KR20120111054A - 인트론 ３을 포함하는 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자, 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법 및 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자를 사용할 경우, 혈관 신생인자 중 하나인 아드레노메듈린을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 아드레노메듈린을 필요로 하는 혈관 질환 환자의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

인트론 ３을 포함하는 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법{Novel Expression Cassettes for Adrenomedullin Gene Harboring Intron 3 and Process for Preparing the Adrenomedullin Using the Same}

본 발명은 인트론 ３을 포함하는 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자, 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법 및 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

죽상경화 (atherosclerosis)로 인한 동맥의 협착은 신체 장기로의 산소공급 장애를 초래하여 허혈성 심혈관 질환을 유발한다. 최근 식생활의 서구화, 영양상태의 개선, 노인인구의 증가 등에 기인하여 이로 인한 허혈성 질환의 발병률이 점차 증가하는 추세인데, 허혈성 심혈관 질환은 심근, 다리, 뇌의 혈류장애를 초래하여 협심증, 파행증상, 일과성 뇌졸중을 일으키며, 동맥경화반이 파열되면 혈전생성으로 인한 불안정형 협심증, 심근 경색증, 뇌경색, 급성 사지 허혈과 같은 병을 일으킨다. 급성 심근경색증의 경우 치료하지 않을 경우 초기 사망률이 50%에 이르며, 급성 사지허혈의 경우 다리를 절단해야 되는 심각한 질환이고, 급성 뇌경색의 경우 급사 또는 사지마비를 유발하게 되는 등 성인사망율의 수위를 차지하며, 사회/경제적으로도 질병부담율 수위를 다투는 질환이다.

이와 같은 허혈성 심혈관질환을 치료하는 방법은 크게 세 가지로서, 첫째, 약물요법, 둘째, 경피적관동맥성형술 (percutaneous transluminal coronary angioplasty; PTCA), 셋째, 관상동맥우회술 (coronary artery bypass graft; CABG)이며 환자가 일반적인 약물요법에 반응하지 않을 때 PTCA나 CABG의 방법을 사용하게 된다. 그러나 이러한 치료법은 항상 시행할 수 있는 것은 아니며, 기존의 치료에 적응증이 안되거나 기존의 치료법에 반응하지 않는 “no option patient"가 전체 환자의 약 20%에 이르게 된다. 이들은 결국, 심근경색, 뇌경색, 심부전 등으로 사망하거나, 다리를 절단하게 되므로, 현재 한계에 도달한 허혈성 심혈관 질환의 치료를 위해서는, 특히 “No option patient”에게는, 새로운 치료전략의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

관상동맥질환이나 뇌혈관질환에 비해, 말초동맥질환 (Peripheral Arterial Disease [PAD], 본 과제의 하지허혈모델이 반영되는 질환)은 대표적인 under-appreciated disease로서 그 높은 유병율에도 불구하고 잘 치료되지 않음으로 인해 매우 높은 사망률을 보이는 질환이다. PAD 환자 중 30%가 5년 내에 죽고, 10년 뒤에는 50%가 죽는다는 통계가 있다. 또 전체 PAD 환자 중 약 10% 정도는 기존의 약물 및 수술로 치료가 되지 않는 소위 “no-option patients"로서 새로운 치료법의 개발이 절실한 실정이다. 미국에서의 통계에 의하면 2천만명이 PAD환자이고 이들이 제대로 치료받지 못함으로 인한 잠재적 순환기계통 치료제 값이 약 350억불에 달한다고 한다. (“Peripheral arterial disease (PAD): prevalence, current treatments & new technologies”, Sage Group, 2003)

