mRNA의 증가 및 성상세포의 형태변화를 수반하며 이는 대부분 분화를 암시하는 것으로 여겨진다.

dbcAMP의 영향은 단백질 키나아제 A의 저해제에 의해 차단된다. dbcAMP, 상피성장인자, 또는 뉴런 컨디션 배지에 의해 유도된 GLT-1 발현의 증가는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 또는 전사인자 NF-κB의 저해제에 의해 모두 차단되는 것으로 나타났다. 다른 점에서, GLT-1 발현을 실제로 조절하는 메카니즘에 대해서는 거의 알려진 바 없다. 따라서, EAAT2 프로모터의 동정은 EAAT2 조절을 이해하고 그 합성을 조절하는 어세이를 개발하는데 유용한 수단을 제공한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "EAAT2"는 사람 성상 아교 세포성 글루타메이트 운반체 2 유전자를 가리킨다. 참조 예, 미국특허 제 5,658,782(사람 EAAT2 cDNA 서열이 기재되어 있음). 본 명세서에 사용된, 용어 "GLT-1"은 설치류 성상 아교 세포성 글루타메이트 운반체 2 유전자를 가리킨다.

본 명세서에 사용된, 용어 "프로모터"는 일반적으로 mRNA 전사개시자리에 5'에서 보통 발견되는 게노믹 DNA 영역을 칭한다. 프로모터는 mRNA 전사의 타이밍 및 수준을 조절하는데 관여하며 예를들어, RNA 중합효소 및 다른 전사인자와 같은 세포성 단백질에 대한 바인딩 사이트를 갖는다. 본 명세서에서 호환적으로 사용된 용어 "EAAT2 프로모터", "EAAT2 프로모터 영역" 등은 EAAT2 mRNA 전사인자 개시 사이트의 5'에서 발견되는 게노믹 DNA의 영역을 포함한다. 바람직한 구현으로, EAAT2 프로모터는 SEQ ID NO:1, 2, 3, 또는 4, 또는 이들의 프레그먼트를 포함한다. 프로모터가 없는 리포터 구조물내로 삽입되는 경우, 바람직한 EAAT2 프로모터 프레그먼트는 리포터 유전자의 전사를 지시할 수 있다.

일 구현으로, EAAT2 프로모터는 SEQ ID NO:1(예, SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1-4696)을 포함한다. 다른 구현으로 EAAT2 프로모터는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 733-3450을 포함하는 P1 영역(또한 SEQ ID NO:2로 나타낸 바와 같음)을 포함한다. 다른 구현으로, EAAT2 프로모터는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 733-3186을 포함하는 P2 영역(또한 SEQ ID NO:3으로 나타낸 바와 같음)을 포함한다. 다른 구현으로, EAAT2 프로모터는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 2590-3450을 포함하는 P3 영역(또한 SEQ ID NO:4로 나타낸 바와 같음)을 포함한다.

본 발명의 EAAT2 프로모터 활성화 분자는 신경학적 및 정신의학적 질환용 치료제로 제공된다. 본 명세서에 사용된, 용어 '신경학적 질환'은 예를들어, 중추신경계와 같은 신경계에 영향을 주는 질환, 질병 또는 컨디션을 포함한다. 본 발명에 따라 치료가능한 신경학적 질환은 흥분독성과 관련되어 보고된 특정 질환을 포함한다. 특히 작동 뉴런 기능에 영향을 주는 특정 신경학적 질환이 포함된다. 신경학적 질환은 이에 한정되는 것은 아니나 근위축성 측삭 경화증(ALS), 트리뉴클레오타이드 반복 연장 질환(예, 헌팅톤병(HD), 척추 및 연수 근육 위축, 척수소뇌성 운동실조 타입 1, 2, 6 및 7, 치상적핵담창구루이핵 위축증(Dentatorubropallidoluysian Atrophy), 및 마케도-조셉병), α-시노뉴클레오패티(예, 파킨스병(PD), 루이바디를 갖는 치매(DLB), 및 다중계 위축증(MSA), 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병, 뇌종양(예, 글리오블라스토마), 뇌졸증/이스케미아, 뇌혈관 질환, 간질(예, 측두엽 간질), HIV-관련 치매, 코르사코프병, 만성 통증, 신경통, 고통스런 신경장애, 두통(예, 편두통), 픽크병, 전진적 상핵 마비, 크루즈펠트-자콥병, 안면신경마비, 실어증, 수면장애, 녹내장, 및 메니에르병을 포함한다.

또한, 본 발명의 EAAT2 프로모터 활성화 분자는 학습 및 기억과 뇌기능과 관련된 정상적인 글루타메이트 신경전달의 조절을 위한 치료제로 제공된다. 본 명세서에 기술된 상기 분자는 기억 및 학습의 향상을 위한 치료가 요구되는 대상자에게 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 '정신의학적 질환'은 정신 질병 및 질환을 칭하며, 그리고 Diagnostic and Statistical Manual of Metal Disorders - Fourth Edition(DSM-IV)(American Psychiatric Association, Washington D.C.(1994))에 열거된 질병 및 질환을 포함한다. 정신의학적 질환은 이에 한정하는 것은 아니나, 불안장애(예, 급성 스트레스 질환 광장공포증, 범불안장애, 강박장애, 외상 후 스트레스 장애, 분리불안장애, 사회공포증, 및 특수 공포증), 유년 장애(예, 주의력-결핍 장애/과잉행동 장애, 수행장애 및 반항장애), 섭식 장애(예, 신경성식욕부진증 및 신경성 과식증), 인격장애(예, 우울병, 쌍극성 장애, 순환성 장애, 기분부전장애, 및 주요 우울장애), 인격장애(예, 반사회적 인격장애, 회피성 인격장액, 경계성인격장애, 의존성 성격장애, 연극성 성격장애, 자애성 성격장애, 강박성 인격장애, 편집성 인격장애, 분열성 인격장애, 및 분열형 성격장애), 정신병적 장애(예, 단기 정신병적 장애, 망상장애, 분열정동장애, 정신분열병형 장애, 정신분열병, 및 유발성 정신병적 장애), 물질관련장애(예, 알코올 의존성, 암페타민 의존성, 카나비스 의존성, 코카인 의존성, 헬루시노겐 의존성, 흡입제 의존성, 니코틴 의존성, 오피오이드 의존성, 펜시클리딘 의존성, 및 진정제 의존성), 적응장애, 자폐증, 섬망, 멀티-인프랙트 치매, 학습 및 기억 질환(예, 건망증 및 노화관련 기억상실), 및 투렛 질환을 포함한다.

상기한 바와 같이, 특정 관심있는 신경학적 및 정신의학적 질환은 글루타메이트와 같은 흥분독성 아미노산의 비정상적 방출 혹은 제거와 관련된 질환을 포함한다. 여러가지 CNS 뉴런 타입은 흥분독성 글루타메이트에 의해 특히 해로운 영향을 받는다. 참조 예, Choi, D.W.(1988) Neuron 1:623. 특히 바람직한 신경학적 질환은 AD, HD, PD를 포함하며 ALS가 특히 바람직하다.

III. 스크리닝 어세이

본 발명은 EAAT2 프로모터에 바인딩하거나, 그리고/또는 예를들어 EAAT2 프로모터 활성에 대한 자극적 혹은 억제적 영향을 갖는 조절제, 후보제 또는 시험 화합물 또는 제제(예, 핵산, 펩타이드, 펩티도미메틱스, 소분자 또는 기타 약물)를 식별하는 방법(본 명세서에서 "스크리닝 어세이"라고도 함)을 제공한다.

일 구현으로, 본 발명은 EAAT2 프로모터 활성을 조절하는 후보제 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 어세이를 제공한다. 다른 구현으로, 본 발명은 EAAT2 프로모터에 바인딩하거나 이의 활성을 조절하는 후보제 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 어세이를 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레서블한 병렬 고형상 또는 용액상 라이브러리; 회절풀이(deconvolution)를 필요로 하는 합성 라이브러리법; '원-비드 원-컴파운드' 라이브러리법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리법을 포함하는 당 분야에 알려진 조합적 라이브러리법으로 다수의 어떠한 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근은 펩타이드 라이브러리에 제한되나, 다른 4가지 접근은 화합물의 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 소분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, K.S.(1997) Anticancer Drug Des. 12:45).

