TWI582108B - 條件性表現蛋白質之載體類 - Google Patents

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查理斯 瑞德
布蘭登 卡斯柏森
桑尼爾 查達
威廉 佛克勒
法雅茲 哈理
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Description

條件性表現蛋白質之載體類 參照經電子申請系統(EFS-WEB)提交之序列表
與本申請案一起提出之電子檔序列表的內容(檔名：SequenceListing.ascii.txt，大小：153,629位元組，建立日期：2012年3月2日)係以參照方式整體納入本文。
本發明關於條件性表現蛋白質之載體類。
介白素-12(IL-12)係第一型細胞介素家族之成員，其涉及造成多種生物程序，其包括但不限於保護性免疫反應及抑制腫瘤發生(Abdi et al.,2006；Adorini,1999；Adorini,2001；Adorini et al.,2002；Adorini et al.,1996；Akhtar et al.,2004；Akiyama et al.,2000；Al-Mohanna et al.,2002；Aliberti et al.,1996；Allavena et al.,1994；Alli and Khar,2004；Alzona et al.,1996；Amemiya et al.,2006；Araujo et al.,2001；Arulanandam et al.,1999；Athie et al.,2000；Athie-Morales et al.,2004；Bertagnolli et al.,1992；Bhardwaj et al.,1996；Biedermann et al.,2006；Brunda and Gately,1994；Buchanan et al.,1995；Romani et al.,1997；Rothe et al.,1996；Satoskar et al.,2000；Schopf et al.,1999；Thomas et al.,2000；Tsung et al.,1997；Wolf et al.,1994；Yuminamochi et al.,2007)。越 來越多證據顯示IL-12可能是控制人疾病(例如癌)之有效目標。
雖然IL-12可能是有效之癌治療劑(基於對第1型抗腫瘤NK細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞具有強效之支持活性(Trinchieri,2003))，但是重組人IL-12(rhIL-12)在病患之報告毒性(Atkins et al.,1997)，連同供臨床應用之GMP級rhIL-12之有限來源使得以IL-12為基底之治療方法無法成功。因此認為基因療法代表更安全、更可行之治療選擇似乎是合理的。事實上，在腫瘤內或腫瘤周圍遞送以病毒(Sangro et al.,2004；Triozzi et al.,2005)或質體為基底之重組IL-12 cDNA(Heinzerling et al.,2005)或經IL-12基因改質之自體纖維母細胞(Kang et al.,2001)之第一期臨床試驗已被認為係安全的且耐受性佳。
然而，在接受這些基因療法之黑色素瘤病患或罹患不同癌之病患中很少出現客觀之臨床反應，或臨床反應不一致或為短暫的，且大部分之臨床反應侷限於治療部位(Heinzerling et al.,2005；Kang et al.,2001；Sangro et al.,2004；Triozzi et al.,2005)。在疾病部分或完全緩解之病例中，注意到腫瘤浸潤性淋巴細胞之數量增加(Heinzerling et al.,2005；Sangro et al.,2004)及循環中腫瘤特異性CD8+ T細胞之量增加(Heinzerling et al.,2005)，這些發現與病患體內之抗原特異性T細胞之交叉敏化增加一致。
由於作為IL-12之天然但經調節之來源的樹突細胞(DC)最能交叉敏化特異性T細胞(Berard et al.,2000)，因此最近以DC為基底之IL-12基因療法之優異的臨床前療效之報告已引起高度關注(Satoh et al.,2002；Tatsumi et al.,2003；Yamanaka et al.,2002)。舉例來說，研究顯示在鼠模型中經腫瘤內(i.t.)注射經工程化以產製IL-12p70之DC(經由重組腺病毒感染)導致顯著增加廣泛反應性、腫瘤特異性CD8+ T細胞貯庫之交叉敏化與腫瘤排斥(Tatsumi et al.,2003)。考慮先前使用在CMV啟動子之控制下編碼mIL-12之重組腺病毒(rAd.cIL12，(Tatsumi et al.,2003))，經工程化之DC所產製之IL-12係組成性的，因此就治療結果而言，此細胞介素在腫瘤病灶內之早期免疫影響及在腫瘤引流淋巴結內之晚期免疫影響問題無法被解決。因此，我們需要經工程化以條件性表現IL-12之DC，以達調節轉基因表現之量及適時活化轉基因之目的。本發明提供使用該等細胞之有希望之治療結果。
有鑑於與透過包含由感興趣之核酸序列所編碼之蛋白質的載體組成物進行基因之基因表現有關之問題，仍然需要經改善之轉運載體組成物以用於直接注射或用於細胞基底療法。
紅血球生成素(EPO)藉由控制在骨髓中之紅血球祖細胞之增生、分化及存活，在調節紅血球產製上扮演關鍵角色。缺乏EPO蛋白導致貧血。以重組人EPO(huEPO) 治療有效且安全地改善與慢性疾病有關之貧血的處理。雖然蛋白質療法能成功治療，但有多種不良反應之報告出現。舉例來說，病患可能對EPO具抗藥性，亦可能對該生物製劑具低反應性。另外，在因為化學療法導致貧血之病患的臨床試驗中觀察到rHuEPO蛋白質增加致死性。因此，在此領域中仍需要EPO遞送方法以治療貧血並防止目前可用之遞送方法的缺點。
多發性硬化症係一種發炎性疾病，其中腦及脊髓之軸突周圍的脂肪髓鞘受損，導致脫髓鞘、形成疤痕以及廣泛之徵候及症狀。雖然已知許多此疾病過程涉及之機轉，但其原因仍然未知。多發性硬化症仍無已知解藥。治療企圖在發作後恢復功能、防止新的發作或預防不能(disability)。多發性硬化症藥物可具有不良反應或耐受性不佳，許多病患尋求另類治療，雖然缺乏科學實驗支持。
血管性水腫係真皮、皮下組織、黏膜及黏膜下組織之快速腫脹(水腫)。血管性水腫被分成後天性或遺傳性。後天性血管性水腫通常由過敏造成，且與其他過敏性症狀及蕁麻疹一起發生。此亦可能是某些藥物之不良反應，特別是ACE抑制劑。遺傳性血管性水腫(HAE)具有三種形式，所有形式皆由以體染色體顯性形式遺傳之基因突變造成。這些形式係由潛在性基因異常區別。所有形式之HAE導致補體系統之異常活化，且所有形式皆可造成身體他處諸如消化道之腫脹。若HAE涉及咽部，可造成威脅生命之窒息。
肺高血壓係一種肺動脈(從心至肺之血管)之壓力超過正常值之肺疾病。肺動脈性高血壓(PAH)係一種肺動脈壓力及肺血管阻力增加之疾病。Harrison's Principles of Internal Medicine,15th ed.,pp.1506-1507(McGraw-Hill,2001)。若不加治療，肺動脈性高血壓「通常具有不良預後，最後導致右心室衰竭及死亡」。Ulrich,S.,et al.,Swiss Med.Wkly 137：73-82,73(2007)。
克隆(Crohn)氏病係一種胃腸道(GI)慢性發炎性疾病，其特徵為症狀復發及緩解，且隨時間進展成狹窄、瘺管或膿瘍之併發症。在美國，克隆氏病發生於大約一百萬人，預估每年因為IBD(發炎性腸疾病)造成之直接花費據估為$63億美金，其中克隆氏病據估造成其中的36億。硫唑嘌呤(azathioprine)及6-巰基嘌呤(mercaptopurine)係經常用於第一線治療失敗之病患的處方用藥，特別是依賴或對系統性皮質類固醇無反應之病患。大約40%接受硫唑嘌呤治療之病患維持緩解1年。英利昔單抗(infliximab)及其他以腫瘤壞死因子(TNF)為目標之單株抗體已顯示誘導及維持克隆氏病病患緩解之療效，然而在大多數指南及共識性文章中，英利昔單抗被認為是在將腸疾病(luminal disease)病患轉介至外科醫師之前的最後藥物選項。因此，仍然需要能改善IBD及克隆氏病之治療的治療方法。
IL-10係由經活化之Th2細胞、B細胞、角質細胞、單核球及巨噬細胞所產生之細胞介素。IL-10抑制多種細 胞介素之合成，包括由經活化之巨噬細胞及T輔助細胞產生之IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF及GM-CSF。IL-10可用於促進經活化之人B細胞之生長及分化、抑制Th1反應以防止移植排斥及T細胞媒介性自體免疫疾病。
IL-10(介白素10)係一種強烈下調促發炎細胞介素之產製的免疫調節細胞介素，其係與調節腸道發炎有關。重組人IL-10(rhIL-10)之臨床發展顯示狹窄之治療窗，且其藥物動力學特性導致GI組織有限之生物可利用性。然而，若IL-10可經由活體內細胞表現而局部增加，則系統性不良反應可能不會發生。
囊腫性纖維化(CF)係一種由囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)之基因缺陷造成之體染色體隱性疾病，此病會造成氯化物轉運通過黏膜表面之上皮細胞之異常，因為CFTR蛋白質之功能係作為產生黏液、汗液、唾液、淚液及消化酶之細胞的跨越細胞膜之氯離子通道。氯離子之運輸有助於控制水在組織中之移動，此係產生稀薄、自由流動之黏膜所需(正常量之黏膜係保護呼吸道、消化道、生殖系統及其他器官及組織內襯所需)。該CFTR蛋白質亦調節其他通道之功能，諸如該些運輸稱為鈉離子之正電粒子通過細胞膜之通道。這些通道係器官維持正常功能所需，諸如肺及胰。因此，CF影響外分泌腺體功能，造成黏膜聚積於肺、胰及其他器官。此黏膜阻塞除了造成胰外分泌不足及消化困難以外，還會導致肺之感染及發炎。
大約30,000名美國人罹患CF，此病為美國最常見之壽命縮短遺傳性疾病之一，每位CF病患之平均壽命為37歲。CF之治療中最一致的部分是維持生命品質及治療因濃稠黏液及感染造成之肺部損傷。在囊腫性纖維化病患之CFTR基因中已經識別超過1,000個突變。這些突變大多改變CFTR蛋白質中之單一胺基酸或自該CFTR基因中刪除少量DNA。最常見之突變稱為δ F508，係刪除在CFTR蛋白質之位置508的一個胺基酸。該導致之異常通道在形成後快速分解，因此從未到達細胞膜以運輸氯離子。在CFTR基因中之致病性突變改變氯通道之產生、結構或穩定性。所有這些改變使通道無法正常功能，因而損害氯離子之傳送及將水自細胞移入或移出。因此，在肺、胰及其他器官之通道內襯的細胞產生異常黏稠之黏液。該異常黏液阻塞呼吸道及腺體，導致囊腫性纖維化之特徵徵候及症狀。最近，KALYDECOTM已被美國食品藥物管理局(FDA)核准作為CF之潛在病因的第一治療(在該CFTR基因中之G551D突變)。然而，KALYDECOTM對於治療具有最常見之CFTR突變之病患並無療效。於是，仍然需要經改良之CF治療。
糖尿病(英文Diabetes mellitus通常簡稱為diabetes)係一群代謝性疾病，其中病患具有高血糖，因為身體無法產生足夠的胰島素或因為細胞無法對身體產生之胰島素有所反應。此高血糖產生尿多(頻繁排尿)、喝多(渴感增加)及吃多(餓感增加)之典型症狀。代謝性症候群係 多種醫學疾病之組合，當這些醫學疾病一起發生時增加發生心血管疾病及糖尿病之風險。在美國每五人即有一人罹患此病，且盛行率隨年齡增加。有些試驗顯示在美國之盛行率預估為總人口之25%。於是，仍然需要經改良之糖尿病治療。
升糖素樣肽1(GLP-1)係有效之抗高血糖荷爾蒙，其誘導胰島素分泌之葡萄糖依賴性刺激同時抑制升糖素之分泌。GLP-1似乎能恢復胰β細胞之葡萄糖敏感性，其機轉可能涉及GLUT2及葡萄糖激酶之增加表現。GLP-1亦以抑制胰β細胞之細胞凋亡及刺激胰島素分泌性β細胞之增生及分化見長。此外，GLP-1抑制胃分泌及運動。此延緩及延長碳水化合物之吸收及造成飽足效應。
升糖素樣肽2(GLP-2)係由小腸內分泌L細胞及中樞神經系統中之多種神經元產生。小腸GLP-2係在營養攝取時隨著GLP-1一起分泌。當經外部投予時，GLP-2產生多種效應，包括小腸生長、增進小腸功能、減少骨分解及神經保護作用。
脂聯素(adiponectin)係調節多種代謝過程之蛋白質荷爾蒙，包括葡萄糖調節及脂肪酸分解代謝。脂聯素僅由脂肪組織(及懷孕時之胚胎)分泌至血流，在血漿中之含量相對於許多荷爾蒙極高。該荷爾蒙之量與成人之體脂肪百分比成反比。
人瘦體素主要由白色脂肪組織中之脂肪細胞製造，循環瘦體素之量係與身體脂肪總量成正比。瘦體素作用於腦 下視丘之受體，其藉由下列機轉抑制食慾：(1)抵消神經肽Y(由腸及下視丘之細胞分泌之強力攝食刺激劑)之效應，(2)抵消大麻素之效應(與THC相同受體結合之另一強力攝食刺激劑)，及(3)促進食慾抑制劑α-MSH之合成。
本發明提供一種重組載體，該載體在一或多個啟動子之控制下編碼具有一或多種治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質。在一實施態樣中，該一或多個啟動子係條件性啟動子。在另一實施態樣中，該一或多個啟動子係組成性啟動子。在另一實施態樣中，該載體係編碼關閉啟動子之蛋白質的腺病毒載體，該啟動子可藉由提供可溶性小分子配體如二醯基肼(例如RG-115819、RG-115830或RG-115932)加以條件性活化。
本發明亦提供一種誘導、調節或增強哺乳動物之紅血球生成素(EPO)表現之方法，其中該方法包含：(a)經肌肉內投予腺病毒相關病毒至該哺乳動物，其中該病毒包含編碼EPO之多核苷酸；及(b)投予活化配體，其中該腺病毒相關病毒另包含基因開關，其中該基因開關包含與啟動子可操作性連接之至少一個轉錄因子序列，其中由該至少一個轉錄因子序列編碼之至少一個轉錄 因子係配體依賴性轉錄因子，其中該腺病毒相關病毒另包含與該編碼EPO之多核苷酸可操作性連接之第二啟動子，且其中該第二啟動子係於投予活化配體之後由該至少一個配體依賴性轉錄因子活化。
本發明亦提供一種包含編碼基因開關之多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該編碼一或多種蛋白質之多核苷酸係與啟動子可操作性連接，該啟動子係由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
本發明亦提供一種產製表現一或多種蛋白質之細胞群之方法，其中該方法包含使用條件性表現一或多種蛋白質之重組載體改質該等細胞，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該一或多種蛋白質係選自C1 酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
本發明亦提供一種經條件性表現一或多種蛋白質之重組載體改質之細胞群，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)之蛋白質之多核苷酸。
本發明亦提供一種試管內經工程化之細胞，該細胞包含編碼基因開關之重組多核苷酸，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含：(1)至少一個轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼與啟動子可操作性連接之配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該編碼一或多種蛋白質之多核苷酸係與啟動子連接，該啟動子係由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素 合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
本發明亦提供治療哺乳動物的疾病之方法，該方法包含：(a)投予經試管內工程化以條件性表現一或多種蛋白質之細胞群；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘導該一或多種蛋白質之表現，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
本發明亦提供治療哺乳動物的疾病之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質 之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該載體不包含於細胞內；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
本發明亦提供治療哺乳動物的多發性硬化症之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該載體不包含於細胞內；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化 配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質係選自髓磷脂鹼性蛋白(MBP)或干擾素β(IFN-B)。
一種治療哺乳動物之發炎性腸疾病或克隆氏病之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質之一者係介白素10(IL-10)。
序列表說明
SEQ ID NO：1係於果蠅(Drosophila)中發現之蛻皮激素反應元件之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2係於黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發現之蛻皮激素反應元件之核酸序列。
SEQ ID NO：3係於黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發現之蛻皮激素反應元件之核酸序列。
SEQ ID NO：4係包含人IL-12編碼序列：Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)之腺病毒載體之DNA序列。
SEQ ID NO：5係載體(Ad-RTS-mIL-12)之核酸序列。
SEQ ID NO：6係人紅血球生成素之胺基酸序列。
SEQ ID NO：7係雲杉芽捲蛾(Choristoneura fumiferana)蛻皮激素受體配體結合結構域之胺基酸序列。
SEQ ID NO：8係信號肽序列、人紅血球生成素序列及終止密碼子之核酸序列。
SEQ ID NO：9係人髓磷脂鹼性蛋白之核酸序列。
SEQ ID NO：10係人C1酯酶抑制劑之胺基酸序列。
SEQ ID NO：11係艾卡拉肽(ecallantide)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：12係人前列腺素合成酶2之胺基酸序列。
SEQ ID NO：13係人前列腺素合成酶1之胺基酸序列。
SEQ ID NO：14係人前列腺素合成酶2之核酸序列。
SEQ ID NO：15係人前列腺素合成酶1之核酸序列。
SEQ ID NO：16係人干擾素β之胺基酸序列。
SEQ ID NO：17係人GLP-1之胺基酸序列。
SEO ID NO：18係人GLP-2之胺基酸序列。
SEQ ID NO：19係人脂聯素(adiponectin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：20係人瘦體素(leptin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO：21係人CFTR之胺基酸序列。
SEQ ID NO：22係人IL-10之胺基酸序列。
本發明之詳細說明 定義
除非另外定義，此處所使用之所有技術用語、說明及其他科學用語或詞彙係意圖具有本發明之相關領域之技藝人士所通常了解之意義。在許多情況下，具有通常了解之意義之用語係於此處定義以供清楚及/或輕易地參照及了解，且在此處納入該等定義不應被視為代表與該領域所通常瞭解者之實質差異。分子生物學之用語及/或方法及/或方案之通常了解之定義可見Rieger et al.,Glossary of Genetics：Classical and Molecular,5th edition,Springer-Verlag：New York,1991、Lewin,Genes V,Oxford University Press：New York,1994、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001)及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1994)。當適當時，涉及使用自商業途徑獲得之套組及/或試劑之方法通常根據廠商說明及/或方案及/或參數進行，除非另外說明。
本發明提供在一或多個啟動子之控制下編碼蛋白質之 重組載體。在一實施態樣中，該一或多個啟動子係條件性啟動子。在另一實施態樣中，該一或多個啟動子係組成性啟動子。在另一實施態樣中，該載體係編碼關閉啟動子之蛋白質的腺病毒載體，該啟動子可藉由提供可溶性小分子配體如二醯基肼(例如RG-115819、RG-115830或RG-115932)加以條件性活化。此載體允許控制該(些)蛋白質於細胞中之表現。
在一實施態樣中，該編碼一或多種具有免疫調節劑之功能的蛋白質之多核苷酸係在基因開關之啟動子的控制下且該編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸係在組成性啟動子之控制下。在另一實施態樣中，編碼具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質之多核苷酸及編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸皆在該基因開關之多順反子啟動子之控制下。在另一實施態樣中，該編碼具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質之多核苷酸係由基因開關之啟動子控制且該編碼具有IL-12之功能的蛋白質之多核苷酸係由與基因開關啟動子不同之條件性啟動子控制。在其他實施態樣中，該編碼具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質之多核苷酸的基因調節系統與具有IL-12之功能之多核苷酸的基因調節系統係正交的。在其他實施態樣中，編碼各蛋白質之各個多核苷酸的基因調節系統係正交的。
在一實施態樣中，本發明亦提供癌之治療，諸如但不限於黑色素瘤、神經膠質瘤、腎癌、前列腺癌及表1所列 之癌。IL-12基因療法已在動物模型試驗中證實當以重組cDNA載體施予時之抗腫瘤療效(Faure et al.,1998；Sangro et al.,2005)，更尤甚者當以經基因改質之DC施予時之抗腫瘤療效(Satoh et al.,2002；Svane et al.,1999；Tatsumi et al.,2003；Yamanaka et al.,2002)。然而到目前為止，使用質體或病毒性載體之IL-12基因療法的第一期人臨床試驗無法在癌環境中達成持久、客觀之臨床反應(Heinzerling et al.,2005；Kang et al.,2001；Sangro et al.,2004；Triozzi et al.,2005)，此處描述之基因療法提供有希望之治療方式。
在一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之腫瘤之方法，該方法包含下列步驟：(a)經腫瘤內投予至腫瘤微環境、腫瘤周圍之區域或系統性投予本發明之免疫細胞群、TSC群或載體(或彼等之組合)，該等細胞或載體係經試管內工程化以條件性表現一或多種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質表現以治療該腫瘤。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予經改質之細胞群，該細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有治療性蛋白質(例如 免疫調節劑)之功能的蛋白質；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體；藉此誘發具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質表現以治療該疾病或病狀。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或病狀之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予二或多種經改質之細胞群，該等細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質，其中各種經改質之細胞群表現不同組之一或多種治療性蛋白質(例如免疫調節劑)；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質表現以治療該疾病或病狀。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或病狀之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予經改質之細胞群，該細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中至少一種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體； 藉此誘發具有該治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
在另一實施態樣中，本發明提供治療哺乳動物之疾病或疾患之方法，該方法包含下列步驟：(a)對該哺乳動物投予二或多種經改質之細胞群，該等細胞群係經改質以條件性表現一或多種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質及具有IL-12之功能的蛋白質，其中各種經改質之細胞群表現不同組之一或多種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質，其中至少一種具有治療性蛋白質(例如免疫調節劑)或IL-12之功能的蛋白質受到經配體活化之條件性啟動子之控制；及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘發具有該治療性蛋白質(例如免疫調節劑)之功能的蛋白質及/或具有IL-12之功能的蛋白質表現以治療該疾病或疾患。
在一實施態樣中，本發明提供一種條件性表現蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活 化之啟動子連接。
在一實施態樣中，本發明之載體條件性表現該蛋白質。在另一實施態樣中，該條件性表現一或多種蛋白質之載體(例如腺病毒載體)另包含編碼信號肽之核酸序列。該信號肽可經密碼子最佳化。在其他實施態樣中，該載體另包含5'非轉譯區(UTR)、3'調節區或該5'非轉譯區(UTR)及3'調節區，且增進蛋白質表現及/或整體產量。
本發明另提供一種產製表現蛋白質之細胞群之方法，該方法藉由使用條件性表現蛋白質之重組載體改質(例如轉染、電穿孔等)該等細胞，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在一些實施態樣中，本發明提供一種增加蛋白質表現之方法，該方法包含產製條件性表現一或多種蛋白質及一或多個調節序列之載體，其中該一或多個調節序列增進該蛋白質之表現。
本發明另提供表現蛋白質之細胞群，該細胞群係經條件性表現該蛋白質之重組載體改質(例如轉染、電穿孔等)，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性 轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含本發明之二或多種細胞群之組成物，其中該組成物中之各細胞群表現一或多種與該組成物中之其他細胞群所表現之一或多種蛋白質不同之蛋白質。在一實施態樣中，該組成物包含二種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含超過二種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含三種細胞群。在另一實施態樣中，該組成物包含四種細胞群。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含載體之經試管內工程化之細胞，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子連接。
在另一實施態樣中，本發明提供一種包含本發明之二或多種經試管內工程化之細胞群之組成物，其中該組成物中之各種經試管內工程化之細胞群包含載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼蛋白質之多核苷酸，該多核苷酸與經由該配體依賴性 轉錄因子活化之啟動子連接，且其中該組成物中之各種經試管內工程化之細胞群表現一或多種與該組成物中之其他經試管內工程化之細胞群所表現之一或多種蛋白質不同之蛋白質。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法被用於治療糖尿病、代謝性疾病、代謝性疾患及代謝性症候群。在一實施態樣中，該載體包含編碼GLP-1、GLP-2、脂聯素或瘦體素、或GLP-1、GLP-2、脂聯素或瘦體素之片段的多核苷酸序列。在另一實施態樣中，該載體包含編碼人GLP-1、GLP-2、脂聯素或瘦體素、或人GLP-1、GLP-2、脂聯素或瘦體素之片段的多核苷酸序列。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法被用於治療發炎性腸疾病(IBD)及/或克隆氏病。在一實施態樣中，該載體包含編碼IL-10或彼之片段之多核苷酸序列。在另一實施態樣中，該載體包含編碼人IL-10或彼之片段之多核苷酸序列。
在一實施態樣中，本發明包含具有組成性、誘導性或組織特異性啟動子之載體，該啟動子允許活體內產製囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)以取代或補充該缺陷性或突變之CFTR蛋白質。因此，在一實施態樣中，本發明之載體及方法係用於治療囊腫性纖維化(CF)。在一實施態樣中，該載體包含編碼正常(非突變性)CFTR或彼之功能性(生物活性/可離子運輸)片段之多核苷酸序列。在另一實施態樣中，該載體包含編碼正常人CFTR( 非突變性CFTR)或彼之功能性(生物活性/可離子運輸)片段之多核苷酸序列。
本發明亦提供一種包含如此處所述之細胞群之醫藥組成物，或一種適用於直接注射無細胞群之表現載體即經直接注射之組成物。
本發明亦提供用於條件性表現前列腺素合成酶之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼前列腺素合成酶之多核苷酸。本發明亦提供治療肺高血壓之方法，該方法包含投予該載體。
IL-12係一種細胞介素，其可作為經活化之T及NK細胞之生長因子，增進NK/經淋巴介素活化之殺手細胞之溶解活性及刺激休止週邊血液單核細胞(PBMC)產製IFN-γ。IL-12之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如編號NM_000882(人IL12A)、NM_002187(人IL12B)、NM_008351(小鼠IL12a)、NM_008352(小鼠IL12b)、NM_213588(雞IL12A)、NM_213571(雞IL12B)、NM_053390(大鼠IL12a)及NM_022611(大鼠IL12b)，彼等之序列以參照方式納入此處。
介白素12(IL-12)之胺基酸序列可得自公眾資料庫，如編號NP_000873(人IL12A)、NP_002178(人IL12B)、NP_032377(小鼠IL12a)、NP_032378(小鼠IL12b)、NP_998753(雞IL12A)、NP_998736(雞 IL12B)、NP_445842(大鼠IL12a)及NP_072133(大鼠IL12b)，彼等之序列以參照方式納入此處。
在一實施態樣中，該IL-12基因係野生型小鼠IL-12序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型小鼠IL-12具有至少85%之一致性，例如與野生型小鼠IL-12具有至少90%、95%或99%之一致性。在其他實施態樣中，該IL-12基因序列編碼小鼠IL-12多肽。在另一實施態樣中，該基因編碼與野生型小鼠IL-12具有至少85%一致性之多肽，例如與野生型小鼠IL-12具有至少90%、95%或99%之一致性。
髓磷脂鹼性蛋白(MBP)被認為係一種對於中樞神經系統之神經的髓鞘形成過程重要之蛋白質。由該典型MBP基因編碼之蛋白質係神經系統之寡突細胞及施旺氏(Schwann)細胞之髓鞘的主要組分。MBP相關性轉錄物亦存在於骨髓及免疫系統中。MBP之胺基酸及多核苷酸序列已可獲得，如編號NM_001025081及NP_001020252(人)及NM_001025245及NP_001020416(小鼠)。
在一實施態樣中，該MBP係野生型人MBP序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人MBP具有至少85%之一致性，例如與野生型人MBP具有至少90%、95%或99%之一致性。