혈관형성을 조금 더 자세히 들여다보면, 좁은 의미의 혈관신생 (angiogenesis)은 기존 혈관에서 새로이 혈관내피세포로만 구성된 모세혈관 (capillary)이 만들어지는 것을 뜻하며, arteriogenesis는 모세혈관의 주위를 pericyte나 vascular smooth muscle cell이 덮고 혈관의 내경이 증가하고 벽의 두께도 증가되어 세동맥(arteriole) 이상의 혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 실제로 만들어진 혈관이 혈류를 늘려 허혈 증상을 경감시키기 위해서는 arteriogenesis, 특히 직경 100 μm 이상의 소동맥보다 큰 혈관이 만들어져야 한다. 그러나 현재 진행 중인 국내외의 VEGF 등을 이용한 임상시험 결과에 의하면 새로이 형성되는 혈관은 모세혈관 내지는 매우 가느다란 세동맥 수준에 지나지 않아 개선된 치료전략의 개발이 요구되는 바이다. 이를 개선할 수 있는 유전자 치료 전략으로 multiple angiogeneic factor를 병합투여하는 방법과 전사인자를 통한 다수의 혈관신생 유전자 발현 촉진 전략이 연구되고 있다.

AM은 1993년 처음 발견된 이후 거의 모든 조직에서 발현되며 매우 다양한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌으나 (vasodilation, cell growth, hormone secretion 조절, natriuresis, antimicrobial effects 등), 그 작용기전은 아직 명확히 밝혀지지 않은 상태로 cAMP와 NO 등이 중요한 역할을 수행할 것으로 추측되고 있다. AM은 통상 심혈관계의 이상에 따른 보상 반응으로 그 혈청 내 수준이 높아지는데, 실제로 허혈성 질환에서 AM의 수준이 올라가고, AM 그 자체로서 혈관신생 능력이 있음이 보고된 바 있다.

인트론 서열의 일부가 유전자의 발현 및 목적 단백질의 활성을 조절하는 기능과 관련하여서는 TPI 유전자의 인트론 서열 일부가 유전자의 발현을 조절하며 목적 단백질의 활성을 증가시킨다는 내용이 보고된바 있다. 또한, 간세포 성장인자 유전자에 있는 인트론 4 염기서열의 유무에 따라 유전자의 발현이 조절될 수 있음이 보고된바 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 아드레노메듈린 유전자의 엑손 3 및 4 염기서열 사이에 인트론 3의 염기서열이 도입된 구조체를 제작하여 목적 단백질의 발현 수준을 확인한 결과 인트론 3의 염기서열을 도입한 구조체를 사용할 경우, 혈관신생 능력이 있는 아드레노메듈린 단백질의 발현 효율이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 목적은 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "아드레노메듈린"은 부신수질에서 크롬친화성 세포종의 생성에 관여하는 호르몬으로, 유전자는 염색체 11번의 4번 엑손 및 3번 인트론에 위치하며, 185개의 아미노산 전구체를 암호화한다. 활성화된 아드레노메듈린은 52개의 아미노산, 6개의 환형 아미노산 구조를 가지며, 칼시토닌 유사체 그룹을 조절 펩티드로 포함하는 호르몬으로, 혈장에서 반감기는 평균 22분정도로 길고, 아미노펩티다아제의 대사활성에 관여한다. 본 발명의 일 실시예에서는 단백질의 발현효율을 증가시키기 위해, 인간 아드레노메듈린 염기서열 사이에 인트론 3 염기서열이 삽입된 구조체를 제작하였고(도 1), 상기 구조체가 도입된 벡터로 형질전환된 대장균으로 만든 DNA를 HEK 293세포에서 단백질의 발현 수준을 확인한 결과, 인트론 3의 서열이 도입된 구조체로 형질전환된 HEK293 세포에서 단백질의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 3, 4).