분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 예를들어, DeWitt et al.(1993) Proc. Natl. Acad. USA 90:6909; Erb et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al.(1994). J.Med.Chem. 37:2678; Cho et al.(1993) Science 261:1303; Carrell et al.(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al.(1994) J. Med. Chem. 37:1233에서와 같이 당 기술분야에서 찾아볼 수 있다.

화합물의 라이브러리는 용액으로(예, Houghten(1992) Biotechniques 13:412-421), 또는 비드(Lam(1991) Nature 354:82-84), 칩(Fodor(1993) Nature 364:555-556), 박테리아(Ladner 미특허 제 5,223,409), 스포어(Ladner 미특허 제 '409), 플라스미드(Cull et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)상으로 혹은 파지(Scott 및 Smith(1990) Science 249:386-390); (Devlin(1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 상기 참조)상으로 존재할 수 있다.

바람직한 구현으로, 어세이는 EAAT2 프로모터 또는 이의 일부에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 발현하는 세포(예, 그 발현은 EAAT2 프로모터 또는 그 일부의 조절하에 이루어짐)가 시험 화합물과 접촉하고 그 시험 화합물의 EAAT2 프로모터 활성 조절에 대한 능력이 검출되는 세포-기초 어세이이다. 시험 화합물의 EAAT2 프로모터 활성을 조절하는 능력을 검출하는 것은 리포터 유전자 발현(예, 리포터 mRNA 또는 폴리펩타이드 발현 수준) 또는 예를들어 활성을 모니터링함으로써 수행될 수 있다. 본 명세서에 기술한 바와 같이, 리포터는 어떠한 검출가능한 마커일 수 있다. 예를들어, 리포터는 그 발현이 예를들어, 노던 블롯팅, RT-PCR, 프라이머 익스텐션, 또는 뉴클라아제 프로텍션 어세이에 의해 측정될 수 있는 핵산 서열일 수 있다. 리포터는 또한 그 발현이 예를들어, 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 RIA 어세이에 의해 측정될 수 있는 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열일 수 있다. 리포터 발현은 또한 예를들어, 스탠다드 글루타메이트 운반 어세이, 루시페라아제 어세이, β-갈락토시다아제 어세이, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT) 어세이, 또는 형광 단백질 어세이를 이용하여 리포터에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.

후보 화합물의 존재하에서 EAAT2 프로모터의 조절하에 리포터의 발현수준 또는 활성은 후보 화합물의 부재하에서 리포터의 발현수준 또는 활성과 비교된다. 후보 화합물은 그 다음 이러한 비교에 기초하여 EAAT2 프로모터 활성의 조절제로서 식별될 수 있다. 예를들어, 리포터 mRNA의 발현 또는 단백질 발현 또는 활성이 후보 화합물의 존재하에서 그 부재시에 비해 우수한 경우(통계학적으로 현저히 보다 우수한 경우), 상기 후보 화합물은 EAAT2 프로모터 활성의 자극제로서 식별된다. 택일적으로, 리포터 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성이 후보 화합물의 존재하에서 그 부재시에 비해 낮은 경우(통계학적으로 현저히 보다 낮은 경우), 상기 후보 화합물은 EAAT2 프로모터 활성의 저해제로서 식별된다.

시험 화합물의 EAAT2 프로모터에 바인딩하는 능력 및/또는 EAAT2 프로모터에 대한 단백질(예, 전사인자)의 바인딩을 조절하는 능력이 또한 측정될 수 있다. 시험 화합물의 EAAT2 프로모터에 바인딩하는 능력 및/또는 바인딩 단백질에 대한 EAAT2 프로모터 바인딩을 조절하는 능력의 검출은 예를들어, 시험 화합물, EAAT2 프로모터 또는 바인딩 단백질을 EAAT2 프로모터의 시험 화합물에 대한 바인딩 또는 바인딩 단백질에 대한 바인딩이 복합체에서 표지 성분 검출에 의해 검출가능하도록 방사성동위원소나 효소적 표지와 결합시켜 이루어질 수 있다. 예를들어, 화합물(예, 시험 화합물, EAAT2 프로모터, 또는 바인딩 단백질)은 32P, 125I, 35S, 14C, 또는 3H와 직접 혹은 간접적으로 표지될 수 있으며, 그리고 방사성동위원소는 방사서방출의 직접 카운팅에 의해 혹은 신틸레이션 카운팅에 의해 검출된다. 택일적으로, 화합물은 예를들어, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 또는 루시페라아제로 효소적으로 표지될 수 있으며 이러한 효소적 표지는 적절한 기질의 산물로의 전환을 측정함으로써 검출된다.

어떠한 상호반응물의 표지없이 EAAT2 프로모터와 상호작용하는 화합물(예, 시험 화합물 또는 EAAT2 프로모터 바인딩 단백질)의 능력을 측정하는 것이 또한 본 발명의 견지내에 포함된다. 예를들어, 마이크로피지오미터가 상기 화합물 또는 EAAT2 프로모터의 표지없이 화합물과 EAAT2 프로모터의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다(McConnel, H. M. et al.(1992) Science 257:1906-1912). 본 명세서에 사용된 "마이크로피지오미터"(예, 사이토센서)는 라이트-어드레서블 포텐티오메트릭 센서(LAPS)를 이용하여 세포가 그 환경을 산성화하는 비율을 측정하는 분석기이다. 이러한 산성화 비율 변화는 화합물과 EAAT2 프로모터간 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.

다른 구현으로, 상기 어세이는 EAAT2 프로모터 또는 그 단백질이 시험 화합물과 접촉되고 시험 화합물의 EAAT2 프로모터 또는 그 단백질의 활성을 조절하는(예, 자극 혹은 억제) 능력이 검출되는 세포-프리 어세이이다. 시험 화합물의 EAAT2 프로모터 활성 조절 능력 검출은 예를들어, 상기한 바와 같은 방법중 하나에 의해 EAAT2 프로모터 표적 분자에 바인딩하는 EAAT2 프로모터의 능력을 측정하거나 또는 직접 바인딩을 측정함으로써 이루어질 수 있다. AAT2 프로모터 표적 분자에 바인딩하는 EAAT2 프로모터의 능력을 측정하는 것은 또한 실시간 Biomolecular Interaction Analysis(BIA)와 같은 기술을 이용하여 수행될 수 있다. Sjolander, S 및 Urbaniczky, C.(1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 및 Szabo et al.(1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. 본 명세서에 사용된 "BIA"는 어떠한 상호작용물 표지없이 실시간으로 생체특이적 상호작용을 조사하는 기술이다(예, BIAcore). 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 광학 현상 변화는 생물학적 분자간의 실시간 반응의 지표로 사용될 수 있다.

다른 구현으로, 세포-프리 어세이는 EAAT2 프로모터와 바인딩하는 공지 화합물(예, 기본적 전사 기구의 성분)과 EAAT2 프로모터 또는 그 일부를 접촉시켜 어세이 혼합물을 형성하고, 상기 어세이 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키고 그리고 시험 화합물의 EAAT2 프로모터와 상호작용하는 능력을 측정하는 것을 포함하며, 여기서 시험 화합물의 EAAT2 프로모터와의 상호작용하는 능력 측정은 EAAT2 프로모터의 EAAT2 프로모터 표적 분자에 우선적으로 바인딩하는 능력 또는 EAAT2 프로모터 표적 분자의 활성을 조절하는 능력을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명의 상기 어세이 방법의 일이상의 구현으로, EAAT2 프로모터 또는 그 표적 분자는 하나 또는 두가지 모든 분자의 비복합 형태로부터 복합된 형태의 분자를 분리시키는 것을 촉진시키기위해 또한 어세이의 자동화를 제공하기위해 고정화하는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재하에서 시험 화합물의 EAAT2 프로모터에 대한 바인딩, 또는 EAAT2 프로모터와 기질 혹은 표적 분자와의 상호작용은 반응물을 함유하기에 적절한 어느 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 용기의 예는 마이크로타이터 플래이트, 시험관, 및 마이크로-원심분리관을 포함한다. 일 구현으로, 융합 단백질이 제공될 수 있으며 이는 그 단백질의 하나 또는 두가지 모두가 매트릭스에 바인딩될 수 있도록 하는 도메인이 첨가된다. 예를들어, 글루타티온-S-트랜스페라제/표적 융합 단백질이 글루타티온 세파로즈 비드(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) 또는 글루타티온 유도화 마이크로미터 플래이트상에 흡착될 수 있으며, 이는 그 다음 시험 화합물, 또는 시험 화합물과 비흡착 표적 단백질 또는 EAAT2 프로모터와 혼합되고, 그리고 그 혼합물은 복합체 형성에 도움이 되는 조건(예, 염 및 pH에 대한 생리적 조건)하에서 배양된다. 배양후, 상기 비드 또는 마이크로타이터 플래이트웰은 어떠한 바인딩되지 않은 성분들, 비드의 경우 고정된 매트릭스를 제거하기위해 세척되고, 복합체는 예를들어 상기한 바와 같이 직접 혹은 간접적으로 측정된다. 택일적으로, 상기 복합체는 매트릭스로부터 분리될 수 있으며, 그리고 EAAT2 프로모터 바인딩 또는 활성 수준은 표준기술을 이용하여 측정될 수 있다.

