KR101393204B1 - 뇌 손상을 진단하기 위한 마커로서의 오르니틴 트랜스 카바밀라제(ｏｔｃ)의 용도 - Google Patents

뇌 손상을 진단하기 위한 마커로서의 오르니틴 트랜스 카바밀라제(ｏｔｃ)의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌 질환의 도메인에 관한 것으로서, 개체 특히, 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴화성(neurodegenerative) 질환 환자에서의 뇌 변화를 진단하는 신규한 마커 및 진단방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체에 있어서, 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환을 치료하는 새로운 의약을 확인하는 목적뿐만 아니라, 상기 질환이 진행될 가능성을 측정하는 도구를 제공한다. 특히, 본 발명은 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 유전자의 -389 및 -241 위치에서의 2가지 SNP(single nucleotide polymorphism)의 조합에 기초한 유전자 마커를 제공한다.
뇌 질환, 알츠하이머, 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC), SNP(single nucleotide polymorphism)

Description

뇌 손상을 진단하기 위한 마커로서의 오르니틴 트랜스 카바밀라제(ＯＴＣ)의 용도{Use of the ornithine transcarbamylase(OTC), as a marker for diagnosing brain damages}
본 발명은 뇌 질환의 도메인에 대한 것으로 개체에서 특히, 알츠하이머 질환과 같은 뇌 퇴행성 질환 환자에서 뇌 변화를 진단하는 신규한 마커 및 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환을 치료하는 새로운 의약을 개발하고자 하는 목적뿐만 아니라, 개체에서 상기 질환이 진행될 가능성을 측정하는 도구를 제공한다.
알츠하이머 질환(AD)는 복잡한 다요소적인 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환이며, 노인들 사이에 치매의 손꼽히는 원인이다. 65세 이상 인구의 약 5%는 AD로 영향받고 있으며, 75세 이후에는 약19%, 85세 이후에는 47%로 가파르게 상승한다.
현재, 미국에는 약 4백만명의 AD 케이스, 프랑스에는 약 85만명, 세계적으로 1,200~1400만의 AD 케이스가 있다. 거의 50%가 일종의 치매에 걸린 85세 이상의 그 룹은 유럽 및 아메리카 인구의 가장 증가하는 부문의 하나이다. 그러나, 5년의 지연이 약 50%로 치매의 확산을 낮출 수 있으며, 드라마틱한 유행의 잠재적인 조절을 가능하게 한다는 모델이 제시되었다. 그러한 가능성은 (i) 초기 진단 및 (ii) 치료의 효능의 2가지 필수적인 이슈를 불러일으킨다.
현재까지, 중요한 기술 향상이 이루어졌음에도 불구하고, 질환의 초기단계에서 진단을 하는 것은 여전히 어렵다. 더욱이, 주로 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase) 억제자(현재 3가지 분자가 등록) 및 최근에는 NMDA 수용체의 길항제(antagonist) 등 인지기능의 일부 징후적인 치료가 가능함에도 불구하고, 치유력이 있는 치료제는 없다. 그러나, 환자가 혜택을 볼 수 있는 이러한 전체 치료제는 기껏해야 질환의 악화로 인한 불가피한 의존을 늦추게하는 것을 가능하게 할 뿐이다.
결과적으로, 초기 진단 및 치료제는 밀접하게 연결되어 있다. 효과적인 치료를 제시하기 위해서는 질병의 초기 단계에서의 진단을 확립하고, 심지어 인프라-클리닉 수준에서 첫번째 병리 징후을 탐지하는 것이 필수적인 것으로 보인다.
나이들어가는 개체에서, 대개 기억 및 인지 장애가 관찰되나 반드시 병적인 인지의 퇴보와 관련된 것은 아니다. 이러한 장애는 단지 독립적이거나 사소한 문제의 표시일 수 있거나, 또는 반대로, 개체의 인지 및 병리적 변화를 나타낼 수 있다. 이러한 체제내에서 "경도 인지 장애(mild cognitive impairment) 또는 MCI"의 개념이 일반적인 노화와 치매사이의 전환 영역에 위치하는 개체를 특징짓는 것으로 제시되었다. 이러한 환자는 치매 클리닉의 범주에 들지 않으면서 그들의 인지 수행 은 객관적인 퇴보를 나타낸다. 이러한 환자로의 전환율은 약 1년에 14%이며, MCI 경우의 50%가 3년 후에 치매로 발전될 것이다. 더 긴 기간의 비전을 갖게하는 것은 불가능하나, 이러한 MCI 경우의 놓칠 수 없는 부분은 치매로 발전되지 않을 것이다(5년 후에 약20%).
이러한 빈도에도 불구하고, 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환의 분자 유전적 기초는 불명확하다. 알츠하이머 질환에 대해서는, 2종류의 AD가 있음이 확립되었다; (i) 가족에서 진행되는 가족성 AD(FAD), (ii) 분명한 가족력이 존재하지 않는 단발성(sporadic) AD. 가족성 AD의 초기-개시 형태는 전체 케이스의 5% 미만을 차지하며, 이것은 3가지 다른 유전자의 돌연변이와 관련되어왔다: 21번 염색체의 아밀로이드(amyloid)전구체 단백질(APP) 유전자, 14번 염색체의 프리세닐린 (presenilin 1, PS1)유전자 및 1번 염색체의 프리세닐린 2(presenilin 2, PS2)유전자(Cruts and Van Broeckhoven, 1998). 후발성의(Late-onset) 단발성 AD의 병인은 환경적 요소 및 수많은 유전자의 가능한 관련성 및 상호작용으로 더욱 복잡하다. 아포리포프로테인 E(Apolipoprotein E, APOE), 특히, APOE ε4 대립유전자는 최근 발병(late-onset)AD에서 유전적 위험의 대략 20%를 차지하는 강한 감염성 마커로서 확립되어 왔다(Kamboh, 2004). 그러나, APOE ε4 대립유전자는 AD의 진행에 필수적이지 않으며 충분하지 않기 때문에, APOE ε4 단독 또는 APOE ε4와 함께 작용하는 유전적 및/또는 환경적 요인이 AD의 위험을 변경시킬 수 있다. 최근에, late-onset AD에서의 게놈에 걸친 연관 또는 연관 불평형 연구(linkage disequilibrium, LD)가 많은 염색체에 있는 추정되는 AD의 다양한 유전자의 존재에 대한 증거를 제공해왔다. 그러나, 주어진 염색체에서 추정되는 AD 유전자의 일반적인 위치는 넓은 영역을 차지한다. 더욱이, 이러한 영역 중의 하나는 관심있는 여러가지 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 연관 연구에 기초한 유전자의 위치의 추정이 복잡한 질환의 경우 30cM 이상으로 다양할 수 있기 때문에, 이러한 발견이 염색체 내에 다양한 유전자의 존재를 나타내는 것인지 또는 그들이 관심 영역내에서 변화 가능성을 나타내는 것인지 명확하지 않다(Roberts et al., 1999).
이러한 관심 영역 내에 위치한 후보 유전자의 선택을 위해서는 우선, 유전자의 빠른 확인을 위해 유전자 지도 정보 데이터와 유전자 발현 프로파일링 데이터를 결합시키는 것이 알맞은 확고한 방법이 될 것이다. 이러한 가정은 2가지 관찰로부터 기인한다:
(i) 수많은 유전자의 발현은 AD 병인(aetiology)동안 변화된다(Blalock et al., 2004; Brown et al., 2002; Colangelo et al., 2002; Li et al., 2003; Loring et al., 2001);
(ii) 이미 AD에 관여하는 유전자내에서의 질적 다양성(즉, 코딩 돌연변이) 뿐만 아니라, 이러한 동일한 유전자의 발현에 있어서의 양적 다양성도 질병의 유전적 결정원인임을 보여주고 있다. 가령, APOE, PS1 및 PS2 유전자의 프로모터 서열내의 기능적인 다형성(polymorphisms)은 진행되는 AD의 증가하는 위험과 관련이 있어왔다(Lambert et al., 2002; Riazanskaia et al., 2002; Theuns et al., 2000). A similar involvement of APP has been discussed (Lahiri et al., 2005).