C1酯酶抑制劑(C1-抑制劑，C1-inh)係屬於絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族之蛋白酶抑制劑。彼之主要功能係抑制補體系統以防止自發性活化。C1酯酶抑制 劑係急性期蛋白質，其在血液循環中之量約為0.25 g/L，在發炎期間該量增加約2倍。C1酯酶抑制劑不可逆地結合及不活化補體之經典途徑的C1複合物中之C1r及C1s蛋白酶。凝集素途徑之MBL複合物中之MASP-1及MASP-2蛋白酶亦經不活化。C1酯酶抑制劑防止之後的補體成分C4及C2被C1及MBL蛋白水解切割。C1酯酶抑制劑亦抑制纖維蛋白溶解、凝結及激肽途徑之蛋白酶。C1酯酶抑制劑係血漿激肽釋放素之抑制劑。人C1酯酶抑制劑之胺基酸序列係見於GenBank ADU87625.1，編號GU727623.1。
在一實施態樣中，該C1酯酶抑制劑係野生型人C1酯酶抑制劑序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人MBP具有至少85%之一致性，例如與野生型人C1酯酶抑制劑具有至少90%、95%或99%之一致性。
艾卡拉肽(ecallantide)(商品名Kalbitor，試驗藥物名稱DX-88)係蛋白質激肽釋放素之抑制劑，可用於治療遺傳性血管性水腫(HAE)及預防心胸手術之失血。艾卡拉肽之胺基酸序列係見於美國專利公開號2007/0213275，其以參照方式整體納入此處。
在一實施態樣中，該艾卡拉肽係野生型人艾卡拉肽序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人MBP具有至少85%之一致性，例如與野生型人艾卡拉肽具有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該GLP-1係野生型人GLP-1序列 。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人GLP-1具有至少85%之一致性，例如與野生型人GLP-1具有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該GLP-2係野生型人GLP-2序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人GLP-2具有至少85%之一致性，例如與野生型人GLP-2具有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該脂聯素係野生型人脂聯素序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人脂聯素具有至少85%之一致性，例如與野生型人脂聯素具有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該瘦體素係野生型人瘦體素序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人瘦體素具有至少85%之一致性，例如與野生型人瘦體素具有至少90%、95%或99%之一致性。
在一實施態樣中，該IL-10係野生型人IL-10序列。在另一實施態樣中，該序列係與野生型人IL-10具有至少85%之一致性，例如與野生型人IL-10具有至少90%、95%或99%之一致性。
以本發明之目的而言，用語「經分離」代表已自生物性物質(細胞、核酸或蛋白質)之原始環境(在該環境中該物質係天然存在)移除之物質。舉例來說，以天然狀態存在於植物或動物體內之多核苷酸係未經分離，然而與該多核苷酸天然存在之環境中的鄰近核酸分開之相同多核苷酸 被認為是「經分離」的。
當用於指稱生物性物質時，用語「經純化」不要求該物質以展現絕對純粹、排除其他化合物存在之形式存在。其反而為相對性定義。
「核酸」、「核酸分子」、「寡核苷酸」、「核苷酸」及「多核苷酸」可交換使用，這些用語係指呈單股形式或雙股螺旋之核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧尿苷或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合形式，或彼等之任何磷酯類似物，諸如磷硫代酯及硫酯。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋均有可能。用語核酸分子特別是DNA或RNA分子僅指該分子之一級和二級結構，並不限制彼呈任何特定之三級形式。因此，此用語包括特別是在線性或環狀DNA分子(例如限制片段)、質體、超螺旋DNA及染色體內被發現之雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子之結構時，可能根據通常習慣之僅給予該DNA之非轉錄股之5'至3'方向之序列(即具有和mRNA同源之序列之股)以描述此處之序列。「重組DNA分子」係指遭受分子生物操縱之DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA、質體DNA、合成性DNA及半合成性DNA。
用語「片段」當用於指稱多核苷酸序列時，係指相對於參照核酸長度經減少之核苷酸序列，且除共同部分以外包含與該參照核酸一致之核苷酸序列。就本發明而言，當適 當時，該核酸片段可能為更大之多核苷酸之組分而被包括於該更大之多核苷酸以內。該等片段包含本發明之核酸之至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多個連續核苷酸長度之寡核苷酸，或由該等寡核苷酸組成。
此處所使用之「經分離之核酸片段」係指單股或雙股RNA或DNA之聚合物，該聚合物可任意選擇地包含合成性、非天然或經改變之核苷酸鹼基。呈DNA聚合物形式之經分離之核酸片段可能包含一或多個cDNA、基因組DNA或合成性DNA之區段。
「基因」係指包含編碼功能性分子之核苷酸之多核苷酸，該功能性分子包括僅由轉錄產生者(例如生物活性RNA物種)或由轉錄及轉譯產生者(例如多肽)。用語「基因」包含cDNA及基因組DNA核酸。「基因」亦指表現特定RNA、蛋白質或多肽之核酸片段，包括在該編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)之調節序列。「天然基因」係指在天然中發現具有其本身之調節序列之基因。「嵌合基因」係指非天然基因之任何基因，其包含不在天然中一起發現之調節及/或編碼序列。因此，嵌合基因可能包含源自不同來源之調節序列及編碼序列，或源自相同來源但以不同於在天然中發現之方式排列之調節序列及 編碼序列。嵌合基因可能包含源自不同來源之編碼序列及/或源自不同來源之調節序列。「內源性基因」係指彼之天然位置係位於有機體之基因組內之天然基因。「外來」基因或「異源性」基因係指正常不在宿主有機體內發現，但藉由基因轉移被導入宿主有機體內之基因。外來基因可包含被插入非天然有機體內之天然基因，或嵌合基因。「轉基因」係經由轉形程序被導入基因組內之基因。舉例來說，介白素-12(IL-12)基因編碼IL-12蛋白質。IL-12係由35千道爾頓(kD)次單位(p35)及40千道爾頓次單位(p40)組成之異二聚體，該二個次單位經由雙硫鍵連接以形成完整功能性IL-12p70。IL-12基因編碼p35及p40二個次單位。
「異源性DNA」係指非天然存在於細胞內或細胞內之染色體部位之DNA。異源性DNA可能包含對細胞而言為外來之基因。
用語「基因組」不只包括染色體DNA或RNA，還包括粒線體、葉綠體及病毒DNA或RNA。
當單股形式之核酸分子諸如cDNA、基因組DNA或RNA可在適當之溫度及溶液離子強度之條件下與其他核酸分子黏合時，該核酸分子可與另一核酸分子「雜交」。雜交及清洗條件係廣為周知，並於Sambrook et al.in Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)中舉例說明，特別是其中的第11章及表11.1。溫 度及離子強度之條件決定雜交之「嚴謹度」。
嚴謹度條件可經調整以篩選類似程度不同之片段，自勉強類似之片段(諸如源自相關性遙遠之有機體之同源性序列)至高度類似之片段(諸如源自密切相關之有機體複製功能性酶之基因)。以同源性核酸之初步篩選而言，可使用對應Tm 55℃之低嚴謹度雜交條件，例如5倍SSC、0.1% SDS、0.25%乳及不含甲醯胺；或30%甲醯胺、5倍SSC、0.5% SDS。中度嚴謹度雜交條件對應更高之Tm，例如40%甲醯胺及5倍或6倍SSC。高度嚴謹度雜交條件對應最高之Tm，例如50%甲醯胺及5倍或6倍SSC。
雜交要求二個核酸必須包含互補序列，但是依雜交之嚴謹度不同，鹼基之間可能有錯誤配對之情形。用語「互補」係用來描述核苷酸鹼基之間能彼此雜交之關係。舉例來說，以DNA而言，腺嘌呤係與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。因此，本發明亦包括與此處所揭示或使用之完整序列互補之經分離之核酸片段，以及該些實質上類似之核酸序列。
在本發明之一個實施態樣中，多核苷酸係藉由採用雜交條件加以檢測，該等雜交條件包含於Tm 55℃之雜交步驟及利用如上述之條件。在其他實施態樣中，該Tm係60℃、63℃、或65℃。
雜交後之清洗亦決定嚴謹度之條件。一組條件使用一系列清洗步驟，一開始在室溫下以6倍SSC、0.5% SDS清洗15分鐘(min)，接著在45℃下以2倍SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘，再於50℃下以0.2倍SSC、0.5% SDS重複清洗30分鐘二次。一組嚴謹度條件使用較高之溫度，其中各個清洗步驟與上述相同，除了最後二次以0.2倍SSC、0.5% SDS清洗30分鐘之溫度增加至60℃。另一組高度嚴謹度條件的最後二次清洗於65℃下以0.1倍SSC、0.1% SDS清洗。
另外，技藝人士知道本發明所包含之實質上類似之序列亦可由彼等在嚴謹度條件下(0.1倍SSC、0.1% SDS、65℃及以2倍SSC、0.1% SDS清洗然後以0.1倍SSC、0.1% SDS清洗)與此處示例之序列雜交之能力加以定義。本發明之實質上類似之核酸片段係該些DNA序列與此處所報告之核酸片段的DNA序列有至少約70%、80%、90%或95%一致性的核酸片段。
核酸雜交之適當嚴謹度取決於該等核酸之長度及互補之程度，這些是該領域眾所周知之變異。二個核苷酸序列之間的類似性或同源性程度越高，具有該些序列之核酸的雜交物具有越高之Tm值。核酸雜交之相對穩定性(對應較高之Tm)依下列順序遞減：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。以長度超過100個核苷酸之雜交物而言，計算Tm之方程式已被發展(見Sambrook et al.，同上，9.50-0.51)。以較短核酸(即寡核苷酸)之雜交而言，錯誤配對之位置更顯重要，且寡核苷酸之長度決定彼之特異性(見Sambrook et al.，同上，11.7-11.8)。
在本發明之一個實施態樣中，多核苷酸係藉由採用雜 交條件加以檢測，該等條件包含在低於500毫莫耳鹽濃度及至少37℃下之雜交步驟，及在至少63℃之溫度下使用2倍SSPE之清洗步驟。在另一實施態樣中，該等雜交條件包含低於200毫莫耳鹽濃度及至少37℃下之雜交步驟。在其他實施態樣中，該等雜交條件包含2倍SSPE及在63℃下之雜交及清洗步驟。
在另一實施態樣中，可雜交之核酸之長度係至少約10個核苷酸。較佳地，可雜交之核酸之最短長度係至少約15個核苷酸，例如至少約20個核苷酸，例如至少30個核苷酸。另外，該領域之技藝人士將瞭解該溫度及清洗溶液鹽濃度可根據各種因素諸如探針長度而視需要調整。
用語「探針」係指可與互補性單股標靶核酸鹼基配對以形成雙股分子之單股核酸分子。
此處所使用之用語「寡核苷酸」係指可與基因組DNA分子、cDNA分子、質體DNA或mRNA分子雜交之短核酸。寡核苷酸可利用例如32P-核苷酸或經標記(諸如生物素)共價共軛之核苷酸加以標示。經標示之寡核苷酸可被用來作為探針以檢測核酸之存在。寡核苷酸(其一或二者可經標示)可被用來作為PCR引子，以用於克隆(clone)核酸之全長或片段以供DNA定序，或用於檢測核酸之存在。寡核苷酸亦可被用來與DNA分子形成三螺旋體。通常，寡核苷酸係經合成製備，較佳地在核酸合成儀上合成。因此，經製備之寡核苷酸可具有非天然發生之磷酯鍵類似物，諸如硫酯鍵等。
「引子」係指與標靶核酸序列雜交以產生雙股核酸區之寡核苷酸，該雙股核酸區可在適當之條件下作為DNA合成之起始點。該等引子可被用於聚合酶連鎖反應或DNA定序。
「聚合酶連鎖反應」之縮寫為PCR，係指經酶之作用擴增特定核酸序列之試管內方法。PCR涉及溫度週期之重複循環，每個週期包含三個階段：使模板核酸變性以分開標靶分子之股、使單股PCR寡核苷酸引子與模板核酸黏合及藉由DNA聚合酶使黏合引子延伸。PCR提供檢測標靶分子存在與否，以及在定量或半定量條件下測定該標靶分子在核酸起始池內之相對量之方法。
「逆轉錄聚合酶連鎖反應」之縮寫為RT-PCR，係指經酶之作用自RNA分子產製標靶cDNA分子，接著如上所述經酶之作用擴增在該標靶cDNA分子內之特定核酸序列之試管內方法。RT-PCR亦提供檢測標靶分子存在與否，及在定量或半定量條件下測定該標靶分子在核酸起始池內之相對量之方法。
DNA「編碼序列」或「編碼區」係指編碼多肽之雙股DNA序列，且當「編碼序列」被置於適當調節序列之控制下，其可在細胞內、活體外(ex vivo)、試管內(in vitro)或活體內(in vivo)被轉錄及轉譯成多肽。「適當之調節序列」係指位於編碼序列上游(5'非編碼序列)、編碼序列之內或編碼序列下游(3'非編碼序列)之核苷酸序列，該序列影響該相關編碼序列之轉錄、RNA處理或穩定性或轉譯 。調節序列可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化辨識序列、RNA處理位點、效應子結合位點及莖環結構。編碼序列之邊界定義為在5'(胺基)端之起始密碼子及在3'(羧基)端之轉譯終止密碼子。編碼序列可包括但不限於原核序列、來自mRNA之cDNA、基因組DNA序列及甚至合成性DNA序列。若該編碼序列係意圖用於真核細胞內表現，通常在該編碼序列之3'端將有聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列。
「開放閱讀框」之縮寫為ORF，係指一段核酸序列(不論是DNA、cDNA或RNA)，其包含轉譯起始信號或起始密碼子(諸如ATG或AUG)及終止密碼子，且可能可被轉譯成多肽序列。
此處使用之用語「頭對頭」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5'端係與另一多核苷酸之編碼股的5'端相鄰，該二個多核苷酸係以頭對頭之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著遠離另一多核苷酸之5'端前進。用語「頭對頭」可簡寫為(5')-對-(5')，亦可以符號(← →)或(3'←5'5'→3')表示
此處使用之用語「尾對尾」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的3'端係與另一多核苷酸之編碼股的3'端相鄰，該二個多核苷酸係以尾對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著另一多核苷酸前進。用語「尾對尾」可簡寫為(3')-對-(3' )，亦可以符號(→ ←)或(5'→3'3'←5')表示。
此處使用之用語「頭對尾」描述二個多核苷酸序列彼此之關係的方向性。當一個多核苷酸之編碼股的5'端係與另一多核苷酸之編碼股的3'端相鄰，該二個多核苷酸係以頭對尾之方向性排列，藉以使各多核苷酸之轉錄方向朝著與另一多核苷酸相同之方向前進。用語「頭對尾」可簡寫為(5')-對-(3')，亦可以符號(→ →)或(5'→3'5'→3')表示。
用語「下游」係指位於參考核苷酸序列3'之核苷酸序列。特別是，下游核苷酸序列通常與在轉錄起始點之後的序列相關。舉例來說，基因之轉譯起始密碼子係位於轉錄起始位點之下游。
用語「上游」係指位於參考核苷酸序列5'之核苷酸序列。特別是，上游核苷酸序列通常與位於編碼序列之5'側或轉錄起始點之序列相關。舉例來說，大部分啟動子係位於轉錄起始點之上游。
用語「限制內核酸酶」及「限制酶」可交換使用，係指在雙股DNA之內與特定核苷酸序列結合且在該特定核苷酸序列之內切割之酶。
「同源性重組」係指將外來DNA序列插入另一DNA分子內，例如將載體插入染色體內。較佳地，該載體以特定染色體位點為標靶以進行同源性重組。以特定同源性重組而言，該載體將包含足夠長度之與染色體序列同源之區，以允許互補結合及使載體納入染色體內。同源性之區域越 長及序列類似性之程度越高可增加同源重組之效率。
該領域中已知之一些方法可被用於增殖本發明之多核苷酸。一旦適當之宿主系統及生長條件被建立後，重組表現載體可被大量增殖及製備。如此處所述，可使用之表現載體包括但不限於下列載體或彼等之衍生物：人或動物病毒諸如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒諸如桿狀病毒；酵母菌載體；噬菌體載體(例如λ)及質體及黏質體DNA載體等。
「載體」係指任何用於克隆及/或轉移核酸至宿主細胞內之載具。載體可為複製子，該複製子可與另一DNA片段附著以促成該附著區段之複製。「複製子」係指任何功能為活體內DNA複製之自主單位(即可自行控制複製)之基因元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。用語「載體」包括在試管內、活體外或活體內用於將核酸導入細胞內之病毒及非病毒載具。許多該領域中已知之載體可被用於操縱核酸、將反應元件及啟動子納入基因內等。可能的載體包括例如質體或經改質之病毒包括例如噬菌體諸如λ衍生物，或質體諸如pBR322或pUC質體衍生物，或Bluescript載體。另一可用於本發明之載體實例係如WO 2007/038276及US 2004/185556中所述之UltraVectorTM產製系統(維吉尼亞州布萊克斯堡(Blacksburg,VA)英創松(Intrexon)公司)。舉例來說，欲將對應反應元件及啟動子之DNA片段插入適當之載體中，可藉由使適當之DNA片段與具有互補黏性端之選擇載體連接加以完成 。另外，該等DNA分子之末端可能經酶修飾或可能藉由連接核苷酸序列(連接子)至該DNA末端以產生任何位點。該等載體可能經工程化以包含可選擇之標誌基因，藉此篩選已將該標誌納入細胞基因組內之細胞。該等標誌允許辨識及/或篩選該納入及表現由該標誌所編碼之蛋白質之宿主細胞。
病毒載體(特別是反轉錄病毒載體)已被用於各種細胞內之基因遞送應用，另外也被用於活動物個體。可被使用之病毒載體包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒相關病毒、痘病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、腺病毒、雙生病毒及花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質(細胞轉染素)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。除了核酸之外，載體亦可包含一或多個調節區，及/或可用於選擇、測量及監測核酸轉移結果(轉移至何種組織、表現期間等)之可選擇標誌。
用語「質體」係指通常攜帶並非細胞中心代謝之部分的基因之染色體外元件，且通常呈環狀雙股DNA分子之形式。該等元件可自主性地複製源自任何來源之序列、基因組嵌入序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環狀或超螺旋之單股或雙股DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已被接合或重組成獨特之建構體，該建構體能將經選擇之基因產物的啟動子片段及DNA序列與適當之3'非轉譯序列導入細胞內。
「克隆(cloning)載體」係指「複製子」，其為依序複製且包含複製起點之單位長度之核酸(較佳為DNA)，諸如質體、噬菌體或黏質體，克隆載體可與另一核酸區段附著以促成該附著區段之複製。克隆載體可於一種細胞類型中複製，並於另一種細胞類型中表現(「穿梭載體」)。克隆載體可包含一或多個可被用於篩選包含該載體之細胞之序列，及/或一或多個供插入受關注之序列之多重克隆位點。
用語「表現載體」係指經設計而能夠表現被插入之核酸序列之載體、質體或載具。經克隆之基因即經插入之核酸序列通常被置於控制元件之控制下，諸如啟動子、最小啟動子、增強子或該類似元件。可用於驅動核酸於所欲宿主細胞內之表現之起始控制區或啟動子為數眾多，且為該領域之技藝人士所熟悉。幾乎任何能驅動這些基因表現之啟動子可被用於表現載體，包括但不限於病毒啟動子、細菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成性啟動子、組成性啟動子、組織特異性啟動子、致病機轉或疾病相關啟動子、發展特異性啟動子、誘導性啟動子、光調節性啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、鹼性磷酸酶啟動子(可用於啤酒釀母菌內表現)；AOX1啟動子(可用於畢赤酵母內表現)；β-內醯胺酶、lac、ara、tet、trp、lP L 、lP R 、T7、tac及trc啟動子(可用於在大腸桿菌(Escherichia coli)內表現)；光調節 性-、種子特異性-、花粉特異性-、卵巢特異性-、花菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S、最小CMV 35S、木薯葉脈嵌紋病毒(cassava vein mosaic virus)(CsVMV)、葉綠素a/b結合蛋白、核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶、莖特異性、根特異性、幾丁質酶、壓力誘導性、水稻東格魯(tungro)桿狀病毒、植物超啟動子、馬鈴薯白胺酸胺肽酶、硝酸還原酶、甘露鹼合成酶、胭脂胺酸合成酶、泛素、玉米蛋白及花青素啟動子(可用於在植物細胞內表現)；該領域已知之動物及哺乳動物啟動子包括但不限於SV40早期(SV40e)啟動子區、勞斯肉瘤病毒(RSV)之3'長終端重複(LTR)所包含之啟動子、腺病毒(Ad)之E1A或主要晚期啟動子(MLP)基因之啟動子、巨細胞病毒(CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IE1啟動子、延長因子1 α(EF1)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、鼠啟動子之調節序列及轉錄控制區、金屬硫蛋白-L啟動子及轉錄控制區、普遍型啟動子(HPRT、波形蛋白、α-肌動蛋白、微管蛋白及該類似物)、中間絲(肌間線蛋白、神經絲、角質素、GFAP及該類似物)之啟動子、(MDR、CFTR或因子VIII型及該類似物)之治療基因之啟動子、致病機轉或疾病相關啟動子，及展現組織特異性且已被用於基因轉殖動物之啟動子，諸如在胰腺泡細胞內具活性之彈性蛋白酶I基因控制區；在胰β細胞內具活性之胰島素基因控制區、在淋巴樣 細胞內具活性之免疫球蛋白基因控制區、在睪丸、乳房、淋巴樣及肥胖細胞內具活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區；在肝臟中具活性之白蛋白基因、Apo AI及Apo AII控制區、在肝臟中具活性之α-胎兒蛋白基因控制區、在肝臟中具活性之α 1-抗胰蛋白酶基因控制區、在骨髓細胞內具活性之β-球蛋白基因控制區、在腦之寡突細胞內具活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區、在骨骼肌中具活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區及在下視丘中具活性之促性腺釋放激素基因控制區、丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結合小腸蛋白之啟動子、平滑肌細胞α-肌動蛋白之啟動子及該類似物。此外，這些表現序列可能藉由加入增強子或調節序列及該類似物加以修飾。
載體可經由該領域已知之方法導入所欲之宿主細胞內，例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白(見例如Wu et al.,J Biol.Chem.267：963(1992)、Wu et al.,J Biol.Chem.263：14621(1988)及Hartmut et al.，加拿大第2,012,311號專利申請案)。
本發明之載體亦可經任何投予途徑投予至個體，包括但不限於肌肉內投予。
本發明之多核苷酸亦可經由脂質體轉染被導入活體內。在過去十年內，越來越常使用脂質體於試管內包封及轉染核酸。經過設計以減少脂質體媒介性轉染所遭遇之困難 及危險的合成性陽離子脂質可被用於製備脂質體，以供活體內轉染編碼標誌之基因(FeIgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)、Mackey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027(1988)及Ulmer et al.,Science 259：1745(1993))。使用陽離子脂質可增進帶負電核酸之包封，亦可促進與帶負電細胞膜之融合(Felgner et al.,Science 337：387(1989))。特別適用於轉移核酸之脂質化合物及組成物係描述於WO95/18863、WO96/17823及美國專利第5,459,127號。利用脂質體轉染以導入外源性基因至活體內之特定器官具有某些實際好處。一部分之優點在於脂質體對於特定細胞之分子靶向性。很明顯的，引導對特定細胞類型之轉染將特別適用於具有細胞異質性之組織，諸如胰、肝、腎及腦。脂質可與其他分子化學偶合以達標靶之目的(Mackey et al.1988，同上)。經標靶之肽(例如荷爾蒙或神經傳遞物)及蛋白質諸如抗體或非肽分子可與脂質體化學偶合。
其他分子亦可用於促進核酸於活體內之轉染，諸如陽離子寡肽(例如WO95/21931)、衍生自DNA結合蛋白之肽(例如WO96/25508)或陽離子聚合物(例如WO95/21931)。
也可能於活體內導入呈裸DNA質體之載體(見美國專利第5,693,622、5,589,466及5,580,859號)。受體媒介性DNA遞送方法亦可被使用(Curiel et al.,Hum.Gene Ther.3：147(1992)及Wu et al.,J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
用語「轉染」係指細胞之攝取外源性或異源性RNA或DNA。當外源性或異源性RNA或DNA被導入細胞內時，該細胞係經該等RNA或DNA之「轉染」。當該經轉染之RNA或DNA導致細胞之表型改變，該細胞被外源性或異源性RNA或DNA「轉形」。轉形RNA或DNA可被整合(共價連接)至組成細胞之基因組之染色體DNA。
「轉形」係指將核酸片段轉移至宿主有機體之基因組內，導致基因穩定性繼承。包含該轉形核酸片段之宿主有機體被稱為「基因轉殖」或「重組」或「轉形」有機體。
此外，包含本發明之多核苷酸之重組載體可包括一或多個在細胞性宿主內擴增或表現時所尋找之複製起點、標誌或可選擇之標誌。
用語「可選擇之標誌」係指識別因子，通常為抗生素或化學抗藥性基因，該標誌能根據該標誌基因之效應被選擇，即對抗生素之抗藥性、對除草劑之抗藥性、比色標誌、酶、螢光標誌及該類似物，其中該效應係用於追蹤感興趣之核酸的繼承性及/或識別已繼承感興趣之核酸的細胞或有機體。該領域已知及使用之可選擇之標誌基因實例包括：提供對安比西林、鏈黴素、健他黴素、卡那黴素、潮黴素、雙丙氨磷除草劑、磺醯胺及該類似物之抗藥性的基因；及用來作為表型標誌之基因，即花青素調節基因、異戊烯轉移酶基因及該類似物。
用語「報告基因」係指編碼識別因子之核酸，該識別因子能根據該報告基因之效應被識別，其中該效應係用於追 蹤感興趣之核酸的繼承性、識別已繼承感興趣之核酸的細胞或有機體，及/或測量基因表現誘導或轉錄。該領域已知及使用之報告基因實例包括：螢光素酶(Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-尿苷酸酶(Gus)及該類似物。可選擇之標誌基因亦可被認為是報告基因。
「啟動子」及「啟動子序列」可交換使用，係指能控制編碼序列或功能性RNA之表現的DNA序列。一般來說，編碼序列係位於啟動子序列之3'端。啟動子可整體衍生自天然基因，或可由源自天然中所發現之不同啟動子的不同元件所組成，或甚至包含合成性DNA區段。該領域之技藝人士了解，不同的啟動子可能引導基因在不同的組織或細胞類型中表現，或在不同的發展階段表現，或因應不同的環境或生理條件表現。造成基因在大部分時間及大部分細胞類型中表現之啟動子通常被稱為「組成性啟動子」。造成基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常被稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。造成基因在特定發展或細胞分化階段表現之啟動子通常被稱為「發展特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在以劑、生物性分子、化學物、配體、光線或可誘導啟動子之類似物暴露或處理細胞之後被誘導且造成基因表現之啟動子通常被稱為「誘導性啟動子」或「調節性啟動子」。另外知道的是，由於在大部分情況中，調節序列之確切邊界並未被完全定義，因此不同長度之DNA片段可能具有相同之啟動子活性。
在本發明之任何載體中，該載體可任意選擇地包含此處所揭示之啟動子。在一實施態樣中，該啟動子係列示於此處之表1之啟動子。
在本發明之任何載體中，該載體可任意選擇地包含組織特異性啟動子。在一實施態樣中，該組織特異性啟動子係此處所揭示之組織特異性啟動子。在另一實施態樣中，該組織特異性啟動子係列示於此處之表2之組織特異性啟動子。
啟動子序列通常以彼之3'端的轉錄起始位點為界，延伸至上游(5'方向)以包括啟動在背景值以上可偵測之量之轉錄所需之最小數量之鹼基或元件。在該啟動子序列之內可發現轉錄起始位點(方便地以例如核酸酶S1之定位定義)，和負責與RNA聚合酶結合之蛋白質結合結構域(一致序列)。
「治療性開關啟動子」(「TSP」)係指控制基因開關成份之表現的啟動子。見例如US 2009/0098055，其現以參照方式整體納入此處。基因開關及彼等之各種成份係詳細描述於本說明書之其他地方。在某些實施態樣中，TSP係組成性的，即具連續活性。組成性TSP可能為全面組成性(即在任何組織或細胞中不需額外之因子或調節物而普遍地具有功能)或組織或細胞特異性組成性(即在特定組織類型或細胞類型中不需額外之因子或調節物而普遍地具有功能)。在某些實施態樣中，本發明之TSP在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化。在本發明之某些涉及二或 多種TSP之實施態樣中，該等啟動子可為組成性及活化性啟動子之組合。如此處所使用，「在疾病、疾患或狀況相關性條件下被活化之啟動子」包括但不限於疾病特異性啟動子、對特定生理性、發展性、分化性或病理性條件有反應之啟動子、對特定生物性分子有反應之啟動子，及對特定疾病、疾患或狀況相關性組織或細胞類型(例如腫瘤組織或惡性細胞)具特異性之啟動子。TSP可包含天然發生之啟動子之序列、衍生自天然發生之啟動子的經修飾之序列，或合成性序列(例如將反應元件插入最小啟動子序列以改變該啟動子之反應性)。
當RNA聚合酶將細胞內之編碼序列轉錄成mRNA時，該編碼序列係在轉錄及轉譯控制序列之「控制下」，該mRNA接著經RNA反式剪切(若該編碼序列包含內含子)及轉譯成為由該編碼序列所編碼之蛋白質。
「轉錄及轉譯控制序列」係指DNA調節序列，諸如啟動子、增強子、終止子及該類似序列，其用以在宿主細胞內表現編碼序列。在真核細胞中，聚腺苷酸化信號係控制序列。
用語「反應元件」係指一或多種順式作用之DNA元件，該元件授予經由與轉錄因子之DNA-結合結構域交互作用所媒介之啟動子的反應性。此DNA元件在彼之序列中可為迴文(完美或不完美)或由序列模體或被不等數量之核苷酸分開之半位點組成。該等半位點可為類似或相同的，經排列為正向或反向重複，或為單一半位點或串聯鄰近 半位點之多聚體。依將納入反應元件之細胞或有機體之性質而定，該反應元件可包含分離自不同有機體之最小啟動子。在配體存在或不存在下，轉錄因子之DNA結合結構域與反應元件之DNA序列結合，以在此反應元件之調節下啟動或抑制下游基因之轉錄。天然蛻皮激素受體之反應元件的DNA序列實例包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：1)(見Cherbas et.al.,Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA(SEQ ID NO：2)，其中N(n)可為一或多種間隔子核苷酸(見D'Avino et al.,Mol.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；及GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：3)(見Antoniewski et al.,Mol.Cell Biol.14：4465(1994))。
用語「可操作性連接」係指核酸序列與單一核酸片段相連以致使一者之功能受到另一者之影響。舉例來說，當啟動子能影響編碼序列之表現時(即編碼序列係在啟動子之轉錄控之下)，該啟動子係與該編碼序列可操作性連接。編碼序列可與調節序列以同義或反義之方向可操作性連接。