매트릭스상에 단백질 또는 핵산을 고정하는 다른 기술이 또한 본 발명의 스크리닝 어세이에 사용될 수 있다. 예를들어, EAAT2 프로모터 또는 EAAT2 프로모터 기질 또는 표적 분자는 바이오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 고정될 수 있다. 바이오티닐레이티드 EAAT2 프로모터, 기질, 또는 표적 분자는 바이오틴-NHS(N-히드록시-숙신이미드) 당 분야에 알려진 기술(예, 바이오티닐화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, III)을 이용하여 분리되고, 그리고 스트렙타비딘-코팅된 96웰 플래이트(Pierce Chemical)의 웰에 고정될 수 있다. 택일적으로, EAAT2 프로모터 또는 표적 분자에 반응적이나 EAAT2 프로모터의 그 표적분자와의 바인딩을 저해하지 않는 항체가 상기 플래이트의 웰에 유도될 수 있으며, 그리고 바인딩되지 않은 표적이나 EAAT2 프로모터는 항체 접합에 의해 상기 웰에 트래핑될 수 있다. 이러한 복합체 검출방법은 GST-고정화 복합체에 대해 상기한 것들에 부가적으로 EAAT2 프로모터 또는 표적 분자와 반응적인 항체를 이용한 복합체의 면역검출 뿐만아니라 효소-결합 어세이를 포함하며, 이는 EAAT2 프로모터 또는 표적 분자와 관련된 효소적 활성 검출에 의존한다.

본 발명의 다른 견지로, EAAT2 프로모터는 EAAT2 프로모터와 바인딩하거나 상호작용하며 EAAT2 프로모터 활성에 관여하는 단백질("EAAT2 프로모터-바인딩 단백질" 또는 "EAAT2 프로모터-bp")을 식별하기위해 원-하이브리드 어세이(참조 예, BD Matchmaker One-Hybrid System(1995) Clontechinques X(3):2-4; BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit(2000) Clontechniques XV(4):5-7; BD SMART technology overview(2002) Clontechniques XVII(1):22-28; Ausubel, F.M., et al.(1998) Current Protocols in Molecular Biology Eds. Ausubel, F.M., et al., pp.13.4.1-13.4.10)에서 "베이트"로 사용될 수 있다. 이러한 EAAT2 프로모터-바인딩 단백질은 또한 EAAT2 프로모터로부터 전사 조절에 관여하는 것으로 여겨진다.

다른 견지로, 본 발명은 본 명세서에 기술된 어세이의 두개이상의 조합과 관련된다. 예를들어, 조절제는 세포-기초 혹은 세포-프리 어세이를 이용하여 식별될 수 있으며, 상기 제제의 EAAT2 프로모터의 활성을 조절하는 능력이 예를들어, 신경학적 질병의 동물모델과 같은 동물에서와 같이 생체내에서 확인될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 새로운 제제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델(예, 신경학적 질병용 동물 모델)에서 본 명세서에 기술된 바와 같이 식별된 제제를 더욱 사용하는 것이 본 발명의 견지내에 포함된다. 예를들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 식별된 제제(예, EAAT2 프로모터 조절제 또는 EAAT2 프로모터 바인딩 단백질)는 이러한 제제를 이용한 치료의 효과, 독성, 또는 부작용을 측정하기위해 동물모델에 사용될 수 있다. 택일적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같이 식별된 제제는 이러한 제제의 작용 메카니즘을 조사하기위해 동물모델에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 스크리닝 어세이에 의해 식별된 새로운 제제의 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료용으로서의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에 설명된 스크리닝 방법을 이용하여 식별되는 제제가 본 명세서에 기술된다. 이러한 화합물은 본 명세서에서 식별되는 바와 같은 여러가지 화학 구조물을 포함하며, 이는 β-락탐 고리 시스템을 갖는 화합물, 보다 상세하게, 페니실린류, 세팔로스포린류, 카바페남 및 모노박탐류 화합물을 포함하는 β-락탐 항생제 화합물을 포함한다.

IV. 치료 방법

일 구현으로, 본 발명은 치료학적으로 유효량의 EAAT2 프로모터 조절제를 포함하는 약학 조성물을 대상자(예, 사람과 같은 포유류)에게 투여하는 것을 포함하는 신경학적 및 정신의학적 질환의 치료방법을 제공한다.

EAAT2 프로모터 활성을 조절하고 이에 따라 EAAT2 유전자 발현을 조절하기위해, 예를들어, 본 명세서에 기술되거나 본 발명의 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물은 세포 또는 대상자에게 투여될 수 있다. EAAT2 프로모터 조절제의 포유류 세포(사람 세포 포함)로의 투여는 EAAT2 mRNA 및/또는 폴리펩타이드 발현을 조절(예, 상향 또는 하향 조절)하여 세포내로의 글루타메이트 운반을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 이러한 방법에서, EAAT2 프로모터는 공지 방법에 의해 포유류(사람 포함)에 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 치료방법(예방적 치료 포함)은 일반적으로 치료학적으로 유효량의 EAAT2 프로모터 조절제를 이를 필요로 하는 포유류, 특히 사람을 포함하는 동물에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 신경학적 또는 정신의학적 질환으로 고통받거나 이를 갖거나 이에 민감하거나 위험이 있는 대상자, 특히 사람에게 적합하게 투여될 것이다. 본 발명의 EAAT2 프로모터 조절제는 또한 EAAT2가 관련될 수 있는 어떠한 다른 질환의 치료에 사용될 수 있다.

치료 적용시, 본 발명의 EAAT2 조절제는 하나이상의 허용가능한 이들의 캐리어 및 임의로 다른 치료성분과 함께 EAAT2 조절제를 포함하는 약학 조성물의 단독 또는 일부로서 포유류, 특히 사람과 같은 대상자에게 적절히 투여될 수 있다. 상기 캐리어(들)는 배합물의 다른 성분과 혼화가능하며 이의 수용자에게 해롭지 않은 면에서 "허용가능한" 것이어야 한다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 비강, 국소(구강 및 설하 포함), 질 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 적절한 것들을 포함한다. 상기 배합물은 예를들어, 정제 및 지연 방출 캡슐, 및 리포좀과 같은 유니트 투여형태로 존재할 수 있으며 약학분야에 잘 알려진 어느 방법에 의해 제조될 수 있다. 참조 예, Reminton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA(17th ed. 1985).

이러한 제조방법은 투여되는 분자를 하나이상의 부속성분을 포함하는 캐리어와 같은 성분과 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 액상 캐리어, 리포좀 또는 미세하게 분열된 고형 캐리어 또는 이 모두를 상기 활성 성분과 균일하고 친밀하게 결합하고 그 다음 필요에 따라 그 산물을 성형함으로써 제조된다.

경구 투여용으로 적절한 본 발명의 조성물은 각각 미리결정된 양의 활성성분을 함유하는 캡슐, 쌕, 또는 정제와 같은 분리성 유니트로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비수성 액체내 용액이나 서스펜션으로서; 또는 오일-인-워터 액체 에멀션 또는 워터-인-오일 액체 에멀션으로서, 또는 리포좀내에 패킹되거나 큰 환약 등으로 존재할 수 있다.