결과적으로, 본 발명자는 환자와 대조군 사이에 다른 발현을 나타내며, 이전의 게놈 스캔에 의해 밝혀진 관심 영역 중 하나에 위치한 유전자가 AD의 잠재적인 후보 유전자를 구성할 수 있으리라는 가정을 하였다. '유전자 수렴(genomic convergence)' 접근을 개발하기 위해, 이전에 게놈 스캔 연구(Lambert et al., 2003)에서 밝혀진 위험 관련 loci(9이상의 다른 염색체)에 포함된 2741 ORFs를 스크린하는 home-made microarray(스위스 국내 유전자칩)을 개발하였다. AD와 관련된 12 환자와 12 대조군의 뇌조직에서의 이러한 발현 프로파일링으로 인해 106개의 다르게 발현되는 유전자를 선택할 수 있다. 이러한 106개의 조절된 유전자 중에, 11개는 X 염색체에 위치하였다.
놀랍게도, 본 발명자는 이러한 유전자 중의 하나가 AD 케이스의 뇌에 강하게 과발현되고 있는 반면, 대조군에서는 발현되지 않는다는 것을 발견하였다. 이러한 유전자는 Xp21.1에 위치한 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)유전자이다. OTC는 우레아 사이클의 핵심 효소이며, '정상적인 뇌(normal brain)'에서는 기능하지 않는다(Felipo and Butterworth, 2002; Wiesinger, 2001).
건강한 개체에서는, OTC는 거의 간세포 미토콘드리아에서만 발현되며, 간 특이적인 마커로서 간주된다. 이 단백질의 혈청 수준이 간염(hepatitis), 간경변(cirrhosis) 및 암과 같은 간 질환 환자에게서 증가됨을 알 수 있다. 건강한 개체의 뇌에서 발현되지 않음에도 불구하고, 이러한 효소의 결핍은 신경 질환을 야기할 수 있다. 사실, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍의 일반적인 증상 중 하나는(이 보고서에서 매우 이질적임;heterogenous) 고암모니아성 코마(hyperammonaemic coma)이다(Gordon, 2003).
본 발명자들은 AD 개체 및 대조군에서 OTC 유전자를 심도있게 연구하였다. 또한, MCI, AD 및 non-AD 치매 개체에서 뇌척수액에 있는 OTC 활성의 수준을 연구하였으며, 아래 실험 부분에 공개된 그 결과는 뇌에서의 OTC 발현 뿐만 아니라, OTC 유전자가 알츠하이머 질환 및 다른 뇌 질환에 대한 관련있는 감염 및/또는 진단 마커임을 나타낸다.
본 발명의 첫번째 구현예는 개체에서 뇌 변화를 인 비트로(in vitro) 진단하는 방법으로서, 상기 개체로부터 뇌척수액 샘플에서 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)를 탐지하는(및/또는 정량하는)단계를 포함한다. 본 발명의 문맥에서, "뇌 변화(brain alteration)"는 일종의 뇌 퇴화 특히 치매를 가르킨다.
본 발명에 따른 특별히 관심있는 방법은 뇌 질환의 매우 초기단계에서, 심지어는 인프라-클리닉 단계 즉, 상기 질환(인지 능력이나 개체의 행동과 관련한)의 명백한 징후가 나타나기 전에 뇌 변화의 진단이나 탐지를 가능하게 하는 것이다.
본 발명에 다른 상기 방법을 수행할 때, 의사는 특정 진단 관점에서, 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환 또는 더 간단히, 알츠하이머 질환 또는 non-AD 치매의 진단을 할 수 있을 것이다. "non-AD 질환"은 알츠하이머 질환에 의해 발생되지 않는 치매 종류를 의미한다. 그러한 치매의 제한없는 예로서, 다음이 언급될 수 있다: 혈관성 치매(vascular dimentia), 혼합성 치매, 전두측두점치매(fronto-temporal dimentia), 루이 소체 치매(dimentia with Lewy body) 등.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 경도 인지장애(mild cognitive impairment, MCI)를 겪는 개체에 수행될 수 있으며, 이는 연역적으로, 그 인지장애가 사소한 문제에 대한 것인지, 실제 진행 가능성 있는 병상에 대한 것인지 결정하기 어려운 개체에서 증상의 객관적인 진단을 가능하게 해주기 때문이다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해, 다양한 기술이 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)를 탐지하는데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 뇌척수액에서 그 수준을 측정하는데 사용될 수 있다:
첫번째 기술에 따라, 뇌척수액 샘플에서 OTC의 존재는 OTC 활성에 의해 결정된다. OTC 활성의 정량적 측정은 OTC의 정량화를 가능하게 한다. OTC 활성을 탐지할 수 있는 분석이 이하 및 과학 문헌(Ishikawa et al., 2003; Ohshita et al., 1976)에 기술되어 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 OTC의 활성은 상기 샘플에 카바밀 포스페이트(carbamyl phosphate) 및 오르니틴(ornithine)을 첨가한 후에 생산된 시트룰린(citrulline)의 생산량을 측정함으로써 탐지된다. 바람직하게는, OTC의 기질인 카바밀 포스페이트(carbamyl phosphate) 및 오르니틴(ornithine)이 상기 샘플에 과량으로 첨가되고, 시트룰린의 생산량은 지정된 시간동안 측정된다. 시트룰린의 생산량은 색 분석 가령, Ohshita, Takeda et al. (1976)에 기술된 바와 같이 탈단백질화 없이 디아세틸모노옥사민-티오세미카바자이드(diacetylmonoxime-thiosemicarbazide) 반응을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에 바람직하게 사용될 수 있는 두번째 기술은 Ishikawa et al. (Ishikawa et al., 2003)에 기술된 바와 같이, 오르니틴 트랜스카바밀라제의 역반응에 기초한 분석을 통해 OTC 활성을 측정하는 것으로 이루어진다. 간단히 말해, 오르니틴(ornithine)에서 글루타메이트(glutamate)로의 전환은 OKT, P5CDH 및 GDH의 작용에도 불구하고, OTC가 그 역반응(시트룰린에서 오르니틴으로 전환)의 촉매작용을 하도록 하여, 1몰의 시트룰린으로부터 3몰의 글루타메이트가 생성된다. 그리고 나서 글루타메이트는 글루타메이트 옥시다제(glutamate oxydase) 및 트린더 시약(Trinder's reagent)에 의해 측정된다.
세번째 기술은 OTC에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 면역분석(immunoassay)하는 것에 기초한다. 수행될 수 있는 면역분석(immunoassay)의 예는 Murayama et al. (Murayama et al., 2006)에 기술된 바와 같이 정제된 재조합 OTC에 대해 얻어진 모노클로날 항체로 ELISA assay하는 것이다. 당업자는 OTC나 그 단편에 대한 모노 클로날 또는 폴리클로날 항체로 다른 분석 가령 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 이용할 수 있다. 가령, 폴리펩티드 MKTAKVAASDWTFLHCLPRK (SEQ ID No: 17)와 같이 인간 OTC의 특이적인 폴리펩티드에 대해 얻어지는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 사용될 수 있다. 인간 OTC의 다른 단편도 본 발명의 맥락에서 또한 사용될 수도 있다. 상기 기술은 OTC의 탐지 및/또는 정량화에 관한 것이다.