此處所使用之用語「表現」係指轉錄及穩定累積源自核酸或多核苷酸之同義(mRNA)或反義RNA。表現亦可指將mRNA轉譯成蛋白質或多肽。
用語「卡匣」、「表現卡匣」及「基因表現卡匣」係指可在特定限制位點或藉由同源重組被插入核酸或多核苷酸之內的DNA區段。該DNA區段包含編碼感興趣多肽之多核苷 酸，且該卡匣及限制位點係經設計以確保該卡匣被插入適當之閱讀框以供轉錄及轉譯。「轉形卡匣」係指特定載體，其包含編碼感興趣之多肽的多核苷酸，且除了該多核苷酸以外還具有促進特定宿主細胞轉形之元件。本發明之卡匣、表現卡匣、基因表現卡匣及轉形卡匣亦可包含允許編碼感興趣之多肽的多核苷酸於宿主細胞內增進表現之元件。這些元件包括但不限於：啟動子、最小啟動子、增強子、反應元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列及該類似序列。
為達本發明之目的，用語「基因開關」係指與啟動子相關之反應元件與以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在一或多種配體存在下，可調控基因表現為該反應元件及啟動子係經納入。用語「編碼基因開關之多核苷酸」係指與啟動子相關之反應元件與編碼以配體依賴性轉錄因子為基底之系統的多核苷酸之組合，該以配體依賴性轉錄因子為基底之系統在一或多種配體存在下，可調控基因表現為該反應元件及啟動子係經納入。
本發明之治療性開關啟動子可為任何可用於治療、改善或預防特定疾病、疾患或狀況之啟動子。實例包括但不限於只在特定疾病、疾患或狀況期間展現增加表現之基因的啟動子及在特定細胞狀況下(例如增生、細胞凋亡、pH值改變、氧化狀態改變、氧氣量改變)展現增加表現之基因的啟動子。在基因開關包含超過一種轉錄因子序列之一些實施態樣中，該治療性方法之特異性可藉由組合疾病或 狀況特異性啟動子與組織或細胞類型特異性啟動子而增加，藉以限制該治療性產物在其中表現之組織。因此，組織或細胞類型特異性啟動子係包含於治療性開關啟動子之定義內。
以疾病特異性啟動子為例，可用於治療癌之啟動子包括致癌基因之啟動子，包括用於治療貧血之啟動子。致癌基因之類別實例包括但不限於生長因子、生長因子受體、蛋白質激酶、計畫性細胞死亡調節物及轉錄因子。致癌基因之特定實例包括但不限於sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc及bcl-2及TERT。其他癌相關基因之實例包括腫瘤相關性抗原基因及其他在腫瘤細胞中過度表現之基因(例如MAGE-1、癌胚胎抗原、酪胺酸酶、前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn及湯姆森-佛登斯列(Thompson-Friedenreich)抗原(TF))。
該領域已知且可用來作為本發明之治療性開關啟動子之啟動子序列及其他調節元件(例如增強子)之實例係揭示於表1及2所列示之參考文獻，同時列出與各啟動子相關之疾病/疾患(表1)或組織特異性(表2)。在表中引述之美國專利及經公開之美國申請案中所揭示之啟動子序列及其中所揭示之序列係以參照方式整體納入此處。
編碼表1所列之任何蛋白質之多核苷酸亦可利用本發明之具有非治療性啟動子之啟動子的載體表現。
在特定疾病或疾患期間展現改變之表現量且因此可提供可用於本發明之啟動子的其他基因包括但不限於表3所列之基因(亦列出相關疾病/疾患)。
一旦辨識出在疾病、疾患或狀況過程中經調節之具表現模式之基因，該基因之啟動子可被用於本發明之基因開關。許多基因之序列(包括啟動子區域)係該領域所知，且可自公眾資料庫例如GenBank取得。因此，一旦識別出適當基因，該啟動子序列可被輕易地識別及取得。本發明之另一態樣關於識別適當基因，該適當基因之啟動子可被分離及放置於基因開關之中。因此，該基因之特性對本發明之特定實施態樣無關重要，只要該啟動子可被分離以用於後續設定或環境。本發明因此包括使用來自尚未被識別之基因的啟動子。一旦找出適當之基因，測定啟動子功能所需之基因序列係屬例行技藝或實驗。事實上，有多種商用程序可用於協助測定感興趣之基因的啟動子區域。舉例來說，丁(Ding)等人最近藉由逐步刪除人Sprouty4基因之5'-側翼序列以闡明新穎之Sprouty4基因的啟動子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L52(2004)，以參照方式納入此處)。簡言之，當決定轉錄起始位點後，利用共同PCR引子產生PCR片段以在單一方向選殖5'-側翼區段之區段。該產生之區段被選殖至螢光素酶受體載體，測量螢光素酶之活性以決定人Sprouty4基因之啟動子區域。
另一獲得及驗證基因啟動子之程序實例包括下列步驟：(1)取得類似/相同組織類型之疾病及非疾病細胞/組織樣本；(2)自該等樣本分離全RNA或mRNA；(3)進行疾病及非疾病RNA之差異微陣列分析；(4)找出候選疾病特異性轉錄物；(5)找出與疾病特異性轉錄物有關之基因組序列；(6)取得或合成該疾病特異性轉錄物之預測轉錄起始位點上游及下游的DNA序列；(7)利用得自步驟6之不同長度之DNA設計及產製啟動子報告子載體；及(8)在疾病及非疾病細胞/組織及不相關細胞/組織中測試啟動子報告子載體。
被插入基因開關中之啟動子的來源可為天然或合成性，該啟動子之來源不應限制此處所述之本發明之範圍。換言之，該啟動子可能直接自細胞選殖，或該啟動子可能自不同來源選殖，或該啟動子可能為合成性。
在另一實施態樣中，編碼表1至3中之任一基因產物之多核苷酸可被用於本發明之載體及方法以用於治療用途及診斷目的。
基因開關系統
基因開關可能為藉由添加或移除特定配體以調節基因表現之任何基因開關。在一實施態樣中，該基因開關係一種其中基因表現之量取決於配體之存在量的基因開關。可用於本發明之基因開關之配體依賴性轉錄因子複合物之實例包括但不限於由彼等之個別配體(例如糖皮質素、雌激 素、黃體激素、類視色素、蛻皮激素及彼等之類似物或擬似物)所活化之核受體超家族之成員及由四環素活化之rTTA。在本發明之一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。該等系統之實例包括但不限於美國專利第6,258,603號、美國專利第7,045,315號、美國公開專利申請案第2006/0014711、2007/0161086號及國際公開申請案第WO 01/70816號中所述之系統。嵌合性蛻皮激素受體系統之實例係描述於美國專利第7,091,038號、美國公開專利申請案第2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457及2006/0100416號及國際公開申請案第WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075及WO 2005/108617號，以上各以參照方式整體納入此處。非固醇性蛻皮激素促效劑調節系統之實例係RheoSwitch®哺乳動物誘導性表現系統(麻州伊普斯維奇(Ipswich,MA)新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司)。在本發明之另一態樣中，該基因開關係以FK506結合蛋白(FKBP)與FKBP雷帕黴素相關蛋白(FRAP)之異二聚化為基底，且由雷帕黴素或彼之非免疫抑制性類似物調節。該等系統之實例包括但不限於ARGENTTM轉錄技術(麻州劍橋市ARIAD藥廠)及美國專利第6,015,709、6,117,680、6,479,653、6,187,757及6,649,595號所描述之系統。
在一實施態樣中，該基因開關包含在治療性開關啟動子之控制下編碼配體依賴性轉錄因子複合物之單一轉錄因 子序列。該轉錄因子序列可能編碼天然發生之配體依賴性轉錄因子複合物或人工配體依賴性轉錄因子複合物。人工轉錄因子係其中該轉錄因子之天然序列已被改變之轉錄因子，例如藉由序列突變或藉由組合來自不同轉錄因子之結構域。在一實施態樣中，該轉錄因子包含H組核受體配體結合結構域。在一實施態樣中，H組核受體配體結合結構域係來自蛻皮激素受體、遍在受體(UR)、孤兒受體1(OR-1)、類固醇激素核受體1(NER-1)、類視色素X受體交互作用蛋白-15(RIP-15)、肝X受體β(LXR β)、類固醇激素受體樣蛋白(RLD-1)、肝X受體(LXR)、肝X受體α(LXR α)、類法尼醇X受體(FXR)、受體交互作用蛋白14(RIP-14)或法尼醇受體(HRR-1)。在另一實施態樣中，H組核受體LBD係源自蛻皮激素受體。
A.蛻皮激素基底基因開關
EcR及其他H組核受體係核受體超家族之成員，其中所有成員之一般特徵為具備可任意選擇地與異二聚體伴(HP)融合以形成共活化蛋白(CAP)之胺基端反式活化結構域(AD，亦可互換地稱為「TA」或「TD」)、DNA結合結構域(DBD)及經由鉸鏈區與DBD融合之LBD以形成配體依賴性轉錄因子(LTF)。此處所使用之用語「DNA結合結構域」包含自最小多肽序列之DNA結合蛋白至全長DNA結合蛋白，只要該DNA結合結構域之功能為與特定 反應元件相連。核受體超家族成員之特徵亦包括具備四或五個結構域：A/B、C、D、E，有些成員具備F結構域(見美國專利第4,981,784號及Evans,Science 240：889(1988))。該「A/B」結構域對應反式活化結構域，「C」對應DNA結合結構域，「D」對應鉸鏈區，及「E」對應配體結合結構域。有些家族成員亦在對應「F」之LBD的羧基端側具有另一反式活化結構域。
下列多肽序列係經報告為蛻皮激素受體(蛻皮類固醇受體)之多肽序列(20-羥基-蛻皮激素受體)(20E受體)(EcRH)(核受體子家族1之H組成員1)，Genbank編號為P34021。
源自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)之蛻皮激素受體(878個胺基酸)(SEQ ID NO：5)
在一實施態樣中，該蛻皮激素受體配體結合結構域係選自無脊椎動物蛻皮激素受體配體結合結構域、節肢動物門蛻皮激素受體配體結合結構域、鱗翅類昆蟲(Lepidopteran)蛻皮激素受體配體結合結構域、雙翅類昆蟲(Dipteran)蛻皮激素受體配體結合結構域、直翅類昆 蟲(Orthopteran)蛻皮激素受體配體結合結構域、同翅類昆蟲(Homopteran)蛻皮激素受體配體結合結構域、半翅類昆蟲(Hemipteran)蛻皮激素受體配體結合結構域、雲杉芽捲蛾(Choristoneura fumiferana)EcR蛻皮激素受體配體結合結構域、黃粉蟲(Tenebrio molitor)蛻皮激素受體配體結合結構域、天蛾(Manduca sexta)蛻皮激素受體配體結合結構域、綠棉夜蛾(Heliothis virescens)蛻皮激素受體配體結合結構域、搖蚊(Chironomus tentans)蛻皮激素受體配體結合結構域、桑蠶(Bombyx mori)蛻皮激素受體配體結合結構域、叢林斜眼褐蝶(Bicyclus anynana)蛻皮激素受體配體結合結構域、鹿眼蝶(Junonia coenia)蛻皮激素受體配體結合結構域、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)蛻皮激素受體配體結合結構域、埃及斑蚊(Aedes aegypti)蛻皮激素受體配體結合結構域、綠頭蒼蠅(Lucilia capitata)蛻皮激素受體配體結合結構域、銅綠蠅(Lucilia cuprina)蛻皮激素受體配體結合結構域、紅頭麗蠅(Calliphora vicinia)蛻皮激素受體配體結合結構域、地中海果實蠅(Ceratitis capitata)蛻皮激素受體配體結合結構域、飛蝗(Locusta migratoria)蛻皮激素受體配體結合結構域、桃蚜(Myzus persicae)蛻皮激素受體配體結合結構域、大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)蛻皮激素受體配體結合結構域、美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum)蛻皮激素受體配體結合結構域、銀葉粉蝨(Bamecia argentifoli)蛻皮激素 受體配體結合結構域、或偽黑尾葉蟬(Nephotetix cincticeps)蛻皮激素受體配體結合結構域。
在另一實施態樣中，該蛻皮激素受體配體結合結構域係雲杉芽捲蛾(Choristoneura fumiferana)蛻皮激素受體配體結合結構域，其胺基酸序列係如SEQ ID NO：1所示。
在另一實施態樣中，該蛻皮激素受體配體結合結構域係雲杉芽捲蛾蛻皮激素受體配體結合結構域之類似物，其保留雲杉芽捲蛾蛻皮激素受體配體結合結構域之試管內雲杉芽捲蛾蛻皮激素受體配體結合活性的至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。試管內蛻皮激素受體配體結合試驗係該領域之一般技藝人士所廣為周知。見例如WO 02/066612。
在另一實施態樣中，該蛻皮激素受體配體結合結構域類似物係於WO 02/066612、US 2006/0100416、WO 05/108617及2005/0266457揭示之蛻皮激素受體配體結合結構域。在另一實施態樣中，該蛻皮激素受體配體結合結構域類似物係SEQ ID NO：7之V107I/Y127E取代突變。
DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經改質之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。EcR如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。由於核受體之結構域在天然中係經模塊化，因此LBD、DBD及AD可能可互相交換。
在另一實施態樣中，該轉錄因子包含AD、DBD及H組核受體LBD，該DBD辨識與治療性蛋白質或治療性多核苷酸相連之反應元件以調節該治療性蛋白質或治療性多核苷酸之表現。在某些實施態樣中，該H組核受體LBD包含取代突變。
該DNA結合結構域可為任何具有已知反應元件之DNA結合結構域(DBD)，包括合成性及嵌合性DNA結合結構域或彼等之類似物、組合或修飾物。在一實施態樣中，該DNA結合結構域係選自GAL4 DBD、LexA DBD、轉錄因子DBD、H組核受體成員DBD、類固醇/甲狀腺素核受體超家族成員DBD、細菌性LacZ DBD、EcR DBD、GAL4 DBD或LexA DBD。
該反式活化結構域(縮寫為"AD"或"TA")可為任何H組核受體成員AD、類固醇/甲狀腺素核受體AD、合成性或嵌合性AD、聚麩醯胺AD、鹼性或酸性胺基酸AD、VP16 AD、GAL4 AD、NF-κ B AD、BP64 AD、B42酸活化結構域(B42AD)、p65反式活化結構域(p65AD)、或彼等之類似物、組合或改質物。
在另一實施態樣中，基因開關包含在第一治療性開關啟動子(TSP-1)控制下之第一轉錄因子序列(例如CAP)，及在第二治療性開關啟動子(TSP-2)控制下之第二轉錄因子序列(例如LTF)，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成蛋白質複合物(LDTFC)，即以「雙重開關」或「雙雜交物」為基 底之基因開關。第一及第二TSP可為相同或不同。在此實施態樣中，在表現治療性分子所需之基因開關中存在之二種不同的TSP增進治療性方法之特異性(見WO 2011/119773之圖2)。WO 2011/119773之圖2亦顯示藉由單純地插入適當之TSP以改質治療性基因開關以治療任何疾病、疾患或狀況之能力。
在另一實施態樣中，該第一及第二轉錄因子序列(例如CAP或LTF)皆在單一治療性開關啟動子之控制下(例如WO 2011/119773之圖1中之TSP-1)。此啟動子之活化將在單一開放閱讀框內產製CAP及LTF。此可藉由使用轉錄連接子諸如IRES(內部核糖體進入位點)達成。在此實施態樣中，該配體依賴性轉錄因子複合物之兩部分在TSP-1活化時合成。TSP-1可為組成性啟動子或僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化。
在另一實施態樣中，一轉錄因子序列(例如LTF)係在治療性開關啟動子之控制下，該啟動子僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化(例如WO 2011/119773之圖4中之TSP-2或TSP-3)，另一轉錄因子序列(例如CAP)係在組成性治療性開關啟動子(例如WO 2011/119773之圖4中之TSP-1)之控制下。在此實施態樣中，該配體依賴性轉錄因子複合物之一部分係組成性存在，然而該第二部分將僅在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被合成。
在另一實施態樣中，一轉錄因子序列(例如CAP)係在第一TSP(例如WO 2011/119773之圖3中之TSP-1) 之控制下，而二或多種不同的第二轉錄因子序列(例如LTF-1及LTF-2)係在不同的TSP(例如WO 2011/119773之圖3中之TSP-2及TSP-3)之控制下。在此實施態樣中，各種LTF可能具有辨識不同因子調節性啟動子序列之不同DBD，例如DBD-A與因子調節性啟動子-1(FRP-1)相關性反應元件結合，DBD-B與因子調節性啟動子-2(FRP-2)相關性反應元件結合。各種因子調節性啟動子可與不同的治療性基因可操作性連接。以此方式，可同時提供多重治療。
在一實施態樣中，第一轉錄因子序列編碼包含AD、DBD及H組核受體LBD之多肽，該DBD辨識與治療性產物序列相連之反應元件以調節該治療性產物序列之表現，第二轉錄因子序列編碼包含核受體LBD之轉錄因子，該LBD選自脊椎動物類視色素X受體(RXR)、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體配體結合結構域多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2及US 2004/0096942 A1)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在另一實施態樣中，基因開關包含編碼第一多肽之第一轉錄因子序列及編碼第二多肽之第二轉錄因子序列，該第一多肽包含核受體LBD及DBD，該DBD辨識與治療性產物序列相連之反應元件以調節該治療性產物序列之表現，該第二多肽包含AD及核受體LBD，其中核受體LBD之 一係H組核受體LBD。在一實施態樣中，該第一多肽係實質上不含AD，該第二多肽係實質上不含DBD。就本發明之目的而言，「實質上不含」係指有問題之蛋白質不包含有問題之結構域的足夠序列來提供活化或結合活性。
在本發明之另一態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含異二聚體伴及AD之蛋白質(「CAP」)，該第二轉錄因子序列編碼包含DBD及LBD之蛋白質(「LTF」)。
當只有一個核受體LBD係H組LBD時，另一核受體LBD可能來自任何其他核受體以與H組LBD形成二聚體。舉例來說，當H組核受體LBD係EcR LBD時，其他核受體LBD「伴」可能來自EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體LBD多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2、國際專利申請案PCT/US02/05235、US 2004/0096942 A1及美國專利第7,531,326號，以參照方式整體納入此處)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在一實施態樣中，脊椎動物RXR LBD係來自人智人(Homo sapiens)、小鼠家鼷鼠(Mus musculus)、大鼠溝鼠(Rattus norvegicus)、雞原雞(Gallus gallus)、豬家豬(Sus scrofa domestica)、青蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚斑馬魚(Danio rerio)、被囊動物三崎海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母箱型水母( Tripedalia cysophora)之RXR。
在一實施態樣中，無脊椎動物RXR配體結合結構域係來自蝗蟲飛蝗(Locusta migratoria)之超氣門多肽(「LmUSP」)、硬蜱美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum)之RXR同源物1(「AmaRXR1」)、硬蜱美洲鈍眼蜱之RXR同源物2(「AmaRXR2」)、招潮蟹大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)之RXR同源物(「CpRXR」)、甲蟲黃粉蟲(Tenebrio molitor)之RXR同源物(「TmRXR」)、蜜蜂義大利蜂(Apis mellifera)之RXR同源物(「AmRXR」)、蚜蟲桃蚜(Myzus persicae)之RXR同源物(「MpRXR」)或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之RXR同源物。
在一實施態樣中，嵌合性RXR LBD包含至少二種選自脊椎動物物種RXR多肽片段、非脊椎動物物種RXR多肽片段或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段之多肽片段。用於本發明之嵌合性RXR配體結合結構域可能包含至少二種不同物種之RXR多肽片段，或當物種係相同時，該二或多種多肽片段可來自該物種RXR多肽片段之二或多種不同的異構體。該等嵌合性RXR LBD係揭示於例如WO 2002/066614。
在一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種無脊椎動物物種RXR多肽片段。
在另一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包 含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段。
當配體與核受體之LBD組合且轉而與治療性產物序列相關性FRP之反應元件結合時，該配體提供外部時態調控治療性產物序列之表現。本發明之各種成份間互相結合即例如配體與LBD結合、DBD與反應元件結合、AD與啟動子結合等之結合機轉或順序並不重要。
在特定實施例中，配體與H組核受體之LBD及彼之核受體LBD伴結合使治療性產物序列得以表現。此機轉不排除配體與H組核受體(GHNR)或彼之伴結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如GHNR+GHNR或伴+伴)之可能性。較佳地，以一或多種不同的受體結構域產生雜交基因開關。通常，該三種結構域DBD、LBD及AD中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該雜交基因及該形成之雜交蛋白質在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))，或專門與經設計、改質及選擇以進行特定交互作用之蛋白質進行該等標靶交互作用之合成性反應元件(見例如Kim et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,94：3616(1997))，以適應雜交受體。雙雜交系統之另一好處在於它們能夠根據所欲之終結果選擇用於驅使基因表現之啟動子。該等雙重控制在基因治療之領域中特別重要，尤其是當細胞毒性蛋白質被產生時，因為表現時機及表現發生之細胞皆可被控制。當與適當之啟動子可操作性連接之基因被導入個體之細胞內時，該等外源性基因之表現係受到本發明之系統的存在所控制。啟動子可能經組成性或誘導性調節，或可能具組織特異性(即僅在特定細胞類型中表現)或對有機體之某些發展階段具特異性。
在配體存在或不存在下，該第一雜交蛋白質之DNA結合結構域與反應元件之DNA序列結合，以在此反應元件之調節下啟動或抑制下游基因之轉錄。
功能性LDTFC，例如EcR複合物，亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38或β FTZ-1)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR、USP及/或RXR之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。此外，可能需要其他輔因子，諸如通常被稱為輔活化子(亦稱為適應子或媒介子)之蛋白質。這些蛋白質不與DNA序列特異性結合，且不參與基礎轉錄。它們可能經由各種機轉展現它們對轉錄活化之影響，包括刺激與活化子之DNA結合、影響染色質結構，或媒介活化子起始複合物交互作用。該等輔活化子之實例包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA- 2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混雜輔活化子C反應元件B結合蛋白CBP/p300(見回顧文獻Glass et al.,Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。另外，通常被稱為輔抑制子(又名抑制子、靜默子或靜默媒介子)之蛋白質輔因子可能為缺乏配體時有效抑制轉錄活化所需。這些輔抑制子可與無配體之EcR交互作用以靜默反應元件之活性。目前的證據顯示，配體結合改變受體之構型，導致釋放輔抑制子及吸引上述輔活化子，藉此取消彼等之靜默活性。輔抑制子之實例包括N-CoR及SMRT(見回顧文獻Horwitz et al.,Mol Endocrinol.10：1167(1996))。這些輔因子可能為在細胞或有機體內之內源性因子，或可能為外源性添加之轉基因以經調節或未調節之方式表現。
B.雷帕黴素基底基因開關
本發明另提供利用FK506結合蛋白作為配體依賴性轉錄因子複合物及雷帕黴素作為配體之基因開關系統。在一實施態樣中，該編碼基因開關之建構體包含(a)編碼第一嵌合性蛋白質之第一多核苷酸，該第一多核苷酸與雷帕黴素或彼之類似物結合且包含至少一個FK506-結合蛋白(FKBP)結構域及至少一個與FKBP結構域異源之蛋白質結構域，其中該FKBP結構域包含選自下列之肽序列：(1)天然發生之FKBP，(2)天然發生之FKBP之變異體，其中最多10 個胺基酸殘基被刪除、插入或被取代胺基酸取代，或(3)由與編碼(1)或(2)之FKBP的DNA序列選擇性雜交之DNA序列所編碼之FKBP；(b)編碼第二嵌合性蛋白質之第二多核苷酸，該第二多核苷酸與(a)雷帕黴素或雷帕黴素類似物及(b)第一嵌合性蛋白質形成複合物，且包含至少一個FKBP：雷帕黴素結合(FRB)結構域及至少一個與FRB結構域異源之蛋白質結構域，其中該FRB結構域包含選自下列之肽序列：(4)天然發生之FRB結構域，(5)天然發生之FRB結構域之變異體，其中最多10個胺基酸殘基被刪除、插入或被取代胺基酸取代，或(6)由與編碼(4)或(5)之FRB的DNA序列選擇性雜交之DNA序列所編碼之FRB結構域。
在此基因開關系統中，該第一多核苷酸及該第二多核苷酸各在本說明書他處所述之一或多種治療性開關啟動子之控制下。另外，在某些實施態樣中，至少一種與該第一及第二嵌合性蛋白質中之FKBP及/或FRB結構域異源之蛋白質結構域可為一或多種「活性」或「效應」結構域。效應結構域可選自各式各樣之蛋白質結構域，包括DNA結合結構域、轉錄活化結構域、細胞定位結構域及傳訊結構域(即當群集或多聚化時可引發細胞生長、增生、分化、細 胞凋亡、基因轉錄等之結構域)。
在某些實施態樣中，一種融合蛋白質包含至少一種DNA結合結構域(例如GAL4或ZFHD1 DNA結合結構域)，另一種融合蛋白質包含至少一種轉錄活化結構域(例如VP16或p65轉錄活化結構域)。融合蛋白質之配體媒介性連接代表形成轉錄因子複合體及導致開始轉錄與由該融合蛋白質之一的DNA結合結構域所辨識(即能夠結合)之DNA序列連接之標靶基因。有關基因表現系統及配體之資訊係揭示於美國專利第6,187,757 B1、6,649,595 B1、6,509,152 B1、6,479,653 B1及6,117,680 B1號。
在其他實施態樣中，本發明提供包含編碼二種融合蛋白之多核苷酸的基因開關系統，該二種融合蛋白在無配體存在下會自行聚集，其中(a)該第一融合蛋白包含條件性聚集結構域，該結構域與經選擇之配體及轉錄活化結構域結合，及(b)該第二融合蛋白包含條件性聚集結構域，該結構域與經選擇之配體及DNA結合結構域結合，及(c)在無配體存在下，該等細胞表現與該DNA結合結構域結合之調節性DNA所可操作性連接之基因。包含該基因開關系統之經改質之細胞在足以抑制該基因之量的配體存在下擴增。配體移除誘發造成細胞死亡之編碼蛋白之表現。編碼該二種融合蛋白之核酸係在至少一個條件性啟動子之控制下。利用條件性聚集結構域之基因表現系統係揭示於美國專利公開號2002/0048792。
C.原核性抑制子/操作子基底基因開關系統
在一實施態樣中，本發明提供基因開關系統，該系統包含(a)編碼反式活化融合蛋白之第一多核苷酸，該反式活化融合蛋白包含原核性四環素(「tet」)抑制子及真核性轉錄活化子蛋白結構域；及(b)編碼治療性蛋白質或治療性多肽之第二多核苷酸，其中該第二多核苷酸係與最小啟動子及至少一種tet操作子序列可操作性連接。該編碼反式活化子融合蛋白之第一多核苷酸可包含如本發明他處所述之治療性開關啟動子。該致死蛋白質之表現在四環素不存在時係經上調(見例如Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89：5547-5551、Gossen et al.(1993)TIBS 18：471-475、Furth et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：9302-9306及Shockett et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92：6522-6526)。TetO表現系統係揭示於美國專利第5,464,758 B1號。
在另一實施態樣中，基因開關系統包含來自細菌大腸桿菌之乳糖(「Lac」)抑制子-操作子系統。本發明之基因開關系統亦可包含(a)編碼反式活化融合蛋白之第一多核苷酸，該反式活化融合蛋白包含原核lac I抑制子及真核轉錄活化子蛋白結構域；及(b)編碼治療性蛋白質或治療性多肽之第二多核苷酸，其中該第二多核苷酸係與治療性開關啟動子可操作性連接。在Lac系統中，當無乳糖或合成性類似物諸如異丙基-b-D-硫代半乳糖苷存在時，lac操縱子被不活化。
其他基因開關系統包括該些於下列描述者：US 7,091,038、WO2004078924、EP1266015、US20010044151、US20020110861、US20020119521、US20040033600、US20040197861、US20040235097、US20060020146、US20040049437、US20040096942、US20050228016、US20050266457、US20060100416、WO2001/70816、WO2002/29075、WO2002/066612、WO2002/066613、WO2002/066614、WO2002/066615、WO2005/108617、US 6,258,603、US20050209283、US20050228016、US20060020146、EP0965644、US 7,304,162、US 7,304,161、MX234742、KR10-0563143、AU765306、AU2002-248500及AU2002-306550。
D.基因開關系統之組合
本發明提供包含二或多種基因開關系統之核酸組成物、經改質之細胞及生物反應器，該等基因開關系統包含可被有效量之一或多種配體活化之不同的配體依賴性轉錄因子複合物，其中該二或多種基因開關系統包含第一基因開關及第二基因開關，當與一或多種配體結合時，二者皆選擇性誘發一或多種治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。本發明之範圍包含任何數量及/或組合之基因開關系統。
在一實施態樣中，本發明提供核酸組成物，其包含：a.第一基因開關系統，其包含：i.第一基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第一雜交多 肽之多核苷酸，該第一雜交多肽包含：1.反式活化結構域，其活化與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.異二聚體伴結構域，ii.第二基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第二雜交多肽之多核苷酸，該第二雜交多肽包含：1. DNA結合結構域，其辨識與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.配體結合結構域；及iii.第三基因表現卡匣，該卡匣包含編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸包含：1.因子調節性啟動子，其經由第二雜交多肽之反式活化結構域活化；及2.編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，及b.第二基因表現系統，其包含：i.第一基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第一雜交多肽之多核苷酸，該第一雜交多肽包含：1.反式活化結構域，其活化與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.異二聚體伴結構域， ii.第二基因表現卡匣，該卡匣包含編碼第二雜交多肽之多核苷酸，該第二雜交多肽包含：1. DNA結合結構域，其辨識與編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸可操作性連接之因子調節性啟動子；及2.配體結合結構域；及iii.第三基因表現卡匣，該卡匣包含編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸，該多核苷酸包含：1.因子調節性啟動子，其經由第二雜交多肽之反式活化結構域活化；及2.編碼治療性多肽或治療性多核苷酸之多核苷酸。