정제는 압축 또는 성형에 의해, 임의로 하나이상의 부속성분과 함께 제조될 수 있다. 압축 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유-흐름 형태의 활성성분을 임의로, 바인더, 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 표면-활성제 또는 분산제와 함께 혼합 활성성분을 적절한 기계에서 압축하여 제조될 수 있다. 성형 정제는 비활성 액체 희석제로 적셔진 분말 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 성형하여 제조될 수 있다. 상기 정제는 임의로 코팅 혹은 스코어링될 수 있으며 또한 그 안의 활성 성분이 서서히 방출되거나 조절된 방출성을 제공하도록 배합될 수 있다.

국소 투여용으로 적절한 조성물은 상기 성분들을 향료 베이시스, 일반적으로 설탕 및 아카시아 혹은 트래거캔스 고무내에 포함하는 마름모꼴 정제; 및 상기 성분들을 젤라틴 및 글리세린, 또는 설탕 및 아카시아와 같은 비활성 베이시스내에 포함하는 패스틸을 포함한다.

비경구 투여용으로 적절한 조성물은 항-산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 배합물을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주입액; 및 부유제 및 농후제를 포함하는 수성 및 비-수성 멸균 서스펜션을 포함한다. 상기 배합물은 예를들어, 밀봉된 앰플 및 바이얼과 같은 유니트-투여 또는 다중-투여 용기내에 존재할 수 있으며, 그리고 예를들어 사용직전 주입용 물과 같은 멸균 액체 캐리어의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주입용액 및 서스펜션은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

대상자 치료의 적용은 종종 관심 부위에 투여되도록 하는 것과 같이 국소적일것이다. 주사, 카테터, 투관침, 프로젝틸, 플루론 겔, 스텐트, 지연 약물 방출 중합체 또는 내부접근을 제공하는 다른 장치와 같은 여러가지 기술이 관심 부위에 조성물을 대상자에게 공급하는데 사용될 수 있다. 환자로부터 제거되기때문에 기관 또는 조직이 접근가능한 경우, 이러한 기관 또는 조직은 대상 조성물을 함유하는 매체내에 담궈지거나, 상기 조성물은 기관에 발라지거나 또는 어느 통상적인 방법으로 적용될 수 있다.

주어진 치료에 사용되는 본 발명의 EAAT2 조절제의 실제 바람직한 양은 사용되는 특정 활성 화합물, 배합되는 특정 조성, 적용방식, 특정 투여부위, 환자 체중, 성 등과 같은 일반적 건강상태, 처리되는 특정 지표 등 및 주치 의사 혹은 수의사를 포함하는 당업자에게 인지되는 다른 인자들에 따라 달라질 것이다. 주어진 투여방법에 대한 최적 투여율은 통상적인 투여 결정 시험을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이러한 실시예는 예시적인 것이며 본 발명을 어떠한 방식으로 한정하려는 것은 아니다.

실시예 1: EAAT2 단백질 발현의 시험관내 분석.

EAAT2 단백질 과발현에 대한 스크리닝 어세이 . 척수 기관형 배양 및 성상 아교 세포 배양이 EAAT2 합성 및 작용을 자극시킬 수 있는 약물을 스크리닝하는데 사용된다. 기관형 배양은 이들이 시험관내에서 뉴런-성상 아교세포 상호작용의 일반적 구성을 유지하는 점에서 잇점을 가지며 출산후 기관으로부터 유도되며; 이에 따라 (배아 세포에 비해) 생체내에서 성상 아교 세포 반응을 보다 잘 나타낼 수 있다. 따라서 성상세포에 작용하는거나 또는 성상세포에 경보를 발하는 인자를 분비하도록 뉴런을 유도하는 약물은 동물 전체에 운반되는 "자연적인" 조건을 보다 잘 반영한다.

바이오어세이 방법 (어세이 설명요약에 대해 도 2 참조)

기관형 척수. 척수 기관형 배양은 종래에 본 발명자들에 의해 상세히 설명된 바 있다. Rothstein JD et al., N.Engl.J.Med. 1992; 326:1464-1468. 간략히, 생후 8-10일의 랫트 새끼로부터 얻어진 랫트 요추 척수의 300㎛ 절편을 Millipore Millicell CM 반투과막상에 놓는다. 각 웰은 5 슬라이스를 함유한다(도 2A). 50-100 배양물이 매주 준비될 수 있다. 각 약물(10-100μM)을 세포배양배지/혈청과 함께 3일간 첨가하였다. 배양물을 수집하고 5-50㎍의 조직을 슬롯 블롯 장치에 적용하여 Kuncl RW et al., Motor neuron diseases. In: Asbury AK et al., editors. Diseases of the Nervous System. 2ed. Philadephia: W.B. Saunders, 1992:1179-1208; Rothstein JD et al., Neuron 1994; 13:713-725에 기술된 표준 웨스턴 블롯팅/화학발광법에 의해 EAAT2을 검출하였다. 모든 항펩타이드 항체는 친화 정제되었으며 운반체 서브타입에 고 특이적이었다. 전형적인 슬롯-블롯 분석은 도 2B,C에 나타내었다. 이러한 방법에 의해, 본 발명자들은 발현된 단백질의 50%이상을 신뢰성있게 검출할 수 있다. 각 항체 슬롯 블롯에 대해, 사용된 균질화물은 종래의 표준곡선에 기초하여 항체 검출에 대한 선형 범위내에 존재하는 것으로 예측된다.

스크리닝 라이브러리- 어세이 디자인. 이러한 첫번째 연구에 대한 화합물 라이브러리는 Microsouce Discovery의 NINDS Custom Collection이었다. 상기 라이브러리는 96웰 플래이트에 1040 화합물로 구성되며, 이는 또한 운반체 합성에 대한 양성 대조구를 포함하였다(디부티릴 시클릭 AMP[dbcAMP], GDNF). 상기 라이브러리는 수백개의 판매 약물 및 생화학적 스탠다드의 동시 평가가 가능한 알려진 생물활성 화합물의 독특한 집합체이다. 각 화합물은 10-100μM의 최종 농도로 조사되었다. 모든 어세이는 2회 수행되었다. 전형적인 슬롯 블롯은 도 2C에 나타낸다.

데이타 분석. 모든 블롯은 레이저 밀도법(BioRad Image Quant)에 의해 분석되었으며 이중 포인트는 평균화되었다. 1040 화합물의 완료 결과 데이타세트를 도 2D에 나타내었다. 각 블롯은 양성 대조구 스탠다드(예, dbcAMP) 및 음성 대조구 스탠다드(예, 혈청, DMSO)를 포함하였다. 데이타는 수/문자 암호 시스템을 이용하여 Excel Spreadsheets에 보관되었다. 모든 양성 약물(단백질 발현에서 적어도 50% 증가된 것으로 정의된 양성)은 재평가되었다.

결과: 스크리닝된 약물은 시험관내에서 EAAT2 를 증가시킬 수 있다. 1040 화합물을 스크리닝한 후, 본 발명자들은 10개이상의 관련 화합물이 3.5-7배로 EAAT2 단백질 수준을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(참조 도 2E). 전체적으로, 본 발명자들은 일차 스크리닝에서 80 화합물이 2배이상으로 EAAT2를 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 리스트중, β-락탐 항생제가 과도하게 나타났으며 모든 화합물에서 관찰된 가장 공통적인 구조적 모티프이었다. 즉 15가지의 다른 베타 락탐 항생제가 활성적이었다. 도 2E에 나타낸 바와 같이, 이들 β-락탐은 모두 EAAT2 단백질 발현을 증가시킬 수 있었다. 후속적인 투여량 반응 분석(도 2F)은 3.5μM의 세프트리악손 단백질 발현에 대한 EC50을 나타낸다.

실시예 2: EAAT2 프로모터 리포터 활성화.

COS7 및 사람 성상 아교 세포성 프로모터 리포터 세포주.