상기 방법에서, 오르니틴 트랜스카바밀라제의 심각한 수준 및/또는 활성이 뇌척수액에서 탐지될 때, 뇌 변화가 진단된다. 심각한 수준 또는 활성이란 통계적으로 건강한 개체에서 관찰되는 수준이나 활성보다 더 높은 오르니틴 카바밀라제의 수준이나 활성을 의미한다. 이러한 뇌 변화는 이미 선고받은 경우이거나, 인프라-클리닉 수준이거나 간에 뇌 변화의 표시이다.
본 발명의 두번째 구현예는 알츠하이머 질환과 같은 뇌 질환에 대한 개인별 유전적 경향을 결정하는 유전자 마커로서 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)유전자의 사용에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 개체에서 뇌 질환을 진행하는 위험의 증가여부를 in vitro로 예측하는 방법 또는 개체에서 뇌 질환을 in vitro로 진단하는 방법에 대한 것으로, 상기 개체로부터의 생물학적 샘플에서 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 발현을 조절하는 영역의 유전자 분석(genotyping)단계를 포함한다. 상기 방법은 특히 신경퇴행성(neurodegenerative) 질환, 특히, 알츠하이머 질환의 위험을 예측하거나, in vitro로 진단하는데 적합하다. 물론, 여기 기술된 새로운 유전자 마커는 상기 테스트의 통계학적 중요성을 높이기 위해 아포리포프로테인 E 유전자(apolipoprotein E gene)와 같은 다른 마커와 결합할 수 있다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, -389 A/G 및 -241 G/A SNPs(single nucleotide polymorphisms)가 분석된다.
본 분석은 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 유전자의 발현을 조절하는 영역의 하나 또는 2개의 단편의 증폭을 통해 수행될 수 있다. 만일 2개의 단편이 증폭된다면, 그들 중 하나는 -389 뉴클레오티드를 포함하며, 다른 하나는 -241 뉴클레오티드를 포함한다. 만일 하나의 단편만 증폭된다면, -389 및 -241를 모두 포함하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 제시한 실시예에서, PCR(polymerase chain reaction)이 CTCCTGAGGTGGCCATAGTTG (SEQ ID No: 1) 및
CCAACATGGTGAATCCCCGTC (SEQ ID No: 2)의 프라이머로 수행되었다.
-389 A/G 및 -241 G/A 다형성(polymorphisms)의 유전자 분석(genotyping)은 또한 증폭된 산물의 효소의 절단 패턴을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 가령, -389 A/G 다형성(polymorphism)의 유전자 분석(genotyping)은 증폭된 산물의 AlwNI 에 의한 절단을 포함할 수 있으며, -241 G/A 다형성(polymorphism)의 유전자 분석(genotyping)은 증폭된 산물의 HinI에 의한 절단을 포함할 수 있다. 각각의 경우에 얻어진 패턴은 아래의 실험 부분에 상세히 기술되어 있다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 분석하는 단계를 포함하며, G-389-G-241 하플로타입(haplotype)은 알츠하이머 질환의 진행 위험이 낮음을 표시하며, A-389-A-241 하플로타입(haplotype)은 알츠하이머 질환의 진행 위험이 높음을 표시한다.
본 발명은 또한 사망한 개체에서 뇌 변화을 진단하는 방법에 관한 것으로, 상기 개체로 부터의 뇌 생검(biopsy)을 항-OTC 항체로 라벨링(labelling)하는 단계를 포함하며, 상기 항-OTC 항체는 인간 OTC에 특이적인 폴리펩티드에 대해 얻어진 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 뇌혈관 내피세포(cerebrovascular endothelial cells)에서 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 존재는 뇌 변화의 척도가 된다. 특히, 뇌혈관 내피세포(cerebrovascular endothelial cells)에서 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 존재는 알츠하이머 질환의 표시일 수 있다.
본 발명에 따라, 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제에 대한 항체는 따라서, 사망한 개체나 살아있는 개체에서 경도 인지 장애, 알츠하이머 질환 또는 비-알츠하이어 질환 치매와 같은 뇌 질환의 in vitro 진단에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 항체의 일 실시예는 폴리펩티드 MKTAKVAASDWTFLHCLPRK (SEQ ID No: 17)에 대해 얻어진 폴리클로날 항체이다.
본 발명은 또한 알츠하이머 및/또는 다른 뇌 질환을 예방, 완화, 치료할 수 있는 화합물을 확인하는 스크리닝 방법에 관한 것으로, 세포에서 오르니틴 트랜스카바밀라제의 발현 및/또는 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 질환의 성질이나 단계, 뇌척수액에서 암모니아 농도 등을 포함하는 여러 가지 요인에 따라, 오르니틴 트랜스카바밀라제의 활성을 증가시키거나 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 스크리닝 방법에서, "조절한다(modulate)" 는 "저해(inhibit)"하는 것 뿐만아니라, "활성화(activate)"하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법의 바람직한 실시예에서, 오르니틴 트랜스카바밀라제의 발현 및/또는 활성을 조절하는 화합물의 능력은 OTC 유전자를 발현하는 배양된 혈관 내피세포(vascular endothelial cells)에서 분석된다.
환자의 뇌척수액에서 OTC 발현 및/또는 활성을 측정하는 상기에 기술된 동일한 기술들은 본 발명에 따른 스크리닝 방법을 실시하는데 사용될 수 있다. 그러나, Ishikawa et al. (Ishikawa et al., 2003)에 기술된 바와 같이 OTC의 역반응에 기초한 분석을 통해 OTC 활성을 측정하는 것으로 이루어진 기술은 자동화될 수 있으며, 따라서 특히 고성능 스크린(high-throughput screening)에 적합하다. 물론, OTC의 조절자(modulator)를 확인하는 화합물을 스크리닝하기 위해, OTC 발현 및/또는 활성은 후보 화합물이 존재 및 부존재하는 경우에서 측정되며, 그 결과가 비교된다.
본 발명의 다른 목적은 상기 기술된 방법을 수행하는 키트이다. 그런 키트는 OTC 활성이나 OTC 정량(진단을 확립하는 경우 뇌척수액, 스크리닝 방법의 경우에 배지에서)을 측정하는데 고안된 경우, 오르니틴(ornithine) 용액 및 카바밀 포스페이트(carbamyl phosphate) 용액 중 적어도 하나 및 선택적으로 트리에탄올아민(triethanolamine)용액 및/또는 인산(phosphoric acid) 및 황산(sulphuric acid)용액 및/또는 부탄디온(butanedione)용액을 포함한다.
대체적으로 또는 보완적으로, 본 발명에 따른 뇌 질환을 진단하는 키드 또는 분자를 스크리닝하는 키트는 인간 오르니틴 트랜스카바밀라제에 대한 항체, 예를 들어, 폴리펩티드 MKTAKVAASDWTFLHCLPRK (SEQ ID No: 17)에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 적어도 하나 포함한다.