본 발명에서 용어, "인트론"이란 전사를 조절하는 유전자 또는 그의 전사체 내에 존재하고 유전자의 최종 RNA 산물에는 포함되지 않는 서열을 가리킨다. 인트론의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열에 관한 정보를 갖지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 아드레노메듈린의 염기서열에 인트론 3의 염기서열을 포함하는 유전자를 제작하였고(도 1), 상기 염기서열이 도입된 구조체를 포함하는 발현 벡터를 제작하여 아드레노메듈린 유전자의 발현 수준을 비교한 결과, 인트론 3의 서열이 도입된 재조합체에서 단백질 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

본 발명에서 용어, "인트론 3"은 본 발명의 아드레노메듈린 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 도입된 염기서열로, 본 발명의 목적상 인트론 3은 하기 ⅰ- ⅲ으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 DNA 단편으로 이루어진 것을 특징으로 하는 염기서열인 바: ⅰ. 서열번호 9로 표시되는 DNA 단편, 또는 ⅱ. ⅰ을 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 삽입된 것으로 프로모터의 활성 및 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결되는 목적 유전자의 발현 조절 활성을 가지는 DNA 단편일 수 있다. 이러한 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다. 상기 인트론 3 영역은 아드레노메듈린 유전자의 엑손 3의 말단에서 시작하여 엑손 4의 시작점에서 종결되며, 바람직하게는 서열번호 9로 개시된 약 232bp 크기의 DNA 단편일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 405 내지 637bp의 염기서열을 포함하는 단편일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 아드레노메듈린 유전자의 발현효율을 증가시키기 위하여, 엑손 3 및 엑손 4의 염기서열 사이에 인트론 3의 일부 또는 전부를 작동가능하게 연결하여 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 재조합체를 제작하였다(도 2). 본 발명의 인트론 3의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 재조합체는 인트론 서열이 포함되지 않은 기존의 아드레노메듈린 유전자의 염기서열에 비해 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현 효율이 증가된 것을 확인하였다(도 4).

보다 구체적으로, 본 발명의 인트론 3의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 아드레노메듈린 유전자는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편, 서열번호 9로 표시되는 DNA 단편일 수 있고, 상기 DNA 단편을 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드의 치환 변이체는 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 염기가 제거되고 다른 염기가 그 자리에 삽입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 삽입 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 내 미리 결정된 부위에 도입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 결실 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 염기으로부터 제거된 것에 특징이 있다. 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아있도록 유도하도록 한다. 본 발명에 따른 인트론 3의 서열을 포함하는 아드레노메듈린 DNA 단편은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편, 서열번호 9로 표시되는 DNA 단편으로 이루어진 DNA 단편에 적어도 60% 상동성을 가지는 DNA 단편이다. 본 발명의 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64) 참조. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.

보다 바람직하게, 본 발명의 벡터는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머로 증폭된 아드레노메듈린 엑손 유전자의 염기서열, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머로 증폭된 아드레노메듈린 엑손 유전자의 염기서열 또는 인트론 3의 염기서열을 포함하는 서열번호 9로 표시되는 아드레노메듈린 유전자의 염기서열이 포함된 벡터의 구조를 갖을 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 벡터는 개열지도 도 3에 개시된 pcDNA3.1(+) AM Int3 벡터일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

아울러, 본 발명의 발현벡터는 검출용 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "검출용 유전자(또는 리포터 유전자)"는 상기 유전자의 효과에 기초하여 동정될 수 있는 동정하는 인자를 코딩하는 염기를 말하며, 여기서 상기 효과는 관심 염기의 유전을 추적하거나 관심 염기를 물려받은 세포나 유기체를 동정하기 위해, 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용된다. 공지되고 당해 기술에서 사용되는 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광 단백질(GFP)와 같은 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전이효소 (CAT), 베타-갈락토시다아제 (LacZ), 베타-글루쿠로니다아제 (Gus) 등. 선택적 마커 유전자는 또한 검출용 유전자로 간주될 수 있다.

