JPH11507539A

JPH11507539A - 真核生物における誘導的遺伝子発現のための自己制御性テトラサイクリン調節系

Info

Publication number: JPH11507539A
Application number: JP9502206A
Authority: JP
Inventors: シャッツ、デイビッド・ジー
Original assignee: イェール・ユニバーシティー
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-07-06
Also published as: WO1996040946A1; DE69635992T2; EP0832254B1; EP0832254A1; ATE321871T1; US5851796A; DE69635992D1; AU6274596A

Abstract

(57)【要約】テトラサイクリン調節系であって、自己制御性誘導的遺伝子発現を培養細胞中およびトランスジェニック動物において提供するシステムが記載される。自己制御性フラスミドpＴet-tＴＡkにおいて、tＴＡkと称される修飾tＴＡ遺伝子がＴetpの制御下に配置された。テトラサイクリンは、tＴＡがＴetp-へ結合することを妨げ、tＴＡおよびルシフェラーゼ両者の発現を妨げる。この負のフィードバックサイクルにより、テトラサイクリンの存在下にtＴＡがほとんど生産されないかまたは全く生産されないことが保証され、これにより、考え得る毒性効果は低減または排除される。しかしながら、テトラサイクリンが除去されると、この戦略は、微量のtＴＡタンパク質（これは、おそらく最小プロモーターの漏れから生じるものであり得る）が、Ｔet-opに結合し、tＴＡk遺伝子の発現を促進するであろうことを予想させるものである、正のフィードフォーワードループが開始され、これにより次に、より高レベルのtＴＡの、よって、ルシフェラーゼの発現が導がれる。自己制御性システムをコードするポリヌクレオチド分子、および所望の遺伝子の発現を高めまたは低減させる方法、並びにこれらの方法を実施するためのキットが記載される。

Description

【発明の詳細な説明】真核生物における誘導的遺伝子発現のための自己制御性テトラサイクリン調節系発明の背景米国国家の援助を受けた研究および開発のもとでなされた発明の権利に関する陳述本発明の開発中に行われた仕事の一部は、米国政府の資金を利用している。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。発明の分野本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。培養細胞およびトランスジェニック動物において自己制御性誘導的遺伝子発現(autoregulatory inducible geneexpres sion)を引き起こす、テトラサイクリンにより調節される系を記載する。関連技術誘導的哺乳動物遺伝子発現のための系は、典型的には、基底漏出、誘導剤または誘導処理の毒性または非特異的作用、限定された細胞型の適用性、低レベルの発現のような限界に直面している(Ｙarranton，Ｇ.Ｔ.，Ｃurr．Ｏpin．Ｂiotec h．3:506-511(1992)中で論評されている)。最近、Ｔn10のテトラサイクリン耐性オペロンからの調節配列（tetＯ）の制御下に標的遺伝子を置くことにより、これらの難点の多くを克服する系が開示された(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard．Ｈ. ，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992))。細菌では、この短い配列には、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（tetＲ）が強固に結合し、この結合は、抗生物質テトラサイクリンにより遮断される(Ｈillen，Ｗ. およびＷissmann，Ａ.，Ｐrotein-Ｎucleic Ａcid Ｉnteraction，Ｔopics in Ｍolecular and Ｓtructural Ｂiology，Ｓaenger，Ｗ.およびＨeinemann，Ｕ. 編，Ｍacmillan，Ｌondon(1989)，pp．143-162)。ハイブリッド融合タンパク質であるテトラサイクリントランスアクチベーター（tＴＡ）は、tetＯ配列を含有する最小プロモーターにtＴＡが結合すると、標的遺伝子の転写が活性化されるように、tetＲＤＮＡ結合ドメインをＶＰ-16の転写活性化ドメインと合体させる。テトラサイクリンはtＴＡに結合して活性化を妨げるが、これはおそらく、tetＯにtＴＡが結合するのを遮断するtＴＡのtetＲ部分にコンホメーション変化を引き起こすことによるものであろう(Ｈinrichs，Ｗ．ら，Ｓcience 264:418-420(1994))。テトラサイクリンを除去することにより、遺伝子の活性化が得られる(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992))。この系の主な限界は、tＴＡタンパク質の発現が、たとえそれが中度であっても困難なことである(ウエスタンブロット法では検出不可能であり、ゲル電気泳動移動シフトアッセイではほとんど検出できない(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992)))。ＧossenおよびＢujardの推論によると、これは、ＶＰ16トランスアクチベータードメインによる転写の「鎮圧(squelching)」（Ｇill，Ｇ.およびＰtashne，Ｍ.，Ｎature（Ｌondon）334:721-724(1988)）によるものであり、これは、tＴＡタンパク質を適度に発現する細胞でさえも死に至らしめる。これらの結果を、この系を用いる誘導性ルシフェラーゼ導入遺伝子の見掛け上低レベルの発現の観察(Furth，Ｐ. Ａ.ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 91:9302-9306(1994))と組み合わせると、tＴＡの発現不全がこのような難点の一因となっていると示唆される。発明の概要 tetＯを含有するプロモーターの制御下にtＴＡ遺伝子を置くことにより、高レベルのtＴＡ発現を可能にする自己制御性tＴＡ発現ベクターを作製する。この戦略により、構成的な系(constitutive system)よりもはるかに高い効率を有する高度に誘導可能なトランスフェクション化細胞の作製が可能となることが本明細書において示されている。さらに、この戦略により、動物の飲料水中のテトラサイクリン濃度を変えることによりルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を制御できるトランスジェニックマウスの作製が可能となる。トランスアクチベータータンパク質の自己制御性発現により、テトラサイクリン系は、誘導的哺乳動物遺伝子発現が必要な多数の広範な課題に適用しうるものとなるはずである。本発明の第１の実施態様は、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる組成物であって、該タンパク質が、原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、該ポリヌクレオチド分子が、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており(operably linked)、該プロモーターが、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有することを特徴とする組成物に関する。テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームは、翻訳開始のために最適な環境(contex)を付与するために、その５'末端で修飾されている。本発明の好ましい実施態様では、それは、ＨindIIIのような唯一の制限部位を付与するために修飾されている。本発明の最も好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームは、配列番号で識別されるオリグヌクレオチドをコードするように、その５'末端で修飾されている。好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡである。本発明の第２の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド分子を含有するクローニングベクターに関する。本発明の最も好ましい実施態様は、プラスミドpＴet- ＳpliceおよびpＴet-tＴＡＫに関する。本発明の第３の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド分子でトランスフェクションされた真核細胞に関する。好ましい実施態様では、該真核細胞は、前記誘導性最小プロモーターに対するテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質の結合を抑制するために十分な量のテトラサイクリンを含有する。本発明のもう１つの好ましい実施態様では、前記真核細胞はさらに、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合した異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子でトランスフェクションされている。本発明の最も好ましい実施態様では、該ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つは、最小プロモーターおよび７個のtetオペレーター配列に作動可能的に結合している。さらに好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、該異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の発現をテトラサイクリンの不存在下で駆動するのに十分な量で発現される。もう１つの好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質は、該異種タンパク質の発現を駆動するのに十分な量で存在する。本発明の第４の実施態様は、異種タンパク質の発現を減少または停止させる方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、該ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子、 (ii) 異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子により形質転換することと、 (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を含む培地中で該真核細胞を培養することを含んでなる方法に関する。好ましい実施態様では、第２のポリヌクレオチド分子は、最小プロモーターおよび７個のtetオペレーター配列に作動可能的に結合している。本発明の第５の実施態様は、異種タンパク質の発現を活性化または高める方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、該ポリヌクレオチド分子が誘導性プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子、 (ii) 異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子により形質転換することと、 (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を欠く培地中で該真核細胞を培養することを含んでなる方法に関する。本発明の第６の実施態様は、少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、該ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子を含有し、第２の収容手段が、前記誘導性最小プロモーターであって、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、該tetオペレーター配列がポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するよう効果的に(strategically)配置されるプロモーターをコードする第２のポリヌクレオチド分子を含有することを特徴とするキットに関する。本発明の第７の実施態様は、少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、該タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、該ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する分子によりトランスフェクションされた真核細胞を含有し、第２の収容手段が、誘導性最小プロモーターであって、該プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、該tetオペレーター配列が異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するよう効果的に配置されるプロモーターを含む第２のポリヌクレオチド分子を含有することを特徴とするキットに関する。本発明で説明するポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを含有する細胞系は、多種多様な遺伝子の発現を厳密かつ定量的に制御することを可能にする研究手段である。これは、基礎研究および応用研究の広範な領域において重要である。本発明はまた、生産物（ＲＮＡまたはタンパク質）の合成がtet調節系により制御される真核生産細胞系および株の構築に関する。これらの細胞系および株により、発酵プロセスの間の一定の時点または時間枠（time window）内でタンパク質合成を誘導することが可能となる。この制御により、持続的に存在すれば細胞に致死的となる遺伝子産物を大規模培養で合成するのが可能となる。あるいは、種々の細胞の働き(cellular task)、調節および機能を達成するために使用されるＲＮＡ分子を産生することを所望する場合、該細胞を使用することにより、ＲＮＡ産生の誘導が可能となる。例えば、細胞に対して同種または異種のいずれかの遺伝子の機能を抑制するためにＲＮＡをアンチセンスオリゴヌクレオチド(o ligo)として使用する場合に、ＲＮＡ産生の誘導を制御することができる。本発明はまた、薬学的またはその他の商業的な価値がある化合物を同定するためのスクリーニング系で使用することができる細胞系の構築に関する。そのような系では、長期的に存在すると（特に、高コピー数で存在する場合）しばしば細胞傷害性となる受容体（例えば、ＧＡＢＡまたはエストロゲン受容体）など（これらに限定されるものではない）の標的分子の発現を、一時的かつ定量的に制御することができる。本発明はまた、単一の遺伝子の発現をtet調節系により外的に制御することができるトランスジェニック動物の作製に関する。そのような遺伝子には、ヒト遺伝子のうち、その発現、発現の欠如、または他の欠陥がヒト疾患に関与するものが含まれる。そのようなトランスジェニック動物は、治療研究におけるヒト疾患モデルとして、および薬学的に関心のある化合物をスクリーニングするためのヒト疾患モデルとして使用することができる。また本発明は、薬学的またはその他の商業的な関心のある化合物を製造するためのトランスジェニック動物の作製に関する。この系のもう１つの重要な適用は、遺伝子発現の一時的な制御を可能とし、この場合、例えば、関心のある遺伝子を細胞、動物または植物中に導入して、該導入遺伝子(transgene)内のある遺伝子の致死的な破壊を補償する。抑制または不活性化されている遺伝子のコピーを導入する系を用いると、遺伝子の産生を停止させ前記遺伝子の致死的な破壊を必要とする操作を行なうことが望ましい時まで、細胞または植物または動物の成長および発育を可能にするために十分なタンパク質またはＲＮＡを産生させることができる。