다른 구현예에 따라, 뇌 질환을 진단하거나, 개체에서 그러한 질병의 진행 위험성을 예측하기 위해 고안된 본 발명에 따른 키트는 -389 및 -241 뉴클레오티드를 포함하는 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 유전자의 발현을 조절하는 영역을 증폭하기 위한 적어도 하나의 프라이머 세트를 포함한다. 이 키트는 또한 추가적으로 AlwNI 및 HinI의 제한효소를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 각 키트는 또한 용도의 통지(notice of use)를 포함하며, 이는 상기 키트로 수행될 수 있는 방법의 단계, 얻어질 수 있는 정보의 성질 및 가능하다면, 어떻게 이러한 정보가 해석되어야 하는지(콘텍스트에 따라)를 표시한다. 가령, 재조합 OTC를 포함하여 양성(positive) 및 음성(negative) 조절도 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 조건적 및/또는 조직 특이적 방식으로 OTC 발현을 위한 발현 카세트를 가진 인간을 제외한 형질전환 포유류(transgenic non-human mammal)에 대한 것이다. 그러한 동물은 알츠하이머 질환의 모델로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시예에서, OTC 형질전환 유전자(transegene)의 발현은 유도성 전사활성자(inducible transcriptional activator)의 활성에 의존한다. 예를 들어, OTC 형질전환 유전자(transegene)는 테트라사이클린-반응성 프로모터 요소(tetracycline-responsive promoter element, TRE)의 조절하에 있을 수 있다. 본 발명에 따른 형질전환 동물을 얻는데 사용될 수 있는 유도성 전사활성자의 예는 테트라사이클린-조절 전사활성 단백질(tTA)일 수 있으며, 조직-특이적 프로모터의 조절하에서 선호되어 발현될 수 있을 것이다. 이러한 전사 활성자의 발현을 유도하는 특히 적합한 프로모터는 혈관 내피 캐드헤린 프로모터(vascular endothelial cadherin promoter)이다.
본 발명은 다음의 도면과 실시예로 더 예시된다.
도 1: RT-PCT 실험을 통해 뇌에서의 우레아 사이클의 효소 발현을 분석하였다. 전체 RNA는 전사 분석에 사용되는 11 AD 케이스(AD) 및 9 대조군(T)의 뇌로부터 추출되었다. 대조군은 RNA 샘플(T-)을 생략하였다; 카바모일-포스페이트 합성효소(carbamoyl-phosphate synthetase 1, CPS1), 오르니틴 트랜스카바밀라제(ornithine transcarbamylase, OTC), 아르기노숙시네이트 합성효 소(argininosuccinate synthetase 1, ASS), 아르기노 숙시네이트 리아제(argininosuccinate lyase, ASL)
도 2: Immunohistochemistry 실험. 일반 간세포(hepatocyte)의 세포질은 패널 A에서 나타난 바와 같이 항-OTC 항혈청(antiserum)에 의해 갈색으로 강하게 염색되나, 혈관 및 간내 담관(intrahepatic bile ducts)은 그렇지 않다. 대조군의 뇌의 대뇌피질(cortex)은 OTC에 면역반응하지 않는 반면(B), 대뇌 피질의 내피(endothelium)는 12명의 알츠하이머 환자 중 6명에서 이 항체로 라벨링된다(C 및 D).
도 3: 중아황산염 서열분석(sequencing)에 의해 -389 및 -241 위치에서 OTC 프로모터의 메틸화 상태의 대표 일렉트로포어그램(electrophoregram). 박스는 -389 SNP 대립유전자(allele)에 따른 메틸화의 존재(A) 또는 부존재(B)를 나타낸다.
도 4: (a) OTC SNPs의 유전적 위치측정(localisation). (b) 다른 SNPs 사이의 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD)의 추정.
도 5: OTC에 의해 촉매되는 반응의 개략적 표시.
도 6: OTC의 활성에 대응하여 새로이 생성된(de novo) 시트룰린의 정량화는 대조군(n=10), MCI 개체(n=14), AD 케이스(n=16) 및 non-AD 치매 케이스(n=30)에서 30분 후에, CSF 50μl에서 측정되었다.
도 7: OTC 기질의 존재 또는 부존재 상태에서의 시트룰린의 측정.
도 8: OTC 활성의 효소적 측정 및 대조군 테스트.
실시예 1: 알츠하이머 질환의 잠재적 유전자 마커로써 OTC 유전자의 동정
1.1. 재료 및 방법
뇌샘플. 뇌는 1986-2001 동안 영국의 그레이터 맨체스터 지역으로부터 얻어진 초기 및 최근 발병(late-onset) 돌발성 AD 환자 114명의 부검에서 얻어졌다(평균 사망 연령=73.1±9.1세; 평균 발병(at onset)연령= 65.9±10.3세; 51% 남성) 모든 환자는 코카시안 인종 기원(Caucasian ethnic origin)이었다. 병리학적 진단은 AD의 CERAD 뇌병리학적 기준에 따라 실시되었다(Mirra et al., 1991). 모든 환자는 사망당시 Braak 5 또는 6 단계에 있었다. 대조군 뇌는 Hospices Civiles de Strasbourg(France)에서 수행된 일반적인 부검에서 얻어진 167개의 뇌 초기 세트에서 얻어졌다. 후보군은 치매의 경우를 제외하도록 고안되었다(치매를 가진 환자가 대부분인 의료기관은 후보군으로 채택되지 않았으며, 일반적인 병원에서 얻어졌음). 대부분의 경우는 응급 서비스를 통해 사망 전 48시간 이하에 승인되었으며, 그 승인 전에 집에서 살고 있었다. 신경 병리를 위한 부검에 관한 케이스들은 배제되었다. 신경병리학적인 범주는 Braak 단계를 정의하는데 사용되거나(Braak and Braak, 1991), CERAD Neuropathological Criteria(Mirra et al., 1991)에 따라 적용된다. 다시말해, 모든 대조군 개체는 코카시안이다.
총 RNA는 페놀/클로로포름 프로토콜(TRizol? reagent, Invitrogen)를 사용하여 114 AD 및 167 대조군 샘플로부터 냉동 전두 대뇌피질 조직으로부터 추출하였다. 전체 RNA의 질은 Agilent 2100 bionalyser를 사용하여 측정되었고, 리보좀 RNA 28S/18S 의 비율은 Agilent 2100 bionalyser bio-sizing software를 사용하여 체계적으로 측정되었다. 12 AD 케이스 및 12 대조군이 범주에 따라 초기 샘플로부터 선택되었다: (ⅰ) 1.0 이상의 리보좀 RNA 28S/18S 비율; (ⅱ) 대조군 샘플에 대해 2 이하의 Braak 단계. 아래 표1에 상기 샘플의 주요 특징을 나타내었다.
표 1: 전사분석에 사용된 뇌 샘플의 주요 특징
AD Case 성별 사망
연령 (y)		 28S/18S 비율 Control case 성별 사망 연령(y) 28S/18S 비율
AD1 F 68 1.4 T1 F 74 1.0
AD2 M 86 1.0 T2 F 72 1.2
AD3 M 67 1.9 T3 M 75 1.0
AD4 F 66 1.6 T4 F 74 1.7
AD5 M 66 1.4 T5 F 70 1.1
AD6 F 84 1.7 T6 M 67 1.4
AD7 M 77 1.1 T7 M 69 1.8
AD8 M 71 1.2 T8 F 73 1.4
AD9 M 65 1.3 T9 F 80 1.1
AD10 F 64 1.0 T10 M 72 1.2
AD11 F 85 1.0 T11 M 78 1.2
AD12 F 77 1.3 T12 M 70 1.5
50% 73.0 ± 8.4 1.3 ± 0.3 50% 72.8 ± 3.7 1.3 ±0.3
마이크로어레이(Microarray) 분석.