상기에서 제조된 벡터의 목적 단백질 발현능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상기 유전자의 염기서열이 포함된 대장균 형질전환체를 제작하여 단백질의 발현수준을 비교하였다. 대조군으로는 본 발명에서 사용된 벡터의 기본 구조를 가지며, 본 발명에 따른 아드레노메듈린 유전자의 인트론 3 염기서열이 제거된 proAM 및 preproAM 벡터를 사용하였다. 아드레노메듈린 단백질의 발현능을 확인한 결과, 엑손 3 및 엑손 4의 염기서열 사이에 인트론 3의 염기서열의 일부 또는 전부가 도입된 벡터를 포함하는 형질전환체의 경우 대조군에 비해 목적 단백질의 발현 수준이 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

상기 재조합 벡터는 벡터의 구조를 도식화해서 개열지도로 나타낼 수 있으며, 본 발명에서 목적 단백질의 발현 수준이 높은 인트론 3 유전자의 일부 또는 전부가 도입된 구조를 갖는 재조합 벡터는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터일 수 있고, 7116 bp의 크기를 갖는 개열지도 도 4에 개시된 pcDNA3.1(+) AM Int3벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 HEK293 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, "숙주"는 동물을 포함한다. 동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를, 염소β카세인(goat β casein)과 같은 유즙(乳汁) 중에 고유하게 생산되는 폴리 펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적으로 하는 항체를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 폴리펩티드를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Bio/Technology, Vol.12, p.699-702, 1994). 또한, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스(Baculovirus)를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다(Nature, Vol.315, p.592-594, 1985). 바람직하게 본 발명에서는 HEK293 세포를 숙주로 사용하였다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본원에서의 용어, "예방"은 본 발명의 유전자 발현체에 의해 발현되는 목적 단백질 또는 그 약제학적 염을 포함하는 조성물의 투여로 혈관질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본원에서의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 유전자 발현체에 의해 발현되는 단백질 또는 그 약제학적 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 벡터를 상기의 개시된 용도로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터 성분과 함께, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 당업계의 공지된 보조제 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

의료용 단백질, 진단 및 치료용 항체 또는 유전자 치료용 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경우, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터를 함유하는 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 약제학적 조성물의 구성 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다.

본원에서 용어, "개체"는 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하여 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다.

본 발명의 혈관질환 예방 및 치료용 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 혈관질환 예방 및 치료용 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법에 관한 것이다.

상기 아드레노메듈린의 제조를 위하여 in vitro 및 in vivo 시스템을 이용할 수 있고, 바람직하게는 in vitro 시스템으로서 진핵세포 또는 원핵세포를 사용하는 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들면, 전술한 숙주 세포를 in vitro에서 배양함으로써 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 배지, F12 배지 등을 사용할 수 있다. 이때, 소태아혈청(FCS) 등의 헐청 보액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하고, 무혈청 배양해도 된다. 더욱이, 트랜스액티베이터를 배지에 첨가해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기(通氣), 교반을 추가한다. 배양조건은 사용하는 세포의 종류에 따라 상이하기 때문에, 당업자는 적절히 적합한 조건을 결정할 수 있다.

또한, 동물세포 배양용의 각종 배양장치로서는, 예를 들면 발효조형 탱크 배양장치(fermentation tank-type tank culture apparatuses), 에어리프트형 배양장치(airlift-type culture apparatuses), 컬쳐 플라스크형 배양장치(culture flask-type culture apparatuses), 스피너 플라스크형 배양장치(spinner flask-type culture apparatuses), 마이크로캐리어형 배양장치(microcarrier-type culture apparatuses), 유동층형 배양장치, 홀로 파이버형 배양장치(hollow fiber-type culture apparatuses), 롤러 보틀형 배양장치(roller bottle-type culture apparatuses), 충전조형 배양장치(packed bed-type culture apparatuse) 등을 사용해서 배양할 수 있다.