EAAT2 프로모터( E2P ) 분리 및 리포터 생성. 2.7kb EAAT2 프로모터 프레그먼트는 Kpn1 및 Nco1으로 PAC 클론 RP4-683L5를 절단하여 획득되었다. 선행 연구는 서열, EAAt2 암호부위의 5'은 프로모터, 모티프를 가지며 시험관내에서 활성화될 수 있다고 보고하였다. 상기 프로모터는 pGL3-베이직 루시페라아제 리포터 벡터(Promega)(pE2P-GL3라 불리움) 또는 pEGFP-1 플라스미드(Clontech)(pE2P-eGFP라 불리움)내로 클로닝되었다. E2P는 또한 pLck-eGFP 플라스미드(eGFP 단백질을 그 멤브레인에 대해 표적하는 eGFP의 미리스토일레이티드 형태)내로 클로닝되었다. 최종적으로, E2P는 또한 pE2P-Luciferase-IRES-Lck-eGFP 플라스미드내로 클로닝되었으며, 이는 pE2P-GL3의 프레그먼트 E2P-Luciferase, 그 다음 IRES(내부 리보좀 엔트리 사이트), 그 다음 Lck-eGFP(pELILE라 불리움)를 갖는다. 이러한 최종 구조물에서 E2P는 루시페라아제 및 eGFP의 발현을 동시에 유도한다.

E2P - eGFP 및 Bac - EAAT1 - eGFP 트랜스제닉 마우스의 생성(도 3). 상기 어세이를 위한 스크리닝 세포주를 제공하기위해 본 발명자들은 EAAT2 프로모터 프레그먼트(E2P) 또는 전장 EAAT1 프로모터(Bac-EAAT1)를 발현하는 두가지 트랜스제닉 마우스를 성공적으로 생성하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명자들은 CNS에서 EAAT2 프로모터 리포터의 넓게 퍼진 발현을 입증하는 E2P 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 마찬가지로 본 발명자들은 Bac-EAAt1 마우스 및 발현세포를 생성하였다. 최근에 Heinz 그룹은 또한 본 발명자들의 마우스에 사용된 유사한 Bac 구조에 기초하여 EAAT1 Bac-리포터 베이즈드 마우스를 생성하였다.

스크리닝 어세이 . 리포펙타민 2000 시약이 Cos-7 및 HEK-293 세포를 형질감염시키는데 사용되었다. 사람 피질 성상 아교 세포는 본 발명자들의 동료 Dr. Avi Nath로부터 획득되었다. EpE2P-eGFP, pE2P-Lck-eGFP, 및 pELILE는 안정한 세포주의 확립을 이루게 하는 네오마이신 저항성을 갖는다. 사람 성상 아교 세포에 대해서, SV40이 상기 세포를 불멸화시키는데 사용되었다. 안정적으로 형질감염된 세포는 24-웰 플래이트상에 시딩되고, 48시간동안 10μM 화합물 용액으로 배양되고 형광 강도는 자동 판독기(SpectraGeminiXS)로 기록되었다.

결과: EAAT2 프로모터 활성화 화합물의 식별(도 4). 오리지널 NINDS 스크린으로부터, 본 발명자들은 EAAt2 프로모터를 강력하게 활성화시킬 수 있는 다수의 β 락탐 화합물을 확인하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대부분의 β 락탐은 알려진 양성 대조구, 디부티릴 시클릭 AMP보다 상당히 높게 EAAT 프로모터를 증가시킬 수 있었다. 모든 화합물은 1-10μM - 이러한 화합물이 표준 항균 치료(예, 세프트리악손)후 CNS에서 발견될 수 있는 농도범위의 약학 관련 농도에서 활성적이었다.

실시예 3: EAAT 발현/기능의 생체내 활성화.

단백질 발현/기능의 생체내 활성화는 시험 화합물로서 세프트리악손을 이용하여 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 평가될 수 있다.

세프트리악손은 뇌 GLT1 수준을 증가시킨다(도 5). 단계 1 및 2에서 확인된 약물이 실제로 생체내에서 EAAT 발현을 유도할 수 있는지 조사하기위해, 본 발명자들은 세프트리악손을 래트(n=5)에 매일 투여하였다. 세프트리악손은 CNS 수준, 200mg/kg ip로 이끄는 것으로 알려진 투여량으로 투여되었다. 만성적인 매일 투여의 5일후, 동물들은 희생되고 뇌조직이 회수되었다. 도 5A,B에 나타낸 바와 같이, 세프트리악손 치료는 뇌 GLT1 수준 뿐만아니라 이의 정상적 스플라이싱 산물, GLT1b의 3배 증가를 이끈다. 이러한 증가는 시험관내에서 나타난 프로모터 활성화 결과에 상당한 것이다(도 4). 성상 아교 세포 글루타메이트 운반체 GLAST 뿐만아니라 두가지 뉴런 글루타메이트 운반체, EAAC1 및 EAAT4에 대한 웨스턴 블롯은 세프트리악손 치료후 운반체 발현의 변화를 나타내지 않았다(도 5C,D). 마찬가지로, 구성 단백질, 액틴은 세프트리악손 투여에 의해 변화되지않았다(도 5A,C).

세프트리악손은 뇌 GLT1 수준을 증가시킨다(도 5). 단계 1 및 2에서 확인된 약물이 실제로 생체내에서 EAAT 발현을 유도할 수 있는지 조사하기위해, 본 발명자들은 세프트리악손을 래트(n=5)(및 마우스, n=3)에 매일 투여하였다. 세프트리악손은 CNS 수준, 200mg/kg ip로 이끄는 것으로 알려진 투여량으로 투여되었다. 만성적인 매일 투여의 5일후, 동물들은 희생되고 뇌조직이 회수되었다. 도 5A,B에 나타낸 바와 같이, 세프트리악손 치료는 뇌 GLT1 수준 뿐만아니라 이의 정상적 스플라이싱 산물, GLT1b의 3배 증가를 이끈다. 이러한 증가는 시험관내에서 나타난 프로모터 활성화 결과에 상당한 것이다(도 4). 성상 아교 세포 글루타메이트 운반체 GLAST 뿐만아니라 두가지 뉴런 글루타메이트 운반체, EAAC1 및 EAAT4에 대한 웨스턴 블롯은 세프트리악손 치료후 운반체 발현의 변화를 나타내지 않았다(도 5C,D). 마찬가지로, 구성 단백질, 액틴은 세프트리악손 투여에 의해 변화되지않았다(도 5A,C).

실시예 4: 화합물의 신경보호( neuroprotection ).

프로모터 활성화 약물에 의한 EAAT2의 증가된 발현에 의해 산출된 잠재적 신경보호를 평가하기위해, 본 발명자들은 글루타메이트 독성이 신경사에 기여하는지 시험관내에서 및 생체내에서 수회 실험을 수행하였다. 신경보호는 시험 화합물로서 β-락탐 항생제를 이용하여 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 평가될 수 있다.

이스케미아의 시험관내 모델 - 산소 글루코즈 결핍(도 7A) 산소 글루코즈 결핍(OGD)의 시험관내 모델은 잘 알려져 있으며 급성 신경 손상의 적절히 수용된 모델이다. 본 발명자의 이스케미아 시험관내 모델에서, 1시간의 산소 글루코즈 결핍(OGD)은 배양 뉴런에 치명적이며 과도한 글루타메이트를 포함하는 것으로 알려진 독성을 갖는다. 그러나, 이러한 배양은 치명적 조건 이전 24시간에 일시적 OGD(5분)로 예비조건화되는 경우, 세포사멸에 대한 뉴런의 극적이면서도 확고한 저항성이 존재한다. 이러한 데이타는 신경보호가 부분적으로 증가된 GLT1 발현에 기인할 수 있음을 나타낸다.

방법. 일차 피질 혼합 신경-글리얼 세포 배양물이 잉태 14-16일 CD1 마우스로부터 준비된다. 마우스 태아 피질로부터 이러한 배양물의 제조는 잘 설명되어 있다. 실험은 시험관내에서 13-15일에 수행된다. 상기 실험 조건에서 배양물은 산소 글루코즈 결핍(OGD), 이스케미아의 시험관내 모델에 적용되었다. 피질 세포는 대조 처리에 적용(배지는 글루코즈를 포함하는 변형 Earle's 발란스드 염 용액이며 5% CO₂, 95% O₂로 버블링되고, 처리군과 함께 변하나 OGD는 수행되지 않음)되거나 혹은 5분(아치사성)의 OGD에 적용(글루코즈가 없는 변형 Earle's 발란스드 염 용액이며 10% H₂, 85% N₂, 및 5% 산소로 버블링됨)된다. 37℃ 혐기 챔버를 이용하여 혐기성 조건이 이루어졌다. OGD는 배지를 산소화 성장배지로 다시 바꾸어 줌으로써 완료된다. 24시간후 피질 세포는 무처리되거나 1시간의 OGD 처리된다. 신경 생존은 형광 바이탈 염료 프로피듐 이오다이드(신경 사멸의 지표로서) 및 Hoechst 33342(총 뉴런수의 지표로서)로 염색한 후 컴퓨터-보조 세포 카운팅에 의해 측정되고 세포사멸의 퍼센트로서 나타난다. 보다 낮은 강도의 글리얼 핵 형광은 제거된다. 약물은 일차 실험 조건전 24시간에 첨가되고(세프트리악손 1μM) 따라서 1시간 OGD 시작전 48시간에 배지에 존재하였다. 1시간 OGD후, 세포는 약물이 없는 성장배지로 되돌려진다.