図面の簡単な説明図１は、誘導的遺伝子発現の自己制御的戦略の概略図である。tＴＡの自己制御性発現は、ＴＡＴＡボックスと転写開始部位（黒丸）とを含有する最小ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）プロモーター領域の上流のテトラサイクリンオペレーター配列（Ｔet-op；濃い陰影の付いた箱）の７個のコピーよりなるＴetp の制御下にtＴＡk遺伝子（白の箱）を配置することにより、pＴet-tＴＡkにおいて達成される。pＵＨＣ13-3のルシフェラーゼレポーター遺伝子（陰影の付いた箱）も、Ｔetpプロモーターに制御される。tＴＡタンパク質は、該タンパク質の２つのドメイン（ＤＮＡ結合とトランス活性化のためのもの）を表す２つの隣接する縞状の箱として示されている。テトラサイクリンの存在下（左パネル）では、最小hＣＭＶプロモーターの基礎活性により、非常に低レベルのtＴＡタンパク質（小さなtＴＡアイコンとして表されている）の発現が生じるが、産生されたすべてのtＴＡタンパク質は、Ｔet-opに対する結合から遮断される。したがって、ルシフェラーゼおよびtＴＡの発現は共に、低レベルに維持される（細い短い破線）。テトラサイクリンが除かれると（右パネル）、存在する少量のtＴＡが、Ｔet-opに結合し、tＴＡ遺伝子の発現を刺激する。tＴＡタンパク質が高レベルになるほど、より高レベルのtＴＡの発現、そしてより高レベルのルシフェラーゼの発現を刺激する(太い長い破線)。図２Ａおよび2Ｂは、ＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞における誘導可能なＶ(Ｄ)Ｊ組換えを示す棒グラフである。図２Ａは、pcＤＮＡ-tＴＡkを含有するクローンの棒グラフ分析を示す(構成的 tＴＡ発現)。17個の安定なトランスフェクション体クローン（Ｓ1-1からＳ1-17 ）を誘導化し、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換え基質とＴetp制御性ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2発現ベクターとによる一過性コトランスフェクションによりＶ(Ｄ)Ｊ組換えを行なう能力に関してアッセイする。「材料および方法」に記載されているとおり、増殖培地中のテトラサイクリンの存在下（Ｔet+）および不存在下（Ｔet-）で平行トランスフェクションを行い、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換え頻度（％で表す）を測定した。また、比較のために、ＮＩＨ3Ｔ3細胞において行なった以下の４つの対照アッセイを示す（最初の２つのサンプル）：テトラサイクリンの存在下および不存在下での、ＲＡＧ-1 およびＲＡＧ-2の不存在下での該組換え基質のトランスフェクション、およびテトラサイクリンの存在下および不存在下での構成的ＲＡＧ発現ベクターによる該組換え基質のコトランスフェクション。構成的hＣＭＶプロモーターからＲＡＧ- 1およびＲＡＧ-2を発現させた場合には、テトラサイクリンはＶ(Ｄ)Ｊ組換え頻度に影響を及ぼさなかった。テトラサイクリンを除くことにより得られた誘導の倍率を、明らかに検出可能な組換えが認められた場合に棒の上に示す。図２Ｂは、pＴet-tＴＡkを含有するクローンの棒グラフ分析を示す（自己制御性tＴＡ発現)。10個の安定なトランスフェクション体クローン(Ｓ2-1からＳ2-10 )、およびpＴet-tＴＡk、pＴet-Ｒ1Ａ/ＣおよびpＴet-Ｒ2Ａを含有する２つのクローン(Ｓ4-9およびＳ4-5)を、前記のとおり、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えを行なう能力に関してアッセイした。最初の２つのサンプルは、図２Ａで記載したものと同じ対照サンプルである。図２Ａと図２Ｂとで、組換え頻度についての縦軸の目盛りが異なっていることに注意すべきである。アステリスク（^*）は、得られたアンピシリン耐性コロニーが非常に少数であり算出組換え頻度に信頼性のない２つのＴet +トランスフェクションを示す。そのため、これらのコロニーについての誘導倍率は示していない。アンピシリン耐性コロニーの数は、これらの実験では少なかった(350〜55,550の範囲)。該細胞系のいくつかについての追加的なアッセイに基き、本発明者らは、報告されている組換え頻度は、図２Ａおよび図２Ｂの両方において２倍も過大評価されていると推定している。図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、誘導的自己制御系を用いて活性化されたmＲＮＡおよびタンパク質の発現の検出を示すＲＮＡブロットおよびウエスタンブロットの写真である。図３Ａは、テトラサイクリンの存在下または不存在下で23時間培養されたＳ4- 9(pＴet-tＴＡk、pＴet-Ｒ1Ａ/ＣおよびpＴet-Ｒ2Ａの安定なコトランスフェクション体)、およびpＴet-Ｒ1またはpＴet-Ｒ2のいずれかにより一過性にトランスフェクションされ、テトラサイクリンの存在下および不存在下で48時間培養されたＳ2-6（pＴet-tＴＡkの安定なトランスフェクション体）からの全細胞ＲＮＡのＲＮＡブロットの写真である。ブロットを、tＴＡＫ、ＲＡＧ-1および／またはＲＡＧ-2およびγ-アクチンmＲＮＡを検出するプローブと順次ハイブリダイズさせた。図３Ｂは、テトラサイクリンの存在下または不存在下で48時間培養されたＳ2- 6細胞からの細胞抽出物のウエスタンブロットの写真である。ブロットを、tＴＡタンパク質を検出する抗tetＲ抗体含有ハイブリドーマ上清でプローブした。染料先端が示されている。図３Ｃは、飲料水中のテトラサイクリンの存在下または不存在下で７日間維持されたpＴet-tＴＡk/Ｔet-ルシフェラーゼトランスジェニックマウスの胸腺（Ｔ）および肺（Ｌ）からの全細胞ＲＮＡのブロットの写真である。各レーンに約20 μgのＲＮＡをロードした。図４は、トランスジェニックマウスの組織中の誘導ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。値は、飲料水中のテトラサイクリンの存在下または不存在下で７〜８日間維持された４〜７週齢のマウスからの組織ライゼート(lysate)中のタンパク質１mg当たりの相対光単位（rＬＵ）（溶解緩衝液バックグラウンドを差し引いている）を表す。白三角は、導入遺伝子陰性マウスであり、白丸は非誘導導入遺伝子陽性マウスであり、黒丸は誘導された導入遺伝子陽性マウスである。マウスは、導入遺伝子に関して遺伝的に同一である。結果は、３つの独立した実験をまとめたものである。図５は、トランスフェクションされた繊維芽細胞系においてpＴet-tＴＡkがルシフェラーゼ活性の発現を誘導する能力を示すグラフである。pＵＨＣ13-3を、p Ｔet-tＴＡkまたはpcＤＮＡ-tＴＡkのいずれかと共にＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞中にコトランスフェクションし、48時間後に該細胞を収穫し、該抽出物中に存在するルシフェラーゼ光単位を測定した。pＴet-tＴＡkのトランスフェクションはテトラサイクリン(tet)の存在下および不存在下で行ない、一方、pcＤＮＡ-tＴＡkのトランスフェクションはtetの不存在下のみで行なった。トランスフェクション効率に関してルシフェラーゼ値が補正されていないことに注意することが重要である。さらに、用いた条件下では、pcＤＮＡ-tＴＡkは細胞内で複製するが、pＴ et-tＴＡkは複製しないであろう。したがって、pＴet-tＴＡkとpcＤＮＡ-tＴＡk とで得られた値を比較することは、無意味である。図６は、Ｓ2-6細胞におけるテトラサイクリン不存在下での16日目のtＴＡタンパク質の喪失を示すオートラジオグラフの写真である。図６は、培養されたＳ2- 6およびＳ2-1細胞系からの細胞抽出物のウエスタンブロットの写真である。第１レーン:マーカータンパク質（バンドは見えない）；第２および第３レーン：tet の不存在下で16日間成長させたＳ2-6細胞;第４および第５レーン:0.5μg/mltet の存在下で16日間成長させたＳ2-6細胞；第６レーン：0.5μg/ml tetの存在下で 16日間成長させたＳ2-1細胞；および第７レーン：tetの不存在下で２日間成長させたＳ2-6細胞。tＴＡタンパク質のシグナルは、tetの不存在下で２日間成長させたＳ2-6細胞で認められるが、tetの不存在下で16日間培養された同じ細胞では認められない。レーン２〜７の底部で認められるバンド（「タンパク質先端」）は、染料先端であり、非特異的シグナルを表す。図７は、pＣＭＶ-tＴＡ、pcＤＮＡＩ-neoおよびpcＤＮＡ-tＴＡkの概略図である。図８は、pＴet-ＳpliceおよびpＴet-tＴＡkの構成の概略図である。図９は、pＴet-Ｓpliceの制限地図を表す。クローニング部位は、肉太の印刷で示す。ＥcoＲＩ部位が２つあることに注意すべきである。図９Ｂ〜９Ｇは、pＴet-Ｓpliceのヌクレオチド配列（配列番号）を示す。図10Ａは、pＴet-tＴＡkの制限地図を示す。図10Ｂ〜10Ｇは、pＴet-tＴＡkのヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列（配列番号）を示す。図11Ａは、pＵＨＤ15-1の制限地図を示す。図11Ｂ〜11Ｆは、pＵＨＤ15-1のヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列を示す。図12Ａは、pＵＨＣ-13-3の制限地図を示す。図12Ｂ〜12Ｆは、pＵＨＣ-13-3のヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列（配列番号）を示す。好ましい実施態様の詳細な説明テトラサイクリンリプレッサーのＤＮＡ結合ドメインとＶＰ16の転写活性化ドメインとよりなるトランスアクチベーター融合タンパク質(tＴＡ)の構成的発現( constitutive expression)に依存するテトラサイクリン調節誘導的遺伝子発現のための系が、最近記載された（引用によりその全体を本明細書に取り込む米国特許出願第08/076,726号；Ｇossen，Ｍ.およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａca d．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992))。この系は、低レベルのトランスアクチベータータンパク質を与えるにすぎないが、これはおそらく、tＴＡが毒性であるためであろう。この難点を避けるために、tＴＡが結合する誘導性プロモーターの制御下にtＴＡ遺伝子を置いて、tＴＡ自体の発現を誘導可能かつ自己制御性とした。該自己制御系は、組換え活性化遺伝子ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2の発現を駆動するために使用されると、実質的により高レベルのＶ(Ｄ)Ｊ組換え活性（平均で70 倍）およびはるかに高い割合のトランスフェクション化細胞（自己制御性90％対構造性18％）における誘導的発現の両方を与える。さらに、この系により、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現が、調べたほとんどの組織で基底レベルの数十倍〜数百倍で誘導された誘導性トランスジェニックマウスが作製された。発現の誘導レベルは、胸腺および肺で最高であり、構成的な系で作製された既に報告されている誘導性ルシフェラーゼトランスジェニックマウスにおけるものよりも実質的に高いと考えられる。この修飾された系を用いて、誘導性トランスアクチベーターmＲＮＡおよびタンパク質が、ＲＮＡおよびウエスタンブロット法により細胞系で容易に検出され、トランスアクチベーターmＲＮＡが、トランスジェニックマウスのいくつかの組織においてＲＮＡブロット法により検出された。この自己制御系は、培養細胞およびトランスジェニック動物の双方におけるテトラサイクリン調節遺伝子発現のための改良された戦略の一例である。前記のとおり、最近記載された誘導的テトラサイクリン発現系（Ｇossen，Ｍ．およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(199 2)）は、完全に機能的なヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）プロモーターからのtＴＡ遺伝子および誘導性プロモーターＴetpの制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子の構成的発現に依存する。この系では、テトラサイクリンは、ルシフェラーゼ遺伝子発現の活性化を妨げるが、tＴＡタンパク質が細胞に対して潜在的な悪影響を及ぼすことを妨げない(Ｇill，Ｇ.およびＰtashne，Ｍ.，Ｎatur e(Ｌondon)334:721-724(1988))。したがって、自己制御性プラスミドpＴet-tＴＡkでは、tＴＡkと称される修飾されたtＴＡ遺伝子を、Ｔetpの制御下に置いた(図１)。テトラサイクリンは、tＴＡがＴetpに結合することを妨げ、tＴＡおよびルシフェラーゼの両方の発現を妨げる。この負のフィードバックサイクルは、テトラサイクリンの存在下ではtＴＡがほとんど又は全く産生されず、そのため、考えうる毒性作用が抑制または除去されることを保証するものである。しかしながら、この戦略では、テトラサイクリンが除去された場合、微量のtＴＡタンパク質（これは最小プロモーターの漏出から生じうる）がＴet-opに結合し、tＴＡk遺伝子の発現が刺激されると予想される。正のフィードフォーワードループが開始すると、今度は、tＴＡの、そしてルシフェラーゼーのより高レベルの発現につながる(図１)。tＴＡの構成的発現の場合には、hＣＭＶプロモーターおよびそれに続くtＴＡ転写物のＲＮＡスプライシングおよびポリアデニル化を指令する追加的配列の制御下にtＴＡk遺伝子を置いた。また、このプラスミド（pcＤＮＡ-tＴＡk）には、哺乳動物細胞中のプラスミドの選択を可能とするneo遺伝子が含まれる。本発明は、真核細胞において、200〜3700倍を超える個々の遺伝子の発現の調節を可能とする自己制御性制御系に関する。この系は、例えば、大腸菌(Ｅ.coli )のＴn10(ＨillenおよびＷissmann,“Ｔopics in Ｍolecular and Ｓtructural Ｂiology”Ｐrotein-Ｎucleic Ａcid Ｉnteraction，ＳaegerおよびＨeinemann 編，Ｍacmillan，Ｌondon，1989，Vol．10，pp．143-162)（この場合、耐性媒介遺伝子の転写は、テトラサイクリンリプレッサー（tetＲ）により負に調節される）などのテトラサイクリン耐性オペロンの調節要素に基く。テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の存在下では、tetＲは、オペロンのプロモーター領域内に位置するそのオペレーターに結合せず、転写が可能となる。真核生物において転写を活性化しうるタンパク質ドメイン、例えば(i)酸性ドメイン(例えば、ＨＳＶからのＶＰ16のＣ末端ドメイン（Ｔriezenbergら，Ｇenes Ｄev．2:7 18-729(1988)）または遺伝的手段により同定され実験的に決定された非真核性酸性ドメイン(ＧinigerおよびＰtashne，Ｎature 330:670-672(1987))）または（i i）プロリンに富むドメイン（例えば、ＣＴＦ/ＮＦ-1（Mermodら，Ｃell 58:741 -753(1989)）のもの）または(ii)セリン／トレオニンに富むドメイン(例えば、Ｏct-2(ＴanakaおよびＨerｒ，Ｃell 60:375-386(1990))のもの）または（iv）グルタミンに富むドメイン（例えば、Ｓp1（ＣoureyおよびＴjian，Ｃell 55:867-898(1988)）のもの）とtetＲとを組み合わせることにより、テトラサイクリンオペレーター（tetＯ）配列と融合した最小プロモーターを刺激するハイブリッドトランスアクチベーターが得られる。これらのプロモーターは、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター（tＴＡ）がtetＯ配列に結合することを妨げる低濃度のテトラサイクリンの存在下では、実質的に沈黙している。 