본 발명의 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자를 사용할 경우, 혈관 신생인자 중 하나인 아드레노메듈린을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 아드레노메듈린을 필요로 하는 혈관 질환 환자의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 새롭게 제작한 유전자의 구조체 구성을 나타낸 그림이다.
도 2는 발명한 유전자 구조체를 발현벡터에 삽입, 발현 및 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 발명한 AM 유전자 구조체의 단백질을 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)분석 장치를 통하여 찾아낸 AM peak을 나타낸 그림이다.
도 4는 새로 개발한 유전자의 단백질 발현 효과를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아드레노메듈린 의 cDNA 와 gDNA 의 클로닝

실시예 1-1: 세포배양

아드레노메듈린(AM) 유전자의 cDNA와 gDNA를 얻기 위하여 AM이 많이 분비되는 폐 세포 (lung cell)중 IMR90 (Human lung fibroblast)을 선택하여 MEM (Minimum Essential Medium) 배지 (Gibco BRL, Invitrogen, USA)에 FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco BRL, Invitrogen, USA) 10% (v/v)와 항생제 (페니실린-스트렙토마이신, Gibco BRL, Invitrogen, USA) 1% (v/v)를 포함시킨 배지로 가습된 동물세포 배양기에서 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였으며, 3~4일마다 계대배양하였다. 이때 1XPBS (8 g NaCl, 0.2 g KCl. 1.14 g Na₂HPO₄, 0.2 g KH₄PO₄/1L)로 세포를 세척한 후, 1X트립신/EDTA (Gibco BRL, invitrogen, USA) 1 ㎖을 처리하여 CO₂ 배양기에 1~3분간 두었다. 배지 9 ㎖로 트립신을 불활성화시킨 뒤 1,500 g으로 2분 30초간 원심분리하여 상등액을 제거하고 배지로 재현탁하였다. 100 mm 배양접시에 재현탁한 양의 1/3을 접종하여 배양하였다. 또한 gDNA의 돌연변이 때문에 단핵세포인 U-937 세포를 RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) 배지 (Hyclone, USA)에 FBS (Fetal Bovine Serum) 10%와 항생제 1% (v/v)를 포함시킨 배지로 위와 같은 조건하에 배양하였다. U-937 세포는 현탁세포(suspension cell)로 계대배양할 때에는 세포와 상등액을 50 ㎖ 튜브에 그대로 모아 1,500 g로 2분 30초간 원심분리하여 상등액을 제거하고 배지로 재현탁하였다.

실시예 1-2: gDNA 분리

아드레노메듈린의 gDNA를 얻어내기 위해 IMR90 세포와 U-937 세포를 사용하였다. QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, USA)으로 gDNA를 추출하였으며 2X10⁷이하의 IMR90 세포와 U-937 세포를 1 ㎖의 배지에 현탁시킨 후 15 ㎖ 튜브에 넣는다. 이 15 ㎖ 튜브에 제공되는 QIAGEN 단백질 분해효소 (QIAGEN Protease) 100 ㎕를 첨가한다. 그 후 AL 완충액을 1.2 ㎖를 넣은 후 15번 천천히 혼합하였다. 70％ 에 10분 동안 반응(incubation)시킨 후 100% 에탄올을 1 ㎕ 넣은 후 다시 10번 천천히 혼합하였다. 그 후 QIAamp Midi 컬럼에 천천히 트랜스퍼하여 1,850 g에 3분 동안 원심분리하였다. 여과된 것을 제거하고 AW1 완충액 2 ㎖을 컬럼에 넣고 다시 4,500 g에 1 분 동안 원심분리하였다. 그 후 AW2 완충액 2 ㎖을 컬럼에 넣고 4,500 g에 15 분동안 원심분리하였다. 컬럼을 빼내어 새로운 15 ㎖ 튜브에 넣어 200 의 증류수를 컬럼의 막에 넣고 상온에서 5 분동안 반응시킨 후 4,500 g 에 2 분동안 원심분리하였다. 그 후 1%(w/v) TAE 아가로스 겔로 gDNA를 확인하였다.