多重誘導性基因表現系統提供給定治療性多核苷酸或治療性多肽在與不同疾病、疾患或狀況相關之條件下表現，或在與相同疾病、疾患或狀況相關之相同條件下，或在與不同疾病、疾患或狀況相關之不同條件下表現多種治療性多肽或治療性多核苷酸。
在某些實施態樣中，該二或多種基因開關系統之組合可為(1)雙重開關蛻皮激素受體基底基因表現系統，及(2)單一開關蛻皮激素受體基底基因開關。在其他實施態樣中，該組合可為(1)單一或雙重開關蛻皮激素受體基底基因開關及(2)雷帕黴素基底基因開關。另外，基因開關系統之組合可為二個相同之上述揭示之雷帕黴素基底基因開關系統。任何可能之基因開關系統之組合均在本 發明之範圍內。雙重開關蛻皮激素系統之實例可見於例如WO 2002/29075及US 2002/0110861。
配體
此處之用語「配體」當應用於LDTFC-基底基因開關，例如EcD複合物基底基因開關時，描述能活化基因開關以刺激其中編碼之多肽之表現的小型及可溶性分子。本發明之配體依賴性轉錄因子複合物之配體與包含一或多個配體結合結構域、異二聚體伴結構域、DNA結合結構域及反式活化結構域之蛋白質複合物結合。活化配體依賴性轉錄因子複合物之配體的選擇依所利用之基因開關的類型決定。
配體之實例包括但不限於蛻皮類固醇，諸如蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、松甾酮A、米樂甾酮A及該類似物、9-順-視黃酸、視黃酸之合成性類似物、N,N'-二醯基肼諸如該些於美國專利第6,013,836、5,117,057、5,530,028及5,378,726號及美國公開申請案2005/0209283及2006/0020146號中所揭示者；美國專利公開申請案2004/0171651所描述之噁二唑啉；二苯甲醯基烷基氰基肼，諸如歐洲專利申請案461,809所揭示者；N-烷基-N,N'-二芳醯基肼，諸如美國專利第5,225,443號所揭示者；N-醯基-N-烷基羰基肼，諸如歐洲專利申請案第234,994號所揭示者；N-芳醯基-N-烷基-N'-芳醯基肼，諸如美國專利第4,985,461號所描述者；醯胺基酮，諸如美國專利公開申請案2004/0049037所描述者；各以參照方式納入此處， 其他類似物質包括3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯哈帕甙、氧基固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-環氧基膽固醇、T0901317、5-α-6-α-環氧基膽固醇-3-硫酸鹽(ECHS)、7-酮膽固醇-3-硫酸鹽、法尼醇、膽汁酸、1,1-雙膦酸酯、青春激素III及該類似物。可用於本發明之二醯基肼配體之實例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)及RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)。見例如美國專利申請案系列號12/155,111(經公開為US 2009/0163592)及PCT申請案PCT/US2008/006757，二案皆以參照方式整體納入此處。
舉例來說，蛻皮激素受體基底基因開關之配體可能選自任何適當之配體。天然發生之蛻皮激素或蛻皮激素類似物(例如20-羥基蛻皮激素、米樂甾酮A、松甾酮A、松甾酮B、松甾酮C、26-碘松甾酮A、牛膝甾酮或26-甲基磺醯牛膝甾酮)及非固醇類誘導物二者均可被用來作為本發明之基因開關之配體。美國專利第6,379,945 B1號描述自綠棉夜蛾(Heliothis virescens)分離之昆蟲類固醇受體(「HEcR」)，該受體能作為對類固醇及某些非固醇類誘導物有反應之基因開關。在本系統及許多其他對類固醇及 非固醇類誘導物均有反應之系統中，非固醇類誘導物相較於類固醇具有明顯之優勢，原因包括例如：較低之製造成本、代謝穩定性、不存在於昆蟲、植物或哺乳動物及環境接受性。美國專利第6,379,945 B1號描述使用二種二苯甲醯基肼即1,2-二苯甲醯基-1-三級丁基-肼及得芬諾(tebufenozide)(N-(4-乙基苯甲醯基)-N'-(3,5-二甲基苯甲醯基)-N'-三級丁基-肼)作為蛻皮激素基底基因開關之配體。本發明之配體亦包括其他二苯甲醯基肼，諸如該些於美國專利第5,117,057 B1號所揭示者。使用得芬諾(tebufenozide)作為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)之蛻皮激素受體之化學配體亦揭示於美國專利第6,147,282號。此外，蛻皮激素配體之非限制性實例係3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯基哈帕甙、1,2-二醯基肼、N'-取代-N,N'-二取代肼、二苯甲醯基烷基氰基肼、N-取代-N-烷基-N,N-二芳醯基肼、N-取代-N-醯基-N-烷基羰基肼或N-芳醯基-N'-烷基-N'-芳醯基肼。(見美國專利第6,723,531號。)
在一實施態樣中，蛻皮激素基底基因開關系統之配體係二醯基肼配體或手性二醯基肼配體。用於基因開關系統之配體可為式I之化合物
其中
A係烷氧基、芳基烷基氧基或芳基氧基；B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在另一實施態樣中，該配體可為鏡像異構性富集之式II化合物
其中A係烷氧基、芳基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；唯該R1不等於R2； 其中攜帶R1及R2之不對稱碳原子的絕對構型主要為S型；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在某些實施態樣中，該配體可為鏡像異構性富集之式III化合物
其中A係烷氧基、芳基烷基氧基、芳基氧基、芳基烷基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；B係可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；且R1及R2各為可經任意取代之烷基、芳基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、可經任意取代之環烷基、可經任意取代之烯基、可經任意取代之炔基、可經任意取代之雜環基、可經任意取代之芳基或可經任意取代之雜芳基；唯該R1不等於R2；其中攜帶R1及R2之不對稱碳原子的絕對構型主要為R型；或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
在一實施態樣中，配體可為鏡像過量值至少95%之( R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼，或彼之醫藥上可接受之鹽、水合物、結晶形式或非晶形式。
式I之二醯基肼配體及式II或III之手性二醯基肼配體用於蛻皮激素基底基因開關系統時，提供自外部時態調控本發明之治療性多肽或治療性多核苷酸之表現的方式。見2008年5月29日提出之美國專利申請案12/155,111(經公開為US 2009/0163592)，其以參照方式完全納入此處。
本發明使用之配體可形成鹽。此處所使用之用語「鹽」表示與無機及/或有機酸及鹼形成之酸性及/或鹼性鹽。此外，當式I、II或III之化合物同時包含鹼性基團及酸性基團時可能形成兩性離子(「內鹽」)，其仍被包含於此處所使用之用語「鹽」。醫藥上可接受(即無毒性、生理上可接受)之鹽被用於例如在製備時會採用之分離或純化步驟，不過其他鹽亦可被使用。式I、II或III之化合物的鹽可藉由例如使化合物與一定量諸如等量之酸或鹼反應形成，該反應在鹽可在其中沉澱之介質或於水性介質中進行，然後冷凍乾燥。
包含鹼性基團之配體可與各種有機及無機酸形成鹽。示範性酸添加鹽包括醋酸鹽(諸如該些與醋酸或三鹵乙酸例如三氟乙酸形成者)、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊丙酸 鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽(與鹽酸形成)、氫溴酸鹽(與溴化氫形成)、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽(與順丁烯二酸形成)、甲烷磺酸鹽(與甲磺酸形成)、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、果凍酸鹽、過氧硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽(諸如該些與硫酸形成者)、磺酸鹽(諸如該些此處提及者)、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽諸如甲苯磺酸鹽(tosylate)、十一酸鹽及該類似物。
包含酸性基團之配體可與各種有機及無機鹼形成鹽。示範性鹼性鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽諸如鈉鹽、鋰鹽及鉀鹽、鹼土金屬鹽諸如鈣鹽及鎂鹽、含有機鹼(例如有機胺)之鹽諸如苄星(benzathine)、二環己基胺、海巴明(與N,N-雙(去氫樅酸基)乙二胺形成)、N-申基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-葡糖醯胺、三級丁基胺及含胺基酸諸如精胺酸、離胺酸及該類似物之鹽。
利用FK506結合結構域之誘導性基因表現系統的配體之非限制性實例為FK506、環孢素A或雷帕黴素。FK506、雷帕黴素及彼等之類似物係揭示於美國專利第6,649,595 B2及6,187,757號。亦見美國專利第7,276,498及7,273,874號。
此處所描述之配體可經單獨投予或成為包含醫藥上可 接受之載劑的醫藥組成物之一部分投予。在一實施態樣中，該醫藥組成物係呈溶液、懸浮液、錠劑、膠囊、軟膏、酏劑或注射型組成物之形式。
在一實施態樣中，編碼抗體之多核苷酸編碼單株抗體。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於表現核酸以作為疫苗。本發明亦提供包含本發明之載體或表現系統之疫苗組成物。在另一實施態樣中，該疫苗組成物包含佐劑。
「紅血球生成素或彼之促效劑」係指紅血球生成素多肽、與紅血球生成素具有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多肽、或保留至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之紅血球生成素之試管內紅血球生成素受體結合活性的紅血球生成素之片段。
任何紅血球生成素多核苷酸序列可被用於本發明之方法。在一實施態樣中，該紅血球生成素多核苷酸序列編碼人紅血球生成素，彼之胺基酸序列係如編號AAF23134(SEQ ID NO：6)所示。編碼紅血球生成素之胺基酸序列亦可得自公眾資料庫，如編號AAH93628(人)、AA119266(小鼠)、及BAA01593(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處。編碼紅血球生成素之多核苷酸序列可得自公眾資料庫，如編號BC093628(人)、BC119265(小鼠)、及D10763(大鼠)，彼等之序列以參照方式納入此處 。
在另一實施態樣中，該紅血球生成素多核苷酸序列編碼人紅血球生成素之類似物，該人紅血球生成素之類似物保留至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之人紅血球生成素之試管內紅血球生成素受體結合活性。試管內紅血球生成素受體結合試驗係該領域之一般技藝人士所廣為周知。舉例來說，見Harris,K.W.et al.,J.Biol.Chem.25：15205-9(1992)、Wrighton,N.C.et al.,Science 273：458-463(1996)、及Jarsch,M.et al.,Pharmacology 81：63-69(2008)。
紅血球生成素之非限制性實例包括阿法達貝泊汀(darbepoietin alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、貝他依泊汀(epoetin beta)及卡帕依泊汀(epoetin kappa)。
紅血球生成素促效劑之非限制性實例包括該些於美國專利第7,767,643、7,786,163、7,674,913、7,553,861、7,410,941、7,345,019、7,309,687、6,531,121、5,858,670、5,650,489及5,510,240號中揭示之促效劑。其他紅血球生成素促效劑之非限制性實例包括該些於美國專利公開號2011/0027890、2010/0305002、2010/297117、2010/0297106、2010/0190692、2010/0145006、2010/136015、2010/0120661、2010/093608、2010/0028331、2010/016218、2010/0009961、2009/0233844、2009/0022734、2009/0004202、2008/0213277、2008/0014193、2007/0298031、2007/0293421、2007/0060547 、2006/027071、2006/0009518、2003/0134798、2003/0104988及2002/008616中揭示之促效劑。其他紅血球生成素促效劑之非限制性實例包括該些於MacDougal,I.C.et al.,N.Engl.J.Med.361：1848-55(2009)、Pankratova,S.et al.,Brain 133(Pt.8)：2281-94(2010)、及Zarychanski,R.et al.,Canadian Medical Association Journal 177：725-34(2007)中揭示之促效劑。
就基因開關而言，用語「蛻皮激素受體基底」係指包含至少一功能性部分之天然發生或合成性蛻皮激素受體配體結合結構域之基因開關，當配體與蛻皮激素受體配體結合結構域結合時該基因開關調節基因表現。蛻皮激素反應性系統之實例係描述於美國專利第7,091,038及6,258,603號。在一實施態樣中，該系統為RheoSwitch®治療性系統(RTS)，該系統包含二種融合蛋白，即與Gal4 DNA結合結構域融合之經突變之蛻皮激素受體(EcR)之DEF結構域和與VP16轉錄活化結構域融合之嵌合性RXR之EF結構域，如圖1所示在組成性啟動子之控制下表現。
用語「調控」係指誘發、減少或抑制核酸或基因表現，分別導致誘發、減少或抑制蛋白質或多肽之產製。
本發明之多核苷酸或載體可另包含至少一種適合用於驅使基因於宿主細胞內表現之啟動子。
可用於本發明之實施態樣中之增強子包括但不限於：SV40增強子、巨細胞病毒(CMV)增強子、延長因子1(EF1)增強子、酵母菌增強子、病毒基因增強子及該類似 物。
終止控制區(即終止子或聚腺苷酸化序列)亦可衍生自各種對優先宿主為天然之基因。可任意選擇地，終止位點不是必要但是最好包含。在本發明之一實施態樣中，該終止控制區可包含或衍生自合成性序列、合成性聚腺苷酸化信號、SV40晚期聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、病毒終止序列或該類似物。
用語「3'非編碼序列」或「3'非轉譯區(UTR)」係指位於編碼序列下游(3')之DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]辨認序列及其他編碼調節信號以影響mRNA處理或基因表現之序列。聚腺苷酸化信號之特徵通常為影響聚腺苷酸序列添加至mRNA前體之3'端。
「調節區」係指調節第二核酸序列表現之核酸序列。調節區可包括本來就負責表現特定核酸(同源區)之序列，或包括不同來源但負責表現不同蛋白質或甚至合成性蛋白質(異源區)之序列。特別是，該等序列可為原核性、真核性或病毒性基因之序列或衍生序列，其以特定或非特定方式及誘導性或非誘導性方式刺激或抑制基因之轉錄。調節區包括複製起點、RNA剪切位點、啟動子、增強子、轉錄終止序列及引導該多肽進入標靶細胞之分泌途徑之信號序列。
「異源性來源」之調節區係指不是與經表現之核酸天然相連之調節區。異源性調節區包含來自不同物種之調節區 、來自不同基因之調節區、雜交調節序列及不發生於天然中但由該領域之一般技藝人士所設計之調節序列。
「RNA轉錄物」係指由RNA聚合酶酶催化轉錄DNA序列所產生之產物。當RNA轉錄物係DNA序列之完美互補套時，較佳者為初級轉錄物或其可能為源自轉錄後處理該初級轉錄物之RNA序列，被稱為成熟RNA。「信使RNA(mRNA)」係指沒有內含子且可被細胞轉譯成蛋白質之RNA。「cDNA」係指與mRNA互補且源自該mRNA之雙股DNA。「同義RNA」係指包括mRNA因此可被細胞轉譯成蛋白質之RNA轉錄物。「反義RNA」係指與所有或部分之標靶原發轉錄物或mRNA互補且阻斷標靶基因之表現之RNA轉錄物。反義RNA可能與特定基因轉錄物之任何部分互補，例如5'非編碼序列、3'非編碼序列或編碼序列。「功能性RNA」係指反義RNA、核糖酵素RNA或其他不被轉譯但對細胞程序有所影響之RNA。
「多肽」、「肽」及「蛋白質」可交換使用，係指由共價連接之胺基酸殘基組成之聚合性化合物。
「經分離之多肽」、「經分離之肽」或「經分離之蛋白質」係指實質上不含該些在彼之天然狀態下與之正常相關之化合物(例如其他蛋白質或多肽、核酸、碳水化合物、脂質)之多肽或蛋白質。「經分離」不代表排除與其他化合物之人工或合成性混合物，或不影響生物活性之雜質存在，這可能是因為例如純化不完全、添加穩定劑或化合成為醫藥上可接受之製劑。
「取代突變多肽」或「取代突變」將被了解為表示包含至少一個野生型或天然發生之胺基酸取代的突變多肽，該胺基酸與野生型或天然發生之多肽的胺基酸不同。取代突變多肽可僅包含一個野生型或天然發生之胺基酸取代，被稱為「點突變」或「單點突變」多肽。或者，取代突變多肽可包含以二或多個與野生型或天然發生多肽不同之胺基酸取代二或多個野生型或天然發生之胺基酸。根據本發明，包含取代突變之H組核受體配體結合結構域多肽包含以相較於野生型或天然發生之H組核受體配體結合結構域多肽不同之胺基酸取代至少一個野生型或天然發生之胺基酸。取代突變之H組核受體配體結合結構域多肽之非限制性實例可見於WO 2002/066612及US 2006/0100416。
當取代突變多肽包含二或多個野生型或天然發生之胺基酸的取代，該取代可包含相等數量之野生型或天然發生之胺基酸刪除以供取代，即2個野生型或天然發生之胺基酸被2個非野生型或非天然發生之胺基酸取代，或該取代可包含不等數量之野生型胺基酸刪除以供取代，即2個野生型胺基酸被1個非野生型胺基酸取代(取代+刪除突變)或2個野生型胺基酸被3個非野生型胺基酸取代(取代+插入突變)。
取代突變可利用縮寫命名系統描述，以表示在參照多肽序列中被取代之胺基酸殘基及號碼及經取代之新的胺基酸殘基。舉例來說，多肽之第20個胺基酸殘基被取代之取代突變可被縮寫為「x20z」，其中「x」係將被取代之胺基 酸，「20」係該胺基酸殘基在該多肽中之位置或號碼，及「z」係經取代之新的胺基酸。因此，可互換縮寫為「E20A」或「Glu20Ala」之取代突變表示該突變包含以丙胺酸殘基(通常縮寫為「A」或「Ala」)取代在多肽位置20之麩胺酸(通常縮寫為「E」或「Glu」)。
取代突變可利用該領域已知之任何突變形成技術進行，包括但不限於試管內定點突變形成(Hutchinson et al.,J.Biol.Chem.253：6551(1978)；Zoller et al.,DNA 3：479(1984)；Oliphant et al.,Gene 44：177(1986)；Hutchinson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：710(1986))、使用TAB®連接子(法瑪西亞(Pharmacia)公司)、限制內核酸酶消化/片段刪除及取代、PCR媒介性/寡核苷酸引導性突變形成及該類似技術。以PCR為基底之技術較適合定點突變形成(見Higuchi,1989,"Using PCR to Engineer DNA",in PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.Erlich,ed.,Stockton press，第6章61至70頁)。
應用於多肽之用語「片段」係指胺基酸序列相較於參照多肽之胺基酸序列為短之多肽，且該多肽相較於這些參照多肽之所有部分包含完全相同之胺基酸序列。當適當時，該等片段可能被包括於更大多肽之內以形成更大多肽之一部分。本發明之多肽之該等片段的長度可能為至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或 300或更多個胺基酸。
多肽或蛋白質之「變異體」係指源自多肽或蛋白質且保留該多肽或蛋白質之至少一個生物性質之任何類似物、片段、衍生物或突變。不同的多肽或蛋白質變異體可能存在於天然中。這些變異體可能是特徵為編碼蛋白質之結構基因的核苷酸序列不同之等位變異體，或可能涉及差異剪切或轉譯後修飾。技藝人士可產製具有單一或多重胺基酸取代、刪除、添加或替換之變異體。這些變異體可包括特別是：(a)其中一或多個胺基酸殘基被保守性或非保守性胺基酸取代之變異體，(b)其中一或多個胺基酸被加入該多肽或蛋白質之變異體，(c)其中一或多個胺基酸包括取代基之變異體，及(d)其中該多肽或蛋白質與另一多肽諸如血清白蛋白融合之變異體。獲得這些變異體之技術包括基因性(抑制、刪除、突變等)、化學性及酶技術係該領域之一般技藝人士所知。在一實施態樣中，變異體多肽包含至少約14個胺基酸。
用語「同源性」係指二個多核苷酸或二個多肽基團之間一致性之百分比。來自一基團之序列與另一序列之間的對應性可由該領域已知之技術測定。舉例來說，同源性可藉由直接比較二個多肽分子間之序列資訊加以決定，例如排比該序列資訊並利用易於使用之電腦程式進行。或者，可藉由在同源區之間形成穩定雙股之條件下使多核苷酸雜交，然後經單股特異性核酸酶消化後測定該經消化之片段的大小加以決定同源性。
此處所使用之所有文法形式及拼寫差異之用語「同源」係指具有「共同演化來源」之蛋白質之間的關係，包括來自超家族(例如免疫球蛋白超家族)之蛋白質及來自不同物種之同源蛋白(例如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck et al.,Cell 50：667(1987))。該等蛋白質(及彼等之編碼基因)具有序列同源性，因為彼等具有高度序列相似性。然而，在一般用法及本申請案中，當以諸如「高度地」之副詞修飾用語「同源」時，用語「同源」可指序列相似性而非共同演化來源。
因此，所有文法形式之用語「序列相似性」係指可能分享或不分享共同演化來源之蛋白質的核酸或胺基酸序列之間的一致性或對應性程度(見Reeck et al.,Cell 50：667(1987))。在一實施態樣中，當二個DNA序列之定義長度中至少約50%(例如至少約75%、90%或95%)的核苷酸匹配，該等DNA序列係「實質上同源」或「實質上類似」。實質上同源之序列可利用序列資料庫中可用之標準軟體比較序列加以識別，或在例如特定系統所定義之嚴謹度條件下進行南方雜交實驗加以識別。定義適當之雜交條件係屬該領域之技藝(見例如Sambrook et al.,1989，同上)。
此處所使用之「實質上類似」係指其中一或多個核苷酸鹼基之改變導致取代一或多個胺基酸，但不影響由該DNA序列所編碼之蛋白質的功能特性之核酸片段。「實質上類似」亦指其中一或多個核苷酸鹼基之改變不影響該核酸片 段藉由反義或共同抑制技術以媒介基因表現改變之能力的核酸片段。「實質上類似」亦指本發明之核酸片段之修飾，諸如刪除或插入一或多個不實質影響該形成之轉錄物之功能特性的核苷酸鹼基。因此應了解本發明不只包含該特定示範性序列。每種提議之修飾及測定該編碼產物是否保留生物活性皆在該領域之例行技藝範圍內。
當二個胺基酸序列有超過約40%之胺基酸相同，或超過60%之胺基酸類似(功能一致)，該二個胺基酸序列係「實質上同源」或「實質上類似」。較佳地，該類似或同源之序列係藉由使用例如GCG(基因學電腦集團(Genetics Computer Group)公司，GCG套組程式手冊第7版，威斯康辛州麥德遜市)排列(pileup)程式加以排比鑑識。
此處所使用之用語「對應」係指類似或同源性序列，不論確切位置是否與測量類似性或同源性之分子相同或不同。核酸或胺基酸序列排比可能包括間隔子。因此，用語「對應」係指序列類似性，而非胺基酸殘基或核苷酸鹼基之編號。
「顯著部分」之胺基酸或核苷酸序列包含足夠之多肽之胺基酸序列或基因之核苷酸序列，得以由該領域之技藝人士手動評估該序列，或藉由使用演算法諸如BLAST(基礎局部排比搜尋工具；Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1993)，得自ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行電腦自動化序列比較及識別以推定辨識該多肽或基因。一般來說，需要10個或超過10個連續胺基酸或30個或超過30個核 苷酸之序列以推定辨識一多肽或核酸序列與已知蛋白質或基因之同源性。另外就核苷酸序列而言，包含20至30個連續核苷酸之基因特異性寡核苷酸探針可被用於基因辨識(例如南方雜交)及分離(例如細菌菌落或噬菌體噬斑之原位雜交)之序列依賴性方法。此外，含12至15個鹼基之短寡核苷酸可被用來作為PCR中之擴增引子，以獲得包含該引子之特定核酸片段。因此，「顯著部分」之核苷酸序列包含足夠序列以特異性辨識及/或分離包含該序列之核酸片段。
該領域已知之用語「一致性百分比」係指二或多個多肽序列或二或多個多核苷酸序列之間之關係，其係藉由比較序列決定。在該領域中，「一致性」亦指多肽或多核苷酸序列之間序列相關性之程度，視情況亦可由該等序列之間的匹配狀況決定。「一致性」及「相似性」可輕易地由已知之方法計算，包括但不限於下列描述者：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Ana1ysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,New York(1991)。測定一致性 之較佳方法係經設計以給予測試序列間之最佳匹配。測定一致性及相似性之方法被編篡於公眾可用之電腦程式中。序列排比及一致性百分比計算可利用序列分析軟體進行，諸如雷斯基(Lasergene)生物資訊電腦套組之邁佳來(Megalign)程式(DNASTAR公司，威斯康辛州麥迪遜市)。序列之多重排比可利用Clustal排比方法及預設參數(缺口罰分=10，缺口長度罰分=10)進行(Higgins et al.,CABIOS.5：151(1989))。使用Clustal方法進行兩兩排比之預設參數可選自：KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5及DIAGONALS SAVED=5。
用語「序列分析軟體」係指任何可用於分析核苷酸或胺基酸序列之電腦演算法或軟體程式。「序列分析軟體」可自商業途徑獲得或自行發展。典型的序列分析軟體包括但不限於GCG程式套組(威斯康辛套組9.0版，基因學電腦集團(Genetics Computer Group)公司(GCG)，威斯康辛州麥迪遜市)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403(1990))及DNASTAR(DNASTAR公司，美國53715威斯康辛州麥迪遜市公園南街1228號)。在本案之上下文中，應了解當使用序列分析軟體進行分析時，該分析之結果將基於該參照程式之「預設數值」，除非另外說明。此處所使用之「預設數值」將代表在首次啟用該軟體時原本內建之任何數值或參數組。
就DNA之序列而言，「化學合成」指該等成份核苷酸係於試管內組成。DNA之手動化學合成可利用發展成熟之 方法完成，或利用多種商用機器之一進行自動化化學合成。因此，基因可根據最佳化之核苷酸序列修剪以達最佳基因表現，以反應宿主細胞之密碼子偏性。技藝人士了解若密碼子之使用偏向宿主喜好之密碼子，將可能成功地表現基因。較佳密碼子之決定可根據可取得序列資訊之宿主細胞來源之基因調查。
此處所使用之二或多種各自可操作之基因調節系統被稱為「正交」，當a)各給定系統由彼之選擇濃度之個別配體之調控導致該系統之基因表現幅度可測量的改變，及b)該改變係統計上顯著地異於所有其他於細胞、組織或有機體中同時可操作性系統之表現的改變，不論該實際調控為同時或依序發生。較佳地，每種各自可操作性基因調節系統之調控導致基因表現之改變相較於細胞、組織或有機體中之所有其他可操作性系統高出至少2倍，例如至少高出5倍、10倍、100倍或500倍。理想地，藉由彼之選擇濃度之個別配體調控各給定系統導致該系統之基因表現幅度可測量的改變，且該細胞、組織或有機體中之所有其他可操作性系統之表現無可測量的改變。在這種情況下，該多重誘導性基因調節系統被稱為「完全正交」。有用之正交配體及正交受體基底基因表現系統係描述於US 2002/0110861 A1。
用語「外源性基因」係指對個體為外來之基因，即經由轉形過程被導入個體體內之基因、非突變版本之內源性突變基因或突變版本之內源性非突變基因。轉形方法並不是 本發明之關鍵，可為該領域人士已知之適合該個體之任何方法。外源性基因可為以DNA或RNA形式導入個體體內之天然或合成性基因，該RNA形式可經由諸如藉由反轉錄酶產生之DNA中間物作用。該等基因可被導入標靶細胞內、直接導入個體體內或藉由轉移經轉形之細胞至個體體內以間接導入。
用語「治療性產物」係指治療性多肽或治療性多核苷酸，該等產物授予有益功能至表現該等產物之宿主細胞。治療性多肽可包含但不限於長度僅三個胺基酸之肽、單鏈或多鏈蛋白質及融合蛋白質。治療性多核苷酸可包括但不限於反義寡核苷酸、小型干擾RNA、核糖酵素及RNA外部引導序列。該治療性產物可包含天然發生之序列、合成性序列或天然及合成性序列之組合。
用語「配體依賴性轉錄因子複合物」或「LDTFC」係指包含一或多個蛋白質次單位之轉錄因子，該複合物可調節由此處所定義之「因子調節性啟動子」驅使之基因表現。LDTFC模型「蛻皮激素受體複合物」通常係指具有至少二個核受體家族成員之異二聚體蛋白質複合物，即蛻皮激素受體(「EcR」)及超氣門蛋白(「USP」)(見Yao et al.,Nature 366：476(1993))；Yao et al.,Cell 71：63(1992))。功能性LDTFC諸如EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38、β FTZ-1或其他昆蟲同源物)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR及/或USP之配體依賴性伴或非配體依賴 性伴。LDTFC諸如EcR複合物亦可為EcR蛋白與超氣門蛋白之脊椎動物同源物、視黃酸-X-受體(「RXR」)蛋白或USP及RXR之嵌合物之異二聚體。用語「LDTFC」及「EcR複合物」亦包含EcR蛋白或USP之同型二聚體複合物，以及具有相同功能之單一多肽或三聚體、四聚體及其他多聚體，
LDTFC諸如EcR複合物可被活性蛻皮類固醇或與該複合物中之一種蛋白質結合的非固醇類配體活化，該種蛋白質包含EcR但不排除該複合物之其他蛋白質。LDTFC諸如EcR複合物包括屬於核受體超家族之成員的蛋白質，其中所有成員之特徵為存在一或多種多肽次單位，包含胺基端反式活化結構域(在此處可交換使用之「AD」、「TD」或「TA」)、DNA結合結構域(「DBD」)及配體結合結構域(「LBD」)。該AD可為與「異二聚體伴」或「HP」融合之形式存在。包含本發明之AD及HP之融合蛋白在此處被稱為「輔活化蛋白」或「CAP」 。DBD及LBD可以融合蛋白之形式表現，在此處被稱為「配體誘導性轉錄因子(「LTF」)。該等融合伴可被連接子例如鉸鏈區分開。LTF家族之有些成員亦在LBD之羧基端側具有另一反式活化結構域。該DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予蛻皮激素反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經改質之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。
組成外源性基因、反應元件及LDTFC例如EcR複合 物之DNA序列可能被納入古細菌(archaebacteria)、原核細胞諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或其他腸內細菌，或真核細胞諸如植物或動物細胞。然而，由於許多由基因表現之蛋白質在細菌中被不正確地處理，因此真核細胞係為較佳。該等細胞可能呈單細胞或多細胞有機體之形式。外源性基因、反應元件及受體複合物之核苷酸序列亦可以RNA分子被納入，較佳地呈功能性病毒性RNA之形式，諸如菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)。以真核細胞來說，脊椎動物細胞係較佳，因為它們天然地缺乏授予反應至本發明之EcR的配體之分子。因此，它們對本發明之配體為「實質上不敏感」。因此，可用於本發明之配體對經轉形之細胞或整個有機體之生理或其他效應將可被忽略。因此，細胞可生長且表現該所欲之產物，實質上不受配體本身之存在的影響。