세프트리악손 신경보호. 배양시 베이스라인 신경 사멸은 도 7A의 무처리 컬럼(NT)에서 보이는 바와 같이 14%이다. 데이타는 한 실험의 각각의 웰에서 평균 신경 사멸로 표현된다. 1μM 세프트리악손이 이러한 배양물에 48시간동안 첨가되는 경우 베이스라인 세포사를 증가시키지 않는다(NT+ 세프트리악손). 배양이 1시간 OGD로 적용되는 경우, 신경 세포사는 예측되는 바와 같이, 약 50%로 극적으로 증가한다. 배양이 1시간 OGD전 24시간에 5분의 OGD로 미리조건화되는 경우, 퍼센트 세포사는 무처리 조건과 대등하며, 이는 이러한 조건에서 뉴런의 이스케믹 내성을 나타낸다. 이는 이스케믹 내성의 잘 알려진 현상이다. 중요하게, 1μM 세프트리악손이 1시간 OGD전 48시간에 첨가되는 경우 또한 뉴런 세포사의 퍼센트를 50% 에서 20%로 감소시켜 세포사로부터 뉴런을 보호한다(이스케믹 내성 신경보호와 유사함). 따라서, 세프트리악손 전처리는 이스케믹 내성에서 신경사멸을 보호하는 것으로 여겨진다.

만성 작동 신경퇴화의 시험관내 모델(도 7B). 비특이적 저해제 트레오히드록시아스파테이트(THA) 또는 TBOA를 이용하여 척수 기관형 배양에서 글루타메이트 운반체의 차단에 기초하여 만성 신경퇴화의 모델이 사용되었다. THA (또는 TBOA)를 이용한 배양물의 만성 배양은 세포외 글루타메이트의 만성적 증가 및 후속적인 작동 뉴런의 느린 사멸(4주에 걸친)을 일으킨다. 글루타메이트-매개 독성(및 치료)을 연구하기위해 기관형 척수 배양 모델이 개발되었다. 이는 전-임상적 약물 동정에 유용하였다(ALS에 대해 FDA 승인 약물인 릴루졸 및 보다 최근의 셀레콕시브 포함). 이러한 시스템에서 유전적 과발현(예, 트랜스펙션 혹은 트랜스제닉 과발현)에 의한 글루타메이트 운반체 GLT1의 증가된 발현)은 트랜스제닉 동물에서 작동 뉴런 사멸(나타내지 않음) 및 신경 사멸을 저해할 수 있다. Guo H., et al. Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532.

약물이 GLT 프로모터 활성화를 유도하는지 그리고 후속적인 GLT1 단백질의 과발현이 신경보호적인지 조사하기위해, 본 발명자들은 기관형 척수 파라다임을 사용하였다. 기관형 척수 배양물은 앞서 기술한 바와 같이 8-일-령 랫트 새끼의 요추 척수로부터 제조되었다. Rothstein JD, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:6591-6595. 세프트리악손은 배지를 갈때 첨가되었다. 배양물 제조후 처음 7일동안 약물이 첨가되지 않았다. 그 다음 THA가 3-4주내에 작동 뉴런의 사멸을 일으키는 100μM의 농도로 실험 배양물에 첨가되었다. 0-100μM의 최종 농도를 달성하기위해 여러가지 농도의 세프트리악손이 첨가되었다. 실험은 항상 대조구 척수 배양물(즉, 약물 무첨가), THA 단독, 세프트리악손 단독, 및 세프트리악손+ THA로 수행되었다. 각 농도의 세프트리악손에서의 실험은 3-5회 반복되었다. 표시된 농도의 THA 및 세프트리악손을 갖는 배지는 1주일에 2회 바뀌어졌다. 4주후, 배양물은 고정되고, 뉴로필리멘트(SMI-32, Strenberger)에 대해 면역염색되어 라지 벤트럴 혼 작동 뉴런을 정량하였다(이 시스템에서 작동 뉴런 생존에 대해 잘 확립된 방법).

세프트리악손에 의한 신경보호. 도 7B에 나타낸 바와 같이, 세프트리악손 치료는 투여량 의존 방식에서 작동 뉴런 손실을 억제하였다. 예비적인 데이타- 단계 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 이러한 농도의 세프트리악손은 GLT1 단백질 및 기능을 적어도 3배 증가시킨다. 중요하게, 이러한 연구에 사용된 농도는 세프트리악손의 경구/비경구 투여로 이룰 수 있는 범위내이다(1-4그람/일). 현저하게, 신경보호는 GLT-1 널 마우스로부터 제조된 배양물에서 발견될 수 없다.

G93A SOD1 마우스에서 작동 뉴런 질병의 발병 및 진전에 대한 세프트리악손의 생체내 신경보호-효과(도 7C,D)

세프트리악손이 글루타메이트 운반체의 변환된 발현을 포함하는 질병 모델에서 신경퇴화를 변환시킬 수 있는지 조사하기위해 G93A SOD1 마우스를 세프트리악손으로 처리하였다. 여러 연구에서 이러한 마우스 모델에서 과도한 글루타메이트에 대한 기여 역할 및 신경보호 전략에서 글루타메이트 수용체 또는 운반체 조절에 대한 역할에 대해 보고하였다. Guo H., et al. Hum Mol Genet. 2003; 12:2519-2532. 트랜스제닉 접근에 의한 적당한 과발현은 발병 및/또는 생존을 변화시킬 수 있다. 또한, 최근 연구는 예를들어, 발병시점과 같은 약물의 늦은 투여가 보다 치료적일 수 있다고 제시하였다.

치료 파라다임 . G93A SOD1 마우스[(B6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J, high expresser]가 약 12주령에 시작하여 세프트리악손(200mg/kg ip)으로 처리되었다. 약물 처리된 동물(n=20) 및 식염수 주입된 대조군(n=20)은 매일 생존에 대해 모니터링되고 매주 그립 강도(Columbus Instruments) 및 체중에 대해 앞서 기술된 바와 같이 모니터링되었다.

세프트리악손은 그립 강도의 손실을 지연시키며 생존을 증가시킨다. 도 7C에 나타낸 바와 같이, 세프트리악손 처리는 현저히 근육 강도의 손실을 지연시켰다. 이러한 효과는 처리후 7일내에 관찰되었으며 4주동안 지속되었다. 18주에 강도 보존은 소실되었다. 유사한 방식으로, 상기 약물은 또한 마우스의 전체 생존을 약 7-10일 증가시켰다(도 7D). 이러한 효과는 상대적으로 작지만, 상기 약물은 발병 시점에 주어져 작은 효과가 임상적 유의도를 가질 수 있다. 본 연구에서 나타난 신경보호는 상기 약물의 일반적인 항생제 특성에 기인한다고 보기 어려우며, 그 이유는 마우스가 현저한 근육 강도 효과가 나타났을때 12-16주에 어떠한 감염도 갖지 않았기 때문이다.

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본 발명의 다수의 구현이 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 여러가지 변형이 본 발명의 정신 및 견지를 벗어나지 않고 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현은 하기 청구범위의 견지내에 포함된다.