실시예 1-3: PCR

상기 실시예 1-2에서 얻은 gDNA 50 ng을 주형으로 ExTaq(Takara, Japan)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 10X 완충액 2 ㎕와 GAPDH 프라이머 (10 pmol/) 센스와 안티센스 각각 1 ㎕, dNTP mix (2.5mM) 4 ㎕, Taq polimerase(ExTaq) 0.5 ㎕, 증류수 11.5 ㎕를 넣고 94℃ 5분, 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 2분, 72℃ 7분으로 PCR 반응을 수행하였다. 그 후 아드레노메듈린의 특이적인 프라이머를 제작하여 94℃ 5분, 94℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 2분, 7℃ 7분으로 PCR 반응을 수행하여 1 % TAE 아가로스 겔에서 확인하였다.

실시예 1-4: RNA 분리

아드레노메듈린의 cDNA를 만들어 RT-PCR을 수행하기 위해 IMR90 세포에서 전체 RNA를 분리하였다. Reagent는 Trizol(Invitrogen)을 사용하였다. 제공되는 메뉴얼을 기본으로 하여 각각 세포들이 100 mm에 80~90 %로 채워졌을때 1XPBS로 세척하고 Trizol 2 ㎖을 처리하여 5분간 상온에서 배양하였다. Pipetting으로 세포를 용해시킨 후 1.5 ㎖ 튜브에 500 ㎕씩 나누어 담고 각 튜브에 100 ㎕씩 chlorofrom(Sigma, USA)을 첨가하고 교반(vortex)한 후 5분간 실온에서 반응시켰다. 4℃ 원심분리기에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리한 후 상등액 200 ㎕를 새로운 튜브에 옮긴 후 동일 부피의 이소프로판올을 첨가하여 교반한 후 상온에서 15분간 반응하였다. 4℃ 원심분리기에서 30분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 70 % 에탄올을 200 ㎕ 첨가하여 7분 동안 4℃ 원심분리기에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 DEPC를 처리한 증류수에 녹인다.

실시예 1-5: 역전사 효소

상기 실시예 4에서 분리한 total RNA중 5ug 을 18mer의 Oligo dT(10 pmol)와 섞은 후 65℃ 에서 5분간 incubation시킨 다음 ice에서 5분간 incubation한다. 4X RT buffer, dNTP mix (4 mM), AMV Reverse Transcriptase(Promega, USA)를 첨가한 후 DEPC-treated water로 총 20 ㎕를 만들어 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 95℃에서 5분간 반응시켜 AMV enzyme의 활성을 완전히 제거한 후 -20℃ 에 보관하였다.

실시예 1-6: RT - PCR

역전사 반응을 마친 cDNA를 사용하여 10X 완충액, dNTP(2.5 mM), GAPDH 프라이머, ExTaq 폴리머라제 (Takara, Japan), dH2O를 이용하여 PCR반응을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 5분, 94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 72℃ 7분으로 진행하였으며, 하우스 킵핑 유전자(house keeping gene)인 GAPDH를 확인하여 역전사 반응이 잘 되었음을 확인하였다. 이후 아드레노메듈린의 특이적 프라이머를 이용하여 4℃ 5분, 94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 72℃ 7분의 조건으로 PCR을 수행하여 아드레노메듈린의 cDNA와 가공(processing)과정 중에 있는 preproAM, proAM을 제작하여 TAE agarose gel로 확인하였다.