게놈 스캔 연구에 의해 정의된 관심영역내에 위치한 2741의 ORF에 대한 특정 올리고뉴클레오티드는 OLIGOMER software (Mediagen)를 사용하여 고안되었다. 선택의 주요 범주는: (i) 60 올리고뉴클레오티드; (ii) 하이브리드화 온도(65 내지 75℃); (iii) 올리고뉴클레오티드 서열의 특이성; (iv) 하이브리드화 온도에서 2차 구조의 형성 불가; (v) 선택된 ORF의 3'-UTR말단에 가까운 올리고뉴클레오티드 서열이었다. 상기 올리고뉴클레오티드의 합성 후에, 이들은 길이이 있어서 일정한 집단을 얻기 위해 시스템적으로 정제되었다(Sigma). 모든 올리고뉴클레오티드들은 그 5'말단에 있는 C6H12NH2 arm으로 기능화된다.
각 AD 케이스에서의 유전자 발현은 대조군에서 잠재적인 개인간의 다양성을 줄이기 위해, 대조 샘플의 풀과 비교되었다. 총 RNA의 10μg으로 부터 초기 mRNA 군의 대표로서 cRNAs는 증폭에 의해 제조되었고, 공급자에 의해 기술된 바에 의해 Agilent 형광 선형 증폭 키트(Fluorescent Linear Amplification Kit)를 사용하여 Cy5 또는 Cy3 fluorophores로 라벨되었다. 염료-스왑 전략(dye-swap strategy)은 각각의 AD 샘플이 2개의 독립적인 마이크로어레이(microarray)에서 분석되는 것을 동반하는데, 그 마이크로어레이 위에 상기 샘플이 Cy5 또는 Cy3 fluorophores로 라벨된다. 하이브리드화룰 위해, 각각의 AD 케이스로부터 4μl의 cRNA가 대조 풀로부터의 4μl의 cRNA와 혼합되었다. 이 혼합물은 40% 포름아마이드, 2.5x Denhardt's, 0.5% SDS 및 4 x SSC의 최종 농도를 얻기 위해, 22μl의 하이브리드화 버퍼(공급자)에서 용해되었다(Sambrook and Russel 2001). 5분동안, 95℃에서 배양한 후에, 상기 혼합물은 커버 슬립아래의 슬라이드에 적용되었다. 상기 슬라이드는 그런 후 하이브리드화 챔버(코닝)에 위치시키고, 밀봉 전 챔버에 30μl의 하이브리드화 버퍼가 첨가되었다. 상기 밀봉된 챔버는 42℃에서 수조에서 14-16시간 동안 배양하었다. 그런 후, 상기 슬라이드는 42℃에서 5분동안 SSC 2X 및 SDS 0.1%에서 2번 세척되었고, 상온에서 SSC 0.2X 에서 1분동안 1번 세척되었으며, 상온에서 SSC 0.1 X에서 1분 동안 1번 세척되었다. 결국, 상기 슬라이드는 상온에서 5분동안 1000 rpm으로 원심분리(centrifugation)에 의해 건조되었다. 결국, 슬라이드는 상온에서 5분동안 1000rpm에서 원심분리기(centrifugation)에 의해 건조되었다. 하이브리드화 후에, 어레이는 Affymetrix® 418 스캐너를 사용하여 스캔되었고, 이미지는 ImaGene 6.0 (Biodiscovery) 소프트웨어를 사용하여 가공되었다. 그런 후 로데이터(raw data)는 통계적 언어 R v2.0.1 (Ihaka and Gentlman, 1996) 운영하에, LIMMA library (Linear Models for Microarray Data)(Smyth et al., 2003)를 사용하여 분석되었다. 염료와 특정 효과를 수정하기 위한 덜 정규화된 칩내 프린트-팁(within-array print-tip)으로 이루어진(Yang et al., 2002) 정규화 프로토콜(normalisation protocol)이 언플라그드 스팟(unflagged spots)의 배경이 삭제된 중간 강도(background subtracted median intensities)에 적용되었다. 정규화 후에, 통계적으로 중요한 규칙의 확인은 표준 에러의 경험적 Bayes shrinkage으로 알맞은 t-statistic을 사용하여 실시되었다(Lonstedt and Speed, 2002).
RT-PCR. 역전사는 마이크로어레이 실험에서 초기에 사용된 11 AD 케이스 및 9 대조군의 전두 대뇌피질로부터 추출된 전체 RNA의 500 ng로 수행되었다. carbamoyl-phosphate synthetase 1 (CPS 1), ornithine transcarbamylase (OTC), argininosuccinate synthetase 1 (ASS), argininosuccinate lyase (ASL) 및 arginase 1 유전자의 mRNA의 특이적 증폭은 표 2에 기술된 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 얻어졌다. 프라이머는 게놈 DNA의 증폭에 의한 잠재적인 오염을 방지하기 위해 다른 엑손내에서 디자인되었다. 대조군 실험은 RNA 샘플을 생략함으로써 수행되었다. PCR 산물은 아가로즈 젤(3%)에서 분석되었다.
표 2: 우레아 사이클 효소 코딩 유전자 발현의 RT-PCR 탐지에 이용되는 올리고뉴클레오티드 세트.
서열 SEQ ID No: 길이 (bp)
CPS I forward aagacctggcatcaggctcc 18 344
reverse tggtagccagccagtggttg 19
OTC forward tcccaattatcaatgggctg 20 319
reverse catgcttatccaaagtgtctg 21
ASS forward cagtcctgctctgccgcctg 22 270
reverse ccggccagatgaactcctcca 23
ASL forward gaggaaccgcccaacatg 24 226
reverse ccaccttgtctaggccatgg 25
Arginase I forward cctacagtattgagaaaggc 26 334
reverse ttccacttgtggttgtcagt 27
면역 세포 화학(Immuno-histochemistry) 실험. 인간 OTC 단백질(MKTAKVAASDWTFLHCLPRK)에 특이적인 20 a.a.에 대한 항-펩티드 폴리클로날 항체(pAbs)는 표준 프로토콜(3개월의 면역화(immunization), Proteogenix SA, France)로부터 개발되었다. 뇌 조직 샘플은 12명의 알츠하이머 환자(57-95세 범위의 7 남자 및 5 여자; 평균 연령75.3세) 및 4명의 대조군(뇌병리학적 연구가 알츠하이머 증세를 전혀 나타내지 않는 신경질환이 없는 환자, 평균연령 69.5세)으로부터 얻어졌다. 모든 환자는 Lille 대학병원에 따랐다. 뇌의 절반은 가벼운 현미경 검사를 위해 포르말린에서 고정되었고, 뇌의 나머지 반은 생화학적 연구를 위해 냉동되었다. 모든 환자에서, 알츠하이머 증세는 Tau, Aβ 및 α-synuclein의 면역 세포 화학 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(Delacourte et al., 2002).
전두 대죄피질의 파라핀 섹션(BA 10)은 Benchmark-XT automate로 가공되었 다(Ventana, Tucson, AZ, USA). 항 OTC 항체 및 면역전 토끼 항체(모두 1/200희석)이 가열 후에 적용되었고, 표준 immunoperoxidase 기술에 의해 밝혀졌다. 포르말린-고정된 간의 파라핀 섹션은 포지티브 조절(Positive controls)이었다. 알츠하이머환자 및 대조군으로부터의 뇌 섹션은 네거티브 조절(Negative controls)이었으며, 면역전 토끼항체로 가공되었다.
유전자분석(Genotyping). 8 SNPs의 유전자 분석은 PCR 증폭에 뒤이어 효소 분해에 의해 결정되었다(아래 표 3). 유전자형의 50%는 랜덤하게 2번 수행되었고, 어떤 차이도 관찰되지 않았다.