<110> THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY <120> Glutamate Transport Modulatory Compounds and Methods <150> US60/450,227 <151> 2003-02-26 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 4696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaaaccacca gggttgttgc tggaaagttt ttattcctgg attaaaggca aggatcagcc 60 tgtattttag caatttcttt ttaaggttaa tgtcccatgc gccacctact tctggggccc 120 tgttccagcc cttctttatg tgttgaccac ttctaggtcc agcacttccc aactctgctg 180 cgcagtggac tcaatcccct gggaagtcct ttaaaaatgc ccaagtcagc ccccgcctac 240 ccccaaagat gcatggacca gaaatctctg aaaggtggcc tgagtattac tattttctaa 300 aaggctctct cagaccattt taatgggcac ccagtgttga aaataactgc tccagtttgt 360 taaaaaataa ttggtgtgaa tattggcaaa agccctctgg cacaaagaaa gagaaccagt 420 ttcttctagc taatgtttgt tagccagaat tatctgtggc atagtccatg tgacttaata 480 gacctggtct tccagggcag ctgaatgcaa atgtttctca cgtgtagaac gggatgtcag 540 ggcttacaga gaaagtggga aactggaatg atgactccat ctaattcggc catgctggat 600 gattcacctg gattctctca tgtcctgagc attgaaaaca taatgaagag tttttaaatt 660 gaatgtttaa 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tctcgctgaa taattgaagg 1620 ccagagattt attcgagctt cggcggggga gggagcgcag ctgggccgcg tttaggctgc 1680 accacccgcg tgtttcagcc gctcgactcc gctggacctg ggacccccag acgtgggagg 1740 atggggtggg tgtgcctgcc tgtgagtttg ggggtgagtg tgagctgaag cgggtgctcc 1800 ggggagtgag gagggagcgc caggggctgc tccagggagg cggagacgga ggggcatccc 1860 gggtctccgc gcggtcgcct gcgcttcacc ccgcacgggg tgacctgggg ccacgcgggc 1920 ttcaggggaa acaatagcta ctccttagat cctgggctcc tgccaccggc tgcccaagcc 1980 ttcccggacg agcggcgggg cctcttttct tatttggcta atttatggcg agaggctggg 2040 ggaagggatg gcagaggagg gaccgcgact gaaaatgggg gcggggggcg gcggttaaag 2100 gagttgcccg aggcggcggc gcgggtgatg tcagctctcg acgaaaatag agagggatcg 2160 cctgcaaatc cccagctccg gcggggctaa accttgcaat ccctccctgg ccggcgccga 2220 gccagagcgc agcggcctcc accgcctccc caggcgcgca cacacccgca cacgcgcacg 2280 cacgctcacc gtcctctgcc accactctct gctcccgcca ctcgccgcgc ccgcgagccc 2340 cgcagcaaag cacaggtggc agcggctgca ggggcgcatc gccggcgtgc gccctcctgc 2400 agccctgggc gcatcgctct ctcggggaag ccaccctcgg agcccccgga gctc 2454 <210> 4 <211> 861 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cccgggtctc cgcgcggtcg cctgcgcttc accccgcacg gggtgacctg gggccacgcg 60 ggcttcaggg gaaacaatag ctactcctta gatcctgggc tcctgccacc ggctgcccaa 120 gccttcccgg acgagcggcg gggcctcttt tcttatttgg ctaatttatg gcgagaggct 180 gggggaaggg atggcagagg agggaccgcg actgaaaatg ggggcggggg gcggcggtta 240 aaggagttgc ccgaggcggc ggcgcgggtg atgtcagctc tcgacgaaaa tagagaggga 300 tcgcctgcaa atccccagct ccggcggggc taaaccttgc aatccctccc tggccggcgc 360 cgagccagag cgcagcggcc tccaccgcct ccccaggcgc gcacacaccc gcacacgcgc 420 acgcacgctc accgtcctct gccaccactc tctgctcccg ccactcgccg cgcccgcgag 480 ccccgcagca aagcacaggt ggcagcggct gcaggggcgc atcgccggcg tgcgccctcc 540 tgcagccctg ggcgcatcgc tctctcgggg aagccaccct cggagccccc ggagctcccc 600 gccaagcgcc atccccgcgg gcggagggga gcgcgggtcg cgcgccgtgg agagccggga 660 cgcggattag cgcccgcagg agcctcctgc gcccgttgag gcgctaaagg gcttaccccg 720 gaggcgggtg gaagggcggg cagaggctcc tcttaaatac cgctcccggc cgcacttcgc 780 gctcaccccg gcgtccgctt tctccctcgc ccacagctgc cggatagtgc tgaagaggag 840 ggggcgttcc ccagaccatg g 861

Claims

적어도 하나의 EAAT2 발현 촉진제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 EAAT2 단백질 발현 증가 방법.
제 1항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는

a) cDNA 분자 및 SEQ ID NO:1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 프로모터리스 리포터 벡터, 또는 이들의 컴플리먼트, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포로부터 mRNA 발현을 지시할 수 있는 핵산 분자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 mRNA 또는 상기 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, EAAT2 단백질 발현은 생체내에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, EAAT2 단백질 발현은 시험관내에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 항생제, 항-고혈압제, 신경전달물질, 항균제, 항-염증제, 스테로이드 유도체, 및 항-패혈제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 적어도 하나의 고리 황원자, 삼차 아민, 사차 암모늄염, 스테로이드, 폴리올, 폴리케타이드, 구아니딘, 우레아, 또는 아르세네이트를 포함하는 헤테로사이클로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 삼차 아민, 사차 암모늄염, 폴리케타이드, 스테로이드성 고리 시스템 및 하나 또는 두개의 고리를 갖는 헤테로사이클, 적어도 하나의 황 고리 원자 및 0, 1, 또는 2 질소 고리원자로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소(structural element)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 200%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 갈라민, 페릴릭 산(-), 아미트립틸린 하이드로클로라이드, 테트라카인 하이드로클로라이드, 디소피라마이드 포스페이트, 시소마이신 설페이트, 케타민 하이드로클로라이드, 실라진, 비큐큘린, 플루비프로펜, 세파드록실, 바캄피실린 하이드로클로라이드, 티아프리드 하이드로클로라이드, 노르에틴드론 아세테이트, 베르갑텐, 카리소프로돌, 시티올론, 피록시캄, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 퍼리그길레이트 소디움, 알벤다졸, 이하이드로스트렙토마이신 설페이트, 알로인, 페노프로펜, 플루타마이드, 암피실린 소디움, 암프로리움, 스파테인 설페이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 알렉시딘 하이드로클로라이드, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 세팔로틴 소디움, 데이드제인, 메클리진 하이드로클로라이드, 린단, 브로모프라이드, N-(3-트리플루오로메틸페닐)피퍼라진 하이드로클로라이드(TFMPP), 에녹솔론, 이프라트로피움 브로마이드, 부펙사막, 글루코노락톤, 리팜핀, 하이드록시클로로퀸, 콜레오포르신, 클로록신, 옥시도파민 하이드로클로라이드, 캄토테신, 나프실린 소디움, 미아세린 하이드로클로라이드, 아세타르솔, 프릴로카인 하이드로클로라이드, 디페록사민 메실레이트, 헥사메토늄 브로마이드, 메테나민, 파락산틴, 하말올 하이드로클로라이드, 피리티온 아연, 하이드로코르티손 부티레이트, 아세타졸아미드, 아미노글루테티미드, 메클로펙녹세이트 하이드로클로라이드, 2-펜프로필아미노-5-니트로벤조산(NPPB), 아미오다론 하이드로클로라이드, 아코니틴, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 및 디오스민으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 300%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 및 옥시메타졸린 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 400%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 및 반코마이신 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 600%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 및 퀴나프릴로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
적어도 하나의 EAAT2 발현 촉진제를 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 세포외 글루타메이트의 농도 감소 방법.
제 16항에 있어서, 상기 포유류는 이러한 치료가 요구되는 것으로 확인된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는