실시예 1-7: 페놀 추출 & 에탄올 침전

PCR 산물과 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜 (25:24:1)을 넣고 교반기(vortex)를 이용하여 완전히 섞어준 후 4℃ 10000 g에서 10분간 원심분리한다. 전체 산물의 80%만을 1.5 ㎖ 튜브에 옮긴 후 원래 튜브에 덜어낸 양만큼 dH2O를 넣어 교반한다. 동일하게 원심분리하여 다시 전체 80%를 앞서 옮겨놓은 튜브에 더한다. 2배 부피의 100% 에탄올과 1/10 부피의 3 M 아세트산 나트륨 (3M)를 넣어 잘 섞어준 뒤 -80℃에 30분간 넣어준다. 4℃에서 10000 g로 30분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% 에탄올 400 ㎕를 넣어 골고루 벽면을 씻은 다음 10분간 원심분리를 한 후 에탄올을 모두 제거한 후 3분 동안 진공(vaccum)을 돌려 에탄올을 말리고 dH₂O에 녹인다.

실시예 1-8: 라이게이션( Ligation )

T-Blunt (Solgent, Korea) 벡터와 7번에서 얻은 DNA(아드레노메듈린 cDNA, gDNA)를 각각 벡터 : 인서트 (cDNA) = 1 : 36 , 벡터 : 인서트 (gDNA) = 1 : 4의 비율로 6X 완충액과 dH₂O를 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

실시예 1-9: 형질전환( Transformation )

라이게이션 산물을 대장균(E. coli, DH5α) 에 형질전환하기 위해 CaCl₂를 이용하여 적격 세포(competent cell)로 제작된 DH5α에 라이게이션 산물을 첨가하여 얼음상에서 30분 동안 반응한 뒤 42℃에서 1분 30초간 열충격 (heatshock)을 주어 형질전환을 한 후 5분간 ice에 보관하고 1 ㎖의 새로운 LB배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 카나마이신이 첨가된 고체 LB 플레이트에 골고루 플레이팅(plating)한 후 37℃ 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 얻어진 콜로니 중 무작위로 선택하여 카나마이신이 함유된 5ml 액체 LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 220 rpm으로 교반 배양 (shaking incubation)하였다.

실시예 1-10: DNA 추출

상기 실시예 1-9에서 배양시킨 콜로니를 4℃ 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상등액만을 제거하였다. 남은 펠렛은 Mini-preparation 키트(Bio Basic, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다. Sol I(50 mM 포도당, 25 mM Tris-Cl: pH8.0, EDTA: pH8.0)를 넣고 피펫팅한 후 Sol II(1% SDS, 0.2 N NaOH) 200 ㎕를 넣어 천천히 혼합한 후 2분간 반응시켰다. Sol III(5 M potassium acrtate, glacial acetic acid, D.W)를 넣고 천천히 반응시킨 후 상온에서 12,000 rpm에 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액만을 컬럼으로 옮기고 상온에서 1,000 rpm에 2분 동안 원심분리 하였다. 여과된 상등액을 제거한 후, 세척 용액(에탄올 80%)을 500 ㎕ 첨가한 후 10,000 rpm으로 2분 동안 원심분리 하는 것을 2번 반복하였다. 마지막으로 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리 하여 막을 건조시킨 후 dH₂O 50 ㎕를 넣어 상온에서 1분 동안 반응시키고 1,000 rpm으로 2분 동안 원심분리 하였다.

실시예 1-11: 제한효소 절단 확인

상기 실시예 1-10에서 얻어진 플라스미드 DNA를 정량하여 원하는 DNA가 T-Blunt 벡터에 들어갔는지 확인하기 위해 아드레노메듈린 cDNA는 Apa1 (Roche, Switzerland)으로, 아드레노메듈린 gDNA는 제한효소인 Kpn(Roche, Switzerland)으로 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시켜 아가로스 겔상에서 절편의 크기를 확인하였다.