표 3 : OTC SNPs의 유전자분석(genotyping)에 사용된 올리고뉴클레오티드 세트.
Figure 112012025555728-pct00001
-389 위치에 존재하는 뉴클레오티드의 결정을 위해, SEQ ID Nos: 1 및 2의 프라이머로 증폭 후에 얻어진 718 bp 증폭산물은 AlwN I로 절단되었고, 그 패턴은 다음과 같이 해석된다: -389 위치의 뉴클레오티드가 G 라면, 상기 증폭산물은 절단되지 않으며, 반면에 -389 위치의 뉴클레오티드가 A 라면, 그 절단은 2개의 밴드(471 및 247 bp)를 나타낸다.
-241 위치에 존재하는 뉴클레오티드의 결정을 위해, SEQ ID Nos: 1 및 2의 프라이머로 증폭 후에 얻어진 718 bp 증폭산물은 Hin I로 절단되었고, 그 패턴은 다음과 같이 해석된다: -241 위치의 뉴클레오티드가 A 라면, 상기 증폭산물은 4개의 단편으로 절단되며(340, 226, 138 및 14 bp), 반면에, -241 위치의 G는 Hin I 의 제한 위치를 만들어내어, 상기 절단 결과가 5개의 단편으로 나타난다(340, 137, 89, 138 및 14 bp).
-389 및 -241 위치의 메틸화 상태. 인간 OTC 프로모터내의 -389 및 -241 위치의 CpG 모티브의 시토신의 메틸화 상태를 결정하기 위해, 중아황산염(bisulfite)으로 게놈 DNA의 처리가 CpGenome DNA Modification Kit (Chemicon)를 사용하여 실시되었다. 간단히 말해, 말초 혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)로부터의 추출된 게놈 DNA 1 μg은 중아황산 나트륨(sodium bisulfite)으로 처리되었고, 50℃에서 16시간동안 배양되었다. 이러한 처리 후에, 메틸화되지 않은 시토신은 우라실로 전환되고, 메틸화된 시토신은 그대로 남아있게 된다. 정제 후에, 중아황산염 처리된(bisulfite-modified) DNA는 PCR에 즉시 사용되거나, -70℃에 저장된다.
중아황산염 처리된(bisulfite-modified) DNA(20 ng)은 프라이머 세트: 5'ATAAATGTGAAGTTGTAGAT-3'(SEQ ID No: 11) 및 5'TAATTACCTATTAATTCTAAC-3'(SEQ ID No: 12)을 사용하여, -389 위치의 CpG/A 모티브의 메틸화 상태를 결정하기 위해, PCR 주형(template)으로 사용된다. 상기 증폭 산물은 프라이머 세트: 5'GAATAGGTTGTTAGGGGAAG-3'(SEQ ID No: 13) 및 5'ATAAATGTGAAGTTGTAGAT-3'(SEQ ID No: 14)를 사용하여 다음에 다시 증폭된다. 중아황산염 처리된(bisulfite-modified) DNA(20 ng)은 프라이머 세트: 5'TGGGTTTATTGTAATTTTTGTTTTTT-3' (SEQ ID No: 15) and 5'CTAACCAACATAATAAATCCCCCATC-3' (SEQ ID No: 16)를 사용하여, -241 위치의 CpG/A 모티브의 메틸화 상태를 결정하기 위해, PCR 주형(template)으로 사용된다. 양자의 OTC 프로모터 SNPs에서의 GG 나 AA genotypes (유전자형으로 4개체)를 포함하는 개체로부터의 PCR 단편은 pGEM-T Easy Vector (Promega)로 클론되었고, 적절한 크기의 삽입(inserts)를 갖는 적어도 5 클론은 개별적으로 서열화되었다.
AD 케이스-대군 연구. 프랑스의 AD 및 대조군 샘플은 코카시안이었다(AD 케이스 n=600, 연령 = 72.4±7.2세, 발병 연령 = 69.5±7.4세, 39.5% 남성; 대조군 n= 664, 연령 = 72.5±7.9 세, 36% 남성). 발병 초기 연령은 65세이하로 밝혀졌다. 가능한 AD의 진단은 DSM-III-R 및 NINCDS-ADRDA criteria에 따라 확립되었다. 코카시안 대조군은 정상적인 인지기능 및 MMS score ≥25를 가지며, DMS-III-R 치매 범주가 아닌 개체로 선발되고 정의되었다. 치매의 가족력을 가진 개체는 범주에서 제외되었다. 대조군은 퇴직자(retirement homes) 또는 선거인명부(이타적 지원자)에 서 선발되었다. 각 개인 또는 근친자는 실험에 동의를 하였다.
통계적 분석 . SAS 소프트웨어, 8.0 버전이 사용되었다(SAS institute, Cary, North Carolina, USA). 단일 변수 분석(Univariate analyses)이 적절한 Pearson's χ2 테스트 또는 피셔 정확도 테스트(Fisher exact test)로 실시되었다. 다변수 분석(multivariate analysis)에서, 우리는 가장 잘 맞는 유전자 모델을 결정하기 위해(우성, 공동우성 또는 열성) Akaike Information Criterion (AIC)를 사용하였다(Akaike, 1978; Bozdogan, 1987). 가장 낮은 AIC를 갖는 모델은 적합도 및 간소화(parsimony)의 가장 좋은 균형을 반영한다. -389 G/A 프로모터 다형성의 유전자형(genotypes)은 결국 열성 모델 즉, AA vs AG+GG genotype에 대한 가정에 따라 dummy variable으로 암호화된다(coded). 상기 질환에 대한 이러한 다양성의 효과는 연령 및 APOE ε4 allele 상태에 알맞는 멀티 로지스틱 회귀 모델(multiple logistic regression models)에 의해 추정되었다. 데시아스(thesias) 소프트웨어의 목적은 관련없는 개인간에 하플로타입에 기초한 연관 분석(haplotype-based association analysis)을 수행하는 것이다. 이 프로그램은 (Bozdogan, 1987)에 기술된 최대 유사 모델(maximum likelihood model)에 기초하고 있으며, SEM 알고리듬에 링크되어 있다(Tregouet and Tiret, 2004).
1.2. 결 과
유전자 발현의 수준은 12대조군 및 12 AD 환자의 사후 뇌조직의 전체 RNA수 로 측정되었다. 본 연구에서, 각 AD 환자에서의 뇌 발현 프로파일은 대조군에서의 개별적 다양성의 영향을 최소화하기 위해 대조군 샘플의 풀과 비교되었다. 연구된 2741 유전자 중에서, 대조군의 풀(선택된 것의 3배, p<10-5)과 비교하여 AD 환자의 뇌에서 36개는 과발현되었고, 70개는 덜 발현되었다. 관심있는 다른 위치내에서의 이러한 유전자의 분배는 표 4에 나타내었다.
표 4: 대조군과 비교하여 적어도 6명의 AD 뇌에서 중요한 다른 발현을 나타내는 유전자의 수.
위치(Locus) cM 선택된 ORFS 다르게 발현된
유전자
Chr. 1 50 393 13
Chr. 5 50 174 6
Chr. 6 40 535 24
Chr. 9 55 230 12
Chr. 10 95 415 15
Chr. 12 40 306 11
Chr. 20 50 239 9
Chr. 21 58 267 6
Chr. X 25 182 11
대조군 풀에서는 microarray에서 OTC에 대해 어떠한 신호도 관찰되지 않은 반면, 12 AD 샘플 모두에서는 특정 하이브리드화가 관찰되었기 때문에, 염색체 X에서 다르게 발현되는 11 유전자 풀에서, 인간 OTC 유전자가 또다른 분석을 위해 선택되었다. 발명자는 AD 환자의 전두 대뇌피질에서 OTC 유전자가 발현되고 대조군의 뇌 대부분에서는 발현되지 않는다는 것을 RT-PCR로 확인하였다(단지 1개의 대조군 뇌 샘플만이 본 조건하에서 OTC 발현을 나타냄, 도 1).