a) cDNA 분자 및 SEQ ID NO:1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 프로모터리스 리포터 벡터, 또는 이들의 컴플리먼트, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포로부터 mRNA 발현을 지시할 수 있는 핵산 분자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 mRNA 또는 상기 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, EAAT2 단백질 발현은 생체내에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, EAAT2 단백질 발현은 시험관내에서 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 항생제, 항-고혈압제, 신경전달물질, 항균제, 항-염증제, 스테로이드 유도체, 및 항-패혈제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 적어도 하나의 고리 황원자, 삼차 아민, 사차 암모늄염, 스테로이드, 폴리올, 폴리케타이드, 구아니딘, 우레아, 또는 아르세네이트를 포함하는 헤테로사이클로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 삼차 아민, 사차 암모늄염, 폴리케타이드, 스테로이드성 고리 시스템 및 하나 또는 두개의 고리를 갖는 헤테로사이클, 적어도 하나의 황 고리 원자 및 0, 1, 또는 2 질소 고리원자로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 200%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 갈라민, 페릴릭 산(-), 아미트립틸린 하이드로클로라이드, 테트라카인 하이드로클로라이드, 디소피라마이드 포스페이트, 시소마이신 설페이트, 케타민 하이드로클로라이드, 실라진, 비큐큘린, 플루비프로펜, 세파드록실, 바캄피실린 하이드로클로라이드, 티아프리드 하이드로클로라이드, 노르에틴드론 아세테이트, 베르갑텐, 카리소프로돌, 시티올론, 피록시캄, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 퍼리그길레이트 소디움, 알벤다졸, 이하이드로스트렙토마이신 설페이트, 알로인, 페노프로펜, 플루타마이드, 암피실린 소디움, 암프로리움, 스파테인 설페이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 알렉시딘 하이드로클로라이드, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 세팔로틴 소디움, 데이드제인, 메클리진 하이드로클로라이드, 린단, 브로모프라이드, N-(3-트리플루오로메틸페닐)피퍼라진 하이드로클로라이드(TFMPP), 에녹솔론, 이프라트로피움 브로마이드, 부펙사막, 글루코노락톤, 리팜핀, 하이드록시클로로퀸, 콜레오포르신, 클로록신, 옥시도파민 하이드로클로라이드, 캄토테신, 나프실린 소디움, 미아세린 하이드로클로라이드, 아세타르솔, 프릴로카인 하이드로클로라이드, 디페록사민 메실레이트, 헥사메토늄 브로마이드, 메테나민, 파락산틴, 하말올 하이드로클로라이드, 피리티온 아연, 하이드로코르티손 부티레이트, 아세타졸아미드, 아미노글루테티미드, 메클로펙녹세이트 하이드로클로라이드, 2-펜프로필아미노-5-니트로벤조산(NPPB), 아미오다론 하이드로클로라이드, 아코니틴, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 및 디오스민으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 300%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 및 옥시메타졸린 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 400%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 및 반코마이신 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 29항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 600%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 및 퀴나프릴로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 포유류는 영장류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 50% 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 75% 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
ETTAT2 발현을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 EAAT 발현 촉진제를 치료학적 량으로 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 변환된 글루타메이트 전달과 관련된 질환 또는 질병으로부터 고통받거나 민감한 포유류를 치료하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 포유류는 이러한 치료가 요구되는 것으로 확인된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 36항 또는 제 37항에 있어서, 상기 변환된 글루타메이트 전달과 관련된 질환 또는 질병은 신경학적 질병인 것을 특징으로 하는 방법.
제 38항에 있어서, 상기 신경학적 질병은 파킨슨병, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 다중 경화증, 근위축성 측삭경화증, 급성 신경질환, 간질, 척수외상, 뇌외상, 글라우코마, 또는 정신의학 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항 내지 제 39항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는

a) cDNA 분자 및 SEQ ID NO:1, 2, 3 또는 4의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 프로모터리스 리포터 벡터, 또는 이들의 컴플리먼트, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 세포로부터 mRNA 발현을 지시할 수 있는 핵산 분자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 mRNA 또는 상기 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 따라 mRNA 또는 cDNA로 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 항생제, 항-고혈압제, 신경전달물질, 항균제, 항-염증제, 스테로이드 유도체, 및 항-패혈제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 적어도 하나의 고리 황원자, 삼차 아민, 사차 암모늄염, 스테로이드, 폴리올, 폴리케타이드, 구아니딘, 우레아, 또는 아르세네이트를 포함하는 헤테로사이클로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 삼차 아민, 사차 암모늄염, 폴리케타이드, 스테로이드성 고리 시스템 및 하나 또는 두개의 고리를 갖는 헤테로사이클, 적어도 하나의 황 고리 원자 및 0, 1, 또는 2 질소 고리원자로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항 내지 제 43항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 200%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 갈라민, 페릴릭 산(-), 아미트립틸린 하이드로클로라이드, 테트라카인 하이드로클로라이드, 디소피라마이드 포스페이트, 시소마이신 설페이트, 케타민 하이드로클로라이드, 실라진, 비큐큘린, 플루비프로펜, 세파드록실, 바캄피실린 하이드로클로라이드, 티아프리드 하이드로클로라이드, 노르에틴드론 아세테이트, 베르갑텐, 카리소프로돌, 시티올론, 피록시캄, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 퍼리그길레이트 소디움, 알벤다졸, 이하이드로스트렙토마이신 설페이트, 알로인, 페노프로펜, 플루타마이드, 암피실린 소디움, 암프로리움, 스파테인 설페이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 알렉시딘 하이드로클로라이드, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 세팔로틴 소디움, 데이드제인, 메클리진 하이드로클로라이드, 린단, 브로모프라이드, N-(3-트리플루오로메틸페닐)피퍼라진 하이드로클로라이드(TFMPP), 에녹솔론, 이프라트로피움 브로마이드, 부펙사막, 글루코노락톤, 리팜핀, 하이드록시클로로퀸, 콜레오포르신, 클로록신, 옥시도파민 하이드로클로라이드, 캄토테신, 나프실린 소디움, 미아세린 하이드로클로라이드, 아세타르솔, 프릴로카인 하이드로클로라이드, 디페록사민 메실레이트, 헥사메토늄 브로마이드, 메테나민, 파락산틴, 하말올 하이드로클로라이드, 피리티온 아연, 하이드로코르티손 부티레이트, 아세타졸아미드, 아미노글루테티미드, 메클로펙녹세이트 하이드로클로라이드, 2-펜프로필아미노-5-니트로벤조산(NPPB), 아미오다론 하이드로클로라이드, 아코니틴, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 및 디오스민으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항 내지 제 45항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 300%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 46항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀄리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 반코마이신 하이드로클로라이드, 티아페니콜, 세프트리악손 소디움, 1,3-디프로필-8-시클로펜틸크산틴(DPCPX), 세파피린 소디움, 액티노스펙타신, 세포페라졸 소디움, 액시비신, 아세틸콜린, 클로람페니콜, 비다라빈, 아테놀롤, 옥시테트라시클린, 글라페닌, 및 옥시메타졸린 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항 내지 제 47항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 400%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 48항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 퀴나프릴, 아목시실린, 프리디놀 메탄설포네이트, 아클로마이드, 및 반코마이신 하이드로클로라이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항 내지 제 49항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 EAAT2 생산을 비-조절된 생산에 비해 600%이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 50항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린 V 포타슘, 디퀼리늄 클로라이드, 및 퀴나프릴로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 포유류는 영장류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 52항에 있어서, 상기 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 50% 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 상기 세포외 글루타메이트 농도가 비-조절된 농도에 비해 적어도 약 75% 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항, 제 16항, 또는 제 36항중 어느 한 항에 있어서,

a) EAAT2를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 시험 화합물의 존재하에서 시험 화합물의 부재하에 비해 상기 세포에서 EAAT2의 발현이 조절되는지 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 따라 EAAT2의 발현을 조절하는 화합물을 신경학적 혹은 정신의학적 질환을 치료할 수 있는 화합물로 식별하는 스크리닝 어세이에 의해 식별되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항, 제 16항 또는 제 36항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 β-락탐 항생제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항, 제 16항 또는 제 36항중 어느 한 항에 있어서, 상기 EAAT2 발현 촉진제는 페니실린류, 세팔로스포린류, 카바페남류 또는 모노박탐류 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
EAAT2 발현을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 EAAT 발현 촉진제를 치료 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 글루타메이트 신경전달을 조절하는 포유류 치료방법.
제 59항에 있어서, 상기 포유류는 이러한 치료가 요구되는 것으로 확인된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 포유류는 학습 또는 기억과 관련된 컨디션을 위한 치료가 요구됨을 특징으로 하는 방법.
제 61항에 있어서, 투여는 학습, 기억 향상 또는 인지력 향상을 위한 것임을 특징으로 하는 방법.