tetＲのオペレーター配列に対するtetＲの特異性(ＨillenおよびＷissmann， “Ｔopics in Ｍolecular and Ｓtructural Ｂiology”,Ｐrotein-Ｎucleic Ａc id Ｉnteraction，ＳaegerおよびＨeinemann編，Ｍａcmillan，Ｌondon，1989， Vol．10,pp．143-162)およびtetＲに対するテトラサイクリンの高い親和性(Ｔak ahashiら，Ｊ．Ｍol．Ｂiol．187:341-348(1986))および十分研究されているテトラサイクリンの化学的および生理的特性は、lacＲ/Ｏ/ＩＰＴＧ系よりもはるかに優れた、真核細胞における自己制御性誘導的発現系の基礎を構成する。特に、本発明は、tetリプレッサー（tetＲ）と真核生物において転写を活性化しうるタンパク質ドメインとを含むトランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合している第１のポリヌクレオチド分子に関する。tetＲをコードするポリヌクレオチドは、Ｐost leら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．12:4849-4863（1984）（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に従い得ることができる。他のtetＲ配列およびこれらのリプレッサーのそれぞれの結合部位が、同定されており(Ｗatersら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．11:6089-6105(1983); Ｐostleら，Ｎucl．Ａcids Ｒes ．12:4849-4863(1984); Ｕngerら，Ｇene 31:103-108(1984); Ｕngerら，Ｎucl ．Ａcids Ｒes．12:7693-7703(1984); Ｔovarら，Ｍol．Ｇen．Ｇenet．215:76- 80(1988); 比較および概観のためには、ＨillenおよびＷissmann，Ｐrotein-Ｎu cleic Ａcid Ｉnteraction，Ｔopics in Ｍolecular and Ｓtructural Ｂiology ，ＳaengerおよびＨeinemann(編)，Ｍacmillan，Ｌondon，Ｖol．10，pp．143-1 62(1989)を参照されたし)、記載されている発現系に使用することができる。真核生物における強力な転写トランスアクチベーターであることが知られているタンパク質ＨＳＶ-16の負に荷電したＣ末端ドメインをコードするポリヌクレオチドは、Ｔriezenbergら，Ｇenes Ｄev．2:718-729（1988）（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に従い得ることができる。好ましくは、該活性化ドメインには、ビリオンタンパク質16のＣ末端の130アミノ酸が含まれる。連結のための平滑末端化または付着末端化末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、適宜行なう付着末端のフィルイン(filling)、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なリガーゼによる連結などを含む従来の技術により、tetＲをコードするポリヌクレオチド分子を、ＨＳＶ- 16の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチド分子に結合させ、そしてベクターＤＮＡと再結合させることができる。 tetＯ配列は、例えば、ＨillenおよびＷissmann,“Ｔopics in Ｍolecular an d Ｓtructural Ｂiology”，Ｐrotein-Ｎucleic Ａcid Ｉnteraction，Ｓaeger およびＨeinemann編，Ｍacmillan，Ｌondon，1989，Ｖol．10，pp．143-162（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に従い得てもよい。本発明を実施するにおいて使用しうる他のtetＯ配列は、以下に記載する文献から入手することができる(Ｗatersら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．11:6089-6105(1983) ; Ｐostleら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．12:4849-4863(1984); Ｕngerら，Ｇene 31: 103-108(1984); Ｕngerら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．12:7693-7703(1984); Ｔovar ら，Ｍol．Ｇen．Ｇenet．215:76-80(1988); 比較および概観のためには、Ｈill enおよびＷissmann，Ｐrotein-Ｎucleic Ａcid Ｉnteraction，Ｔopics in Ｍol ecular and Ｓtructural Ｂiology，ＳaengerおよびＨeinemann(編)，Ｍacmilla n，Ｌondon，Ｖol．10，pp．143-162(1989)を参照されたし(それらの開示の全体を引用により本明細書に取り込むものとする))。tetオペレーター配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または10個またはそれを超えるコピーを使用することができ、そのような配列の数が多いほど、調節範囲を高めることができる。 tetオペレーター配列の複数のコピーは、異種タンパク質の発現を制御する能力に対して相乗効果をもたらす。サイトメガロウイルスプロモーターを特定するポリヌクレオチド配列は、Ｂos hartら，Ｃell 41:521-530(1985)（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に従い得ることができる。好ましくは、該プロモーター−エンハンサーの+75〜−53位または+75〜−31位を使用し得る。該プロモーターの後にはポリリンカー、ついでテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする遺伝子が続き得る。本発明はまた、真核生物において遺伝子発現を誘導するための自己制御性テトラサイクリン調節系であって、第２のポリヌクレオチド分子が該宿主中に導入される自己制御性テトラサイクリン調節系に関する。該第２のポリヌクレオチド分子は、関心のあるタンパク質をコードしており、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのtetオペレーター（tetＯ）配列に作動可能的に結合した最小プロモーターに作動可能的に結合している。少なくとも１つのtetＯ配列に結合した最小プロモーターは、第１のポリヌクレオチド分子に関して前記したとおりに得られる。第１のポリヌクレオチド分子と第２のポリヌクレオチド分子との違いは、該プロモーターの後にポリリンカー、ついで関心のあるタンパク質をコードする遺伝子が続き得る点にある。該調節系の作動能を示すために、ルシフェラーゼ遺伝子または他のレポーター遺伝子を使用することができるが、本発明はそのように限定されることを意図するものではない。本発明はさらに、発生および分化過程ならびに代謝経路（細胞の機能および伝達を確保するもの）に関与する同種および異種遺伝子に関する。本発明はさらに、免疫グロブリン、細胞骨格成分、細胞接着タンパク質、受容体、サイトカインペプチドホルモン、および酵素など（これらに限定されるものではない）の商業的に関心のある物質の製造に使用される細胞系に関する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド分子によりトランスフェクションされた真核細胞に関する。特に、本発明は、 (a) 原核性tetリプレッサーと真核生物において転写を活性化しうるタンパク質とを含むトランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、該第１のポリヌクレオチド分子が最小プロモーターおよび少なくとも１つのtetオペレーター配列に作動可能的に結合している分子、および (b) タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、該第２のポリヌクレオチド分子が最小プロモーターおよび少なくとも１つのtetオペレーター配列に作動可能的に結合している分子によりトランスフェクションされた真核細胞に関する。その２つのポリヌクレオチド分子は、同じまたは別々のベクター上に位置し得る。好ましい実施態様では、第１のポリヌクレオチドを、真核細胞またはトランスジェニック動物の染色体に組込み、第２のポリヌクレオチドを、ベクターの一部として導入する。組込みは、入ってくるポリヌクレオチドと特定のゲノムとの間で共有される相同性領域で乗換えがある場合に行い得る。そのようなトランスフェクション化真核細胞からの異種タンパク質の発現は、厳密に調節し得る。意外なことに、構成的発現系を使用した場合に認められる50 〜100倍を超える増加と比較すると、本発明の自己制御性発現系を使用すると、2 00〜3700倍を超える発現を誘導しうることが確認された。さらに、本発明の発現系により、異種遺伝子の発現のスイッチを可逆的に迅速に開閉することが可能となることが見出された。さらに、本発明の発現系により、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の使用量に応じて所望のレベルの発現を達成することが可能となることが見出された。このように、本発明の自己制御性発現系は、当該分野における大きな進歩である。本発明はまた、ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を減少または停止（不活性化）する方法であって、本発明のトランスフェクションされた真核細胞を、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を含む培地中で培養することを含んでなる方法に関する。培地中のテトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の濃度を注意深く制御することにより、発現の程度を厳密に制御することが可能である。ポリペプチド（ルシフェラーゼ）発現の減少は、わずか 0.0001μg/mlのテトラサイクリンで生じ始めるであろう。約0.1〜1.0μg/mlで、該発現は本質的に停止する。発現レベルの調節に使用することができるテトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の濃度は、約0.0001〜約１μg/mlの範囲であり得る。本発明はまた、ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を作動させる（活性化する）または増加させる方法であって、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を欠く培地中で、本発明の真核細胞を培養することを含んでなる方法に関する。本発明の実施において使用し得る培地には、本発明のトランスフェクションされた真核細胞に適合するいずれもの培地が含まれる。そのような培地は、商業的に入手可能である(Ｇibco/ＢＲＬ)。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド分子の１または２を含んでなるトランスジェニック動物に関する。そのようなトランスジェニック動物は、例えば、受精卵中に該ポリヌクレオチドを注入し、それを成体動物に発生させることにより入手し得る。特に、数百個のＤＮＡ分子を１細胞受精卵の前核中に注入する。ついで、微量注入された卵を、偽妊娠した仮母の卵管に移し、発生させる。Ｂri nsterら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 82:4438-4442(1985)（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）では、発生するマウスの約 25％が、微量注入されたＤＮＡの１以上のコピーを受け継ぐと報告されている。あるいは、該トランスジェニック動物は、Ｇosslerら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 83:9065-9069(1986)（その内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に記載されているとおりに、導入遺伝子を作製するために組換えＥＳ細胞を使用することにより入手し得る。前記の少なくとも１つのＴet-o p配列の転写制御下のtetＲ／転写アクチベータードメイン融合タンパク質をコードする遺伝子および／またはこの調節タンパク質の制御下の遺伝子が導入されている動物は、例えば、その２つのポリヌクレオチド分子の共注入により作製することができる。あるいは、記載されているポリヌクレオチドの１つのみが導入されている別々の動物系統を第１の行程で作製することができる： (i) 該トランスアクチベーターに制御されるべき所望の異種タンパク質をコードする遺伝子のみが導入されている動物を、所望の不活性化発現レベルに関して選別することができる。これには、所望の、一般には、低レベルの基底発現を示す組込み部位に関して選別することが容易な、最小プロモーターに依存性のtet Ｒ/転写アクチベータードメイン融合タンパク質の転写制御下のレポーター遺伝子（例えば、cat、luc、lacＺ）が導入されている指示動物が含まれる。都合がよければ、これらの実験的に決定された遺伝子座を相同的組換えアプローチ（Ｍansourら，Ｎature 336:348-352(1988)）で引き続き使用し、それにより、該レポーター遺伝子を、既に分析されている組込み部位で、関心のあるそれぞれの遺伝子と置換する。 (ii) tetＲ/転写アクチベータードメイン融合タンパク質をコードする遺伝子のみが導入された動物は、該調節タンパク質の所望の発現パターンに関して分析することができる。ついで、その２つの補完的なトランスジェニック動物系統を交配することにより、所望のダブルトランスジェニック動物が得られる。定義以下の説明では、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語を頻繁に使用する。そのような用語が表す範囲などの本明細書および請求の範囲の理解が明確で一貫したものとなるよう、以下にそれらの定義を記載する。発現：発現は、ポリペプチドが構造遺伝子から産生されるプロセスである。このプロセスには、該遺伝子からmＲＮＡへの転写、およびそのようなmＲＮＡからポリペプチド（単数または複数）への翻訳が含まれる。自己制御性発現ベクター:それは、本明細書で記載する本発明を意味する。tＴＡkと称される修飾されたtＴＡ遺伝子を、Ｔetpの制御下に置く(図１)。テトラサイクリンは、tＴＡがＴetpに結合することを妨げ、それにより、tＴＡの、そして所望のタンパク質の両方の発現を妨げる(例えば、図１におけるルシフェラーゼ)。この負のフィードバックサイクルは、テトラサイクリンの存在下ではtＴＡがほとんど又は全く産生されず、そのため、考えうる毒性作用が抑制または除去されることを保証するものである。しかしながら、この戦略においては、テトラサイクリンが除かれると、微量のtＴＡタンパク質（これは最小プロモーターの漏出から生じうる）がＴet-opに結合し、tＴＡk遺伝子の発現が刺激されると予想される。正のフィードフォーワードループが開始すると、今度は、tＴＡの、そしてルシフェラーゼーのより高レベルの発現につながる(図１)。翻訳開始のための最適な環境：これは、ＡＴＧメチオニン開始コドンおよびフランキングヌクレオチド（Ｋozak，Ｍ.，Ｃell 44:283-292(1986)で定義されているとおり）よりなる。該配列は、ＣＣ(ＡまたはＧ)ＣＣＡＴＧＧ（該開始コドンを太字で示している）である。この配列は、翻訳装置による最も効率的な翻訳開始を付与する。プロモーター：転写開始部位付近に位置する、遺伝子の５'領域として一般に記載されるＤＮＡ配列。