다음으로, AD 케이스 및 대조군의 뇌에서 단백질 수준에서의 OTC 발현이 연구되었다. 12명의 AD 케이스 중 6명의 대뇌피질에서 모세혈관의 내피가 인간 폴리클로날 항-OTC 항체에 대해 면역반응성(immunoreactivity)을 나타낸(도 2C 및 D) 반면, 대조군의 뇌에서는 라벨이 전혀 관찰되지 않았다(도 2B). 예상한 바와 같이, 대조군의 간(liver) 섹션에서는, 간세포에서는 강한 신호가 관찰되었으나, 혈관 및 간내 담관(intrahepatic bile ducts)(도 2A)에서는 그렇지 않았다. 테스트한 모든 샘플에서 항-OTC 항체 대신 면역전의 토끼 혈청이 적용되었을 경우 어떠한 신호도 관찰되지 않았다(데이타 없음).
이러한 관찰에 따라, OTC 유전자가 AD의 유전적 결정요인이 될 수 있는지가 평가되었다. 본 발명자는 NCBI international database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Snp)를 사용하여 유전자내의 다형성(polymorphism)을 조사하였다. 수많은 돌연변이가 기술되어 있었으며, 대부분은 OTC 결함 질환에 원인이 있었으며; 다른 빈번한 SNP(single nucleotide polymorphisms)가 기술되어 있었다. 프로모터 영역내에서 6개의 SNPs가 선택되었으며, 2개의 다른 유사하지 않은(non-synonymous) SNPs가 선택되었다(도 4). -146 C/T 및 -69 C/T SNPs는 184명의 건강한 사람들에게서는 탐지되지 않았다. 더욱이, Glu270Arg SNP는 낮은 빈도를 나타내었고(2.3%), 결과적으로, 다음 분석에서 제외되었다. 남은 5개의 선택된 SNPs는 모두 강한 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD)에 해당되었다.(도 4b). 결국, -389 G/A 및 -241 A/G SNPs는 각각 OTC 프로모터내의 CpG 모티브를 잠재적으로 파괴하거나, 만들어내는 것으로 서, 연관 연구를 위해 조사되었다. 사실, 상기 프로모터의 메틸화 상태의 그러한 잠재적 수정은 유전자 발현의 조절과 특히 관련이 있을 수 있다.
이러한 AD 진행 위험에 대한 2 SNPs의 효과는 583의 단발성 AD 케이스 및 639 대조군을 포함하는 프랑스의 케이스-대조군 연구를 사용하여 평가되었다. OTC 유전자는 X 염색체에 위치하기 때문에, 하디-바인베르그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)은 여성에서만 테스트될 수 있었다. 연구된 SNP가 무엇이든지 간에, 하디-바인베르그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)으로부터 출발하지는 않았다. -389 G/A SNP의 유전자형 분포는 AD 와 대조군 사이에 여성에서는 매우 달랐으나(p=0.015), 남성에서는 그렇지 않았다(표5). -389 AA 유전자형을 갖는 여성은 AD 를 진행되는 위험이 높았다(OR=2.3, 95% CI 1.3 to 4.1, p=0.005). 이러한 효과는 APOE ε4의 상태 및 나이와 독립적인 것으로 보인다. -241 A/G SNP는 성별이 무엇이든지 간에, AD와 관련이 없었다.
표 5: OTC -389G/A, -241 A/G 및 Lys46Arg SNP에 대한 대립유전자(allele) 및 유전자형 분포 (a) 남성 및 (b) 여성
Figure 112012025555728-pct00002
1 ns; 2 p=0.015
AD 진행 위험에 관한 이러한 2개의 프로모터 SNPS이 잠재적인 결합된 효과는 이후에 평가되었다. 하플로타입(haplotype) 빈도는 여성에서는 Thesias software를 사용하여 또는 남성에서는 직접적으로 관찰하여, 양상없는 유전자형(unphased genotypes)으로부터 계산되었다(표 6). 대부분의 일반적인 G-389-A-241 하플로타입(haplotype)은 참고로 한정하였다. 드문 G-389-G-241 하플로타입(haplotype)은 AD 진행 위험이 낮은 것과 관련이 있음이 관찰되었다(OR=0.3, 95% CI [0.1-0.7], p=0.001). 반대로, 드문 A-389-A-241 하플로타입(haplotype)은 상기 질환의 진행위험이 높은 것과 관련이 있었다(OR=3.0, 95% CI [1.2-7.3], p=0.007).
표 6 : (a) 여성, (b) 남성 및 (c) 전체에서의 -389 G/A 및 -241 A/G SNPs로부터의 하플로타입 분포.
Figure 112012025555728-pct00003
1 p=0.03; 2 p=0.001; 3 p=0.0002
-389 G/A 및 -241 A/G SNPs의 잠재적 생물학적 관련성을 측정하기 위해, 본 발명자는 이러한 SNPs가 OTC 프로모터의 메틸화 상태를 변화시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. -389 G/A SNP의 드문 A allele는 CpG motif를 파괴하였다. -389 위치에서의 CpG 및 CpA motifs내의 시토신의 메틸화 상태는 중아황산염(bisulfite)-처리된 게놈 DNA로부터 증폭된 클론된 PCR 산물의 직접적인 서열분석(sequencing)에 의해 결정되었다. 대표적인 sequencing electrophoretograms는 도 3에 도시하였다.
-389 위치에서의 CpG motifs에서의 시토신은 체계적으로 메틸화되는 반면, 동일한 위치에서 CpA motifs에서의 시토신은 그렇지 않다. 이들은 G allele가 CpG motif를 만들어 냄으로서, -241 A/G SNP가 OTC 프로모터의 메틸화 상태를 수정할 수 있을 것인지를 유사하게 측정하였다. -241 위치의 CpA motif에 있는 시토신은 체계적으로 메틸화되지 않는 반면, 동일한 위치의 e CpG motif에 있는 시토신은 동일 개체내에서 다양하다. 이러한 모든 관찰은 OTC 프로모터의 메틸화 상태가 -389 G/A and -241 A/G SNPs에 의존할 수 있음을 나타낸다. 흥미롭게도, 드문 G-389-G-241 하플로타입(haplotype)은 AD 진행위험이 낮은 것과 관련이 있고, OTC 프로모터의 메틸화 수준이 높은 것에 대응할 수 있으며, 반대로, 드문 A-389-A-241 하플로타입(haplotype)은 AD 진행위험이 높은 것과 관련이 있고, OTC 프로모터의 메틸화 수준이 낮은 것과 잠재적으로 관련이 있다.
실시예 2 : 뇌척수액에서의 OTC는 인지 퇴화 및 치매를 유도하는 뇌 손상의 척도이다.
2.1. 재료 및 방법
CSF 샘플:
"Centre de Mёmoire du Service de Neurologie de l'Hopital Salengro, CHRU de Lille" 로부터 입수한 CSF는 환자 본인이나 친척 또는 법적 보호자가 설명을 듣고 동의한 서비스에 의해 얻어졌다. 200μl는 효소 측정을 수행하는데 필요하였다.
