JP6154282B2 - 神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤 - Google Patents
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Description
外因性の傷害による脊髄損傷に代表される不随やアルツハイマー病、パーキンソン病といった神経変性疾患に対する治療方法がないことも、中枢神経における再生能が無いことが一つの原因である。一方で、末梢神経は再生能を有しており、一旦切断された後も軸索が再生し機能が回復する。しかしこの場合にも再生に要する期間は数ヶ月から1年以上と長期間を要する。このため、患者にとっての苦痛は大きい。
また神経の再生に長期間を要するために、その間に神経細胞が死滅し機能回復に至らない場合も多い。このように再生能を有する末梢神経の場合も、脳や脊髄といった中枢神経系の環境では全く伸長することはできない。そのため、中枢神経系には神経の伸長を阻止する物質が存在していることが推測されている。この中枢神経系に存在する神経再生阻害物質を抗体などで抑制すると、中枢で一部の神経再生が起こり、機能の回復も見られる。最近、この中枢神経再生阻害因子としてNogoが発見された(非特許文献1:Nature 403, 434, 2000、非特許文献2:Nature 403, 439, 2000)。しかし、Nogoを阻害することによって、再生する神経線維は一部であり、他の再生阻害物質が存在するのではないかと考えられているが、インビボで神経の再生阻害に働いている因子の一つとしてセフォマリンも推定されている(非特許文献3:Cell 75, 217, 1993、非特許文献4:Cell 75, 1389, 1993)が、これまで明らかにされていない。
(1)以下に示す化学式I〜Vで表される化合物のいずれか1以上を有効成分として含む神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。
化学式I〜化学式Vの化合物はいずれも、コムギ末粉から単離され、メトキシヒドロキノンまたはジメトキシヒドロキノンにグルコースまたは、オリゴ糖が結合した配糖体構造を有している。化学式Iの化合物は、メラニン生成抑制剤として公知である(特開平5−310547号公報参照)。しかし化学式Iの化合物がコムギ末粉に含有されていることは知られていない。化学式II〜Vの物質もいずれも配糖体として公知であるが、コムギ末粉に含まれていることは知られていない。
化学式1〜Vの化合物は、一般的な化学合成法によって合成することもできる。またコムギ末粉から抽出することもできる。
なお本発明でいう神経新生とは神経幹細胞または神経前駆細胞に作用して細胞を増殖性、神経を新生させる作用をいう。
医薬用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。本発明に関わる末梢神経障害改善剤において、卵黄由来ホスファチジルセリンの投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択・決定されるが、例えば一日あたり0.01mg/kg〜1000mg/kg体重程度とされ、一日数回に分けて投与してもよい。
神経新生剤の摂取量は、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、適宜選択・決定されるが、例えば一日あたり0.01mg/kg〜1000mg/kg体重程度とされる。
1.コムギ末粉水抽出物の調製
コムギ末粉1gに対して水5mLを添加し、1分30秒超音波処理を行った。次いで、遠心機で1,000rpm×10分遠心後、上清を回収し、凍結乾燥機で水分を飛ばしたものを水抽出物とした。
コムギ末粉水抽出物からG3000S(東ソー株式会社)オープンカラムを用いて、5、10、15、20および100%エタノールにて分画した(5、10、15、20および100%エタノール画分)。得られた分画は、凍結乾燥して試験に用いた。
下記方法で神経幹/前駆細胞(NSC/NPCs)を得た。
(1)妊娠14〜18日目のラットを購入し、頸椎脱臼後、胎仔を取り出す。
(2)クリーンベンチ内で脳を採取し、大脳皮質および海馬部分を選別して軟膜を取り除く。
(3)PBS(−)上で細断した後、遠沈管に移し、2.5%トリプシン1mL、5%グルコースPBS(−)1mL、1% DNaseI溶液100μLを加えて全量を10mLとし、37℃のインキュベーター内で10分間、時々撹拌しながらインキュベートする。
(4)Horse serum 5mLを加えて低速遠心機で800rpm、3分間遠心して上清を捨てた後、DMEM/Ham’s F12(10%FBS、1%PS)を10mL加え、細胞塊がなくなるまでピペッティングする。
(5)細胞懸濁液をCell strainerに通して細胞塊を取り除く、DMEM/Ham’s F12+10% FBS培地で培養する。
(6)培養2日後にArac 10μMを添加し、増殖性の細胞を変性死させる。
(7)さらに2日後,N2 supplementおよび20ng/mL bFGFを添加したDMEM/Ham’s F12に換える。
(8)コンフルエントになった後トリプシン処理により細胞を剥がし、試験に用いる。
NSC/NPCsとして使用するため、神経幹/前駆細胞マーカーであるnestinが発現していることを確認した。
神経新生活性試験を実施する前に、上記で得た細胞について、1次抗体にRat nestin antibody(R&D Systems)、2次抗体にAlexa Fluor 488 anti−goat IgG(Life Science)を用い、蛍光抗体法によって、NSC/NPCsが生成していることを確認する。
プレート播種およびMTTアッセイにより活性を確認する。
ポリ−L−リジンコートした96wellプレートに、前記のNSC/NPCsを2×103cell/well播種した。1日後、成長因子(bFGF)を除いた培地に置き換え、試験サンプルを添加して3日間培養した。
被験物質添加培地からMTT培地に交換して3時間インキュベートした後、培地を除去し、dimethyl sulfoxideを添加した。沈殿したホルマザンを溶解させた後、570nmの吸光度を測定した。被験物質の溶媒のみを添加したウエルの吸光度を対照として、吸光度比の上昇した被験物質を神経新生活性を有する化合物と判定する。
前記の試験試料は、次に示す分画操作によって得られた各分画物を下記表1の濃度になるように各ウエルに添加した。
前記の分画で最も活性の高い5%エタノール分画物を用いて、ODSカラム(株式会社資生堂)を装着したLC/MS/MS分析装置により分離を行った。活性画分はFr1〜6の6つのピークに分離できた。
クロマトグラムを図3に示す。
各フラクション(Fr1〜6)は凍結乾燥し、神経新生活性を測定した。神経新生活性測定に当たっては陽性対照として神経新生作用を有することが知られている線維芽細胞増殖因子(FGF)を最終濃度20μg/mLになるように添加した。
分離できたフラクション1〜6についてLC/MS/MS分析装置のマススペクトルデータ及びNMRによる解析を行い構造決定した。各フラクションの構造を図5に示す。
フラクション1はアデノシン、フラクション2はタキオシドという慣用名を持つ化合物であった。
フラクション1を除くすべての物質は、神経新生作用が知られていない化合物であった。
Claims (2)
- 以下に示す化学式I〜Vで表される化合物のいずれか1以上を有効成分として含む神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。
- 請求項1に記載の化学式I〜Vで表される化合物のいずれか1以上を有効成分として含むコムギ末粉抽出物からなる神経幹細胞又は神経前駆細胞の増殖促進剤。
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