隣接遺伝子の転写は、プロモーター領域で開始する。プロモーターが誘導性プロモーターの場合、転写速度は、誘導剤に応答して増加する。これに対し、プロモーターが構成的プロモーターの場合は、転写速度は、誘導剤により調節されない。誘導性最小プロモーター：それは、他の調節要素と一緒になって転写を開始しうるプロモーター配列からの核酸の最小数を意味する。最小プロモーターは、転写開始部位を最低限度で定めるが、それ自体は、たとえあったとしても、転写を効率的に開始することができない。そのような最小プロモーターの活性は、作動可能的に結合する結合部位へのアクチベーター（例えば、テトラサイクリンにより制御されるトランスアクチベーター）の結合により左右される。Ｖ(Ｄ)Ｊ組換え：それは、組換えにおいて使用される可変(Ｖ)、多様性(Ｄ)および連関(joining)(Ｊ)遺伝子セグメントに関してそのように称され、限られた量の遺伝情報から、発生中のリンパ球がそれらの莫大な範囲の結合特異性を生成し始めるプロセスである。発生中のリンパ球においては、７つの異なる遺伝子座（Ｂ細胞ではμ、κおよびλ、そしてＴ細胞ではα、β、γおよびδ）の組み合わせとなることが公知である。(再検討のためには、ＢlackwellおよびＡlt(1988 )，Ｉmmunoglobulin genes，Ｉn Ｍolecular Ｉmmunology，ＨamesおよびＧlove r編(Ｗashington，Ｄ.Ｃ.: ＩＲＬＰress)，pp．1-60; ＤavisおよびＢjorkman ，Ｎature 334:395-402(1988);Ｒaulet，Ｄ.Ｈ.，Ａnnu.Ｒev．Ｉmmunol．7:175 -207(1989)を参照されたし)。ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2：ＲＡＧ-1（組換え活性化遺伝子−１）およびＲＡＧ -2は、成熟中のリンパ球内で共発現される遺伝子である。Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えおよびリンパ球発生のためには、両遺伝子の発現が絶対に必要である。ＲＡＧ-1とＲＡＧ-2とが一緒に繊維芽細胞中へトランスフェクションされると、それらはＶ(Ｄ) Ｊ組換え活性を誘導する。ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2遺伝子は、脊椎動物のゲノム中に互いに隣接して存在し、無関係なタンパク質をコードする。ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2は共に、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えを行なう種の間で保存されており、それらの発現パターンは、Ｖ (Ｄ)Ｊ組換え活性のものと厳密に相関する。始祖(founder)：それは、もとの（第１世代の）トランスジェニック動物、すなわち、受精卵のゲノムを操作し、その卵を偽妊娠動物中に移植することにより作製された、導入遺伝子を担持する動物である。オペレーター：それは、隣接するプロモーターで転写が開始することを妨げるために、リプレッサータンパク質が結合するＤＮＡ上の部位である。オペロン：それは、調節遺伝子産物により認識されるＤＮＡ中の構造遺伝子および制御要素を含む、細菌の遺伝子発現および調節の単位である。リプレッサー：それは、ＤＮＡ上のオペレーターまたはＲＮＡに結合して、それぞれ転写または翻訳を妨げるタンパク質である。抑制：ある酵素の産物が存在する場合、その酵素の合成を妨げる生物の能力である。より一般的には、ＤＮＡ（またはmＲＮＡ）上の特異的部位に対するリプレッサータンパク質の結合による転写（翻訳）の阻害を意味する。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：それは、アミノ酸に対する一連のトリプレットコードを含有し、終結コドンは含まない。配列は、タンパク質へ（潜在的に）翻訳されうる。異種タンパク質：それが存在する特定の宿主生物内で天然には生じないタンパク質である。唯一の制限部位：制限酵素に認識される核酸上の部位が単一に存在することを意味する。テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質：ハイブリッド融合タンパク質であるテトラサイクリントランスアクチベーター(tＴＡ)は、tetＲＤＮＡ結合ドメインとＶＰ16の転写活性化ドメインとを合体させ、それにより、 tetＯ配列を含有する最小プロモーターにtＴＡが結合すると、該標的遺伝子の転写が活性化される。テトラサイクリンがtＴＡに結合すると活性化を妨げるのは、おそらく、tＴＡがtetＯに結合するのを遮断するtＴＡのtetＲ部分のコンホメーション変化を引き起こすことによるものであろう(Ｈinrichs，Ｗら，Ｓcience 264:418-420(1994))。テトラサイクリンを除くことにより、遺伝子の活性化が得られる(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992))。ドメイン：タンパク質のドメインは、特定の機能に対応しうるアミノ酸配列の別個の連続的部分である。クローニングベクター：宿主細胞中で自律複製能を有し、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけられるプラスミドまたはファージＤＮΛまたは他のＤＮＡ配列であり、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位において、そのようなＤＮＡ配列を、該ベクターの本質的な生物機能を失うことなく決定可能な態様で切断し得、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位中へ、ＤＮＡ断片を挿入(splice)して、その複製およびクローニングを引き起こしてもよい。該クローニングベクターは、それにより形質転換された細胞の同定に使用するのに適したマーカーをさらに含有していてもよい。発現ベクター：クローニングベクターに類似しているが、その中へクローニングされた遺伝子の発現を宿主中への形質転換の後で高め得るベクター。そのクローニングされた遺伝子は、通常、ある制御配列（例えば、プロモーター配列）の制御下に置かれる（すなわち、その配列に作動可能的に結合している）。プロモーター配列は、構成的または誘導的のいずれであってもよい。真核細胞：本発明では、真核細胞は、酵母、植物細胞、昆虫細胞、例えばシュナイダーおよびＳf9細胞；哺乳動物細胞、例えばリンパ系およびＨeＬa細胞(ヒト)、ＮＩＨ3Ｔ3および胚幹細胞（マウス）およびＲＫ13（ウサギ）細胞を含む（これらに限定されるものではない）いずれもの真核生物の細胞であり得る。組換え真核宿主：本発明では、組換え真核宿主は、発現ベクターまたはクローニングベクター上に本発明のポリヌクレオチド分子を含有するいずれもの真核細胞であり得る。この用語は、その生物の染色体、ゲノムまたはエピソーム中に所望のポリヌクレオチド分子を含有するよう遺伝的に操作されている真核細胞をも包含する意である。したがって、組換え真核宿主細胞は、タンパク質を安定発現または一過性発現する能力を有する。組換えベクター：本発明のポリヌクレオチド分子を含有するいずれものクローニングベクターまたは発現ベクター。宿主：複製可能なベクターの受容細胞であるいずれもの原核または真核細胞。本発明で使用する「宿主」なる語には、その染色体またはゲノム上に所望の遺伝子（単数または複数）を含有するよう、よく知られている技術により遺伝的に操作することができる原核または真核細胞をも含まれる。そのような宿主の具体例に関しては、Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙo rk(1989)を参照されたし。遺伝子：ポリペプチドへ翻訳されずＲＮＡとして機能するＲＮＡ分子（例えば、リボソーム遺伝子）を含む、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子を発現させるのに必要な情報を含有するＤＮＡ配列。構造遺伝子：メッセンジャーＲＮＡ（mＲＮＡ）に転写されるＤＮＡ配列。該m ＲＮＡはついで、特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列へ翻訳される。ポリヌクレオチド分子：ポリヌクレオチド分子は、ポリデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）またはポリリボ核酸分子（ＲＮＡ）であり得る。相補的ＤＮＡ（cＤＮＡ）：「相補的ＤＮＡ」または「cＤＮＡ」遺伝子には、 mＲＮＡの逆転写により合成され、介在配列（イントロン）が除去されている組換え遺伝子が含まれる。断片：ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子の「断片」は、その分子のいずれものポリペプチドまたはポリヌクレオチドのサブセットを意味する。テトラサイクリン類似体：「テトラサイクリン類似体」は、テトラサイクリンと密接に関連しており、少なくとも約10⁶Ｍ^-1のＫaでtetリプレッサーと結合する多数の化合物のいずれか１つである。好ましくは、テトラサイクリン類似体は、約10⁹Ｍ^-1以上（例えば、10¹¹Ｍ^-1）の親和性で結合する。そのようなテトラサイクリン類似体としては、例えば、ＨlavkaおよびＢoothe,“Ｔhe Ｔetracycl ines”,Ｈandbook of Ｅxperimental Ｐharmacology 78，Ｒ.Ｋ．Ｂlackwoodら( 編)，Ｓpringer-Ｖerlag，Ｂerlin-Ｎew Ｙork，1985; Ｌ.Ａ．Ｍitscher,“Ｔh e Ｃhemistry of the Ｔetracycline Ａntibiotics”,Ｍedicinal Ｒeseach 9，Ｄekker，Ｎew Ｙork，1978; Ｎoyee Ｄevelopment Ｃorporation,“Ｔetracycl ine Ｍanufacturing Ｐrocesses”,Ｃhemical Ｐrocess Ｒeviews，Ｐark Ｒidg e，Ｎ.Ｊ.，2 volumes，1969; Ｒ.Ｃ．Ｅvans,“Ｔhe Ｔechnology of the Ｔetracyclines”,Ｂiochemical Ｒeferenc e Ｓeries 1，Ｑuadrangle Ｐress，Ｎew Ｙork，1968; およびＨ.Ｆ．Ｄowling ,“Ｔetracycline”,Ａntibiotics Ｍonographs，no．3，Ｍedical Ｅncycloped ia，Ｎew Ｙork，1955（これらそれぞれの内容の全体を引用により本明細書に取り込むものとする）に開示されているもの（これらに限定されるものではない）などが挙げられる。培養細胞にける構成的発現系と自己制御性誘導的発現系との比較 pcＤＮＡ-tＴＡkおよびpＴet-tＴＡkがルシフェラーゼ活性の高レベルの発現を指令し、pＴet-tＴＡkにより指令される発現が誘導可能であることを確認した後(図５を参照されたし)、これらのプラスミドの機能特性(組換え活性化遺伝子ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2によりコードされる高レベルのタンパク質を発現する能力)を、より厳密なアッセイで比較した(Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-104 8(1989); Ｏettinger，Ｍ.Ａ.ら，Ｓcience 248:1517-1523(1990))。リンパ系の発生の間に、ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2は、可変(Ｖ)、多様性(Ｄ)および連関(Ｊ) 遺伝子セグメント成分から機能的免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体遺伝子が集合する（Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えとして公知の過程である）ことに関与する。ここで記載する実験で最も重要なのは、ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2が、非リンパ系細胞においてＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼを活性化するために必要かつ十分であり(Ｓchatz，Ｄ .Ｇ.ら，Ａnnu．Ｒev．Ｉmmunol．10:359-383(1992)で論評されている)、Ｖ(Ｄ) Ｊリコンビナーゼの活性が、染色体外組換え基質を用いて定量的にアッセイできることである(Ｈesse，Ｊ.Ｅ.ら，Ｃell 49:775-783(1987))。種々のプロモーターを使用してＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞においてＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2を発現するために広範な努力がなされているが、標準的な染色体外組換え基質を用いてアッセイした場合に数パーセントを超える組換え頻度（Ｒn）を得るのは困難であることが示されている(Ｓadofskyら，Ｎuc．Ａcids．Ｒes．22 :1805-1809(1994); Ｓadofskyら，Ｎuc．Ａcids．Ｒes．21:5644-5650(1993); ＣuomoおよびＯettinger，Ｎuc．Ａcids．Ｒes．22:1810-1814(1994))。他の研究者らにより開発された高力価のＲＡＧレトロウイルスのみが、再現性よく10％ものＲnを獲得する能力を示している(Ｓilver，Ｄ.Ｐ.ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ 90:6100-6104(1993))。しかしながら、明らかなことは、Ｒnが、少なくとも３桁を超えるオーダーでＲＡＧ発現レベルと強く相関しているということである(0 .01％がら10％を優に超えるＲn；Ｏltz，Ｅ.Ｍ.ら，Ｍol．Ｃell．Ｂiol．13(10 ):6223-6230(1993))。したがって、Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼの活性により測定されるＲＡＧタンパク質の発現能は、該タンパク質の発現に伴う難点と該アッセイの感度および範囲の両方故に、誘導的発現系の適当な指標となる。 pcＤＮＡ-tＴＡk（17個のクローン）またはpＴet-tＴＡk（10個のクローン）により安定にトランスフェクションされたＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞クローンを、組換え基質およびＴetp調節ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2による一過性トランスフェクションの後にＶ(Ｄ)Ｊ組換えを行なう能力に関して試験した。各クローンを、テトラサイクリンの存在下（非誘導状態）または不存在下（誘導状態）で平行してアッセイし、その結果を、ＲＡＧ-1またはＲＡＧ-2を欠く（図２Ａおよび２Ｂの最初のサンプル）か又は非常に活性な構成的なＲＡＧ発現構築物（この場合、ＲＡＧ発現はhＣＭＶプロモーターにより駆動される；図２Ａおよび２Ｂの２番目のサンプル）を含有する対照トランスフェクションと比較した。さらに、pＴet- tＴＡkおよびＴetp調節ＲＡＧ発現ベクターにより安定にトランスフェクションされた２つのＮＩＨ3Ｔ3クローンを、テトラサイクリンの存在下または不存在下での組換え基質の一過性トランスフェクション（図２Ｂの最後の２つのサンプル）によりアッセイした。該自己制御性発現系（pＴet-tＴＡk）は、構成的発現系（pcＤＮＡ-tＴＡk）を越える実質的な改良を表す。17個のpcＤＮＡ-tＴＡkトランスフェクション体のうちの３個（18％）だけが、明らかに検出可能なレベルのＶ(Ｄ)Ｊ組換えを有しており(図２Ａ)、組換えの最高レベル（クローンＳ1-17）は、構成的に活性なＲＡＧ発現ベクターを用いる陽性対照で認められるものの３倍である(第２サンプル；図２Ａ)。テトラサイクリンを除くと、これらの３つクローン（Ｓ1-12、Ｓ1-13、Ｓ1-17）において、50〜100倍を超える組換えが誘導された。