用語「蛻皮激素受體複合物」通常係指具有至少二個核受體家族成員之異二聚體蛋白質複合物，即蛻皮激素受體(「EcR」)及超氣門蛋白(「USP」)(見Yao et al.,Nature 366：476(1993))；Yao et al.,Cell 71：63(1992))。功能性EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38、β FTZ-1或其他昆蟲同源物)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR及/或USP之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。該EcR複合物亦可為EcR蛋白與超氣門蛋白之脊椎動物同源 物、視黃酸-X-受體(「RXR」)蛋白或USP及RXR之嵌合物之異二聚體。用語EcR複合物亦包含EcR蛋白或USP之同型二聚體複合物。
EcR複合物可被活性蛻皮類固醇或與該複合物中之一種蛋白質結合的非固醇類配體活化，該種蛋白質包含EcR但不排除該複合物之其他蛋白質。此處之用語「配體」當應用於EcR-基底基因開關時，描述能活化基因開關以刺激其中編碼之多肽之表現的小型及可溶性分子。配體之實例包括但不限於蛻皮類固醇，諸如蛻皮激素、20-羥基蛻皮激素、松甾酮A、米樂甾酮A及該類似物、9-順-視黃酸、視黃酸之合成性類似物、N,N'-二醯基肼諸如該些於美國專利第6,013,836、5,117,057、5,530,028及5,378,726號及美國公開申請案2005/0209283及2006/0020146號中所揭示者；美國專利公開申請案2004/0171651所描述之噁二唑啉；二苯甲醯基烷基氰基肼，諸如歐洲專利申請案461,809所揭示者；N-烷基-N,N'-二芳醯基肼，諸如美國專利第5,225,443號所揭示者；N-醯基-N-烷基羰基肼，諸如歐洲專利申請案第234,994號所揭示者；N-芳醯基-N-烷基-N'-芳醯基肼，諸如美國專利第4,985,461號所描述者；醯胺基酮，諸如美國專利公開申請案2004/0049037所描述者；及其他類似物質包括3,5-二-三級丁基-4-羥基-N-異丁基-苯甲醯胺、8-O-乙醯哈帕甙、氧基固醇、22(R)羥基膽固醇、24(S)羥基膽固醇、25-環氧基膽固醇、T0901317、5-α-6-α-環氧基膽固醇-3-硫酸鹽(ECHS)、 7-酮膽固醇-3-硫酸鹽、法尼醇、膽汁酸、1,1-雙膦酸酯、青春激素III及該類似物。可用於本發明之二醯基肼配體之實例包括RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)、RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)及RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-三級丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲醯基)-醯肼)。其他可用於實施本發明之二醯基肼見美國專利申請案12/155,111(2008年5月29日提出)及PCT/US2008/006757(2008年5月29日提出)。
EcR複合物包括屬於核受體超家族之成員的蛋白質，其中所有成員之特徵為具備胺基端反式活化結構域(「TA」)、DNA結合結構域(DBD)及被鉸鏈區分開之配體結合結構域(LBD)。有些家族成員亦在LBD之羧基端側具有另一反式活化結構域。該DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予蛻皮激素反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經改質之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。
組成外源性基因、反應元件及EcR複合物之DNA序列可能被納入古細菌(archaebacteria)、原核細胞諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或其他腸內細菌，或真核細胞諸如植物或動物細胞。然 而，由於許多由基因表現之蛋白質在細菌中被不正確地處理，因此真核細胞係為較佳。該等細胞可能呈單細胞或多細胞有機體之形式。外源性基因、反應元件及受體複合物之核苷酸序列亦可以RNA分子被納入，較佳地呈功能性病毒性RNA之形式，諸如菸草嵌紋病毒(tobacco mosaic virus)。以真核細胞來說，脊椎動物細胞係較佳，因為它們天然地缺乏授予反應至本發明之EcR的配體之分子。因此，它們對本發明之配體為「實質上不敏感」。因此，可用於本發明之配體對經轉形之細胞或整個有機體之生理或其他效應將可被忽略。因此，細胞可生長且表現該所欲之產物，實質上不受配體本身之存在的影響。
當EcR配體與EcR複合物一起使用且轉而與連接外源性基因之反應元件結合時，該EcR配體提供外部時態調節該外源性基因之表現。各種成份彼此之間的結合順序，即配體與受體複合物及受體複合物與反應元件之結合順序並不重要。通常，外源性基因之表現調控係因應EcR複合物與特定控制或調節性DNA元件之結合。該EcR蛋白質如同核受體家族之其他成員具有至少三個結構域，即反式活化結構域、DNA結合結構域及配體結合結構域。此受體如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。在EcR蛋白質之配體結合結構域與USP或RXR蛋白質異二聚化之後，配體與該配體結合結構域之結合，使該呈活化形式之異二聚化蛋白質之DNA結合結構域得以與反應元件結合，因此導致外源性基因之表現 或抑制。此機轉不排除配體與EcR或USP結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如EcR+EcR或USP+USP)之可能性。在一實施態樣中，該一或多種受體結構域可為不同以產生嵌合性基因開關。通常，該三種結構域中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該嵌合性受體在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))以適應嵌合性EcR複合物。嵌合性系統之另一好處在於它們能夠根據所欲之終結果選擇用於驅使外源性基因之啟動子。該等雙重控制在基因治療之領域中特別重要，尤其是當細胞毒性蛋白質被產生時，因為表現時機及表現發生之細胞皆可被控制。當與適當之啟動子可操作性連接之外源性基因被導入個體之細胞內時，該等外源性基因之表現係受到本發明之配體的存在所控制。啟動子可能經組成性或誘導性調節，或可能具組織特異性(即僅在特定細胞類型中表現)或對有機體之某些發展階段具特異性。
在某些實施態樣中，本方法所描述之治療性開關啟動子係組成性。在某些實施態樣中，該治療性開關啟動子係在與疾病、疾患或狀況相關之條件下被活化，例如該啟動子會被疾病、被特定生理性、發展性、分化性或病理性條 件、及/或被一或多種特定生物性分子所活化；及/或該啟動子在特定組織或細胞類型中被活化。在某些實施態樣中，該疾病、疾患或狀況對治療性多肽或多核苷酸有反應。舉例來說在某些非限制性實施態樣中，該治療性多核苷酸或多肽可用於治療、預防、改善、減少症狀、預防疾病進展或治癒該疾病、疾患或狀況，但不一定需要完成任何或所有之上述功效。在某些實施態樣中，該第一及第二多核苷酸被導入以允許該配體依賴性轉錄因子複合物在與疾病、疾患或狀況有關之條件下之表現。在一實施態樣中，該治療性方法被進行以使該治療性多肽或治療性多核苷酸以足以治療、改善或預防該疾病、疾患或狀況之量被表現及散播於個體體內。此處所使用之「散播」表示該多肽係自經改質之細胞足夠地表現及釋放以在個體體內具有效應或活性。散播可為系統性、局部性或介於系統性或局部性之任何散播。舉例來說，該治療性多肽或治療性多核苷酸可經血流或淋巴系統系統性散播。或者，該治療性多肽或治療性多核苷酸可在欲治療之組織或器官中局部性散播。
編碼各種多肽諸如轉錄因子及報告蛋白之許多基因組及cDNA核酸序列係該領域所廣為周知。該領域之技藝人士可取得幾乎所有已知基因之核酸序列資訊，且可直接自公眾存庫、發表該序列之機構獲得該核酸分子，或可實施例行方法以製備該分子。見例如以下所述之序列登記號之說明。
基因開關可能為藉由添加或移除特定配體以調節基因 表現之任何基因開關系統。在一實施態樣中，該基因開關係一種其中基因表現之量取決於配體之存在量的基因開關。可用於本發明之基因開關之配體依賴性轉錄因子之實例包括但不限於由彼等之個別配體(例如糖皮質素、雌激素、黃體激素、類視色素、蛻皮激素及彼等之類似物或擬似物)所活化之核受體超家族之成員及由四環素活化之rTTA。在本發明之一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。該等系統之實例包括但不限於美國專利第6,258,603號、美國專利第7,045,315號、美國公開專利申請案第2006/0014711、2007/0161086號及國際公開申請案第WO 01/70816號中所述之系統。嵌合性蛻皮激素受體系統之實例係描述於美國專利第7,091,038號、美國公開專利申請案第2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457及2006/0100416號及國際公開申請案第WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075及WO 2005/108617號。非固醇性蛻皮激素促效劑調節系統之實例係RheoSwitch®哺乳動物誘導性表現系統(麻州伊普斯維奇(Ipswich,MA)新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)公司)。
在一實施態樣中，編碼該基因開關之多核苷酸包含在啟動子之控制下編碼配體依賴性轉錄因子之單一轉錄因子序列。該轉錄因子序列可能編碼天然發生或人工轉錄因子之配體依賴性轉錄因子。人工轉錄因子係其中該轉錄因子 之天然序列已被改變之轉錄因子，例如藉由序列突變或藉由組合來自不同轉錄因子之結構域。在一實施態樣中，該轉錄因子包含H組核受體配體結合結構域(LBD)。在一實施態樣中，H組核受體LBD係來自EcR、遍在受體、孤兒受體1、NER-1、類固醇激素核受體1、類視色素X受體交互作用蛋白-15、肝X受體β、類固醇激素受體樣蛋白、肝X受體、肝X受體α、類法尼醇X受體、受體交互作用蛋白14或法尼醇受體。在另一實施態樣中，H組核受體LBD係源自蛻皮激素受體。
在一實施態樣中，編碼該基因開關之多核苷酸包含在啟動子之控制下編碼配體依賴性轉錄因子之單一轉錄因子序列。該轉錄因子序列可能編碼天然發生或人工轉錄因子之配體依賴性轉錄因子。人工轉錄因子係其中該轉錄因子之天然序列已被改變之轉錄因子，例如藉由序列突變或藉由組合來自不同轉錄因子之結構域。在一實施態樣中，該轉錄因子包含H組核受體配體結合結構域(LBD)。在一實施態樣中，H組核受體LBC係來自EcR、遍在受體、孤兒受體1、NER-1、類固醇激素核受體1、類視色素X受體交互作用蛋白-15、肝X受體β、類固醇激素受體樣蛋白、肝X受體、肝X受體α、類法尼醇X受體、受體交互作用蛋白14或法尼醇受體。在另一實施態樣中，H組核受體LBD係源自蛻皮激素受體。
EcR及其他H組核受體係核受體超家族之成員，其中所有成員之一般特徵為具備胺基端反式活化結構域(TD) 、DNA結合結構域(DBD)及與DBD藉由鉸鏈區分開之LBD。此處所使用之用語「DNA結合結構域」包含自最小多肽序列之DNA結合蛋白至全長DNA結合蛋白，只要該DNA結合結構域之功能為與特定反應元件相連。核受體超家族成員之特徵亦包括具備四或五個結構域：A/B、C、D、E，有些成員具備F結構域(見美國專利第4,981,784號及Evans,Science240：889(1988))。該「A/B」結構域對應反式活化結構域，「C」對應DNA結合結構域，「D」對應鉸鏈區，及「E」對應配體結合結構域。有些家族成員亦在對應「F」之LBD的羧基端側具有另一反式活化結構域。
DBD之特徵為具備二個半胱胺酸鋅手指，在其間為二個胺基酸模體P盒及D盒，該二模體授予反應元件特異性。這些結構域可為天然結構域、經改質之結構域或異源性受體蛋白質之不同結構域之嵌合體。EcR如同核受體家族之亞群，亦具備定義較不明確之造成異二聚化性質之區域。由於核受體之結構域在天然中係經模塊化，因此LBD、DBD及TD可能可互相交換。
在另一實施態樣中，該轉錄因子包含TD、DBD及H組核受體LBD，該DBD辨識與外源性基因相連之反應元件以調控該外源性基因之表現。在某些實施態樣中，該H組核受體LBD包含取代突變。
在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及 該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物，即「雙重開關」或「雙雜交物」基底基因開關。該第一及第二啟動子可為相同或不同。
在某些實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物，即「單一基因開關」。該第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列可由內部核糖體進入位點(IRES)連接。該IRES可能是EMCV IRES。
在一實施態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含TD、DBD及H組核受體LBD之多肽，該DBD辨識與外源性基因相連之反應元件以調節該外源性基因之表現，該第二轉錄因子序列編碼包含核受體LBD之轉錄因子，該LBD選自脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD、超氣門蛋白LBD或包含二個多肽片段之嵌合性LBD，其中該第一多肽片段係來自脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD或超氣門蛋白LBD，且該第二多肽片段係來自不同的脊椎動物RXR LBD、無脊椎動物RXR LBD或超氣門蛋白LBD。
在另一實施態樣中，基因開關包含編碼第一多肽之第一轉錄因子序列及編碼第二多肽之第二轉錄因子序列，該第一多肽包含核受體LBD及DBD，該DBD辨識與外源性 基因相連之反應元件以調節該外源性基因之表現，該第二多肽包含TD及核受體LBD，其中核受體LBD之一係H組核受體LBD。在一實施態樣中，該第一多肽係實質上不含TD，該第二多肽係實質上不含DBD。就本發明之目的而言，「實質上不含」係指有問題之蛋白質不包含有問題之結構域的足夠序列來提供活化或結合活性。
在本發明之另一態樣中，該第一轉錄因子序列編碼包含異二聚體伴及TD之蛋白質，該第二轉錄因子序列編碼包含DBD及LBD之蛋白質。
當只有一個核受體LBD係H組LBD時，另一核受體LBD可能來自任何其他核受體以與H組LBD形成二聚體。舉例來說，當H組核受體LBD係EcR LBD時，其他核受體LBD「伴」可能來自EcR、脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR、超氣門蛋白(USP)或包含至少二種不同之選自脊椎動物RXR、無脊椎動物RXR或USP之核受體LBD多肽片段之嵌合性核受體(見WO 01/70816 A2、國際專利申請案PCT/US02/05235及US 2004/0096942 A1)。「伴」核受體配體結合結構域可另包含截短突變、刪除突變、取代突變或其他修飾。
在一實施態樣中，脊椎動物RXR LBD係來自人智人(Homo sapiens)、小鼠家鼷鼠(Mus musculus)、大鼠溝鼠(Rattus norvegicus)、雞原雞(Gallus gallus)、豬家豬(Sus scrofa domestica)、青蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚斑馬魚(Danio rerio)、被囊動物三崎 海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)或水母箱型水母(Tripedalia cysophora)之RXR。
在一實施態樣中，無脊椎動物RXR配體結合結構域係來自蝗蟲飛蝗(Locusta migratoria)之超氣門多肽(「LmUSP」)、硬蜱美洲鈍眼蜱(Amblyomma americanum)之RXR同源物1(「AmaRXR1」)、硬蜱美洲鈍眼蜱之RXR同源物2(「AmaRXR2」)、招潮蟹大西洋砂招潮蟹(Celuca pugilator)之RXR同源物(「CpRXR」)、甲蟲黃粉蟲(Tenebrio molitor)之RXR同源物(「TmRXR」)、蜜蜂義大利蜂(Apis mellifera)之RXR同源物(「AmRXR」)、蚜蟲桃蚜(Myzus persicae)之RXR同源物(「MpRXR」)或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之RXR同源物。
在一實施態樣中，嵌合性RXR LBD包含至少二種選自脊椎動物物種RXR多肽片段、非脊椎動物物種RXR多肽片段或非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲之無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段之多肽片段。用於本發明之嵌合性RXR配體結合結構域可能包含至少二種不同物種之RXR多肽片段，或當物種係相同時，該二或多種多肽片段可來自該物種RXR多肽片段之二或多種不同的異構體。
在一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種無脊椎動物物種RXR多肽片段。
在另一實施態樣中，嵌合性RXR配體結合結構域包 含至少一種脊椎動物物種RXR多肽片段及一種非雙翅類昆蟲/非鱗翅類昆蟲無脊椎動物物種RXR同源物多肽片段。
當配體與核受體之LBD組合且轉而與和外源性基因連接之反應元件結合時，該配體提供外部時態調控外源性基因之表現。本發明之各種成份間互相結合即例如配體與LBD結合、DBD與反應元件結合、TD與啟動子結合等之結合機轉或順序並不重要。
在特定實施例中，配體與H組核受體之LBD及彼之核受體LBD伴結合使外源性基因得以表現。此機轉不排除配體與H組核受體(GHNR)或彼之伴結合且導致形成活性同型二聚體複合物(例如GHNR+GHNR或伴+伴)之可能性。較佳地，以一或多種不同的受體結構域產生雜交基因開關。通常，該三種結構域DBD、LBD及TD中之一或多種可自不同於其他結構域來源之來源選擇，以使該雜交基因及該形成之雜交蛋白質在經選擇之宿主細胞或有機體內之反式活化活性、與配體之互補結合及對特定反應元件之辨識係經最佳化。此外，該反應元件本身可經其他DNA結合蛋白質結構域之反應元件改質或取代，諸如來自酵母菌之GAL-4蛋白質(見Sadowski et al.,Nature 335：563(1988))或來自大腸桿菌之LexA蛋白質(見Brent et al.,Cell 43：729(1985))，或專門與經設計、改質及選擇以進行特定交互作用之蛋白質進行該等標靶交互作用之合成性反應元件(見例如Kim et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,94：3616(1997))，以適應雜交受體。
功能性EcR複合物亦可能包含額外之蛋白質諸如免疫親合素。已知為轉錄因子(諸如DHR38或β FTZ-1)之蛋白質核受體家族之額外成員亦可為EcR、USP及/或RXR之配體依賴性伴或非配體依賴性伴。此外，可能需要其他輔因子，諸如通常被稱為輔活化子(亦稱為適應子或媒介子)之蛋白質。這些蛋白質不與DNA序列特異性結合，且不參與基礎轉錄。它們可能經由各種機轉展現它們對轉錄活化之影響，包括刺激與活化子之DNA結合、影響染色質結構，或媒介活化子起始複合物交互作用。該等輔活化子之實例包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及混雜輔活化子C反應元件B結合蛋白CBP/p300(見回顧文獻Glass et al.,Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。另外，通常被稱為輔抑制子(又名抑制子、靜默子或靜默媒介子)之蛋白質輔因子可能為缺乏配體時有效抑制轉錄活化所需。這些輔抑制子可與無配體之EcR交互作用以靜默反應元件之活性。目前的證據顯示，配體結合改變受體之構型，導致釋放輔抑制子及吸引上述輔活化子，藉此取消彼等之靜默活性。輔抑制子之實例包括N-CoR及SMRT(見回顧文獻Horwitz et al.,Mol Endocrinol.10：1167(1996))。這些輔因子可能為在細胞或有機體內之內源性因子，或可能為外源性添加之轉基因以經調節或未調節之方式表現。
該外源性基因係與啟動子可操作性連接，該啟動子包含至少一個由該基因開關所編碼之配體依賴性轉錄因子之DBD所辨識之反應元件。在一實施態樣中，該啟動子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10套反應元件。包含該所欲之反應元件之啟動子可為天然發生之啟動子或利用該領域廣為周知之技術產生之人工啟動子，例如一或多個反應元件與最小啟動子可操作性連接。
編碼蛋白質之基因亦可經密碼子最佳化。在一實施態樣中，蛋白質之編碼區係經密碼子最佳化以於人表現。如該領域之技藝人士所了解的，不同的核酸編碼區將編碼相同多肽，因為基因密碼具有多餘性。在包含編碼任何多肽鏈之胺基酸的密碼子之核苷酸序列中的偏差允許編碼該基因之序列的變異。由於每個密碼子係由三個核苷酸組成，且組成DNA之核苷酸限制於四個特定鹼基，因此有64種可能的核苷酸組合，其中的61種編碼胺基酸(其餘3個密碼子編碼終止轉譯之信號)。顯示何種密碼子編碼何種胺基酸之「基因密碼」複製於此處表4。如表中所示，許多胺基酸由超過一種密碼子指定。舉例來說，胺基酸丙胺酸及脯胺酸係由四種三聯體密碼編碼，絲胺酸及精胺酸係由六種三聯體編碼，然而色胺酸及甲硫胺酸則僅由一種三聯體編碼。此簡併性允許DNA鹼基組成物有廣泛差異，但不至於改變由該DNA所編碼之多肽的胺基酸序列。
應了解任何依照本發明所述編碼多肽之多核苷酸均屬於本發明之範圍，不論其所使用之密碼子為何。
許多有機體展現使用特定密碼子之偏性，以在成長中之多肽鏈編碼插入特定胺基酸。密碼子偏好或密碼子偏性即有機體間密碼子之使用差異係由基因密碼之簡併性提供，在許多有機體間有廣泛文獻記錄。密碼子偏性通常與信使RNA(mRNA)之轉譯效率有關，接著被認為尤其取決於被轉譯之密碼子的特性及特定轉移RNA(tRNA)分子 之可得性。細胞內經選擇之tRNA之優勢通常反映在肽合成中最常所使用之密碼子。因此，基因可經修剪以在給定有機體內基於密碼子最佳化達到最佳基因表現。
多核苷酸係藉由將給定物種之基因中偏好使用之密碼子納入DNA序列加以製備。
由於可自廣泛種類之動物、植物及微生物物種取得大量之基因序列，因此有可能計算密碼子使用之相對頻率。密碼子使用表可被輕易地取得，例如在網站http：//www.kazusa.or.jp/codon/(於2006年5月30日造訪)提供之「密碼子使用資料庫」，這些表格可經多種方式調整。見Nakamura,Y.,et al.,"Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases：status for the year 2000" Nucl.Acids Res.28：292(2000)。自GenBank Release 151.0計算得到之人密碼子使用表被複製為下列表5(來自同上之http：//www.kazusa.or.jp/codon/)。這些表格使用mRNA命名法，因此該等表格不使用在DNA中發現之胸腺嘧啶(T)，而是使用在RNA中發現之尿嘧啶(U)。該等表格係經調整，因此頻率係根據各胺基酸計算，而非根據所有64個密碼子計算。
藉由使用這些或類似之表格，該領域之一般技藝人士可應用這些頻率至任何給定之多肽序列，以產生經密碼子最佳化之編碼區之核酸片段，該核酸片段使用對給定物種最佳化之密碼子以編碼該多肽。
有多種方法可被用於合成由上述任何方法所設計之經密碼子最佳化之編碼區，包括該領域之一般技藝人士所廣為周知之標準及例行分子生物操作。
在一實施態樣中，本發明之載體中編碼該蛋白質之編碼區係經密碼子最佳化。在另一實施態樣中，該編碼區係經密碼子最佳化以於人表現。在特定實施態樣中，該序列係由經密碼子最佳化之核酸序列編碼。
為了將多核苷酸導入活體內或活體外之細胞內，可使用載體。該載體可為例如質體載體或單股或雙股RNA或DNA病毒載體。藉由廣為周知之導入DNA及RNA至細胞內之技術，該等載體可被導入需要該載體之個體例如哺乳動物的細胞內。病毒載體可為複製型或複製缺陷型。就複製缺陷型病毒載體而言，病毒增殖通常將僅發生於互補宿主細胞。此處所使用之用語「宿主細胞」或「宿主」係指本發明中包含本發明之一或多種多核苷酸之細胞。
因此，該載體至少必須包含本發明之多核苷酸。載體之其他成份可包括但不限於選擇性標誌、染色質修飾結構域、驅使其他亦可能存在載體中之多肽(例如致死多肽)表現之額外啟動子、基因組嵌入位點、重組位點及分子插入支點。載體可能包含任何數量之該些額外元件，不論是 否位於該等多核苷酸之內，因此該載體可經剪裁以符合所欲治療性方法之特定目標。
在本發明之一實施態樣中，被導入細胞內之該等載體另包含「選擇性標誌基因」，當選擇性標誌基因表現時表示本發明之基因開關建構體已被嵌入宿主細胞之基因組內。因此，該選擇性基因可作為基因組嵌入之陽性標誌。選擇性標誌基因雖然不是本發明之方法所必須，但其存在允許實施者得以選擇載體建構體已被嵌入細胞之基因組中之活細胞群。因此，本發明之某些實施態樣包含選擇已成功嵌入載體之細胞。此處所使用之用語「選擇」或彼之變異詞當與細胞一起使用時，係意圖表示標準、廣為周知之選擇具有特定基因組成或表型之細胞之方法。典型方法包括但不限於在抗生素諸如G418、新黴素及安比西林(ampicillin)存在時培養細胞。其他選擇性標誌基因之實例包括但不限於授予二氫葉酸還原酶、潮黴素或黴酚酸抗藥性之基因。其他選擇方法包括但不限於允許使用胸苷激酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸糖激酶或腺嘌呤轉磷酸糖激酶作為選擇劑之選擇性標誌基因。包含抗生素抗藥性基因之載體建構體的細胞將可耐受在培養中之抗生素。反之，不含抗生素抗藥性基因之載體建構體的細胞將無法耐受在培養中之抗生素。
此處所使用之「染色質修飾結構域」(CMD)係指與各種與維持及/或改變染色質結構有關之蛋白質(諸如但不限於DNA絕緣子)交互作用之核苷酸序列。見Ciavatta et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.,103：9958(2006)。CMD之實例包括但不限於雞β球蛋白絕緣子及雞高敏感位點4(cHS4)。舉例來說，在一或多種基因計畫(即啟動子、編碼序列及3'調節區)之間使用不同的CMD序列有利於使用差別CMD DNA序列作為「最小同源臂」與各種微生物或試管內重組工程技術之組合，以「交換」在現存多重基因及單基因穿梭載體之間的基因計畫。其他染色質修飾結構域之實例係該領域已知或可被輕易識別。
在本發明之載體中之多核苷酸及核酸編碼區可與額外之編碼區相連，該額外之編碼區編碼分泌或信號肽，以引導蛋白質之分泌。根據信號假設，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦生長蛋白質鏈開始被輸出通過粗糙內質網，該信號肽或分泌前導序列會自成熟蛋白質切除。由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有與該多肽之N端融合之信號肽，該信號肽將自完整或「全長」多肽切除以產生分泌或「成熟」型多肽。
在一實施態樣中，本發明之載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，其與經由該配體依賴性轉錄因子活化之啟動子可操作性連接，其中該編碼一或多種蛋白質之多核苷酸另包含編碼信號肽之核酸序列。在另一實施態樣中，該信號肽增加由該載體所編碼之蛋白質之分泌，相較於包 含該蛋白質之天然信號肽基因之載體。特別是，本發明所使用之信號肽係經密碼子最佳化。
本發明之載體可包含各種調節區，例如5'非轉譯區(5'UTR)、3' UTR或二者。本發明亦關於使用各種調節區以誘發增進之分泌、蛋白質轉譯、轉譯後、mRNA轉錄或轉錄後處理。此處所使用之基因之「5'非轉譯區」或「5'UTR」被瞭解為基因經轉錄為初級RNA轉錄物(前-mRNA)之部分且該部分係位於編碼序列之上游。初級轉錄物係由DNA轉錄所產生之起始RNA產物，其包含內含子及外顯子。許多初級轉錄物必須經過RNA處理以形成具有生理活性之RNA物種。要成為成熟mRNA之處理可能包含修剪末端、移除內含子、加蓋及/或自彼等之RNA前體切除個別核糖體RNA(rRNA)分子。mRNA之5'UTR因此係為不經轉譯成為蛋白質之mRNA部分，且該部分係位於編碼序列之上游。在基因組序列中，5'UTR通常被定義為介於轉錄起始位點及起始密碼子之間的區域。脊椎動物mRNA之5'非轉譯區(5'UTR)的長度可自數十個鹼基至數百個鹼基(Crowe et al.,2006 BMC Genomics 7：16)。此處所使用之5'UTR可為天然發生或經修飾以包含一或多個在天然中不連續之核酸序列(嵌合性序列)，及/或可包含取代、插入及刪除及彼等之組合。在一實施態樣中，該5'UTR序列係源自野生型TNF-α序列或5U2序列。在另一實施態樣中，該5'UTR序列係5U2之5'UTR。在一些實施態樣中，該5'UTR誘發增進之蛋白質表現，例如 mRNA轉錄、轉錄前或轉錄後。
本發明所使用之3'非轉譯區(UTR)係指位於編碼序列下游(3')之DNA序列，可包含聚腺苷酸化[poly(A)]辨認序列及其他編碼調節信號以影響mRNA處理或基因表現之序列。聚腺苷酸化信號之特徵通常為影響聚腺苷酸序列添加至mRNA前體之3'端。任何適當之聚腺苷酸化序列皆可被使用，包括合成性最佳化序列，以及BGH(牛生長激素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(EB病毒)及乳頭狀瘤病毒之聚腺苷酸化序列，包括人乳頭狀瘤病毒及BPV(牛乳頭狀瘤病毒)。在特定實施態樣中，3'調節區係SV40e(人肉瘤病毒-40)聚腺苷酸化序列。在另一特定實施態樣中，3'調節區係人生長激素之聚腺苷酸化序列。
在某些實施態樣中，相較於不含信號肽及/或調節區之對照物，單獨或經組合之信號肽及/或調節區可增進至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍或500倍之蛋白質分泌、轉錄或轉譯。蛋白質例如TNF-α之分泌量可經正常化至由具有野生型基因之載體所編碼之蛋白質表現。在本發明之另一特定實施態樣中，該單獨或經組合之信號肽及/或調節區增加約5%至約10%、約11%至約20%、約21%至約30%、約31%至約40%、約41%至約50%、約51%至約60%、約61%至約70%、約71%至約80%、約81%至約90%、約91%至約100%、約101%至約149%、約 150%至約199%、約200%至約299%、約300%至約499%或約500%至約1000%之蛋白質之產量。在特定實施態樣中，本發明包含條件性表現蛋白質之載體，其中該載體包含源自5U2之5'UTR、編碼IL-2信號肽之經密碼子最佳化之核酸序列、編碼蛋白質之經密碼子最佳化之編碼區及SV40e或人生長激素之聚腺苷酸化信號。
用於本發明之特定載體係編碼蛋白質或多核苷酸之表現載體。通常，該等載體包含與所欲表現之多核苷酸可操作性連接以供宿主內之有效表現之順式作用控制區。適當之反式作用因子係由宿主提供、由互補載體提供或當導入宿主內時由載體本身提供。
多種表現載體可被用於表現蛋白質或多核苷酸。該等載體包括染色體、附加型及病毒衍生性載體，例如源自細菌性質體、噬菌體、酵母菌附加體、酵母菌染色體元件、病毒諸如腺病毒相關病毒、慢病毒、桿狀病毒、乳多泡病毒諸如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒及反轉錄病毒之載體及源自彼等之組合之載體，諸如該些源自質體及噬菌體基因元件(如黏質體及噬菌體)之載體。所有皆可被用於本發明此態樣中之表現。一般來說，任何適合在宿主內維持、增殖或表現多核苷酸或蛋白質之載體可被用於這方面之表現。
用於本發明之適當病毒載體包括但不限於腺病毒基底載體、反轉錄病毒載體、單純皰疹病毒(HSV)基底載體、小病毒基底載體，例如腺病毒相關病毒(AAV)基底載 體及AAV-腺病毒嵌合性載體。這些病毒載體可利用標準重組DNA技術製備，例如於Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1994)中所述之技術。