본 연구는 14명의 "경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment, MCI)"환자, 30명의 non-AD 치매 환자(혈관성 치매(vascular dimentia), 혼합성 치매, 전두측두점치매(fronto-temporal dimentia), 루이 소체 치매(dimentia with Lewy body) 등) 및 AD 가능성있는 16명의 환자를 포함한다.
OTC의 활성의 효소적 측정 :
간단히, OTC 활성은 과량의 기질 존재하에서 주어진 시간동안 생산되는 시트룰린 비율을 결정함으로써 정량한다(도 5).
시트룰린의 비율은 Ohshita, Takeda et al. (1976)에 기술된 바에 따라, 디아세틸모노옥사민-티오세미카바자이드(diacetylmonoxime-thiosemicarbazide)반응에 의해 색으로 측정된다. 효소적 OTC 활성은 Lee and Nussbaum, (1989)에 설명된 기술에 따라 측정되나, 96-well 플레이트에서 이 실험을 수행할 수 있는 목적에 맞게 약간 수정되었다. 각 샘플에서, 기질의 추가가 있거나 없는 2가지 측정을 하였으며, 샘플에 본래 존재하는 시트룰린의 양을 측정하고 OTC 활성 후에 존재하는 시트룰린의 총 양으로부터 이를 뺄 수 있도록 하기 위해, 이것이 기질의 첨가에 의해 유도되었으며, 30분 동안 유지되었다. 간단히, CSF 50μl가 5mM 의 오르니 틴(ornithine), 15mM의 리튬 카바밀 포스페이트(lithium carbamyl phosphate) 및 270mM의 트리에탄올아민( triethanolamine)의 최종 농도를 갖거나, 희석된 물 140μl 를 갖는 기질을 포함하는 용액 140μl 에 첨가되었다. 상기 유닛은 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 효소반응은 50μl의 (v/v) 인산(phosphoric acid)/황산(sulphuric acid) 3:1 용액의 추가에 의해 정지되었다. 결국, 샘플에 존재하는 시트룰린의 비율을 정량화하도록 하는 색반응은 10μl의 2,3 부탄디온(butanedione)3%와 관련있고, 15분 동안 어두운 곳에서, 95℃에서 유지되었다. 리딩(측정)은 490nm 파장에서 마이크로플라그 리더(microplaque reader, Elx800 -Biotek)에서 수행되었다.
2 범위의 대조군에 각각의 실험이 진행되었고, 하나는 상업적인 시트룰린의 양의 증가(0 to 150 nmoles/50μl)를 포함하며, 다른 하나는 상업적 OTC 양의 증가(0 to 3.10-3 unites/50μl)를 포함한다. 이러한 범주의 대조군에 대해, 기질이 있거나 없는 2가지 측정이 또한 실시되었고, 샘플에 대해 상기 설명된 바와 같다(도 7 및 도 8). 뿐만 아니라, 다른 대조군은 Proteogenix SA, France에 의해 본 실험을 위해 개발된 OTC에 대한 폴리클로날 항체의 양을 포화시키는 상업적 OTC 효소를 미리 배양시키는 것으로 실시되었다; 상기 목적은 항체에 의한 효소의 억제가 OTC 기질의 존재에도 불구하고 시트룰린의 생산을 방해한다는 것을 증명하는 것이다(도 8).
OD 값은 각 웰에 존재하는 시트룰린의 nmole양을 결정하기 위해, 대응하는 시트룰린 대조군의 범위에 따른다. 각 샘플에 대해 기질이 없는 경우에 측정된 시 트룰린의 nmole의 양은 기질이 있는 경우 측정된 시트룰린의 nmole의 양에서 제하였고, 결과치는 30분 동안 샘플에 존재하는 OTC에 의해 생산된 시트룰린의 수준을 나타낸다. OTC 대조군 범위에 대한 이 수치의 이월(carryforward)이 또한 상기 샘플에 있는 OTC 유닛의 수준을 결정하도록 한다는 점을 주목하여야 한다. 그러나, 30분/50μl CSF로 처음 생산된 시트룰린의 nmoles 양으로 OTC 활성을 나타내기 위해 선택되었다.
2.2 결과
도 6에 나타난 결과는, 30분에 걸쳐 측정된 OTC활성에 따라, 처음 생산된 시트룰린의 양이 대조군(p<0.0001)과 비교하여 MCI, a non-AD 또는 AD 치매를 보이는 환자들 사이에서 적어도 평균 10배 높다는 것을 나타낸다.
따라서, CSF에서의 OTC 활성 수준은 사소하거나, 치매로 이어지는 민감한 것이거나 간에 객관적인 인지 퇴화의 존재를 탐지하는 효과적인 도구가 될 수 있다는 것이다. 이러한 측정은 따라서, 인지 변화 및 치매의 매우 초기진단에 도움이 되는 것으로서 제시될 수 있다.
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Claims (43)

  1. 개체로부터 분리된 뇌척수액 샘플 중의 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC)를 탐지하는 단계를 포함하는 상기 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뇌 변화는 인프라-클리닉(infra-clinic) 수준인 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 개체가 신경퇴행성 (neurodegenerative) 질환을 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 개체가 경도 인지 장애 (mild cognitive impairment), 알츠하이머 질환, 및 비-알츠하이머 치매 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 뇌척수액 샘플 내 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 탐지가 OTC 활성의 탐지에 의해 수행되는 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 OTC 활성은 상기 샘플에 카바밀 포스페이트 및 오르니틴의 첨가 후 시트룰린의 생산을 측정하는 것에 의해 탐지되고 정량화되는 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 OTC 활성은, 생산된 시트룰린의 양을 비색적으로(colorimetrically) 측정하여 분석되는 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 뇌척수액 샘플 중의 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC)의 탐지는 OTC에 대항하여 유도되는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 면역분석 (immunoassay)하는 것에 의해 수행되는 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 인 비트로 (in vitro) 제공하는 방법.
  9. 항-오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 항체로, 사망한 개체로부터 분리된 뇌 생검 (biopsy)을 라벨링하는 단계를 포함하며, 여기서 뇌혈관 내피세포 (cerebrovascular endothelial cells) 내의 오르니틴 트랜스카바밀라제의 존재가 뇌 변화의 척도인 상기 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 항체는 인간 OTC에 특이적인 폴리펩티드에 대항하여 얻어진 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체는 폴리펩티드 MKTAKVAASDWTFLHCLPRK (SEQ ID No: 17)에 대항하여 얻어진 폴리클로날 항체인 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 뇌혈관 내피세포 내의 오르니틴 트랜스카바밀라제의 존재가 알츠하이머 질환의 척도인 개체가 뇌 변화를 갖는 가능성을 평가하기 위한 정보를 제공하는 방법.
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  15. 세포 내 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC)의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 조절하는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질환 또는 다른 뇌 질환을 예방, 완화, 또는 치료할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 유전자를 발현하는 배양된 혈관 내피세포(vascular endothelial cells)에서, OTC의 발현, 활성, 또는 발현 및 활성을 조절하는 화합물의 활성을 분석하는 스크리닝 방법.
  17. 제1항 내지 제7항, 제15항 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 적어도 오르니틴 용액 및 카바밀 포스페이트 용액을 포함하는 것인 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 키트는 적어도 트리에탄올아민 용액, 인산 및 황산의 용액, 부탄디온 용액, 또는 이들의 조합을 포함하는 키트.
  19. 제1항 내지 제4항, 제8항, 제9항, 제12항, 제15항, 또는 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 키트로서, 적어도 하나의 항-OTC 항체를 포함하는 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항-OTC 항체는 폴리펩티드 MKTAKVAASDWTFLHCLPRK (SEQ ID No: 17)에 대항하여 유도된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 키트.
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