これに対して、10個のpＴet-tＴＡkトランスフェクション体のうちの９個(90％)（図２Ｂ）で、高レベルの組換えが示され(図２Ａと図２Ｂとで目盛りが異なることに注意されたし)、最高レベル（Ｓ2-1での28％）は、該陽性対照（図２Ｂ、第２サンプル）よりも約50倍高かった。これらの９個のクローンにおける誘導能は非常に優れており、 200〜3700倍を超える範囲であった。pＴet-tＴＡkおよびＴetp調節ＲＡＧプラスミドにより安定にトランスフェクションされたクローンにおいて得られた、認められた組換え頻度は同等に高かった(Ｓ4-9およびＳ4-5；図２Ｂの最後の２つのサンプル)。 pＴet-tＴＡkトランスフェクション体Ｓ2-6およびpＴet-tＴＡk＋pＴet-Ｒ1Ａ /Ｃ+pＴet-Ｒ2Ａトランスフェクション体Ｓ4-9のさらなる特徴づけから、高レベルのＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を誘導する能力が再現性あるものであり、組換えが0.01μg/mlテトラサイクリンで３倍、0.1μg/mlテトラサイクリンで20倍減少することが示された。10日以内に50％を超える細胞死が認められ、検出可能な tＴＡタンパク質の喪失が３週間までにテトラサイクリンの不存在下で培養されたＳ2-6細胞においてみられた(図６)。図３Ａは、tＴＡを安定に発現する誘導細胞系ならびにＲＡＧ-1および／またはＲＡＧ-2を安定にまたは一過性に発現する誘導細胞系において、tＴＡk並びにＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2遺伝子に対応するmＲＮＡが検出されることを示す。図３Ｂは、テトラサイクリンの除去により48時間誘導されたＳ2-6細胞において、t ＴＡタンパク質がウエスタンブロット法により容易に検出可能であることを示す。誘導性トランスジェニックマウスの作製自己制御性テトラサイクリン系をトランスジェニックマウスで使用できる可能性を評価するために、pＴet-tＴＡkpおよびＵＨＣ13-3の関連部分を精製し、受精卵に同時微量注入し、ついでそれを偽妊娠雌マウスに移植した。５匹の導入遺伝子陽性の始祖を、３〜18日間テトラサイクリンを除去されたマウスからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のルシフェラーゼレベルを測定することにより、誘導能に関して選別した。３匹の始祖（＃17、＃19および＃20）は、誘導後に高レベルのルシフェラーゼ活性を示し、それは、同じ実験で導入遺伝子陰性マウスからのＰＢＭＣの抽出物で得られたものの70〜900倍であった(表１)。始祖＃11は漏出性であり、＃12は、ＰＢＭＣにおいて誘導性ルシフェラーゼを示さなかった。種々の始祖における導入遺伝子の誘導能および漏出の多様性は、その組込まれた導入遺伝子の組込み部位および／または構造から生じると推定される。ＰＢＭＣにおけるルシフェラーゼ発現または漏出のレベルと、該導入遺伝子のコピー数との間に、明らかな相関性はなかった。特に重要なのは、テトラサイクリン不存在下で前もって７日間誘導した後、テトラサイクリンを含有する水をマウス＃20に再び18日間与えたところ、ルシフェラーゼレベルが実質的にバックグラウンドにまで低下したことであり、このことは、導入遺伝子の誘導が可逆的であることを示すものである(表１)。導入遺伝子の生殖細胞系伝達は、始祖＃17と＃ 20とからは達成されたが、＃19からは達成されなかった。 ^aサザンブロット法から推定された、pＴet-tＴＡおよびpＵＨＣ13-3(pＴet-lu c)z導入遺伝子のおよそのコピー数。 ^b値は、示されている日数だけテトラサイクリンを除いたマウスからのＰＢＭＣsの細胞抽出物で測定した、10⁶個の細胞当たりの光単位（溶解緩衝液バックグラウンドが差し引かれている）を表す。括弧内の値は、同じ日に行なったアッセイにおける導入遺伝子陰性マウスからの細胞抽出物の場合に対する、ルシフェラーゼ活性の増加または減少倍率である。７日^*は、飲料水のテトラサイクリンを７日間除き、ついでそれを18日間戻したマウスからの細胞抽出物で測定されたルシフェラーゼ活性を示す。トランスジェニックマウスにおけるルシフェラーゼの誘導能をより注意深く分析するために、始祖＃17および＃20（Ｃ57Ｂ1/6と戻し交雑した）の第２または第３世代の導入遺伝子陽性の子孫の種々の組織および器官から、７または８日間テトラサイクリンを除き、テトラサイクリン上で維持された導入遺伝子が同一の陽性子孫と比較した。図４および表２に示すとおり、マウス＃51（始祖＃17からのもの）の子孫は、調べたすべての器官においてルシフェラーゼ活性を示した。ルシフェラーゼ活性のレベルは、組織により実質的に異なっており、発現は、胸腺および肺で一貫して高く、肝臓および腎臓で低かった。誘導は、精巣における２倍から胸腺における150倍までの範囲であった。また、テトラサイクリンの不存在下で発生した導入遺伝子陽性マウスの17日の胎児脳および肝臓において、ルシフェラーゼ活性（10⁵〜４×10⁶rＬＵ/mgタンパク質）が検出された。さらに、テトラサイクリンの不存在下で発生し、妊娠から3.5ヶ月まで維持された導入遺伝子陽性マウスは、最適レベルのルシフェラーゼを発現し続け、正常と思われた。また、始祖＃20からの子孫は、胸腺および肺において、最高レベルの誘導性ルシフェラーゼ活性を示し、一方、ルシフェラーゼの誘導能および組織分布は、始祖＃17の子孫の場合よりも限られていた。テトラサイクリンを除いた後、マウス＃ 51の子孫からの胸腺および肺において、tＴＡ mＲＮＡレベルが明らかに誘導されることが、ノーザンブロット法から示された(図３Ｃ)。６ヶ月までの間テトラサイクリンを除かれたマウスは、健康に見えたが、これは、tＴＡタンパク質のインビボでの誘導が、無毒性であり、致死性でないことを示すものである。また、誘導マウスからの胸腺においては、mＲＮＡが、ルシフェラーゼ遺伝子に特異的なプローブとハイブリダイズすることが認められた。 /a この平均値は、図４に示す実験からのデーターと合致する。各群のマウスの数を括弧内に示す。各組識についての誘導の平均倍率を示す。値は、溶解緩衝液バックグラウンド（130rＬＵ〜180rＬＵ）を差し引いたrＬＵ/mgタンパク質を示す。ここに記載される自己制御系（pＴet-tＴＡk）は、培養細胞における構成的発現戦略（pcＤＮＡ-tＴＡk）を越える実質的な改良を表すが、これはおそらく、それが、非誘導状態のトランスアクチベーターの毒性作用を妨げ、誘導後により高レベルのトランスアクチベーターを許容するためであろう。構成的発現の戦略は、以下の２点で、それほど効果的ではない：何らかの発現を与えるクローンのフラクション(fraction)はより少なく(18％対90％)、誘導されたＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼレベルは、はるかに低い(すべてのクローンにわたる平均で、70倍を超える)。その２つの系による遺伝子発現の誘導の速度論は、比較しうるものであると考えられる。自己制御系による予備実験では、トランスアクチベーターmＲＮＡの強力な発現が、誘導の12時間後に認められ、これは、構成的系の24時間の時点で認められるタンパク質発現の最適レベルと一致する(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 89:5547-5551(1992))。pＴ et-tＴＡkの安定なトランスフェクションにより、後続する一過性または安定なトランスフェクションにより種々の遺伝子を誘導的に発現しうるアクチベーター細胞系の容易な誘導化(derivation)が可能となるはずである。重金属イオンまたは芳香族炭化水素により活性化された遺伝子を使用して誘導性トランスジェニックマウスを作製するためのこれまでの試みは、漏出、比較的低レベルの誘導、限定された組織特異性、および誘導剤の毒性または発癌性により妨げられている(Ｊones，Ｓ.N.ら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．19(23):6547-6551(1 991); Ｇoodnow，Ｃ.Ｃ.ら，Ｎature 342:385-391(1989); およびＹarranton，Ｇ.Ｔ.，Ｃurr．Ｏpin．Ｂiotech．3:506-511(1992)で論評されている)。誘導性トランスジェニックマウスを作製するために、構成的テトラサイクリン系が使用されており(Ｆurth，Ｐ.Ａ.ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 91:9302-9 306(1994))、これは、これまでのこれらのアプローチの難点のいくつかを回避するものである。同等感度のルシフェラーゼ測定法を使用するとすると、該自己制御系は、およそ２桁倍大きなルシフェラーゼ活性を、胸腺（該構成系での最大1.1×10⁴rＬＵ/mgタンパク質対該自己制御系での2.5×10⁶rＬＵ/mgタンパク質）および肺（該構成系での最大1.5×1 0³rＬＵ/mgタンパク質対該自己制御系での1.7×10⁵rＬＵ/mgタンパク質）において与える。該自己制御系のさらなる利点は、胸腺におけるルシフェラーゼ活性のより大きな誘導（150倍対67倍）、および該非修飾系で活性をほとんど又は全く示さない組織（例えば、肺、腎臓および脳）における容易に検出可能なレベルのルシフェラーゼ活性にあると考えられる。さらに、胸腺、脾臓およびリンパ腺において活性が検出されるため、この系は免疫系の研究に特に適しているであろう。受精後にテトラサイクリンの不存在下に維持されたルシフェラーゼを発現する成体トランスジェニックマウスからのヘマトキサリン／エオシン染色組織切片では、脾構造のひどい破壊は認められなかった。非修飾系で認められるとおり、漏出は胸腺では構成系よりも自己制御系において高いが、組織によって異なる。ルシフェラーゼタンパク質標準との比較により、胸腺で認められたルシフェラーゼ活性は、１細胞当たり平均約30分子のルシフェラーゼに相当する。しかしながら、いずれのフラクションの細胞がルシフェラーゼ活性を発現するか、あるいは、発現細胞間において発現レベルがどのように異なるのかについては知られていない。この系におけるtＴＡ発現の誘導は、tＴＡ導入遺伝子の低レベルの漏出に左右されるため、個々の細胞型および分化段階の転写プロフィールによって誘導能が異なると予想される。したがって、ルシフェラーゼタンパク質の１細胞当たりの計算は、個々の細胞で誘導された実際のレベルを過少表示している。これらの結果は、Ｔetpに制御されるレポーター導入遺伝子からの高度に誘導可能で可逆的な発現を、pＴet-tＴＡk構築物を使用することにより得ることができることを示し、テトラサイクリンおよびこれらの導入遺伝子の存在下で、マウスが正常に発生できることを示唆し、テトラサイクリンの除去による誘導は、該マウス、その繁殖能力または胎児発生に対する明らかな悪影響に全くつながらないことを示唆する。したがって、tＴＡタンパク質のインビボでの潜在的な毒性は、重要な問題ではあり得ない。誘導されたマウスは、テトラサイクリン除去の3.5 ヶ月後においても依然として最適レベルのルシフェラーゼを発現し、テトラサイクリンの不存在下でも少なくとも６ヶ月は生存可能なままであり、このことは、導入遺伝子発現が許容され(torelate)、ダウンレギュレーションされないことを示唆するものである。該pＴet-tＴＡk系は、いずれもの所望する遺伝子（単数または複数）の発現を誘導的に指令する能力を有するはずである。この発現系は、トランスフェクションされた細胞およびインビボでの遺伝子機能の研究、治療剤の試験のための疾患モデルの作製、および哺乳動物生物の発生の理解のための検討に広範に適用可能であるはずである。それは、それを用いなければ非常に毒性で該生物が発生の間許容できない遺伝子の調節的トランスジェニック発現を可能とするのに特に有用であろう。実施例以下の実施例は、本発明のある好ましい実施態様をさらに例示するものであり、本発明を何ら限定するものではない。材料および方法プラスミド構築物の詳細：プラスミドpＵＨＣ13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)に記載されている）は、5157塩基対のサイズであり、診断的制限消化に使用しうる３個のＥcoＲＩ制限部位（454、667および4036 位）を有する。該プラスミドは、以下の３個の主要断片よりなる：（１）colＥ1 複製起点、Ｔn2661（ＨincII部位およびＰstＩ部位が除去されている）のＰ_bla/ _p3 を有するβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含むpＢＲ322配列；（２）７量体化したtetオペレーターを上流に有するhＣＭＶ最小プロモーター（開始部位に対して −53）を有する調節領域；および（３）pＳＶ-2-luc（de Ｗetら，Ｍol．Ｃell ．Ｂiol．7:725-37(1987)）からの３'フランキング領域を有するルシフェラーゼ遺伝子。pＵＨＣ13-3の地図に関しては図12Ａを、pＵＨＣ13-3の配列に関しては図12Ｂ〜12Ｆを参照されたし。 pＵＨＤ15-1(図11を参照されたし)（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＥcoＲＩ部位とＸbaＩ部位との間の配列を、二本鎖オリゴヌクレオチド（その配列は図７の右上部に示されている）で置換して、pＣＭＶ-tＴＡkを作製した(工程１)。該挿入配列は、該tＴＡ遺伝子に、翻訳開始のための最適な環境を付与し(Ｋozac，Ｍ.，Ｎuc．Ａcids Ｒes．12: 857-872(1984))、tＴＡタンパク質（２位のアラニン）中にアミノ酸を挿入し、そして後続のクローニング工程のための唯一のＨindIII部位を付与する。この修飾されたtＴＡ遺伝子は、本明細書では、tＴＡkと称される。ついで、tＴＡk遺伝子を含有するpＣＭＶ-tＴＡkのＨindIIIからＢamＨＩまでの断片を、pcＤＮＡＩ-neo（Ｉnvitrogen Ｃorporation）のＨindIIIからＢamＨＩまでの部位内にクローニングして、pcＤＮＡ-tＴＡkを作製する(図７の工程２)。プラスミドpＴet-tＴＡkは、tＴＡk（コンセンサスなコザック翻訳開始部位が挿入されているtＴＡ遺伝子に関して本明細書で使用する略称）と称される修飾されたtＴＡ遺伝子を、pＵＨＣ-13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＴetプロモーターの制御下に置く。したがって、該構築物は、自己制御性である。まず、ＳＶ40スプライスおよびポリＡ部位を有するベクター中にpＵＨＣ13-3 のＴetプロモーターを有するベクターを構築し、ついで該Ｔetプロモーターと該スプライス／ポリＡとの間にtＴＡkを挿入することにより、pＴet-tＴＡkを構築した。ＳＶ40介在配列は、スモールＴ抗原［ＭboＩ（0.56mu＝4100）からＭboＩ (0.44mu＝4710)］に由来する。ＳＶ40ポリＡ配列は、ＢclＩ（0.19mu＝2770）からＥcoＲＩ(0mu＝1782)までのＳＶ40であり、初期ポリアデニル化配列およびＳＶ40後期領域の３'末端配列を含有する(与えられている同等物はＳV40についてのものである)。該スプライス領域のすぐ上流には、細菌ＣＡＴ遺伝子（非翻訳配列）の３'末端に由来する125bpがある：これらの配列は何ら悪影響を及ぼさないと考えられ、それらが便利な制限部位を付与するというだけの理由で含めることとした。pＴet-tＴＡkの地図に関しては図10Ａを、pＴet-tＴＡkの配列に関しては図10Ｂ〜10Ｇを参照されたし。 pＴet-tＴＡk、pＳplice-ＰＡの構築のための開始プラスミドは、ＥcoＲＩ部位のクレノウフィルインの後でＸbaＩリンカーを連結することにより、pＨＡＶ- ＣＡＴ(Ｊones ら，Ｎuc．Ａcids Ｒes．19:6547-6551(1991)）のＳcaＩからＥcoＲＩまでの断片をpＢＫＳII⁺（Ｓtratagene）のＸbaＩ部位中に挿入することにより構築した。図８に示すとおり、pＳplice-ＰＡプラスミドは、スモールＴ抗原に由来するＳＶ40介在配列およびＳＶ40初期ポリアデニル化配列を含有する。最小ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）プロモーターの上流のtetオペレーターの７個のコピーを含有するpＵＨＣ13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓ ci.ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＸhoＩからＳalＩまでの断片を、pＳplice- ＰＡのユニークＸhoＩ部位中にクローニングして、pＴet-Ｓpliceを得た（図８、工程１）。このtetオペレーター含有プロモーターを、本明細書では、Ｔetpと称する。pＴet-Ｓpliceは、関心のある遺伝子をＴetp配列と該スプライス／ポリＡ配列との間へ容易に挿入するための多数の唯一の制限部位を含有する。pＴet- Ｓpliceの地図に関しては図９Ａを、pＴet-Ｓpliceの配列に関しては図９Ｂ〜９Ｇを参照されたし。ついで、tＴＡk遺伝子を含有するpＣＭＶ-tＴＡkのＨindIII からＢamＨＩ（クレノウで平滑化）までの断片を、pＴet-ＳpliceのＨindIIIからＥcoＲＶまでの部位中にクローニングして、pＴet-tＴＡkを得た（図８、工程２）。これらの実験で使用されるＴetpに制御されるマウスＲＡＧ-1発現構築物は、p Ｒ1Ａ/Ｃのコード領域をＢamＨＩ（クレノウで平滑化）からＸbaＩまでの断片としてpＴet-ＳpliceのＥcoＲＶからＳpeＩまでの部位中に挿入して、pＴet-Ｒ1/ Ｃを得ることにより構築した。しかしながら、ＲＡＧ-1をコードする核酸分子は、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができるし、あるいはいずれもの他の起源から単離することができる。ＲＡＧ-1の完全な配列に関しては、Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989)を参照されたし。pＲ1Ａ/ＣのＲＡＧ-1コード領域は、アミノ酸２〜89およびアミノ酸1009〜1040の欠失、第２コドンの直後への６個のヒスチジンの付加、該ヒスチジンの直後へのアラニンおよびセリンコドンの挿入によるＮheＩ部位の導入、およびＡＵＧ開始コドンを囲む(surround)コンセンサス翻訳開始環境の付加により、完全長のマウスＲＡＧ-1 と比べて改変されている。ＲＡＧ-1のこの欠失突然変異体は、完全長マウスＲＡＧ-1よりも有意に大きなＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を有する。本明細書において使用するテトラサイクリン制御性マウスＲＡＧ-2発現構築物は、pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のＸholからＸbalまでの断片をpＴet-ＳpliceのＳalＩからＳpeＩまでの部位中に挿入してpＴet-Ｒ2Ａを得ることにより構築した。しかしながら、ＲＡＧ-2をコードする核酸分子は、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができるし、あるいはいずれかの他の入手可能な起源から単離することができる。ＲＡＧ-2の完全な配列に関しては、1992年10月27日付け発行の米国特許第5,159,066号またはＯettinger，Ｍ.Ａ.ら，Ｓcience 248:1517-152 3(1990)を参照されたし。pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のＲＡＧ-2コード領域は、アミノ酸492 〜527のＣ末端欠失、ＡＵＧ開始コドンを囲むコンセンサス翻訳開始環境の付加、および２位におけるアラニンコドンの挿入により、完全長のマウスＲＡＧ-2に対して改変されている。このＲＡＧ-2突然変異体は、完全長マウスＲＡＧ-2よりもある程度高いＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を有する。実施例１：プラスミドの構築 tＴＡオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含有するpＵＨＤ15-1(Ｇossen ，Ｍ．およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551 (1992))のEcoＲＩ-ＢamＨＩ断片を、翻訳開始のための最適環境を付与する30bp オリゴヌクレオチド（配列番号）（Ｋozak，Ｍ.，Ｎucl．Ａcids Ｒes．12:857- 872(1984)）および後続のクローニングのための唯一のＨindIII部位の付加により、その５'末端で修飾した。その付加されたヌクレオチドは、図７の右上部に示されているものである。付加されたヌクレオチドの数は、ＥcoＲＩおよびＸba Ｉ酵素部位のヌクレオチドを計数するか否かで異なる。単純化のために、該ＯＲＦの修飾された５'末端を、本明細書では、30bpオリゴと称することにする。以下、該修飾tＴＡ遺伝子をtＴＡkと称する。ＨindIII-ＢamＨＩ tＴＡk断片を、p cＤＮＡＩ-neo(Ｉnvitrogen Ｃorporation)のＨindIII-ＢamＨＩ部位中にクローニングして、pcＤＮＡ-tＴＡkを得る。pcＤＮＡーtＴＡkでは、tＴＡk遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）の前初期遺伝子(immediate early gene) のエンハンサーおよびプロモーター配列の転写制御下にある。プラスミドpＳpli ce-ＰＡは、ＳＶ40スモールＴ抗原介在配列およびＳＶ40初期ポリアデニル化配列（pＨＡＶ-ＣＡＴ（Ｊones，Ｓ.Ｎ.ら，Ｎucl．Ａcids Ｒes.19:6547-6551(19 91)）からのもの）をpＢＫＳII⁺（Ｓtratagene）中に挿入することにより構築した。最小プロモーター（以下、Ｔetpと称する）の上流のtetオペレーターの７個のコピーを含有するpＵＨＣ13-3(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard ，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ:89:5547-5551(1992))のＸhoＩ-Ｓal Ｉ断片を、pＳplice-ＰＡのスプライス／ポリＡ配列の上流にクローニングして、pＴet-Ｓpliceを得た。tＴＡk遺伝子を、pＴet-Ｓplice中にクローニングして pＴet-tＴＡkを得、該転写開始部位をtＴＡkＡＵＧの143bp上流に置いた（図１）。Ｔetp制御性マウスＲＡＧ-1発現構築物（pＴet-Ｒ1Ａ/Ｃ）は、pＲ1Ａ/Ｃのコード領域をpＴet-Ｓplice中に挿入することにより構築した。pＲ1Ａ/ＣのＲＡＧ -1コード領域は、Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性の少なくとも２倍の増加（すなわち、ＶＤＪが、Ｒ1Ａ/ＣによりＲ1Ａに対して、そしてＲ2ＡによりＲ2に対しての２倍増加）を引き起こす小さなＮおよびＣ末端欠失により、完全長マウスＲＡＧ-1と比べて改変されている。該Ｔetp制御性マウスＲＡＧ-2発現構築物（pＴet -Ｒ2Ａ）は、pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のコード領域をpＴet-Ｓplice中に挿入することにより構築した。このＲＡＧ-2コード領域は、Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性の小さな増加を引き起こす小さなＣ末端欠失により、完全長マウスＲＡＧ-2に対して改変されている。pＴet-Ｒ1およびpＴet-Ｒ2は、pＴet-splice部位中に挿入されているそれぞれ完全なＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2のＯＲＦよりなる。実施例２：トランスフェクションされた細胞系の細胞培養および誘導化既に記載されているとおりに(Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989) )、10μgの線状化プラスミドを0.5×10⁶個のＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞中にリン酸カルシウム／グリセロールショックでトランスフェクションし、トランスフェクションの48時間後に0.75mg/ml Ｇ418および0.5μg/mlテトラサイクリン中で細胞をプレーティングすることにより、pcＤＮＡ-tＴＡkの安定なトランスフェクション体を作製した。12日後に拾い上げた単一のコロニーを、0.5mg/ml Ｇ418、0.5 μg/mlテトラサイクリン中で成長させた。 10μgの各線状化プラスミドを１μgの線状化pＳＶ2-Ｈisと共にトランスフェクションし、ついで、Ｌ−ヒスチジノールを含有するがヒスチジンを欠く培地中で選択する（既に記載されているとおりに行なった(Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989))）ことにより、pＴet-tＴＡk単独のあるいはpTet-tＴＡkと pＴet-Ｒ1Ａ/ＣとpＴet-Ｒ2Ａとの安定なトランスフェクション体を作製した。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションの開始時から0.5μg/ml テトラサイクリンの存在下で維持した。実施例３：Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性のアッセイ他の研究者により記載されているとおりに(Ｌewis，Ｓ.Ｍ.およびＨesse，Ｊ. Ｅ.，ＥＭＢＯＪ．10(12):3631-3639(1991))、染色体外レポータープラスミドp Ｄ243（シグナルジョイント(ｊoint)欠失基質）を使用してＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を測定した。簡単に言えば、ＮＩＨ3Ｔ繊維芽細胞系を、リン酸カルシウム／グリセロールショックトランスフェクション法により、10μgのpＤ243を用いて、および示されている場合には６μgのpＴet-Ｒ1Ａ/Ｃおよび4.8μgのpＴ et-Ｒ2Ａを用いてトランスフェクションした。「tet^-」と示されているサンプルでは、トランスフェクション後に該細胞培養からテトラサイクリンを除いた。他の場合（「tet⁺」）には、0.5μg/mlテトラサイクリンを含有する培地中に細胞を維持した。トランスフェクションの48時間後に該細胞の急速アルカリ溶解により染色体外プラスミド分子を収穫し、その単離されたＤＮＡの小さなアリコートをＭＣ1061細菌中にエレクトロポレーションした。そのエレクトロポレーションされた細菌を、100μg/mlアンピシリン（Ａ）を含有するＬＢ寒天平板上および11 μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリン（ＣＡ）を含有する平板上に広げた。37℃で16時間増殖させた後、ＣＡ耐性コロニーの総数をＡ耐性コロニーの総数で割り100倍することにより、組換えの割合（％）（Ｒn）を算出した。トランスフェクションの48時間後にＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞から収穫されたプラスミドの99％よりも多くが、少なくとも１回複製しており(ＤpnＩによる消化に対する抵抗性により示される)、このことは、収穫されたプラスミド分子の実質的にすべてが、トランスフェクションされた細胞の核内に入り、したがって組換えに利用(accessible)されたと考えられることを示すものである(Ｌieber Ｍ.Ｒ.ら，Ｇenes and Ｄevel．1:751-761(1987))。実施例４：ＲＮＡブロット分析全細胞ＲＮＡを１〜1.2％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動した後、ナイロン膜（Ｚetabind，ＣＵＮＯまたはＧenescreen Ｐlus，ＮＥＮ）へブロッティングし、ついで、ランダムヘキサマー標識キット（Ｂoehringer Ｍan nheim）を用いて調製されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2のmＲＮＡを検出するプローブを、それぞれＲＡＧ-1またはＲＡＧ-2コード領域の断片から調製した(Ｓchatｚ，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989); Ｏettinger，Ｍ.Ａ.ら，Ｓcience 248:1517-1523(1990))。アクチンのためのプローブは、既に記載されている(Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989) )。実施例５：ウエスタンブロット分析１レーン当たり1.5×10⁷個の細胞からのタンパク質を、８％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ-ＰＡＧＥに付し、0.2ミクロンのＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ-ＲＡＤＬaboratories）へエレクトロブロットした。膜をＴＴＢＳ（トリス緩衝塩液＋0 .1％Ｔween-20）中の１％ＢＳＡ、0.5％ゼラチンの溶液中室温（ＲＴ）で一晩ブロッキングし、ＴＴＢＳ中で２×５分間洗浄し、モノクローナル抗tetＲ抗体（9 F10）含有ハイブリドーマ上清（Ｓ．Ｆreundlieb and Ｈ．Ｂujard，Ｈeidelber g，Ｇermany）で一晩プローブし、ＴＴＢＳ中１％ＢＳＡ中で１:４に希釈した。該ブロットを、ＴＴＢＳ中で４×10分間洗浄し、ヤギ抗マウス抗体（ＴＴＢＳ中１：10,000）（Ａmersham）で40分間インキュベートし、ＴＴＢＳ中で４×10分間およびＴＢＳ中で２×10分間洗浄し、ついでＥＣＬウエスタンブロッティングキット（Ａmersham）で展開することによりtＴＡタンパク質を検出した。実施例６：トランスジェニックマウスおよびルシフェラーゼに関するアッセイゲル精製されたＤＮＡ（0.5μg/mlテトラサイクリンの存在下）をＦ1(Ｃ57ＢＬ/6×Ｃ3Ｈ)受精卵中に同時微量注入し、ついでそれを偽妊娠雌の子宮内に移植することにより、pＴet-tＴＡk(ＸhoＩからＮotＩまでの断片)およびpＵＨＣ13- 3（ＸhoＩからＡseＩまでの断片）が導入されたダブルトランスジェニックマウスを作製した。妊娠した雌に、100μg/mlテトラサイクリンおよび５％ショ糖を含有する水を与えた。尾部ＤＮＡのサザンブロットを、前記のとおりα-³²Ｐ-d ＣＴＰで標識されたtＴＡ（761bpのＸbaＩ-ＳalＩ）またはルシフェラーゼ（136 5bpのＨindIII-EcoＲＶ）断片でプローブすることにより、子孫を選別した。サザンブロットシグナルをプラスミドＤＮＡ断片の希釈から得られたものと比較することにより、導入遺伝子のコピー数を推定した。アッセイ系を製造業者の指示（＃Ｅ1500，Ｐromega Ｃorporation）に従い用いることにより、トランスジェニックマウスの組織中のルシフェラーゼ活性を測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣs）（0.1〜1.0×10⁶細胞）を、50μlの溶解緩衝液中に室温で15分間溶解し、不溶物を14,000rpmで５秒間ペレット化した後、20 μlの上清を100μlのルシフェリン試薬と混合し、10秒で生じた光をルミノメーター（Ｂerthold，Ｌumat ＬＢ9501，Ｇermany）で測定した。該アッセイにおけるライゼートの細胞等価物数（number of cell equivalents）を用いて、サンプル間でルシフェラーゼ活性を正規化した。収穫し、液体窒素中で急速凍結した他の組織を、冷えた乳鉢および乳棒で粉砕して粉末化し、100〜200μlのルシフェラーゼ溶解緩衝液に入れ、室温で15分間インキュベートした。細胞デブリを14,0 00rpmで10秒間ペレット化し、分析するまで上清を−70℃で保存した。20μlの上清をルシフェラーゼアッセイで使用した。組織ライゼート間でのルシフェラーゼ活性の正規化のために、ライゼート中の全タンパク質濃度を、ブラッドフォード（Ｂradford）タンパク質アッセイ（Ｂio-Ｒad Ｌaboratories）を用いて測定した。