在一實施態樣中，本發明之病毒載體係腺病毒載體。腺病毒(Ad)係36 kb之雙股DNA病毒，其於活體內有效地轉移DNA至各種不同之標靶細胞類型。腺病毒載體可以高力價產生，且可有效地轉移DNA至複製及非複製細胞。腺病毒載體基因組可利用任何種、系、亞型、多種種(species)之混合物、多種系之混合物、多種亞型之混合物或嵌合性腺病毒作為載體DNA之來源加以產製。可被用來作為腺病毒來源之腺病毒保存液可自腺病毒血清型1至51擴增，這些血清型目前可得自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC，維吉尼亞州馬納薩斯市)，或自任何其他來源所提供之任何其他腺病毒血清型擴增。舉例來說，腺病毒可為A亞群(例如血清型12、18及31)、B亞群(例如血清型3、7、11、14、16、21、34及35)、C亞群(例如血清型1、2、5及6)、D亞群(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22至30、32、33、36至39及42至47)、E亞群(血清型4)、F亞群(血清型40及41)或任何其他腺病毒血 清型。由於人腺病毒血清型5(Ad5)基因組已被完全定序，此處所描述之本發明之腺病毒載體係關於Ad5血清型。該腺病毒載體可為任何能在細胞內生長之腺病毒載體，該載體之某些顯著部分(雖然不見得實質上)係衍生自或基於腺病毒之基因組。該腺病毒載體可基於任何適當之野生型腺病毒之基因組。在某些實施態樣中，腺病毒載體係源自C群野生型腺病毒之基因組，尤其是血清型2或5。腺病毒載體係該領域所廣為周知，已被描述於例如美國專利第5,559,099、5,712,136、5,731,190、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,962,311、5,965,541、5,981,225、5,994,106、6,020,191及6,113,913號、國際專利申請案WO 95/34671、WO 97/21826及WO 00/00628及Virology,B.N.Fields et al.,eds.,3d ed.,Raven Press,Ltd.,New York(1996)之Thomas Shenk所著之第67章"Adenoviridae and their Replication"及M.S.Horwitz所著之第68章"Adenoviruses"。
在其他實施態樣中，該腺病毒載體係複製缺陷型載體。此處所使用之用語「複製缺陷型」係指該腺病毒載體包含缺乏至少一種複製必要基因功能之基因組。此處所使用之基因缺陷、基因功能缺陷、基因區缺陷或基因組區缺陷係定義為刪除病毒基因組中足夠之基因材料以破壞或抹煞該核酸序列被整體或部分刪除之基因的功能。複製必要之基因功能係複製缺陷型腺病毒載體複製(即增殖)所需之該些基因功能。複製必要之基因功能係由例如腺病毒早期區 (例如E1、E2及E4區)、晚期區(例如L1至L5區)、與病毒包裝有關之基因(例如IVa2基因)及病毒相關性RNA(例如VA-RNA I及/或VA-RNA II)所編碼。在其他實施態樣中，該複製缺陷型腺病毒載體包含缺乏腺病毒基因組之一或多區之至少一種複製必要性基因功能之腺病毒基因組(例如缺乏腺病毒基因組之二或多區以導致多重複製缺陷型腺病毒載體)。該腺病毒基因組之一或多區係選自E1、E2或E4區。複製缺陷型腺病毒載體可包含E1區之至少一種複製必要性基因功能之缺陷(即為E1-缺陷型腺病毒載體)，特別是腺病毒E1A區及腺病毒E1B區各區中複製必要性基因功能之缺陷。除了該種E1區之缺陷以外，該重組腺病毒亦可在主要晚期啟動子(MLP)中具有突變，如國際專利申請案WO 00/00628中之討論。在特定實施態樣中，該載體缺乏E1區之至少一種複製必要性基因功能及至少部分之非必要性E3區(例如E3區之Xba I刪除)(即為E1/E3-缺陷型腺病毒載體)。
在某些實施態樣中，該腺病毒載體係「多重缺陷」，表示該腺病毒載體缺乏腺病毒基因組之二或多區之各區中的一或多種病毒複製所需之基因功能。舉例來說，前述之E1-缺陷型或E1/E3-缺陷型腺病毒載體可另缺乏至少一種E4區之複製必要性基因功能(即為E1/E4-缺陷型腺病毒載體)。刪除整個E4區之腺病毒載體可誘發較低之宿主免疫反應。
或者，該腺病毒載體缺乏所有或部分之E1區及所有 或部分之E2區的複製必要性基因功能(即為E1/E2-缺陷型腺病毒載體)。缺乏所有或部分之E1區、所有或部分之E2區及所有或部分之E3區之複製必要性基因功能之腺病毒載體亦於此處考慮。若本發明之腺病毒載體缺乏E2A區之複製必要性基因功能，則該載體不包含完整刪除之E2A區，其長度少於約230個鹼基對。通常，腺病毒之E2A區編碼DBP(DNA結合結構域)，其為DNA複製所需之多肽。依病毒血清型而定，DBP係由473至529個胺基酸組成。一般認為DBP是呈長橢球形狀之非對稱性蛋白質，其由球狀Ct與延伸之Nt結構域組成。研究顯示，該Ct結構域負責DBP與核酸結合、與鋅結合及在DNA合成中作用於DNA鏈延長階段之能力。然而，該Nt結構域被認為作用於轉錄及轉錄後二個階段之晚期基因表現，負責蛋白質之有效核定位，且亦可能與增強彼自身之表現有關。刪除在胺基酸2至38之間的Nt結構域顯示此區是DBP功能之重要部分(Brough et al.,Virology,196,269-281(1993))。雖然刪除編碼DBP之Ct區的E2A區對病毒複製沒有影響，但刪除編碼DBP之Nt結構域的胺基酸2至38之E2A區妨礙病毒複製。在一實施態樣中，多重複製缺陷型腺病毒載體包含腺病毒基因組之此部分之E2A區。特別是，舉例來說，該所欲保留之E2A區部分係由該E2A區之5'端所定義之腺病毒基因組之E2A區部分，特別是腺病毒血清型Ad5基因組之E2A區的位置Ad5(23816)至Ad5(24032)。
該腺病毒載體可為缺乏僅腺病毒基因組早期區之複製必要性基因功能、僅腺病毒基因組晚期區之複製必要性基因功能及腺病毒基因組早期及晚期兩區之複製必要性基因功能。腺病毒載體亦可實質上移除完整之腺病毒基因組，在此情況中至少維持完整之病毒反向末端重複(ITR)及一或多種啟動子或病毒ITR及包裝信號(即腺病毒增殖子)。被移除之腺病毒基因組區域越大，可被插入基因組內之外源性核酸序列之片段越大。舉例來說，如果腺病毒基因組為36 kb，保留完整之病毒ITR及一或多種啟動子，該腺病毒之外源性插入能力係約35 kb。或者，僅包含ITR及包裝信號之多重缺陷腺病毒載體有效地允許插入約37至38 kb之外源性核酸序列。當然，在任何或所有的缺陷型腺病毒區中包含間隔子元件將降低腺病毒載體容納大型插入序列之能力。適當之複製缺陷型腺病毒載體包括多重缺陷型腺病毒載體係揭示於美國專利第5,851,806及5,994,106號及國際專利申請案WO 95/34671及WO 97/21826。在一實施態樣中，本發明方法所使用之載體係描述於國際專利申請案PCT/US01/20536。
應了解的是，刪除腺病毒載體之不同區域可改變哺乳動物之免疫反應。特別是，刪除不同區域可減少腺病毒載體所產生之發炎反應。另外，腺病毒載體外套蛋白可經修飾以降低腺病毒載體可被或不可被針對野生型外套蛋白之中和抗體辨識之能力，如國際專利申請案WO 98/40509中所述。
當該腺病毒載體具多重複製缺陷特別是E1及E4區之複製必要性基因功能時，該載體可包括間隔子元件以提供病毒在互補細胞系中生長，類似單一複製缺陷型腺病毒載體特別是包含E1區缺陷之腺病毒載體所達成之病毒生長。該間隔子元件可包含任何所欲長度之序列。間隔子元件序列可為腺病毒基因組之編碼或非編碼及天然或非天然序列，但不恢復該缺陷區之複製必要性功能。在缺乏間隔子的情況下，多重複製缺陷型腺病毒載體之纖維蛋白產製及/或病毒生長相較於單一複製缺陷型腺病毒載體係經減少。然而，在缺陷型腺病毒區之至少一區較佳地E4區中包含間隔子可彌補此纖維蛋白產製及病毒生長之降低。間隔子於在腺病毒載體中之用途係描述於美國專利第5,851,806號。
腺病毒載體之建構係該領域所廣泛了解。腺病毒載體可利用前述方法建構及/或純化，例如美國專利第5,965,358號及國際專利申請案WO 98/56937、WO 99/15686及WO 99/54441中所述。腺病毒基因轉移載體之產製係該領域所廣為周知，涉及使用標準分子生物技術諸如該些於例如Sambrook et al.(同上)、Watson et al.(同上)、Ausubel et al.(同上)及此處提及之數篇其他文獻中所描述者。
複製缺陷型腺病毒載體通常在互補細胞系中產製，該細胞系提供不存在於複製缺陷型腺病毒載體但為病毒增殖所需之適當量之基因功能，以產製高力價之病毒載體保存 液。在一實施態樣中，細胞系互補至少一種及/或所有不存在於複製缺陷型腺病毒之複製必要性基因功能。該互補細胞系可互補至少一種由早期區、晚期區、病毒包裝區、病毒相關性RNA區或彼等之組合所編碼之複製必要性基因功能之缺陷，包括所有腺病毒功能(例如使包含最小腺病毒序列，諸如僅反向末端重複(ITR)及包裝信號或僅ITR及腺病毒啟動子之腺病毒增殖子得以增殖)。在另一實施態樣中，該互補細胞系互補腺病毒基因組之E1區的至少一種複製必要性基因功能之缺陷(例如二或多種複製必要性基因功能)，特別是在各E1A及E1B區之複製必要性基因功能之缺陷。此外，該互補細胞系可互補腺病毒基因組之E2(特別是腺病毒DNA聚合酶及末端蛋白質)及/或E4區之至少一種複製必要性基因功能之缺陷。刻意地，互補E4區之缺陷的細胞包含E4-ORF6基因序列及產製E4-ORF6蛋白。該細胞刻意地至少包含ORF6，但不含腺病毒基因組之E4區之其他ORF。該細胞系之較佳其他特徵為包含不與腺病毒載體重複之互補基因，如此能最小化且幾乎消除載體基因組與細胞性DNA重組之可能性。因此可將複製型腺病毒(RCA)存在之機率降到最低即使無法在載體保存液中避免，使該載體保存液得以適合某些治療性目的特別是基因療法之目的。不含RCA之載體保存液可避免腺病毒載體在非互補細胞中複製。互補細胞系之建構涉及標準分子生物學及細胞培養技術，諸如該些由Sambrook et al.(同上)及Ausubel et al.(同上)所述者 。用於產製基因轉移載體(例如腺病毒載體)之互補細胞系包括但不限於293細胞(例如Graham et al.,J.Gen.Virol.,36,59-72(1977)所述)、PER.C6細胞(例如國際專利申請案WO 97/00326及美國專利第5,994,128及6,033,908號所述)及293-ORF6細胞(例如國際專利申請案WO 95/34671及Brough et al.,J.Virol.,71,9206-9213(1997)所述)。核酸序列插入腺病毒基因組內(例如腺病毒基因組之E1區)可由已知方法達成，例如藉由在腺病毒基因組之給定位置導入獨特之限制位點。
反轉錄病毒係能感染多種宿主細胞之RNA病毒。當感染時，反轉錄病毒基因組嵌入彼之宿主細胞的基因組內，並隨宿主細胞之DNA複製，藉以持續產製病毒RNA及任何納入反轉錄病毒基因組內之核酸序列。藉此方式，當使用反轉錄病毒時可達成長期表現治療性因子。考慮用於基因療法之反轉錄病毒相對不具致病性，雖然有致病性反轉錄病毒存在。當採用致病性反轉錄病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人嗜T細胞病毒(HTLV)時，必須小心地改變病毒基因組以消除對宿主之毒性。反轉錄病毒載體可經其他改變以使該病毒成為複製缺陷。因此反轉錄病毒載體被認為特別適用於活體內穩定之基因轉移。慢病毒載體諸如HIV-基底載體係用於基因傳送之示範性反轉錄病毒。不像其他的反轉錄病毒，已知HIV-基底載體會將彼等之乘客基因納入非分裂細胞，因此可被用於治療持續性疾病。
HSV-基底病毒載體適合用來作為基因轉移載體以導入核酸至各種細胞類型。成熟HSV病毒粒子之結構為有套膜之二十面體核殼以及由152 kb之線性雙股DNA分子組成之病毒基因組。大部分複製缺陷型HSV載體包含刪除以移除一或多種立即早期基因以避免複製。HSV載體之優點在於彼進入可導致長期DNA表現之潛伏階段之能力，及彼之可容納至25 kb之外源性DNA插入之大型病毒DNA基因組。當然，HSV啟動長期產製外源性蛋白質之能力就短期治療計劃而言可能是一項缺點。然而，該領域之一般技藝人士具備判斷特定情況下之適當載體之必備了解。HSV-基底載體係描述於例如美國專利第5,837,532、5,846,782、5,849,572及5,804,413號及國際專利申請案WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637及WO 99/06583。
AAV載體係特別受到關注地被用於基因療法計畫中之病毒性載體。AAV係DNA病毒，其未被發現會造成人之疾病。AAV基因組係由二個基因rep及cap組成，其兩側為包含DNA複製及病毒包裝之辨識信號之反向末端重複(ITR)。AAV需要與輔助病毒(即腺病毒或單純皰疹病毒)共感染或表現輔助基因以有效地複製。AAV可在各種宿主細胞中增殖，包括人細胞、類人猿細胞及齧齒動物細胞，依所採用之輔助病毒而定。用於投予核酸序列之AAV載體通常被刪掉大約96%之親代基因組，僅剩ITR被保留。如此可消除因為表現病毒基因所造成之免疫或毒性不良 反應。若有需要，AAV rep蛋白可與AAV載體共投以使AAV載體能夠被嵌入宿主細胞之基因組內。包含經嵌入之AAV基因組的宿主細胞在細胞生長或細胞形態上沒有變化(見例如美國專利第4,797,368號)。因此，長期表現來自AAV載體之治療性因子可被用於治療持續性及慢性疾病。
表現載體中之多核苷酸序列係與適當之表現控制序列可操作性連接，包括例如引導mRNA轉錄之啟動子。其他啟動子之代表包括但不限於組成性啟動子及組織特異性或誘導性啟動子。組成性真核啟動子之實例包括但不限於小鼠金屬硫蛋白I基因(Hamer et al.,J.Mol.Appl.Gen.1：273(1982))、皰疹病毒之TK啟動子(McKnight,Cell 31：355(1982))、SV40早期啟動子(Benoist et al.,Nature 290：304(1981))及牛痘病毒啟動子。可用於驅使蛋白質或多核苷酸表現之啟動子的其他實例包括但不限於組織特異性啟動子及其他特定蛋白質之內源性啟動子，諸如白蛋白啟動子(肝細胞)、前胰島素啟動子(胰臟β細胞)及該類似物。一般來說，表現建構體將包含供轉錄之起始及終止位點，及在經轉錄區中供轉譯之核糖體結合位點。由建構體表現之成熟轉錄物的編碼部分可包括在所欲轉譯之多肽開始處之轉譯起始密碼子AUG及大約位於尾端之終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
此外，該建構體可包含調節及引起表現之控制區。一般來說，這些區將藉由控制轉錄之方式操作，其中包括諸 如抑制子結合位點及增強子。
真核載體之實例包括但不限於斯壯特基(Stratagene)公司之pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1及pSG；法瑪西亞(Amersham Pharmacia Biotech)公司之pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL；及克隆技術(Clontech)公司之pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito及pCMV-EGFP。許多其他載體係廣為周知且可自商業途徑獲得。
特別有用之載體包含分子插入支點以供快速插入及移除基因計畫之元件，該等載體係描述於美國公開專利申請案2004/0185556、美國專利申請案11/233,246及國際公開申請案WO 2005/040336及WO 2005/116231。該載體實例係如WO 2007/038276中所述之UltravectorTM產製系統(維吉尼亞州布萊克斯堡(Blacksburg,VA)英創松(Intrexon)公司)。此處所使用之「基因計畫」係基因元件之組合，包含啟動子(P)、表現序列(E)及3'調節序列(3)，因此「PE3」即一基因計畫。在此基因計畫中之元件可被輕易地在基因計畫之各元件側翼之分子支點之間交換。此處所使用之分子支點係定義為包含至少二個以線性方式排列之非變動性罕見或少見之限制位點之多核苷酸。在一實施態樣中，該分子支點包含至少三個以線性方式排列之非變動性罕見或少見之限制位點。通常任一分子支點不包括在相同基因計畫內之任何其他分子支點之罕見或少見之限制位點。給定限制酶作用於其上之超過6個核苷酸之 同源序列被稱為「罕見」限制位點。然而有些6 bp之限制位點的發生頻率不如統計預期的高，這些位點及切割彼等之內核酸酶被稱為「少見」限制位點。罕見或少見限制酶之實例包括但不限於AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、Sgf I、Srf I、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45 I、Age I、Bst1107 I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I、Xma I、BsrB I、Nsi I、Sac II、Sac I、Blp I、PspoM I、Pci I、Stu I、Sph I、BamH I、Bsu36 I、Xba I、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG I及Sse8781 I。
載體亦可包含第二類限制酶稱為歸巢內核酸酶(HE)之限制位點。HE酶具有大型、非對稱性限制位點(12至40個鹼基對)，彼等之限制位點在天然中並不常見。舉例來說，被稱為I-SceI之HE具有18 bp之限制位點(5'TAGGGATAACAGGGTAAT3')，預計每7x1010鹼基對之隨機序列中僅出現一次。此出現頻率相當於在大小為哺乳動物基因組之20倍的基因組中僅一個位點。HE位點之罕見性大幅提高基因工程師切割基因計畫而不破壞該基因計畫之完整性的可能，若HE位點被包括於選殖載體質體之適當位置。
選擇適當載體及啟動子以於宿主細胞中表現係廣為周知之程序，而載體建構及導入宿主之必要技術以及彼於宿主中之表現係該領域之例行技藝。
導入多核苷酸至細胞內可為過渡性轉染、穩定性轉染或可為基因座特異性插入載體。過渡性及穩定性轉染載體至宿主細胞內可由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖媒介性轉染、陽離子脂質媒介性轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法達成。該等方法係描述於許多標準實驗室手冊，諸如Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)、Keown et al.,1990,Methods Enzymol.185：527-37、Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.。這些穩定轉染方法導致隨機插入載體至細胞之基因組內。另外，載體之複製數及方向性通常來說亦為隨機。
在本發明之一實施態樣中，載體被插入基因組之生物中性位點。生物中性位點係指在基因組內插入多核苷酸而極少干擾(若有的話)該細胞之正常功能的位點。生物中性位點可利用可取得之生物資訊加以分析。許多生物中性位點係該領域已知，例如ROSA-相等基因座。其他生物中性位點可利用該領域廣為周知之例行技術加以辨識。基因組插入位點之特徵描述係利用該領域已知之方法進行。當導入載體至細胞內時，為了控制多核苷酸之位置、複製數及/或方向性，可使用基因座特異性插入之方法。基因座 特異性插入之方法係該領域所廣為周知，包括但不限於同源性重組及重組酶媒介性基因組插入。當然，若要在本發明之方法中使用基因座特異性插入方法，該等載體可包含輔助此基因座特異性插入之元件，諸如但不限於同源性重組。舉例來說，該等載體可能包含一、二、三、四或四個以上之基因組整合位點(GIS)。此處所使用之「基因組整合位點」被定義為載體序列之核苷酸序列與細胞內之基因組部分序列一致或幾乎一致之部分，該部分允許載體插入基因組。特別是，該載體可包含在至少多核苷酸兩側之二個基因組整合位點。當然，GIS可在其他元件或甚至存在載體上之所有元件之旁側。
在另一實施態樣中，基因座特異性插入可藉由重組酶位點特異性基因插入進行。簡言之，細菌性重組酶諸如但不限於PhiC31整合酶可作用於人基因組內之「假性」重組位點。這些假性重組位點可成為使用重組酶之基因座特異性插入之目標。重組酶位點特異性基因插入係描述於Thyagarajan et al.,Mol.Cell Biol.21：3926(2001)。可用於重組酶位點特異性基因插入之重組酶及彼等之個別位點之其他實例包括但不限於絲胺酸重組酶諸如R4及TP901-1和WO 2006/083253所描述之重組酶。
在另一實施態樣中，該載體可包含化學抗藥性基因，例如多重藥物抗藥性基因mdr1、二氫葉酸還原酶或O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶。化學抗藥性基因可在組成性(例如CMV)或誘導性(例如RheoSwitch®)啟動子之控 制下。在此實施態樣中，若想要治療個體之疾病同時維持該個體體內經改質之細胞，臨床醫師可使用化學治療劑以殺死疾病細胞，但該經改質之細胞將不受該劑之影響因為適當化學抗藥性基因之表現，且可被持續使用以治療、改善或預防疾病或疾患。藉由將化學抗藥性基因置於誘導性啟動子之控制下，可避免非必要之化學抗藥性基因表現，但若須持續治療該基因仍將可用。若經改質之細胞本身變成疾病細胞，它們仍可藉由誘導如下所述之致死性多肽之表現而被摧毀。
本發明之方法可藉由導入編碼基因開關及外源性基因之多核苷酸至個體之細胞內加以實現。可使用任何已知之用於導入多核苷酸至該領域已知之細胞內之方法，諸如上述之該些方法。
當多核苷酸是要導入活體外之細胞內時，該等細胞可藉由任何該領域已知之技術取自個體，包括但不限於生檢、刮削及手術組織移除。該經分離之細胞可經足以允許多核苷酸導入細胞內之時間的培養，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小時或更久。短時間內培養初代細胞之方法係該領域所廣為周知。舉例來說，細胞可於培養盤(例如微量孔盤)中附著或懸浮培養。
以活體外治療性方法而言，細胞係自個體分離，並在適用於導入多核苷酸至細胞內之條件下培養。一旦多核苷酸被導入細胞內，該等細胞係經足夠時間之培養以允許配體依賴性轉錄因子之表現，例如0.5、1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、12、18或24小時或更久。在多核苷酸被導入細胞後的某些時間點(不論是在顯著量之配體依賴性轉錄因子被表現之前或之後)，該等細胞被導入回該個體體內。導回可藉由該領域已知之任何方法進行，例如靜脈輸注或直接注入組織或腔內。在一實施態樣中，在將細胞導回個體之前，會先測定細胞內有多核苷酸存在。在另一實施態樣中，包含多核苷酸之細胞係經篩選(例如根據多核苷酸之選擇性標誌之存在與否)，只有該些包含多核苷酸之細胞會被導回個體。在細胞被導回個體之後，配體被投予至個體以誘發該治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。在選擇性實施態樣中，該配體甚至可在細胞被導回個體之前被加至該細胞，以使該治療性多肽或治療性多核苷酸在細胞被導回之前開始表現。該配體可經任何適當之方法投予，不論是系統性投予(例如經口、經靜脈)或局部性投予(例如腹膜內、脊椎鞘內、腦室內、直接注射至細胞被導回之組織或器官內)。每種細胞類型及疾病或疾患之理想配體投予時間可利用例行技術決定。
本發明之活體內治療性方法涉及直接活體內導入多核苷酸例如腺病毒載體至個體之細胞內。多核苷酸可經系統性或局部性(例如疾病或疾患之部位)導入個體體內。一旦多核苷酸被導入個體體內，配體可被投予以誘發該治療性多肽或治療性多核苷酸之表現。該配體可經任何適當之方法投予，不論是系統性投予(例如經口、經靜脈)或局部性投予(例如腹膜內、脊椎鞘內、腦室內、直接注射至 發生疾病或疾患之組織或器官內)。每種細胞類型及疾病或疾患之理想配體投予時間可利用例行技術決定。
以活體內用途而言，此處描述之配體可包含於醫藥上可接受之載劑中，諸如溶液、懸浮液、錠劑、膠囊、軟膏、酏劑及注射型組成物。醫藥組成物可包含自0.01重量%至99重量%之配體。組成物可為單一或多重劑量形式。在任何特定醫藥組成物中之配體量將依有效劑量而定，即誘發該所欲之基因表現或抑制所需之劑量。
此處所使用之用語「rAD.RheoIL12」係指腺病毒多核苷酸載體，其包含在RheoSwitch®治療系統(RTS)之基因開關的控制下之IL-12基因，該載體能在活化配體存在下產製IL-12蛋白。此處所使用之用語「rAd.cIL12」係指包含在組成性啟動子控制下之IL-12基因的腺病毒多核苷酸控制載體。
此處所使用之用語「IL-12p70」係指IL-12蛋白，其天然地具有二個通常被稱為p40及p35之次單位。用語IL-12p70包含由IL-12之二個次單位(p40及p35)組成之融合蛋白，其中該融合蛋白可包含在次單位之間的連接子胺基酸。
投予該醫藥製劑之適當途徑包括經口、經直腸、局部(包括經皮、經頰及舌下)、經陰道、非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、腫瘤內、皮內、脊椎鞘內及硬膜外)及經鼻胃管。該領域之技藝人士將了解到，投予途徑將依所欲治療之情況而定，且可能隨不同因素例如接受者之狀 況而異。
此處所使用之用語「活化(activating或activate)」係指基因開關之細胞活性的任何可測量之增加，導致受到關注之基因之表現。
此處所使用之用語疾病「治療(treating或treatment)」疾病係指為了緩和疾病之徵候或症狀而執行計畫，該計畫可能包括投予一或多種藥物或經試管內工程化之細胞至哺乳動物(人或非人)。因此，「治療」不應一定被視為需要完全緩和徵候或症狀，不要求治癒，且特別包括僅對個體具邊際效應之計畫。
此處所使用之用語「經試管內工程化之細胞」或「經試管內工程化之細胞群」或「經工程化之細胞群」或「表現蛋白質之細胞」係指在基因開關之控制下條件性表現蛋白質之細胞，該基因開關可由活化配體活化。
此處之用語「經改質之細胞」係指經一程序改變之細胞，該程序包括但不限於轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉澱及脂質體轉染(溶酶體融合)。
此處之用語「MOI」或「感染複數」係指在特定實驗中感染單一細胞之腺病毒顆粒平均數量(例如重組腺病毒或對照腺病毒)。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療疾病。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治 療腎病。在一實施態樣中，該腎病係腎衰竭。在另一實施態樣中，該腎病係慢性腎衰竭。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療貧血。在一實施態樣中，該貧血係腎病相關性貧血，例如腎衰竭或慢性腎衰竭相關性貧血。在另一實施態樣中，該貧血係與癌治療有關，例如與一或多種化學治療劑有關。在另一實施態樣中，該貧血係與高齡有關。在另一實施態樣中，該貧血係與肺功能受損有關。在另一實施態樣中，該貧血係與骨髓異常增生有關。在另一實施態樣中，該貧血係與放射治療有關。在另一實施態樣中，該貧血係與重大疾病有關。
在一實施態樣中，該貧血係與心臟病無關。在另一實施態樣中，該對紅血球生成素之治療有反應之疾病、疾患或狀況不是心臟病。非限制性類型之「心臟病」係鬱積性心衰竭、缺氧、缺血性心臟病、高血壓性心臟病、冠狀動脈疾病、週邊血管性疾病及缺血性心臟事件，例如心肌梗塞、心臟病發作、心衰竭、心律不整、心肌破裂、心包炎、心因性休克、血栓形成、栓塞、動脈粥樣硬化及動脈狹窄。
在另一實施態樣中，該包含編碼紅血球生成素或彼之促效劑之多核苷酸的多核苷酸不同時編碼依那西普(etanercept)，依那西普係TNF受體-Fc融合體。在另一實施態樣中，該包含編碼紅血球生成素或彼之促效劑之多核苷酸的多核苷酸不被投予至個體，該個體亦經包含編碼 依那西普之多核苷酸的多核苷酸之投予。
在一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療多發性硬化症。在一實施態樣中，該載體包含編碼干擾素之多核苷酸序列或彼之片段。在另一實施態樣中，該載體包含編碼干擾素β之多核苷酸序列或彼之片段。在另一實施態樣中，該載體包含編碼髓磷脂鹼性蛋白(MBP)之多核苷酸序列或彼之片段。在一實施態樣中，該載體包含編碼干擾素(例如干擾素β)之多核苷酸序列或彼之片段及編碼髓磷脂鹼性蛋白之多核苷酸序列或彼之片段。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療血管性水腫。在另一實施態樣中，該血管性水腫係遺傳性血管性水腫。在一實施態樣中，該載體包含編碼選自C1酯酶抑制劑(例如人C1酯酶抑制劑)、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑或緩激肽(bradykinin)B2受體拮抗劑之分子的多核苷酸序列。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法係用於治療疾病、狀況或病狀，其中C1酯酶之抑制提供治療好處效應。在此實施態樣中，該載體包含編碼C1酯酶抑制劑之多核苷酸序列，以治療例如選自敗毒症、血凝過快、肺功能障礙、低血氧症、出血性胰炎、心肌梗塞、肺移植、外傷、燒燙傷或血管滲漏之疾病、狀況或病狀。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法係用於治療疾病、疾患或狀況，其中激肽釋放素之抑制提供治療好處效應。該等疾病、狀況或病狀之實例包括但不限於接觸系 統之疾病、狀況或病狀。見例如Shariat-Madar et al.,Innate Immunity,vol.10,no.1,3-13(2004)及Frick,et al.,EMBO J.,(2006)25,5569-5578(2006)。在此實施態樣中，該載體包含編碼激肽釋放素抑制劑之多核苷酸序列，以治療例如選自動脈粥狀栓塞症、冠狀動脈疾病、阿茲海默(Alzheimer)氏症、發炎性腸疾病(例如克隆(Crohn)氏病)、血管滲漏、急性呼吸窘迫症候群或緩激肽媒介性發炎之疾病、狀況或病狀。在一實施態樣中，該載體包含編碼激肽釋放素抑制劑之多核苷酸序列。激肽釋放素抑制劑之實例包括但不限於艾卡拉肽(ecallantide)及該些如美國專利公開號2010/0034805、2009/0264350、2009/0234009、2008/0221031、2007/0213275、2006/0264603及2005/0089515中所示之激肽釋放素抑制劑，這些專利各以參照方式整體納入此處。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法可被用於治療肺高血壓。在一實施態樣中，該肺高血壓係肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係自發性肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係家族性肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係與其他疾病或狀況有關之肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係繼發於其他狀況之肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係繼發性肺動脈性高血壓。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓造成顯著靜脈或微血管牽連，例如肺靜脈閉鎖症及 肺微血管血管瘤病。在另一實施態樣中，該肺動脈性高血壓係新生兒之持續性肺高血壓。在一實施態樣中，該載體係經肌肉內投予。
在一實施態樣中，用語「前列腺素合酶」係選自前列腺素合酶、前列腺素合成酶、前列腺素合成酶1、前列腺素合成酶2、前列腺素內過氧化物合成酶、前列腺素E合成酶、前列腺素H2合成酶、前列腺素G/H合成酶1、前列腺素G/H合成酶2、PG合成酶、環氧合酶(COX)、COX-1、COX-2或COX-3之多肽。
人前列腺素G/H合酶1核苷酸序列之編號係NC_000009，人前列腺素G/H合酶1胺基酸序列之編號係NP_000953。見例如Lander et al.,Nature 429：369-374(2004)。
人前列腺素G/H合酶2核苷酸序列之編號係NC_000001，人前列腺素G/H合酶2胺基酸序列之編號係NP_000954.1。見例如Lander et al.,Nature 431：931-945(2004)。
人干擾素β之編號係NP_002167.1。
人GLP-1之編號係RP_12738。
人GLP-2之編號係RP_10769。
人脂聯素之編號係ABZ10942.1。
人瘦體素之編號係AAH69323.1。
人CFTR之編號係ABD72213.1。
人IL-10之編號係NP_000563。
在另一實施態樣中，本發明之載體及方法係用於治療疾病、狀況或病狀，其中緩激肽B2受體之抑制提供治療好處效應。在此實施態樣中，該載體包含編碼緩激肽B2受體抑制劑之多核苷酸序列，以治療例如選自腎小球硬化、阿茲海默(Alzheimer)氏症、腦水腫、血管滲漏、急性呼吸窘迫症候群、疼痛、發炎、創傷、燒傷、休克、過敏或心血管疾病之疾病、狀況或病狀。緩激肽B2受體抑制劑之實例包括但不限於哈羅基那他汀(helokinestatin)及抗緩激肽B2受體抗體。哈羅基那他汀之胺基酸序列係Gly-Pro-Pro-Tyr-Gln-Pro-Leu-Val-Pro-Arg(Kwok,H.F.et al.,Peptides 29I 65-72(2008)，其係以參照方式整體納入此處)。抗緩激肽B2受體抗體之非限制性實例係如Alla,S.A.et al.,J.Biol.Chem.271：1748-1755(1996)所示。