サンプルを該アッセイの直線範囲内でアッセイし、ライゼートを希釈した場合、わずか約２倍の変動が認められた。野生型マウスからの種々の組織からの抽出物に加えたホタルルシフェラーゼタンパク質標準（Ｓigma）は、活性の変動を示さなかった。前記の発明は明瞭化および理解のためにある程度詳しく説明されているが、当業者であれば、本発明および添付の請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細において種々の変化を加え得ることをこの開示の解釈から理解するであろう。本明細書中に記載したすべての特許および刊行物は、その全体を引用により本明細書に取り込むものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１月１６日【補正内容】質を含み、該ポリヌクレオチド分子が、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており(operably linked)、該プロモーターが、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有することを特徴とする組成物に関する。テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオーフンリーディングフレームは、翻訳開始のために最適な環境(contex)を付与するために、その５'末端で修飾されている。本発明の好ましい実施態様では、それは、ＨindIIIのような唯一の制限部位を付与するために修飾されている。本発明の最も好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームは、配列番号１で識別されるオリグヌクレオチドをコードするように、その５'末端で修飾されている。好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡである。本発明の第２の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド分子を含有するクローニングベクターに関する。本発明の最も好ましい実施態様は、プラスミドpＴet- ＳpliceおよびpＴet-tＴＡＫに関する。本発明の第３の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド分子でトランスフェクションされた真核細胞に関する。好ましい実施態様では、該真核細胞は、前記誘導性最小プロモーターに対するテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質の結合を抑制するために十分な量のテトラサイクリンを含有する。本発明のもう１つの好ましい実施態様では、前記真核細胞はさらに、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合した異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子でトランスフェクションされている。本発明の最も好ましい実施態様では、該ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つは、最小プロモーターおよび７個のtetオペレーター配列に作動可能的に結合している。さらに好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、該異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の発現をテトラサイクリンの不存在下で駆動するのに十分な量で発現される。もう１つの好ましい実施態様では、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質は、該異種タンパク質の値を比較することは、無意味である。図６は、Ｓ2-6細胞におけるテトラサイクリン不存在下での16日目のtＴＡタンパク質の喪失を示すオートラジオグラフの写真である。図６は、培養されたＳ2- 6およびＳ2-1細胞系からの細胞抽出物のウエスタンブロットの写真である。第１レーン：マーカータンパク質（バンドは見えない）：第２および第３レーン：te tの不存在下で16日間成長させたＳ2-6細胞;第４および第５レーン:0.5μg/mltet の存在下で16日間成長させたＳ2-6細胞；第６レーン：0.5μg/ml tetの存在下で 16日間成長させたＳ2-1細胞；および第７レーン：tetの不存在下で２日間成長させたＳ2-6細胞。tＴＡタンパク質のシグナルは、tetの不存在下で２日間成長させたＳ2-6細胞で認められるが、tetの不存在下で16日間培養された同じ細胞では認められ/cい。レーン２〜７の底部で認められるバンド（「タンパク質先端」）は、染料先端であり、非特異的シグナルを表す。図７は、pＣＭＶ-tＴＡk、pcＤＮＡＩ-neoおよびpcＤＮＡ-tＴＡkの概略図である。図８は、pＴet-ＳpliceおよびpＴet-tＴＡkの構成の概略図である。図９は、pＴet-Ｓpliceの制限地図を表す。クローニング部位は、肉太の印刷で示す、ＥcoＲＩ部位が２つあることに注意すべきである。図９Ｂ〜９Ｇは、pＴet-Ｓpliceのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。図10Ａは、pＴet-tＴＡkの制限地図を示す。図10Ｂ〜10Ｇは、pＴet-tＴＡkのヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列（それぞれ配列番号３および配列番号４）を示す。図11Ａは、pＵＨＤ15-1の制限地図を示す。図11Ｂ〜11Ｆは、pＵＨＤ15-1のヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列を示す。図12Ａは、pＵＨＣ-13-3の制限地図を示す。図12Ｂ〜12Ｆは、pＵＨＣ-13-3のヌクレオチドおよび部分アミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および配列番号８）を示す。好ましい実施態様の詳細な説明テトラサイクリンリプレッサーのＤＮＡ結合ドメインとＶＰ16の転写活性化ドメインとよりなるトランスアクチベーター融合タンパク質（tＴＡ）の構成的発現(constitutive expression)に依存するテトラサイクリン調節誘導的遺伝子発現の重要な問題ではあり得ない。誘導されたマウスは、テトラサイクリン除去の3.5 ヶ月後においても依然として最適レベルのルシフェラーゼを発現し、テトラサイクリンの不存在下でも少なくとも６ヶ月は生存可能なままであり、このことは、導入遺伝子発現が許容され(torelate)、ダウンレギュレーションされないことを示唆するものである。該pＴet-tＴＡk系は、いすれもの所望する遺伝子（単数または複数）の発現を誘導的に指令する能力を有するはずである。この発現系は、トランスフェクションされた細胞およびインビボでの遣伝子機能の研究、治療剤の試験のための疾患モデルの作製、および哺乳動物生物の発生の理解のための検討に広範に適用可能であるはずである。それは、それを用いなければ非常に毒性で該生物が発生の間許容できない遺伝子の調節的トランスジェニック発現を可能とするのに特に有用であろう。実施例以下の実施例は、本発明のある好ましい実施態様をさらに例示するものであり、本発明を何ら限定するものではない。材料および方法プラスミド構築物の詳細：プラスミドpＵＨＣ13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)に記載されている）は、5157塩基対のサイズであり、診断的制限消化に使用しうる３個のＥcoＲＩ制限部位（454、667および4036 位）を有する。該プラスミドは、以下の３個の主要断片よりなる：（１）colＥ1 複製起点、Ｔn2661（ＨincII位およびＰstＩ部位が除去されている）のＰ_bla/p3 を有するβ−ラクタマーゼ耐性遺伝子を含むpＢＲ322配列；（２）７量体化した tetオペレーターを上流に有するhＣＭＶ最小プロモーター（開始部位に対して− 53）を有する調節領域；および（３）pＳＶ-2-luc（de Ｗetら，Ｍol．Ｃell．Ｂiol．7:725-37(1987)）からの３'フランキング領域を有するルシフェラーゼ遺伝子。pＵＨＣ13-3の地図に関しては図12Ａを、pＵＨＣ13-3の配列に関しては図 12Ｂ〜12Ｆを参照されたし。。 pＵＨＤ15-1(図11を参照されたし)（ＧossenおよびＢuｊard，Ｐroc．Ｎatl. Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＥcoＲＩ部位とＸbaＩ部位との間の配列を、二本鎖オリゴヌクレオチド（その配列は図７の右上部に示されている）で置換して、pＣＭＶ-tＴＡkを作製した(工程１)。該挿入配列は、該tＴＡ遺伝子に、翻訳開始のための最適な環境を付与し(Ｋozac，Ｍ.，Ｎuc．Ａcids Ｒes．12: 857-872(1984))、tＴＡタンパク質（２位のアラニン）中にアミノ酸を挿入し、そして後続のクローニング工程のための唯一のＨindIII部位を付与する。この修飾されたtＴＡ遺伝子は、本明細書では、tＴＡkと称される。ついで、tＴＡk遺伝子を含有するpＣＭＶ-tＴＡkのＨindIIIからＢamＨＩまでの断片を、pcＤＮＡＩ-neo（Ｉnvitrogen Ｃorporation）のＨindIIIからＢamＨＩまでの部位内にクローニングして、pcＤＮＡ-tＴＡkを作製する(図７の工程２)。プラスミドpＴet-tＴＡkは、tＴＡk（コンセンサスなコザック翻訳開始部位が挿入されているtＴＡ遺伝子に関して本明細書で使用する略称）と称される修飾されたtＴＡ遺伝子を、pＵＨＣ-13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＴetプロモーターの制御下に置く。したがって、該構築物は、自己制御性である。まず、ＳＶ40スプライスおよびポリＡ部位を有するベクター中にpＵＨＣ13-3 のＴetプロモーターを有するベクターを構築し、ついで該Ｔetプロモーターと該スプライス／ポリＡとの間にtＴＡkを挿入することにより、pＴet-tＴＡkを構築した。ＳＶ40介在配列は、スモールＴ抗原［ＭboＩ（0.56mu＝4100）からＭboＩ (0.44mu＝4710)］に由来する。ＳＶ40ポリＡ配列は、ＢclＩ（0.19mu＝2770）からＥcoＲＩ(0mu＝1782)までのＳＶ40であり、初期ポリアデニル化配列およびＳＶ40後期領域の３'末端配列を含有する(与えられている同等物はＳＶ40についてのものである)。該スプライス領域のすぐ上流には、細菌ＣＡＴ遺伝子（非翻訳配列）の３'末端に由来する125bpがある：これらの配列は何ら悪影響を及ぼさないと考えられ、それらが便利な制限部位を付与するというだけの理由で含めることとした。pＴet-tＴＡkの地図に関しては図10Ａを、pＴet-tＴＡkの配列に関しては図10Ｂ〜10Ｇを参照されたし。 pＴet-tＴＡk、pＳplice-ＰＡの構築のための開始プラスミドは、ＥcoＲＩ部位のクレノウフィルインの後でＸbaＩリンカーを連結することにより、pＨＡＶ- ＣＡＴ(Ｊones ら，Ｎuc．Ａcids Ｒes．19:6547-6551(1991)）のＳcaＩからＥcoＲＩまでの断片をpＢＫＳII⁺(Ｓtratagene)のＸbaＩ部位中に挿入することにより構築した。図８に示すとおり、pＳplice-ＰＡプラスミドは、スモールＴ抗原に由来するＳＶ40介在配列およびＳＶ40初期ポリアデニル化配列を含有する。最小ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）プロモーターの上流のtetオペレーターの７個のコピーを含有するpＵＨＣ13-3（ＧossenおよびＢujard，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＸhoＩからＳalＩまでの断片を、pＳplice-ＰＡのユニークＸhoＩ部位中にクローニングして、pＴet-Ｓpliceを得た（図８、工程１）。このtetオペーター含有プロモーターを、本明細書では、Ｔetpと称する、pＴet-Ｓpliceは、関心のある遺伝子をＴetp配列と該スプライス／ポリＡ配列との間へ容易に挿入するための多数の唯一の制限部位を含有する。pＴet-Ｓpl iceの地図に関しては図９Ａを、pＴet-Ｓpliceの配列に関しては図９Ｂ〜９Ｇを参照されたし。ついで、tＴＡk遺伝子を含有するpＣＭＶ-tＴＡkのＨindIIIからＢamＨＩ（クレノウで平滑化）までの断片を、pＴet-ＳpliceのＨindIIIからＥc oＲＶまでの部位中にクローニングして、pＴet-tＴＡkを得た(図８、工程２)。これらの実験で使用されるＴetpに制御されるマウスＲＡＧ-1発現構築物は、p Ｒ1Ａ/Ｃのコード領域をＢamＨＩ（クレノウで平滑化）がらＸbaＩまでの断片としてpＴet-ＳpliceのＥcoＲＶがらＳpeＩまでの部位中に挿入して、pＴet-Ｒ1Ａ /Ｃを得ることにより構築した。しかしながら、ＲＡＧ-1をコードする核酸分子は、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができるし、あるいはいずれもの他の起源から単離することができる。ＲＡＧ-1の完全な配列に関しては、Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989)を参照されたし。pＲ1Ａ/ＣのＲＡＧ-1コード領域は、アミノ酸２〜89およびアミノ酸1009〜1040の欠失、第２コドンの直後へのの６個のヒスチジンの付加、該ヒスチジンの直後へのアラニンおよびセリンコドンの挿入によるＮheＩ部位の導入、およびＡＵＧ開始コドンを囲む(surround)コンセンサス翻訳開始環境の付加により、完全長のマウスＲＡＧ-1と比べて改変されている。ＲＡＧ-1のこの欠失突然変異体は、完全長マウスＲＡＧ-1よりも有意に大きなＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を有する。本明細書において使用するテトラサイクリン制御性マウスＲＡＧ-2発現構築物は、pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のＸhoＩからＸbalまでの断片をpＴet-ＳpliceのＳalＩからＳpeＩまでの部位中に挿入してpＴet-Ｒ2Ａを得ることにより構築した。。しがしながら、ＲＡＧ-2をコードする核酸分子は、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができるし、あるいはいずれかの他の入手可能な起源から単離することができる。ＲＡＧ-2の完全な配列に関しては、1992年10月27日付け発行の米国特許第5,159,066号またはＯettinger，Ｍ.Ａ.ら，Ｓcience 248:1517-1 523(1990)を参照されたし。pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のＲＡＧ-2コード領域は、アミノ酸4 92〜527のＣ末端欠失、ＡＵＧ開始コドンを囲むコンセンサス翻訳開始環境の付加、および２位におけるアラニンコドンの挿入により、完全長のマウスＲＡＧ-2 に対して改変されている。このＲＡＧ-2突然変異体は、完全長マウスＲＡＧ-2よりもある程度高いＶ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性を有する。実施例１：プラスミドの構築 tＴＡオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含有するpＵＨＤ15-1(Ｇossen ，Ｍ．およびＢujard，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551 (1992))のＥcoＲＩ-ＢamＨＩ断片を、翻訳開始のための最適環境を付与する30bp オリゴヌクレオチド（配列番号１）（Ｋozak，Ｍ.，Ｎucl．Ａcids Ｒes．12:85 7-872(1984)）および後続のクローニングのための唯一のＨindIII部位の付加により、その５'末端で修飾したその付加されたヌクレオチドは、図７の右上部に示されているものである。付加されたヌクレオチドの数は、ＥcoＲＩおよびＸba Ｉ酵素部位のヌクレオチドを計数するか否かで異なる。