在一實施態樣中，投予至罹患一或多種該揭示疾病之哺乳動物之載體係腺病毒載體。在一實施態樣中，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸。在一態樣中，該基因開關係EcR-基底基因開關。在另一實施態樣中，編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物。在一態樣中，該配體係二醯基肼。在另一態樣中，該配體係選自RG-115819、RG-115932或RG-115830。在又一 態樣中，該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
在一實施態樣中，本發明提供包含基因開關之核酸腺病毒載體，其中由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)序列分開之VP16-RXR及Gal4-EcR編碼序列被插入由人泛素C啟動子控制之腺病毒穿梭載體。舉例來說，被IRES序列分開且置於合成性誘導性啟動子控制下之IL12的次單位p40及p35之編碼序列被插入泛素C啟動子之上游。在另一實例中，置於合成性誘導性啟動子控制下之TNF-α之編碼序列被插入泛素C啟動子之上游。
純化載體以提高濃度可藉由任何適當之方法完成，諸如藉由密度梯度純化(例如氯化銫(CsCl))或藉由層析技術(例如管柱或分批層析)。舉例來說，本發明之載體可進行二或三個CsCl密度梯度純化步驟。載體例如複製缺陷型腺病毒載體係刻意地自受到該複製缺陷型腺病毒載體感染之細胞純化，所採用之方法包含溶解經腺病毒感染之細胞，將溶解物加至層析樹脂，自該層析樹脂洗脫腺病毒，及收集包含腺病毒之組分。
在特定實施態樣中，該形成之原始病毒保存液係藉由再感染HEK 293細胞或CHO細胞加以擴增，及藉由CsCl密度梯度離心加以純化。
蛋白質基底標籤減少或消除高度特異性轉譯後修飾以供有效標靶之需要。可用之蛋白質基底標籤包括但不限於IGF2R標靶(IGF2(GILT)/IGF2工程化)、運鐵蛋白受體標靶(運鐵蛋白、TfR-標靶肽)、及Tat蛋白(其中細 胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)媒介Tat之內化)。
其他以溶酶體為標靶而可被用來作為標籤之蛋白質包括但不限於維生素D結合蛋白、葉酸鹽結合蛋白、乳運鐵蛋白、性激素結合球蛋白、運甲狀腺素蛋白、鞘脂激活蛋白原、視網醇結合蛋白、載脂蛋白B、載脂蛋白E、泌乳素、受體相關蛋白(在一實施態樣中不含HNEL序列)、天然運鐵蛋白及突變轉移(例如K225E/R651A突變或K225E/K553A突變)。
在一態樣中，本發明提供一種適合用於投予至人或非人之醫藥組成物，該醫藥組成物包含經試管內工程化以表現蛋白質之細胞群或載體例如腺病毒載體，其中該調製劑係適合腫瘤內投予。在另一實施態樣中，組成物例如醫藥組成物包含條件性表現蛋白質之載體。在一些實施態樣中，該組成物包含大約1x105或更多粒子單位(pu)之基因轉移載體。「粒子單位」係單一載體顆粒。在某些實施態樣中，該組成物包含約1x106粒子單位之基因轉移載體(例如約1x107或更多粒子單位、約1x108或更多粒子單位，或約1x109或更多粒子單位)。在其他實施態樣中，該組成物包含約1x1010或更多pu、1x1011或更多pu、1x1012或更多pu、1x1013或更多pu、1x1014或更多pu、或1x1015或更多pu之基因轉移載體，特別是病毒載體，諸如複製缺陷型腺病毒載體。組成物中所包含之基因轉移載體之粒子單位數可利用任何已知之適當方法測定，諸如此 處進一步描述之比較組成物之吸光度與基因轉移載體之標準溶液(即已知基因轉移載體濃度之溶液)的吸光度。
在一實施態樣中，該活化配體係選自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
本發明另提供包含活化配體諸如RG-115819、RG-115830或RG-115932之醫藥組成物，其中該組成物係適合腹膜內、經口或皮下投予。
在一實施態樣中，該活化配體係經口投予。在另一實施態樣中，該活化配體係非經腸投予。在另一實施態樣中，該活化配體係經腹膜內、皮下或肌肉內投予。
本發明之組成物可另包含醫藥上可接受之載劑。該載劑可為對於經工程化之樹突細胞、基因轉移載體或活化配體而言為適當之任何載劑。組成物之適當載劑係描述於美國專利第6,225,289號。該載劑通常為液體，但亦可為固體，或液體與固體成份之組合。該載劑係刻意地為醫藥上可接受(例如生理或藥學上可接受)之載劑(例如賦形劑或稀釋劑)。醫藥上可接受之載劑係廣為周知且易於使用。載劑之選擇將(至少部份)由該組成物中之特定成份及用於投予該組成物之特定方法決定。該組成物可另包含任何其他適當之成份，特別是為了增強該組成物之穩定性及/或彼之終用途。因此，本發明之組成物有各式各樣之適當調製劑。
適合用於經口投予之調製劑包括(a)液體溶液，諸如有效量之活性成分溶解於稀釋劑中，諸如水、鹽水或柳 橙汁，(b)膠囊、小袋或錠劑，各包含呈固體或顆粒形式之預先決定量之活性成分，(c)在適當液體中之懸浮液，及(d)適當之乳液。錠劑形式可包括一或多種乳糖、甘露醇、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化矽、交聯羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、色素、稀釋劑、緩衝劑、潤濕劑、保存劑、添味劑及藥學上相容之賦形劑。含錠形式可包含有味道之活性成分，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍，以及包含該活性成分於惰性基質(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)之錠劑，及除活性成分之外包含該領域已知之賦形劑的乳液、膠及該類似物。
適合經吸入投予之調製劑包括氣霧調製劑。該氣霧調製劑可被置於加壓可接受之推進劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮及該類似物。它們亦可被調製成未經加壓之製劑，以自噴霧器或霧化器投藥。
適合非經腸投予之調製劑包括水性及非水性之等張無菌注射溶液，該溶液可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調製劑與目標接受者之血液等張之溶質，及可包括懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑及保存劑之水性及非水性無菌懸浮液。該調製劑可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可被儲存於僅需在立即使用前加入無菌液體賦形劑例如水以供注射之冷凍乾燥(凍乾)狀態。臨時性之注射溶液及懸浮液可自無菌粉末、顆粒及先前描述之錠劑種類製備。
適合肛門投予之調製劑可藉由混合該活性成分與各種基質諸如乳化基質或水溶性基質以製備為栓劑。適合陰道投予之調製劑可呈現陰道栓(pessaries)、棉條、乳膏、凝膠、糊料、泡沫或噴霧製劑，該製劑除活性成分以外還包含該領域已知為適當之載劑。
此外，該組成物可包含額外之治療性或生物活性劑。舉例來說，可包含用於治療特定適應症之治療因子。控制發炎之因子諸如異丁苯乙酸(ibuprofen)或類固醇可為該組成物之一部分，以減少與活體內投予該基因轉移載體及生理緊迫相關之腫脹及發炎。免疫系統抑制劑可與該組成物方法一起投予以減少對該基因轉移載體本身或與疾病相關之任何免疫反應。或者，免疫增強劑可被包含於該組成物中以上調身體對抗疾病之自然防禦。另外，細胞介素可與該組成物一起投予以吸引免疫效應細胞至腫瘤部位。
在此處描述之特定實施態樣中，本發明提供一種治療腫瘤之方法，該方法包含下列按順序之步驟：a.經腫瘤內投予經試管內工程化之免疫細胞或TSC群至哺乳動物，及b.對該哺乳動物投予治療有效量之活化配體。
在一實施態樣中，該活化配體係在與包含經試管內工程化之細胞或載體例如腺病毒載體之組成物實質上相同的時間投予，例如在投予該細胞或載體組成物之前或之後的1小時內。在另一實施態樣中，該活化配體係在投予該試管內細胞或載體之後大約24小時或不到24小時之內投予 。在又一實施態樣中，該活化配體係在投予該經試管內工程化之細胞或載體之後大約48小時或不到48小時之內投予。在另一實施態樣中，該配體係RG-115932。在另一實施態樣中，該配體係以大約1至50毫克/公斤/天之劑量投予。在另一實施態樣中，該配體係以大約30毫克/公斤/天之劑量投予。在另一實施態樣中，該配體係每天投予共7至28天。在另一實施態樣中，該配體係每天投予共14天。在另一實施態樣中，大約1x106至1x108細胞係經投予。在另一實施態樣中，大約1x107細胞係經投予。
用語「個體」係指哺乳動物。哺乳動物包括人、齧齒動物、猴及其他動物，其中以人或小鼠為較佳。其他哺乳動物包括獸醫動物，諸如犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊、豬及該類似動物。
此處之用語「蛋白質表現」包括但不限於轉錄、轉錄後、轉譯及/或轉譯後。
本發明亦包括一種增加蛋白質之mRNA或蛋白質表現之方法，該方法包含產製條件性表現該蛋白質之載體，及添加活化配體，藉此誘發該蛋白質之表現，其中該載體另包含一或多個與編碼該蛋白質之多核苷酸序列連接之調節序列，其中該一或多個調節序列及/或信號肽增進該蛋白質之表現。本發明之各種調節區包括但不限於5'非轉譯區(5'UTR)、3' UTR或二者皆已被描述。在一實施態樣中，該5' UTR係5U2。5U2係融合犬SERCA2內含子2，其具有突變假定一致之poly-A位點，位於5'端側之外顯子2 剪接供點及位於3'端側之外顯子3剪接受點，接著一部分之牛酪蛋白5'UTR之部分。在另一實施態樣中，該3'調節區係SV40或hGH之聚腺苷酸化信號。
本發明另支持以條件性表現受到關注之基因的經活體外工程化之細胞作為創新方式以有用且高效地治療人疾病之治療性應用。
在此實施態樣中，該載體係以未包裝於細胞中之形式被投予至個體。
在一實施態樣中，細胞非與該載體經腫瘤內投予。
在另一實施態樣中，本發明之不包含於細胞內之載體係於細胞投予之同時、之前或之後投予。
在一實施態樣中，每次投予載體週期之劑量係至少約1.0x109病毒粒子。在另一實施態樣中，每次投予載體週期之劑量係至少約1.0x1010病毒粒子。在另一實施態樣中，每次投予載體週期之劑量係約1.0x109至約1.0x1013病毒粒子。在另一實施態樣中，每次投予載體週期之劑量係約1.0x1010至約1.0x1013病毒粒子。在另一實施態樣中，每次投予載體週期之劑量係約1.0x1010、約1.0x1011、約1.0x1012或約1.0x1013病毒粒子。
活化配體之劑量係約5至100毫克/天，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100毫克/天。在一實施態樣中，該活化配體係以每天至少一次投予。在另一實施態樣中，該活化配體係以每天一次投予約14天。
在一實施態樣中，至少二種載體劑量(例如約1x1011及1x1012)係與至少三種不同的活化配體劑量(例如約5毫克/天至約100毫克/天)組合使用。
該領域之一般技藝人士將能最佳化劑量以在各種活化配體活化之程度下，提供有效之載體血漿量之範圍。
在一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而改變。在另一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而減少。在另一實施態樣中，投予至個體之活化配體之劑量係隨著腫瘤內載體投予週期內之活化配體的投予時間而增加(逐步增加)。
在一實施態樣中，個體係經2、3、4、5、6、7、8、9或10次載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經3至7次載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經4至6次載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經5或6次載體投予周期之治療。在另一實施態樣中，個體係經6次載體投予周期之治療。
在一實施態樣中，每次載體投予周期之間係相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。在另一實施態樣中，每次載體投予週期之間係相隔4周。
在一實施態樣中，每個隨後之載體投予周期的載體劑量係經改變。在另一實施態樣中，每個隨後之載體投予周期的載體劑量係經減少。在另一實施態樣中，每個隨後之 載體投予周期的載體劑量係經增加。
在一實施態樣中，本發明亦提供包含醫藥上可接受之載劑及本發明之不包含於細胞內之載體之醫藥組成物。適當載劑包括但不限於鹽水、蒸餾水、氯化鈉溶液、氯化鈉及無機鹽之混合物或彼等之類似混合物、物質溶液諸如甘露醇、乳糖、葡聚糖及葡萄糖之溶液、胺基酸溶液諸如甘胺酸及精胺酸之溶液、有機酸溶液或鹽溶液與葡萄糖溶液之混合物、水性及非水性之等張無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、螯合劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調製劑呈等張性之溶質，及可包括懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑及保存劑之水性及非水性之無菌懸浮液。該調製劑可存在於單位劑量或多劑量密封容器中，諸如安瓿及小瓶，且可被儲存於僅需在立即使用前加入無菌液體載劑例如水以供注射之冷凍乾燥(凍乾)狀態。
在一實施態樣中，本發明之多核苷酸係包含於宿主細胞內。在一實施態樣中，該宿主細胞係選自哺乳動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、線蟲細胞、昆蟲細胞、魚細胞、植物細胞、禽細胞、真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、無脊椎動物宿主細胞、脊椎動物宿主細胞、酵母菌細胞、斑馬魚細胞、雞細胞、天竺鼠細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、貓細胞、犬細胞、牛細胞、山羊細胞、乳牛細胞、豬細胞、馬細胞、綿羊細胞、類人猿細胞、猴細胞、黑猩猩細胞或人細胞。
在一實施態樣中，該宿主細胞不是心肌細胞或肌細胞 。
宿主細胞轉形係該領域所廣為周知，可利用多種方式達成，包括但不限於電穿孔、病毒感染、質體/載體轉染、非病毒載體媒介性轉染、土壤桿菌(Agrobacterium)媒介性轉形、微粒撞擊及該類似方法。所欲基因產物之表現涉及在適當條件下培養該經轉形之宿主細胞及誘導該經轉形之基因的表現。原核及真核細胞之培養條件及基因表現程序係該領域所廣為周知。收集細胞，根據基因產物特定程序分離該基因產物。
若此處所引用之任何參考文獻與本說明書之任何揭示或建議之間有所衝突，就本發明之目的而言應以後者為主。
此處引用之所有專利、專利申請案及公開資料係以參照方式整體完整納入此處。
應了解前面描述之實施態樣及範例並非意圖在任何方面限制本發明之範圍，而且此處所提之權利要求範圍係意圖包含不論是否在此處明白提出之所有實施態樣及範例。
2008年10月8日提出之美國專利申請案12/247,738(標題為「經工程化之樹突細胞及治療癌之用途」)現以參照方式整體納入此處。2008年9月29日提出之美國專利申請案12/241,018(標題為「供生物治療性分子表現之治療性基因開關建構體及生物反應體及彼等之用途」)亦以參照方式整體納入此處。
本發明之實施態樣亦包括下列(其中“E”代表「實施 態樣」)：
E1.一種誘導、調節或增強哺乳動物之紅血球生成素(EPO)表現之方法，其中該方法包含(a)投予腺病毒相關病毒至該哺乳動物，其中該病毒包含編碼EPO之多核苷酸；及(b)投予活化配體，該活化配體誘導該編碼EPO之病毒多核苷酸表現EPO，其中該腺病毒相關病毒係經肌肉內投予，其中該腺病毒相關病毒另包含基因開關，其中該基因開關包含與啟動子可操作性連接之至少一個轉錄因子序列，其中由該至少一個轉錄因子序列編碼之至少一個轉錄因子係配體依賴性轉錄因子，其中該腺病毒相關病毒另包含與該編碼EPO之多核苷酸可操作性連接之第二啟動子，其中該第二啟動子係於投予活化配體之後由該至少一個配體依賴性轉錄因子活化。
E2.如實施態樣E1之方法，其中該哺乳動物係人。
E3.如實施態樣E1或E2之方法，其中EPO之表現係藉由控制該經投予之活化配體之劑量加以誘導、調節或增強。
E4.如實施態樣E1至E3之任一者之方法，其中活化配體係以足以誘導或維持正常生理範圍內之EPO表現量的劑量投予。
E5.如實施態樣E1至E4之任一者之方法，其中編碼 EPO之多核苷酸包含與SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8(人EPO)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E6.如實施態樣E1至E5之任一者之方法，其中該哺乳動物之血容比或血中紅血球的體積百分比增加。
E7.一種包含編碼基因開關之多核苷酸之載體，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該編碼一或多種蛋白質之多核苷酸係與啟動子可操作性連接，該啟動子係由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
E8.如實施態樣E7之之載體，其中該一或多種蛋白質係人蛋白質。
E9.如實施態樣E7或E8之載體，其中該載體係病毒載體。
E10.如實施態樣E9之載體，其中該病毒載體係選自腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、痘病毒、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、雙生病毒、偽狂犬病病毒、小病毒 或花椰菜花葉病毒載體。
E11.如實施態樣E7至E10之任一者之載體，其中該基因開關係以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關。
E12.如實施態樣E7至E11之任一者之載體，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E13.如實施態樣E7至E11之任一者之載體，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E14.如實施態樣E7至E13之任一者之載體，其中該第一轉錄因子序列與該第二轉錄因子序列係由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)連接。
E15.如實施態樣E7至E14之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：9(人髓磷脂鹼性蛋白)所編碼之胺基酸具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E16.如實施態樣E7至E15之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：10(人C1酯 酶抑制劑)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E17.如實施態樣E7至E16之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：11(艾卡拉肽(ecallantide))具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E18.如實施態樣E7至E17之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15(前列腺素合成酶)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E19.如實施態樣E7至E17之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：17(GLP-1)或SEQ ID NO：18(GLP-2)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E20.如實施態樣E7至E17之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：19(脂聯素(adiponectin))具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E21.如實施態樣E7至E17之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：20(瘦體素(leptin))具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E22.如實施態樣E7至E17之任一者之載體，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：21(CFTR)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E23.一種產製表現一或多種蛋白質之細胞群之方法，其中該方法包含使用條件性表現一或多種蛋白質之重組載體改質該等細胞，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係由該配體依賴性轉錄因子活化，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
E24.如實施態樣E23之方法，其中該一或多種蛋白質係人蛋白質。
E25.如實施態樣E23或E24之方法，其中該載體係病毒載體。
E26.如實施態樣E25之方法，其中該病毒載體係選自腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、痘病毒、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB( Epstein-Barr)病毒、雙生病毒、偽狂犬病病毒、小病毒或花椰菜花葉病毒載體。
E27.如實施態樣E23至E26之任一者之方法，其中該基因開關係以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關。
E28.如實施態樣E23至E27之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E29.如實施態樣E23至E27之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E30.如實施態樣E29之方法，其中該第一轉錄因子序列與該第二轉錄因子序列係由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)連接。
E31.一種經條件性表現一或多種蛋白質之重組載體改質之細胞群，其中該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)編碼一或多種選自C1酯酶抑 制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)之蛋白質之多核苷酸。
E32.如實施態樣E31之細胞群，其中該一或多種蛋白質係人蛋白質。
E33.如實施態樣E31或E32之細胞群，其中該載體係病毒載體。
E34.如實施態樣E33之細胞群，其中該病毒載體係選自腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、痘病毒、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、雙生病毒、偽狂犬病病毒、小病毒或花椰菜花葉病毒載體。
E35.如實施態樣E31至E34之任一者之細胞群，其中該基因開關係以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關。
E36.如實施態樣E31至E35之任一者之細胞群，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E37.如實施態樣E31至E35之任一者之細胞群，其中 該編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E38.如實施態樣E37之細胞群，其中該第一轉錄因子序列與該第二轉錄因子序列係由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)連接。
E39.一種治療哺乳動物之疾病之方法，該方法包含：(a)投予條件性表現一或多種蛋白質之細胞群及(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體；藉此誘導該一或多種蛋白質之表現，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
E40.一種治療哺乳動物之疾病之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因 子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質係選自C1酯酶抑制劑、激肽釋放素(kallikrein)抑制劑、緩激肽(bradykinin)B2受體抑制劑、前列腺素合成酶、升糖素樣肽1(GLP-1)、升糖素樣肽2(GLP-2)、脂聯素(adiponectin)、瘦體素(leptin)或囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。
E41.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係C1酯酶抑制劑且該疾病係選自血管性水腫、遺傳性血管性水腫、敗毒症、血凝過快、肺功能障礙、低血氧症、出血性胰炎、心肌梗塞、肺移植、創傷、燒傷或血管滲漏。
E42.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係激肽釋放素抑制劑且該疾病係選自血管性水腫、遺傳性血管性水腫、動脈粥狀栓塞症、冠狀動脈疾病、阿茲海默(Alzheimer)氏症、發炎性腸疾病、克隆(Crohn)氏病、血管滲漏、急性呼吸窘迫症候群、緩激肽媒介性發炎、或該接觸系統之疾病、狀況或病狀。
E43.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該 蛋白質係緩激肽B2受體抑制劑且該疾病係選自血管性水腫、遺傳性血管性水腫、緩激肽媒介性發炎、腎小球硬化、阿茲海默(Alzheimer)氏症、腦水腫、血管滲漏、急性呼吸窘迫症候群、疼痛、發炎、創傷、燒傷、休克、過敏或心血管疾病。
E44.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係前列腺素合成酶且該疾病係選自肺高血壓、肺動脈高血壓(PAH)、自發性肺動脈高血壓、家族性肺動脈高血壓、繼發性肺動脈高血壓、肺靜脈閉鎖症、肺毛細血管瘤、或新生兒持續性肺高血壓。
E45.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係升糖素樣肽1(GLP-1)且該疾病係糖尿病或其他代謝性疾病或病狀。
E46.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係升糖素樣肽2(GLP-2)且該疾病係糖尿病或其他代謝性疾病或病狀。
E47.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係脂聯素(adiponectin)且該疾病係糖尿病或其他代謝性疾病或病狀。
E48.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係瘦體素(leptin)且該疾病係糖尿病或其他代謝性疾病或病狀。
E49.如實施態樣E39或E40之方法，其中至少一種該蛋白質係囊腫性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)且該 疾病係囊腫性纖維化。
E50.一種治療哺乳動物之多發性硬化症之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質係選自髓磷脂鹼性蛋白(MBP)或干擾素β(IFN-B)。
E51.如實施態樣E50之方法，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：9(人髓磷脂鹼性蛋白)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E52.如實施態樣E50之方法，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：17(干擾素β)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E53.如實施態樣E50之方法，其中該一或多種蛋白質包含髓磷脂鹼性蛋白(MBP)及干擾素β(IFN-B)二者。
E54.如實施態樣E50至E53之任一者之方法，其中該一或多種蛋白質係人蛋白質。
E55.如實施態樣E50至E54之任一者之方法，其中該載體係病毒載體。
E56.如實施態樣E55之方法，其中該病毒載體係選自腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、痘病毒、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、雙生病毒、偽狂犬病病毒、小病毒或花椰菜花葉病毒載體。
E57.如實施態樣E50至E56之任一者之方法，其中該基因開關係以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關。
E58.如實施態樣E50至E57之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E59.如實施態樣E50至E57之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第 二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E60.如實施態樣E59之方法，其中該第一轉錄因子序列與該第二轉錄因子序列係由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)連接。
E61.一種治療哺乳動物之發炎性腸疾病或克隆氏病之方法，該方法包含：(a)對該哺乳動物投予條件性表現一或多種蛋白質之載體，該載體包含編碼基因開關之多核苷酸，其中該多核苷酸包含(1)至少一個與啟動子可操作性連接之轉錄因子序列，其中該至少一個轉錄因子序列編碼配體依賴性轉錄因子，及(2)與啟動子可操作性連接之編碼一或多種蛋白質之多核苷酸，該啟動子係經由該配體依賴性轉錄因子活化，(b)對該哺乳動物投予治療有效量之一或多種活化配體，藉此誘導該一或多種蛋白質之表現及治療該疾病，其中該一或多種蛋白質之一者係介白素10(IL-10)。
E62.如實施態樣E61之方法，其中該一或多種蛋白質之一者包含與SEQ ID NO：22(介白素10)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
E63.如實施態樣E61或E62之方法，其中該介白素10係人IL-10蛋白質。
E64.如實施態樣E61至E63之任一者之方法，其中該載體係病毒載體。
E65.如實施態樣E64之方法，其中該病毒載體係選自腺病毒、腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、痘病毒、桿狀病毒(baculovirus)、牛痘病毒、單純皰疹病毒、EB(Epstein-Barr)病毒、雙生病毒、偽狂犬病病毒、小病毒或花椰菜花葉病毒載體。
E66.如實施態樣E61至E65之任一者之方法，其中該基因開關係以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關。
E67.如實施態樣E61至E66之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在第一啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E68.如實施態樣E61至E66之任一者之方法，其中該編碼基因開關之多核苷酸包含在啟動子控制下之第一轉錄因子序列及第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列編碼之第一轉錄因子與由該第二轉錄因子序列編碼之第二轉錄因子交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之複合物。
E69.如實施態樣E68之方法，其中該第一轉錄因子序 列與該第二轉錄因子序列係由EMCV內部核糖體進入位點(IRES)連接。
E70.一種組成物，其包含如實施態樣E7至E22之任一者之載體或如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群及醫藥上可接受之載劑。
E71.如實施態樣E70之組成物，其係經系統性、靜脈內、腫瘤內、經口、腹腔內、肌肉內、脊柱內、腦內、脊椎鞘內、皮內或皮下投予。
E72.一種藥物，其包含如實施態樣E7至E22之任一者之載體或如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群及醫藥上可接受之載劑。