単純化のために、該ＯＲＦの修飾された５'末端を、本明細書では、30bpオリゴと称することにする。以下、該修飾tＴＡ遺伝子をtＴＡkと称する。ＨindIII-ＢamＨＩ tＴＡk断片を、p cＤＮＡＩ-neo(Ｉnvitrogen Ｃorporation)のＨindIII-ＢamＨＩ部位中にクローニングして、pcＤＮＡ-tＴＡkを得る、pcＤＮＡ-tＴＡkでは、tＴＡk遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス（hＣＭＶ）の前初期遺伝子(immediate early gene) のエンハンサーおよびプロモーター配列の転写制御下にある。プフラスミドpＳp lice-ＰＡは、ＳＶ40スモールＴ抗原介在配列およびＳＶ40初期ポリアデニル化配列（pＨＡＶ-ＣＡＴ（Ｊones，Ｓ.Ｎ.ら，Ｎucl．Ａcids Ｒes．19:6547-6551 (1991)）からのもの）をpＢＫＳII⁺（Ｓtratagene）中に挿入することにより構築した。最小プロモーター（以下、Ｔetpと称する）の上流のtetオペレーターの７個のコピーを含有するpＵＨＣ13-3(Ｇossen，Ｍ.およびＢujard ，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ:89:5547-5551(1992)）のＸhoＩ-Ｓ alＩ断片を、pＳplice-ＰＡのスプライス／ポリＡ配列の上流にクローニングして、pＴet-Ｓpliceを得た。tＴＡk遺伝子を、pＴet-Ｓplice中にクローニングしてpＴet-tＴＡkを得、該転写開始部位をtＴＡk ＡＵＧの143bp上流に置いた(図１)。Ｔetp制御性マウスＲＡＧ-1発現構築物（pＴet-Ｒ1Ａ/Ｃ）は、pＲ1Ａ/Ｃのコード領域をpＴet-Ｓplice中に挿入することにより構築した。pＲ1Ａ/ＣのＲＡＧ -1コード領域は、Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性の少なくとも２倍の増加（すなわち、ＶＤＪが、Ｒ1Ａ/ＣによりＲ1Ａに対して、そしてＲ2ＡによりＲ2に対しての２倍増加）を引き起こす小さなＮおよびＣ末端欠失により、完全長マウスＲＡＧ-1と比べて改変されている、該Ｔetp制御性マウスＲＡＧ-2発現構築物(pＴet- Ｒ2Ａ)は、pＲ2Ａ-ＣＤＭ8のコード領域をpＴet-Ｓplice中に挿入することにより構築した。このＲＡＧ-2コード領域は、Ｖ(Ｄ)Ｊリコンビナーゼ活性の小さな増加を引き起こす小さなＣ末端欠失により、完全長マウスＲＡＧ-2に対して改変されている。pＴet-Ｒ1およびpＴet-Ｒ2は、pＴet-splice部位中に挿入されているそれぞれ完全なＲＡＧ-1およびＲＡＧ-2のＯＲＦよりなる。実施例２：トランスフェクションされた細胞系の細胞培養および誘導化既に記載されているとおりに(Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989) )、10μgの線状化プラスミドを0.5×10⁶個のＮＩＨ3Ｔ3繊維芽細胞中にリン酸カルシウム／グリセロールショックでトランスフェクションし、トランスフェクションの48時間後に0.75mg/ml Ｇ418および0.5μg/mlテトラサイクリン中で細胞をプレーティングすることにより、pcＤＮＡ-tＴＡkの安定なトランスフェクション体を作製した 12日後に拾い上げた単一のコロニーを、0.5ｍg/ml Ｇ418、0.5 μg/mlテトラサイクリン中で成長させた。 10μgの各線状化プラスミドを１μgの線状化pＳＶ2-Ｈisと共にトランスフェクションし、ついで、Ｌ−ヒスチジノールを含有するがヒスチジンを欠く培地中で選択する（既に記載されているとおりに行なった（Ｓchatz，Ｄ.Ｇ.ら，Ｃell 59:1035-1048(1989))）ことにより、pＴet-tＴＡk単独のあるいはpＴet-tＴＡk とpＴet-Ｒ1Ａ/ＣとpＴet-Ｒ2Ａとの安定なトランスフェクション体を作製した。トラ請求の範囲１．テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる組成物であって、前記タンパク質が、原核性te tリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターが、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである組成物。２．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームが、その５'末端で修飾され、翻訳開始のための最適な環境を提供するものである請求項１に記載の組成物。３．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームの５'末端が、さらに修飾され、唯一の制限部位を提供するものである請求項２に記載の組成物。４．前記唯一の制限部位がＨindIIIである請求項３に記載の組成物。５．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームが、その５'末端で修飾され、配列番号１で識別されるオリゴヌクレオチドをコードするものである請求項４に記載の組成物。６．ＤＮＡである請求項１に記載の組成物。７．請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含有するクローニングベクターを含んでなる組成物。８．請求項１に記載のポリヌクレオチド分子によりトランスフェクションされた真核細胞を含んでなる組成物。９．前記真核細胞がさらに、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合した異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子によりトランスフェクションされているものである請求項８に記載の組成物。 10．前記ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つが、最小プロモーターおよび７個のtetオペレーター配列に作動可能的に結合しているものである請求項９に記載の組成物。 11．異種タンパク質の発現を減少または停止させる方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質はが原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子、 (ii) 前記異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子により形質転換し、並びに (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を含む培地中で前記真核細胞を培養することを含んでなる方法。 12．前記第２のポリヌクレオチド分子が、最小プロモーターおよび７個のtet オペレーター配列に作動可能的に結合するものである請求項11に記載の方法。 13．異種タンパク質の発現を活性化または高める方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子、 (ii) 異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子により形質転換し、並びに (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を欠く培地中で前記真核細胞を培養することを含んでなる方法。 14．前記誘導性最小プロモーターに対するテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質の結合を抑制するために十分な量のテトラサイクリンを含有する請求項８に記載の組成物。 15．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子が、テトラサイクリンの不存在下に前記異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の発現を駆動するために十分な量に発現される請求項９に記載の組成物。 16．テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質が、前記異種タンパク質の発現を駆動するために十分な量に存在する請求項９に記載の組成物。 17．プラスミドpＴet-Ｓpliceより実質的になる組成物。 18．プラスミドpＴet-tＴＡＫより実質的になる組成物。 19．少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子を含有し、第２の収容手段が、前記誘導性最小プロモーターをコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、前記tetオペレーター配列がポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するために効果的に配置されるものである分子を含有することを特徴とするキット。 20．少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子によりトランスフェクションされた真核細胞を含有し、第２の収容手段が、誘導性最小プロモーターを含む第２のポリヌクレオチド分子であって、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、前記tetオペレーター配列が異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するために効果的に配置されるものである分子を含有することを特徴とするキット。【図６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる組成物であって、前記タンパク質が、原核性te tリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターが、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである組成物。２．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームが、その５'末端で修飾され、翻訳開始のための最適な環境を提供するものである請求項１に記載の組成物。３．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームの５'末端が、さらに修飾され、唯一の制限部位を提供するものである請求項２に記載の組成物。４．前記唯一の制限部位がＨindIIIである請求項３に記載の組成物。５．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のオープンリーディングフレームが、その５'末端で修飾され、配列番号で識別されるオリゴヌクレオチドをコードするものである請求項４に記載の組成物。６．ＤＮＡである請求項１に記載の組成物。７．請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含有するクローニングベクターを含んでなる組成物。８．請求項１に記載のポリヌクレオチド分子によりトランスフェクションされた真核細胞を含んでなる組成物。９．前記真核細胞がさらに、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有する誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合した異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子によりトランスフェクションされているものである請求項８に記載の組成物。 10．前記ポリヌクレオチド分子の少なくとも１つが、最小プロモーターおよび７個のtetオペレーター配列に作動可能的に結合しているものである請求項９に記載の組成物。 11．異種タンパク質の発現を減少または停止させる方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質はが原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子、 (ii) 前記異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子により形質転換し、並びに (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を含む培地中で前記真核細胞を培養することを含んでなる方法。 12．前記第２のポリヌクレオチド分子が、最小プロモーターおよび７個のtet オペレーター配列に作動可能的に結合するものである請求項11に記載の方法。 13．異種タンパク質の発現を活性化または高める方法であって、 (a) 真核細胞を、 (i) テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子、 (ii) 異種タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質は、誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子により形質転換し、並びに (b) テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を欠く培地中で前記真核細胞を培養することを含んでなる方法。 14．前記誘導性最小プロモーターに対するテトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質の結合を抑制するために十分な量のテトラサイクリンを含有する請求項８に記載の組成物。 15．前記テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子が、テトラサイクリンの不存在下に前記異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の発現を駆動するために十分な量に発現される請求項９に記載の組成物。 16．テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質が、前記異種タンパク質の発現を駆動するために十分な量に存在する請求項９に記載の組成物。 17．プラスミドpＴet-Ｓpliceより実質的になる組成物。 18．プラスミドpＴet-tＴＡＫより実質的になる組成物。 19．少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子を含有し、第２の収容手段が、前記誘導性最小プロモーターをコードする第２のポリヌクレオチド分子であって、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、前記tetオペレーター配列がポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するために効果的に配置されるものである分子を含有することを特徴とするキット。 20．少なくとも２つの収容手段を内部に密閉的に有する担体手段を含んでなるキットであって、第１の収容手段が、テトラサイクリントランスアクチベーター融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド分子であって、前記タンパク質が原核性tetリプレッサーおよび真核性転写アクチベータータンパク質を含み、前記ポリヌクレオチド分子が誘導性最小プロモーターに作動可能的に結合しており、前記プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有するものである分子によりトランスフェクションされた真核細胞を含有し、第２の収容手段が、誘導性最小プロモーターを含む第２のポリヌクレオチド分子であって、前記プロモーターが少なくとも１つのtetオペレーター配列を含有し、前記tetオペレーター配列が異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列に作動可能的に結合するために効果的に配置されるものである分子を含有することを特徴とするキット。