E73.如實施態樣E72之藥物，其係經系統性、靜脈內、腫瘤內、經口、腹腔內、肌肉內、脊柱內、腦內、脊椎鞘內、皮內或皮下投予。
E74.一種套組，其包含如實施態樣E7至E22之任一者之載體或如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群。
E75.如實施態樣E7至E22之任一者之載體或如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群及活化該基因開關之配體。
E76.如實施態樣E75之載體或細胞群及配體，其中該配體係二醯基肼。
E77.如實施態樣E76之載體或細胞群及二醯基肼配體，其中該二醯基肼係RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E78.如實施態樣E75之載體或細胞群及配體，其中該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
E79.如實施態樣E7至E22之任一者之載體、如實施態樣E23至E30及實施態樣E39至E69之任一者之方法、如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群，其中活化配體依賴性轉錄之配體係二醯基肼。
E80.如實施態樣E79之載體、方法或細胞群，其中該二醯基肼係RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E81.如實施態樣E7至E22之任一者之載體、如實施態樣E23至E30及E39至E69之任一者之方法、如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群，其中活化配體依賴性轉錄之配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
E82.一種套組，其包含如實施態樣E7至E22之任一者之載體或如實施態樣E31至E38之任一者之細胞群及配體。
E83.如實施態樣E82之套組，其中該配體係二醯基肼。
E84.如實施態樣E83之套組，其中該二醯基肼係RG-115819、RG-115830或RG-115932。
E85.如實施態樣E82之套組及配體，其中該配體係醯胺基酮或噁二唑啉。
實施例1 局部注射Ad-RTS-mIL12對於B16F0黑色素瘤模型中之局部及對側腫瘤之效果
我們探討以Ad-RTS-mIL12治療局部腫瘤(導致局部腫瘤生長消退)是否亦能在遠處腫瘤導致抗腫瘤活性。為達成此目的，我們在具有免疫活性小鼠(C57BL/6)之雙側腹區域發展黑色素腫瘤，並在活化配體存在下以Ad-RTS-mIL12治療右側腹之腫瘤。
六至八周齡之母鼠C57Bl/6係購自美國哈倫實驗室(Harlan Laboratories)。動物照顧及實驗程序係根據英創松(Intrexon)公司之機構動物照顧及使用委員會準則進行。
小鼠黑色素瘤(B16F0)細胞係購自美國菌種保存中心(ATCC)(維吉尼亞州馬納薩斯市(Manassas,VA))。B16F0細胞係生長於達爾柏克(Dulbecco)氏經改良之伊格爾(Eagle)式培養基(ATCC,Manassas,VA)。該DMEM添加熱不活化之胎牛血清(FCS)10%體積/體積、2毫莫耳L-麩醯胺酸(亞特蘭大生物(Atlanta Biologicals)公司，喬治亞州羅倫斯維爾市)、100 IU/毫升青黴素G及100微克/毫升鏈黴素。細胞於37℃、5% CO2中生長。所有細胞系接受例行檢測，並無發現黴漿菌污染。
總共45隻C57BL/6動物係於右側及左側後腹經皮下接種小鼠黑色素瘤B16F0(ATCC)1e5細胞/50ul。12天之後，當巨觀腫瘤可見時，該些動物經隨機分成四組各十 隻動物，如下表所示：無治療(第1組)、僅活化配體(第2組)、僅Ad-RTS-mIL12(1x1010 vp劑量，第3組)、及Ad-RTS-mIL12(1x1010 vp劑量)與存在於飼料中之活化配體(1000 mg/kg飼料，第4組)。
接受活化配體之世代係餵飼自由採食之與該活化配體RG-115932混合之小鼠飼料直到試驗結束。不接受活化配體之世代持續餵飼一般飼料。
載體係於腫瘤細胞接種後第12及19天經腫瘤內投予。每周測量三次每隻小鼠的腫瘤體積及體重直到試驗結束。當動物的累積腫瘤大小超過1000 mm3或顯示體重減輕>15%超過3天時，該動物被犧牲。在完成試驗時，所有剩餘之動物皆被安樂死。
腫瘤體積係利用公式LxW2/2計算。腫瘤大小係以平均值±SE顯示。統計分析利用雙尾t檢定實施。當p<0.05時，不同組別之間的差異被認為具有顯著性。
當右側腹之腫瘤達到平均體積44 mm3時，開始進行治療。以局部遞送而言，給予右側腫瘤二次相隔7天1e10 vp之Ad-RTS-mIL12腫瘤內注射。這些動物接受活化配體飼料(1000 mg/kg)。對照動物接受無任何處理或僅活化配體(1000mg/kg)或僅Ad-RTS-mIL12不加活化配體。在投予載體之前的24小時，該所示之世代接受活化配體(1000mg/kg)。每周評估三次這些動物的腫瘤變大或消退之任何徵候。如圖1A所示，僅接受活化配體處理或無處理之對照動物在細胞接種後21天的平均腫瘤體積分別為924±80 mm3及884±142 mm3。
相對地，經Ad-RTS-mIL12+活化配體治療之腫瘤的腫瘤體積為86±138 mm3，顯示相較於無治療之動物具有統計顯著性(p<0.0001)之~91%之腫瘤生長抑制。僅Ad-RTS-mIL12不加活化配體之腫瘤體積為565±305 mm3，與對照動物之間並無顯著差異(p<0.07)。這些資料顯示Ad-RTS-mIL12不加活化配體對腫瘤生長之影響很小，然而Ad-RTS-mIL12加上活化配體則具有顯著之抗腫瘤活性。
重要的是，右側腹腫瘤接受Ad-RTS-mIL12加上活化配體之動物顯示統計顯著性(p<0.005)抑制81%之未經注射之左側腹腫瘤之腫瘤生長(189±231 mm3)，相較於無治療對照組之未經注射之對側腫瘤(1019±233 mm)(圖1B)。然而，以Ad-RTS-mIL12不加配體治療之腫瘤而言，對側未經治療之腫瘤體積並無顯著減少。在僅接受 Ad-RTS-mIL12或僅活化配體治療之對照組中，經治療之腫瘤以及對側未經注射之腫瘤在腫瘤植入後21天持續加快生長。這些資料顯示，在以Ad-RTS-mIL12加配體治療原發性腫瘤後所發展出之對抗腫瘤細胞之系統性免疫反應可能是在遠處未經治療之腫瘤觀察到抗腫瘤效應之原因。
體重係作為本試驗之毒性指標測量。每周測量三次動物的體重直到試驗結束。經常觀測小鼠以得知有無任何不良反應及治療相關不良反應之明顯徵候。可接受之毒性係經定義為在試驗期間之平均體重減輕不到15%。此試驗中之所有治療皆耐受良好。最大平均體重減輕係在可接受之範圍內(<15%)(圖2)，沒有發現治療相關之死亡。然而，我們發現在所有組別均有散發性死亡。
已清楚確定的是，免疫系統能辨識腫瘤特異性抗原及清除惡性細胞(Brunda,M.J.et al.,J.Exp.Med.178：1223-1230(1993)、Brunda,M.J.et al.,Cancer Chemother.Pharmacol.38(Suppl)：S16-S21(1996)、及Golab J.et al.,Int.J.Mol.Med.3(5)：537-44(1999))。然而，仍然難以駕馭免疫系統以用於癌治療之治療性目的。此策略涉及使用腫瘤內注射能調節IL-12表現之複製缺陷病毒載體(即Ad-RTS-mIL12)，以在不誘導系統性毒性之情況下減少腫瘤生長(Komita,H.et al,Cancer Gene Ther.16：883-91(2009))及活化免疫系統以殺滅遠處和轉移性癌。
在此試驗中，在已建立之腫瘤內注射之Ad-RTS- mIL12在活化配體存在下抑制B16F0模型中之腫瘤生長。在此處，使用雙側建立之皮下B16F0腫瘤C57BL/6小鼠模型顯示，單側腫瘤內注射Ad-RTS-mIL12造成該經注射之腫瘤及對側未經注射之腫瘤二者的生長顯著減少。此抗腫瘤效應顯著高於僅以活化配體治療或僅以Ad-RTS-mIL12治療不加活化配體之動物。這些結果顯示直接遞送Ad-RTS-mIL12至腫瘤微環境提供治療性好處，且產生對抗轉移性癌細胞之保護性抗腫瘤免疫作用。
實施例2 IL-12與IFN α之組合治療
目前的癌免疫療法在臨床上提供有限之成功，因此需要創新策略以進一步增進抗腫瘤免疫反應之有效性。此試驗評估腫瘤內(i.t.)投予具有新穎之Rheoswitch Therapeutic System®(RTS®)以調節性表現小鼠IL-12或IFNa的腺病毒(Ad)之抗腫瘤活性，該RTS系統係可誘導之啟動子系統。經口投予小分子活化配體(AL)INXN-1001調節IL-12於Ad-RTS-mIL-12及IFNa於Ad-RTS-mIFNa之表現。該單獨或經組合腫瘤內投予之Ad-RTS-mIL-12及Ad-RTS-mIFNa的IL-12及IFNa之調節性表現及治療效益係於同源Lewis肺癌(LLC)及同源乳癌(4T1)模型中評估。
在LLC模型中，相較於對照未經治療之腫瘤，每日僅給予經口AL治療(於飼料中投予1000 ppm，代表每日劑 量~225 mg/kg/day)或僅經腫瘤內給予細胞介素基因療法但無AL存在不導致顯著抑制腫瘤生長。相反地，腫瘤內注射1010 vp Ad-RTS-mIL-12或Ad-RTS-mIFNa及每日口服AL到第25天導致顯著之腫瘤生長抑制(分別為72及71%，p<0.05)。值得注意的是，以Ad-RTS-mIL-12與Ad-RTS-mIFNa之組合和口服AL治療LLC腫瘤相較於各單獨治療導致顯著之抗腫瘤效應(97%生長抑制，p<0.05)，而無觀察到體重變化之明顯毒性。在4T1模型中，腫瘤內投予1010 vp之Ad-RTS-mIL-12加AL或Ad-RTS-mIFNa加AL相較於對照未治療之腫瘤到第34天導致58及53%之腫瘤生長抑制(p<0.05)。值得注意的是，以Ad-RTS-mIL-12加AL與Ad-RTS-mIFNa加AL二者之合併治療導致增強之抗腫瘤活性，即80%之生長抑制。這些資料顯示利用於Ad載體中經RTS調節之IL-12及IFNa併用AL之組合治療策略誘導對抗侵略性小鼠腫瘤之有效治療活性。未來試驗將探討IL-12及IFN α二者在上述之腫瘤模型中展現彼等之抗腫瘤效應之機轉。
介白素12(IL-12)是一種用來治療多種感染性及惡性疾病之強力多效性細胞介素。IL-12抗腫瘤活性係由直接腫瘤細胞細胞毒性、抗血管生成特性及增進免疫調節活性包括活化自然殺手細胞、CD4+ T細胞及CD8+ T細胞所媒介。雖然具備這些抗腫瘤效應，系統性輸注重組IL-12於人導致嚴重之系統性毒性，因此大幅限制彼之臨床用途。
干擾素α(IFNa)是一種具有強效之抗病毒及抗腫瘤效應之細胞介素。投予IFNa刺激T細胞及自然殺手細胞增生，導致腫瘤細胞細胞毒性、抗血管生成及增加主要組織相容性複合體(MHC)、腫瘤抗原及黏附分子之表現。與IL-12類似的是，高量之IFNa亦顯示嚴重之不良反應，包括類流感症候群、嚴重噁心、疲倦及沮喪。
因此，很明顯地需要控制這些細胞介素之表現量。RTSTM(Rheoswitch Therapeutic System)是一種新穎之調節系統，其利用活化配體INXN-1001來控制基因表現，該活化配體係口服生物可利用之小分子藥物。在利用RTS技術以控制細胞介素表現方面，我們先前已在許多臨床前動物模型中利用經Ad-RTS-IL-12轉導之樹突細胞證實腫瘤生長減少，最近更直接在腫瘤內(IT)注射Ad-RTS-IL-12。此導致開始進行直接注射Ad-RTS-IL-12至第III/IV期惡性黑色素瘤病患之腫瘤病灶的第一期臨床試驗。
組合療法在臨床前模型及臨床上顯示很高之潛力。因此在本試驗中，我們探討Ad-RTS-IL-12與Ad-RTS-IFNa於二種不同的同源腫瘤模型(Lewis肺癌(LLC)及4T1乳癌)中經腫瘤內共投之協同效應。
RheoSwitch Therapeutic System(RTS)包含三種基本成份：(1)誘導性啟動子、(2)配體誘導性轉錄因子及共活化伴、(3)RheoSwitch活化配體(AL)。
在無配體存在下，該開關蛋白質複合物提供「關閉」信號。相反地，當配體存在時，該複合物改變構形及提供使 標靶基因表現之劑量依賴性「開啟」信號。在活體內，該經口投予之AL在24小時內啟動基因表現，當停止投予AL時，基因表現在約24小時內回復至基準量。
LLC及4T1細胞係經感染複數為100之Ad-RTS-murine IL12或Ad-RTS-murine IFNa過渡性轉導。為了誘導基因表現，活化配體INXN-1001係以75nM之濃度添加於培養基或以0.1% DMSO處理以作為對照。於48小時收集上清液，細胞介素之量由ELISA檢測。n=3，平均值±標準差(s.d.)。結果顯示於圖3。
LLC及4T1細胞係經感染複數為100之Ad-RTS-murine IL12或Ad-RTS-murine IFNa過渡性轉導。為了誘導基因表現，活化配體INXN-1001係以75nM之濃度添加於培養基或以0.1% DMSO處理以作為對照。於48小時收集上清液，細胞介素之量由ELISA檢測。n=3，平均值±標準差(s.d.)。結果顯示於圖。於圖4箭頭標示之特定天數經腫瘤內投予腺病毒。對照組包括經活化配體(INXN-1001)處理或不處理之PBS及Ad-RTS-Luc注射小鼠，這些被當作對照組因為對腫瘤大小無影響。腫瘤抑制之百分比係如圖所示，其顯著低於對照組及單一細胞介素治療組(p<0.01)。n=5，平均值±標準誤(s.e.m.)。
在分開之試驗中，我們經皮下途徑注射1x105 4T1癌細胞至小鼠。當腫瘤達到可觸知之大小時，小鼠經隨機分組至單獨或組合腫瘤內投予Ad-RTS-IL-12及/或Ad-RTS-IFNa(1010 vp/小鼠/載體)之治療組。在腫瘤內注射後48 小時收集血清及腫瘤。對照組包括經INXN-1001活化配體處理或不處理之PBS及Ad-RTS-Luc注射小鼠，這些被當作對照組因為對腫瘤大小無影響。INXN-1001係經調製於辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)並藉由經口餵食管每天遞送。在循環及腫瘤內之細胞介素量係利用血清及腫瘤均質液以ELISA檢測。n=4，平均值±標準誤(s.e.m.)。結果顯示於圖5。
LLC及4T1(此週稍晚之結果)細胞係經各載體濃度500 MOI之Ad-RTS-IL-12及Ad-RTS-IFNa單獨或組合轉導。經轉導之細胞在75 nm INXN-1001或0.1% DMSO存在時培養48小時。細胞培養上清液係經收集以用於細胞介素分析。亦收集細胞以利用流式細胞分析MHC第一型分子之表現。n=2至3，平均值±標準差(s.d.)。結果顯示於圖6。
資料顯示IL12與IFNa細胞介素抑制腫瘤生長之協同效應。雖然IL-12先前已經顯示可減少腫瘤生長，但其與Ad-RTS-IFNa之組合顯著增進療效，如在LLC及4T1模型中腫瘤生長減緩所示。值得注意的是，在細胞介素表現後並未觀察到毒性，顯示IL12及IFNa之表現受到Rheoswitch系統之調節。在機轉方面，IFNa引發MHC-I表現於腫瘤細胞上，因此導致加劇之細胞死亡。額外之MOA試驗目前正在進行。
整體來說，以安全、受控制及可誘導之方式遞送細胞介素之組合代表治療常見於人族群之侵略性腫瘤的新穎策 略。
實施例3 方法
下列實施例4至8中之試驗係如下述實施。
動物
六至八週齡之C3H/H及Balb/c母鼠係購自哈倫實驗室(Harlan Laboratories)。動物係依據英創松(Intrexon)公司之實驗動物照顧及使用委員會之規定照顧及處理。動物係經餵飼水及購自哈倫實驗室之不含紫花苜蓿之18%蛋白質飼料。
所有程序係於麻醉動物進行。在注射DNA前1小時，於股四頭肌周圍之區域預先注射50 U(終體積50μl)之Hylanex(rHuPH20,Halozyme)。切開一小切口以暴露股四頭肌，利用裝有29G針頭之結核菌素針筒注射終體積100微升之250微克之臨床前等級RTS-hEPO質體。儘快將切口縫合。DNA係藉由插入肌肉中之2針頭電極(5mm)之協助被電穿孔，針頭被插入DNA注射位置之兩側。八次50V/cm(20 ms,1Hz)之脈衝被遞送以增進基因轉移。
配體
RG-115932配體係經調製於動物飲食中，並以 1000mg/kg之濃度給予。至於OG配體則以10mg/ml被調製於辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)。
肌肉內投予AAV-HuEPO(0034A、0034B)
動物係經麻醉，彼等之股四頭肌係經可視化且注射部位經無菌處理。利用0.5毫升之胰島素針筒及29.5G之針頭注射小鼠。每隻動物係經注射100微升體積中共1011病毒基因組。在此步驟後，動物被安置於籠中，觀察到牠們能正常行走。
蛋白質分析
血漿樣本係利用酶連接免疫吸附測定(ELISA)(StemCell Technologies,#01630)測試人紅血球生成素之存在。
血容比測量
小鼠經眼窩採血，樣本經Heska CBC血液分析儀測量。
實施例4 在單次肌肉內投予AAV-RTS-HuEpo後評估人紅血球生成素於小鼠之療效
「AAV-RTS-HuEPO」係指腺病毒相關病毒載體-RheoSwitch®治療系統-人EPO。該信號肽序列、人紅血球 生成素序列及終止密碼子之核酸序列係如SEQ ID NO：8所示。
此試驗之目的在於測定由AAV媒介之肌肉內(IM)遞送HuEPO轉基因至小鼠是否能導致可測量之huEPO表現及血容比(HCT)之同時增加。二個AAV-huEPO載體0034A及0034B(圖7A及7B)係利用二個小鼠品系C3H/H及BALB/c測試。二個AAV載體中之huEPO表現卡匣皆在誘導性啟動子之控制下。血漿之HuEpo量及HCT係於每週測量。
在試驗開始時，小鼠經採血以得到基準血容比，然後每隻動物經肌肉內投予1011 AAV-HuEPO病毒基因組。從投予AAV當天開始，動物接受含活化配體之飼料(18-1000)。對照動物接受載體投予及正常飼料(不含活化配體)，或接受單獨載具之IM投予(食鹽水)及有或無活化配體。所有組別每7天測量一次HCT。二個接受HuEPO載體及有活化配體存在之組別皆顯示上升之血容比。
如圖8所示，相較於對照組，0034A顯示40% HCT增加及0034B顯示25% HCT增加。在試驗第29天時，活化配體被移除，所有組別皆接受正常飼料。重要的是，在移除該活化配體之後二星期，血容比之量下降至正常範圍。在第50天再度給予含配體之飼料又導致HCT增加，在第64天再度移除導致HCT下降。
這些資料顯示，在單次IM投予AAV-huEPO載體後經調節之HuEPO表現媒介生理變化。在活化配體存在下， 高量之HuEPO係經表現而導致HCT增加。當活化配體被移除時，HCT下降至正常範圍之內。HuEPO表現及後續之HCT增加可藉由導入該活化配體被誘導至少二次。
實施例5
HuEPO於C3H/H及Balb/c小鼠之調節表現
經治療之C3H/H小鼠的血漿中有無HuEPO存在係由ELISA檢測。檢測二種AAV-huEPO載體之HuEPO表現。如圖9所示，HuEPO表現量高於正常人生理量之四倍(正常人EPO量為4至24mU/ml)。經0034A處理之動物的血漿HuEPO量相較於經0034B載體處理之動物的血漿HuEPO量高出十倍。在對照動物未檢測到HuEPO之表現。HuEPO表現量在第7及14天之間達到高峰，並自第14至28天維持穩定。
重要的是，HuEPO之表現與HCT之增加成正比，並在誘導huEPO表現及可測量之HCT改變之間展現預期之延遲時間(即紅血球細胞反應EPO而增生所需之時間)。配體於第29天移除。第35、42及50天皆未檢測到血漿中之HuEPO(載體處理組及對照組)。第50天時，相關動物回復含有活化配體之飼料。HuEPO表現又再度被檢測到類似第一次誘導週期時觀察到之量。配體於第64天移除。HuEPO表現在第71天無法被檢測到，在第85天僅0034A載體處理組無法檢測到。第85天之0034B載體處理組檢測到低量之HuEPO表現。
如圖9所示之相同試驗係於正常Balb/c小鼠平行實施(圖10)。
實施例6
HuEPO在單次IM注射AAV-HuEPO後經調節之表現
動物在第0天經IM注射投予1011vp之AAV-HuEPO(0034B)。在試驗的頭21天，以經口餵食管(OG)每天遞送配體。經治療小鼠之血漿中有無HuEPO存在係以ELISA檢測，HuEPO表現和HCT變化成正比。如圖11所示，HCT量及HuEPO表現在第21天達到高峰。第21天停止遞送配體，huEPO表現及HCT在無配體存在時展現急遽下降。第35天樣本之HuEPO ELISA資料在製作圖11時尚未取得。
每個時間點之各動物及組別之平均HCT係與基準值(時間0，投藥前)比較。如圖12A及12B所示，經0034A治療之C3H/H小鼠在第14天及Balb/c小鼠在第28天之HCT增加1.7倍。在投予0034B後，C3H/H小鼠之HCT增加1.4倍，Balb/c小鼠增加1.6倍。在活化配體移除後，HCT下降至正常範圍之內。
實施例7
由活化配體劑量調節HuEPO之表現
動物經採血以測量基準期HCT量，之後每隻動物經IM投予1011AAV-HuEPO病毒基因組(0034A)。動物自 投予AAV當天開始接受含活化配體之飼料，其中活化配體之濃度為1000 mg/kg(18-1000)、250 mg/kg(18-250)、100 mg/kg(18-100)、50 mg/kg(18-50)、或0 mg/kg(18-0)。對照動物接受載體投予及正常飼料(不含活化配體，18-0)，或接受單獨載具之IM投予(食鹽水)及有(18-1000)或無(18-0)活化配體。每7天測量一次所有組之HCT及HuEPO表現量。
如圖13所示，在基準期投藥前之樣本中未檢測到HuEPO。在第7至21天檢測HuEPO之表現。在最低濃度之活化配體組(18-50)中，HuEPO表現在第7天無法被檢測到(該測試之敏感性限值為8 mU/ml)，但在第14及21天可被檢測到，雖然其量低於接受較高活化配體劑量之動物。在接受二個最高濃度之活化配體(18-1000及18-250)之世代中，HuEPO達到類似之高峰表現量。接受中間濃度之活化配體(18-100)的動物血漿之HuEPO量在第7天顯示較低之HuEPO表現，但在第14及21天達到和18-1000及18-250動物類似之量。HCT之變化與HuEPO之表現量呈正比。在第21天移除配體後，HCT量下降至正常範圍之內。
這些資料顯示HuEPO之表現在單次肌肉內投予AAV載體後受到調節。重要的是，HuEPO之表現量係由活化配體之劑量調節。這些資料顯示HuEPO之表現可藉由調整活化配體之濃度而維持在正常生理範圍之內，此具有臨床應用性。
實施例8 HuEPO在單次IM注射AAV-HuEPO後經調節之表現
共25隻¾腎切除之C3H/H小鼠係購自塔可尼克(Taconic)公司。動物經採血以測量基準期HuEPO量及HCT。該所示世代在試驗期間接受含RG-115932活化配體之飼料(18-1000，1000 mg/kg飼料)。在第0天，RTS-HuEPO質體DNA(0034D)係經由預先經透明質酸酶(Hyase)(購自Halozyme公司之50 U rHUPH20)處理一小時後之開放肌肉IM注射加上電穿孔(EP)投予。動物世代包括1)HuEPO DNA+EP+Hyase+配體、2)HuEPO DNA+EP+Hyase不加配體、3)HuEPO DNA+EP不加Hyase+配體、4)食鹽水+EP+Hyase+配體、及5)每周經IP注射二次重組人EPO蛋白質治療之動物。
如圖14所示，高HuEPO表現係於第8天之血漿中檢測到，並在第22天下降至較低之正常範圍。HCT之變化與血漿之HuEPO量呈正比。在第30天再投予該載體後，並未在血漿中檢測到HCT之變化。
HuEPO質體DNA(0034C，RTS-hEpo-IRES-fLuc)係經遞送至Balb/c小鼠(股四頭肌，每隻動物200微克之DNA)，之後實施電穿孔。在DNA遞送及電穿孔之前一小時，動物亦經玻璃酸酶(購自Halozyme公司之50 U rHUPH20)或僅食鹽水處理。所有動物在此試驗期間經由飼料接受活化配體。
於DNA遞送前及遞送後第4天及第7天測量小鼠之HCT。如圖15所示，接受huEPO質體加玻璃酸酶前處理之動物在第7天檢測到HCT增加40%，然而接受huEPO但無玻璃酸酶前處理之動物在第7天顯示HCT增加25%。
應了解前面描述之實施態樣及範例並非意圖在任何方面限制本發明之範圍，而且此處所提之權利要求範圍係意圖包含不論是否在此處明白提出之所有實施態樣及範例。
參考文獻
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圖1A及1B之折線圖說明Ad-RTS-mIL12與活化配體對C57Bl6小鼠之對側黑色素瘤(B16F0)腫瘤之療效。圖1A顯示在動物右側腹之經治療之腫瘤的體積。圖1B顯示在動物左側腹之未經治療之腫瘤的體積。腫瘤大小係以平均值±SE顯示。
圖2之折線圖說明雙側腹荷黑色素瘤之小鼠的體重變化，包括經Ad-RTS-mIL 12及活化配體之治療後。
圖3之柱狀圖說明mIL12及mIFN α於LLC及4T1細胞系中經試管內調節之表現。
圖4A及4B之折線圖說明mIL12及mIFN α於LLC及4T1細胞系中之效應。
圖5之柱狀圖說明IL12及IFN α於小鼠體內之系統性及腫瘤內效應。
圖6之組合折線及柱狀圖說明IL12及IFN α之共表現增強4T1及LLC癌細胞中MHC第一型分子之表現。
圖7A、7B、7C及7D分別說明載體0034A、0034B、0034CB及0034D之載體圖。0034A攜帶標準開關系統元件。0034B攜帶經改質之調節啟動子。
圖8之折線圖說明C3H/H小鼠在經肌肉內(IM)投予AAV-HuEPO後之生理反應。
圖9之組合折線圖及柱狀圖顯示經調節之HuEPO表現對C3H/H小鼠血容比之影響。
圖10之組合折線圖及柱狀圖顯示經調節之HuEPO表現對Balb/c小鼠血容比之影響。
圖11之組合折線圖及柱狀圖顯示在單次IM注射AAV-HuEPO後，經調節之HuEPO表現對血容比之影響。
圖12A及12B之折線圖顯示在經IM投予AAV-HuEPO後血容比之絕對值變化。
圖13之組合折線圖及柱狀圖顯示經活化配體劑量調節之HuEPO表現對血容比之影響。
圖14之組合折線圖及柱狀圖顯示HuEPO之表現對3/4腎切除C3H/H小鼠血容比之影響。
圖15之柱狀圖顯示經IM投予至Balb/c小鼠之RTS-HuEPO的表現對血容比之影響。
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<400> 15
<210> 16
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
<210> 17
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<400> 17
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<211> 244
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<400> 20
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<211> 1480
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
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<211> 178
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22

Claims (16)

  1. 一種供使用之腺病毒相關病毒(adeno-associated virus)，該腺病毒相關病毒包含編碼紅血球生成素(EPO)之多核苷酸，該供使用之腺病毒相關病毒係用於誘導、調節或增強哺乳動物之EPO表現之方法，其中該方法包含(a)投予腺病毒相關病毒至該哺乳動物，其中該病毒包含編碼EPO之多核苷酸；及(b)投予活化配體(activator ligand)，該活化配體誘導該編碼EPO之病毒多核苷酸表現EPO，其中該腺病毒相關病毒係經肌肉內投予，其中該腺病毒相關病毒另包含以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關，其中該基因開關包含與第一啟動子可操作性連接之至少一個轉錄因子序列，其中由該至少一個轉錄因子序列編碼之至少一個轉錄因子係配體依賴性轉錄因子，其中該腺病毒相關病毒另包含與該編碼EPO之多核苷酸可操作性連接之第二啟動子，其中該第二啟動子係於投予活化配體之後由該至少一個配體依賴性轉錄因子活化，及其中，在投予活化配體之後，相較於投予配體之前的血容比或紅血球體積百分比，該哺乳動物之血容比或血中紅血球的體積百分比增加至少25%。
  2. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒 ，其中該哺乳動物係人。
  3. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中EPO之表現係藉由控制該經投予之活化配體之劑量加以誘導、調節或增強。
  4. 如申請專利範圍第3項之供使用之腺病毒相關病毒，其中活化配體係以足以誘導或維持正常生理範圍內之EPO表現量的劑量投予。
  5. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該編碼EPO之多核苷酸包含與SEQ ID NO：6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中，在投予活化配體之後，相較於投予配體之前的血容比或紅血球體積百分比，該哺乳動物之血容比或血中紅血球的體積百分比增加至少40%。
  7. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該基因開關係RheoSwitch®基因開關。
  8. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該活化配體係二醯基肼配體。
  9. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該活化配體係選自由RG-115819、RG-115932及RG-115830所組成的群組。
  10. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該活化配體係RG-115932。
  11. 如申請專利範圍第1項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該基因開關包含在第一治療性開關啟動子控制下之第一轉錄因子序列及在第二治療性開關啟動子控制下之第二轉錄因子序列，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列所編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物。
  12. 如申請專利範圍第11項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該第一轉錄因子序列包含編碼VP-16反式活化結構域(transactivation domain)及類視色素X受體(retinoic X receptor)(RXR)蛋白質之核酸。
  13. 如申請專利範圍第12項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該第二轉錄因子序列包含編碼GAL-4 DNA結合結構域及蛻皮激素受體(EcR)蛋白質之核酸。
  14. 如申請專利範圍第11項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該第一轉錄因子序列包含編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含HSV-VP 16的轉錄活化結構域及源自人序列及蝗蟲飛蝗超氣門多肽(Locusta migratoria ultraspiracle polypeptide)(Lm USP)的嵌合性RXR。
  15. 如申請專利範圍第14項之供使用之腺病毒相關病毒，其中該第二轉錄因子序列包含編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含酵母菌Gal4的DNA結合結構域及來自昆蟲雲杉芽捲蛾(Choristoneura fumiferana)之經突變之蛻皮激素受體的DEF結構域。
  16. 一種供使用之腺病毒相關病毒，該腺病毒相關病 毒包含編碼紅血球生成素(EPO)之多核苷酸，該供使用之腺病毒相關病毒係用於誘導、調節或增強哺乳動物之EPO表現之方法，其中該方法包含(a)投予該腺病毒相關病毒至該哺乳動物；及(b)投予活化配體，該活化配體誘導該編碼EPO之病毒多核苷酸表現EPO，其中該腺病毒相關病毒係經肌肉內投予，其中該腺病毒相關病毒另包含以蛻皮激素受體(EcR)為基底之基因開關，該基因開關包含在第一治療性開關啟動子控制下之第一轉錄因子序列，該第一轉錄因子序列包含編碼VP-16反式活化結構域及類視色素X受體(RXR)蛋白質之核酸；及在第二治療性開關啟動子控制下之第二轉錄因子序列，該第二轉錄因子序列包含編碼GAL-4 DNA結合結構域及蛻皮激素受體蛋白質之核酸，其中由該第一轉錄因子序列及該第二轉錄因子序列所編碼之蛋白質交互作用以形成功能為配體依賴性轉錄因子之蛋白質複合物，其中該腺病毒相關病毒另包含與該編碼EPO之多核苷酸可操作性連接之第二啟動子，其中該第二啟動子係於投予活化配體之後由該配體依賴性轉錄因子活化。
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