실시예 1-12: 서열분석

상기 실시예 1-11에서 확인하여 최종적으로 얻어진 플라스미드 DNA를 유전자분석업체(Bionics, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 이후 컴퓨터 서열화 프로그램(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

실시예 2: 아드레노메듈린 의 AM Int3 구조체의 클로닝

실시예 2-1: 하이브리드 PCR

앞서 제작한 아드레노메듈린의 cDNA와 gDNA의 클론을 주형으로 사용하여 Intron3가 들어있는 construct를 hybrid PCR로 제작하였다. gDNA의 2111부분의 C 삽입때문에 U-937에서 다시 gDNA를 뽑았지만 C 삽입은 여전히 존재하였다. RT를 진행한 후, cDNA에서 AM을 클로닝하던 중, C 삽입이 없는 구조체를 발견하여 그것과 Hybrid PCR을 수행하였다. 프라이머는 overlap되는 부분이 30 머정도 되게 제작하였다.

먼저 돌연변이가 없는 AM의 cDNA가 들어있는 플라스미드 DNA를 주형으로 하고, 하기 표 1에 기재된 서로 다른 프라이머를 이용하여 Exon 1~3, Exon 3~4 부분의 구조체를 제작하였다. PCR 조건은 4℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 7분으로 Taq 폴리머라제 (Neotherm, Genecraft, Germany)를 이용하여 10X 완충액, dNTP(2 mM), 프라이머, dH₂O를 혼합하여 제작하였다. 또한 돌연변이가 없는 AM의 gDNA가 들어있는 플라스미드 DNA를 주형으로 각각 다른 프라이머를 이용하여 인트론 3가 포함된 부분의 구조체를 제작하였다. PCR 조건은 4℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 2분, 72℃ 7분으로 Taq 폴리머라제 (Neotherm, Genecraft, Germany)를 이용하여 10X 완충액, dNTP (2 mM), 프라이머, dH₂O를 혼합하여 제작하였다.

서열번호	프라이머 명칭	염기서열
1 2 3 4 5 6 7 8	Exon1 sense Exon3 antisense Exon3 sense Exon4 antisense AM sense AM antisense gDNA Hybrid sense gDNA Hybrid antisense	5'-CTGGATAGAACAGCTCAAGCC-3' 5'-TCCGCAGTTCCCTCTTCCCAC-3' 5'-CTCTGAGTCGTGGGAAGAGGG-3' 5'-GGTTTGCTGTTCGCATATCAC-3' 5'-TACCGCCAGAGCATGAACAAC-3' 5'-GTAGCCCTGGGGGCTGATCTT-3' 5'-CTCACGGCGTGTCACCCCACC-3' 5'-AATAGTGAGGCTTGCGCCCTG-3'

인트론 3이 들어가는 구조체는 gDNA에서 PCR을 수행한 인트론 3와 cDNA에서 PCR을 수행한 Exon 1~3부분을 주형으로 PCR을 수행하였다.

실시예 2-2: 효소 절단 및 용리( Enzyme cut & Elution )

T-Blunt 벡터는 EcoRI으로 잘라내면 인서트가 나오게 된다. 모든 구조체는 EcoR으로 잘리지 않기 때문에 EcoRI으로 잘라 벡터와 인서트를 분리해 내었다. 10X 완충액, EcoR(Roche, Germany), DNA를 넣어 37℃ 배양기에서 16시간 반응하였다. TAE 아가로스 겔에 로딩하여 잘려진 구조체를 용리하였다.

또한 pcDNA3.1(+) 벡터를 EcoRI으로 잘라 TAE 겔에 로딩하여 크기를 확인하였다.

실시예 2-3: 알카라인 포스파타제( Alkaline phosphatase )

상기 실시예 2-2에서 얻어진 pcDNA3.1(+) 벡터와 구조체를 라이게이션하기 위해 pcDNA3.1(+) 벡터에 알카라인 포스파타제를 처리하였다. 알카라인 포스파타제를 처리하면 벡터의 5' 프라임에 있는 인산기가 일부 손실되어 self-ligation을 막아주게 된다. 이로써 벡터와 인서트의 EcoRI부분이 만나 라이게이션이 될 수 있게 된다. Shrimp 알카라인 포스파타제 (Roche, Switzerland)를 사용하여 10X 완충액 2 ㎕, DNA 1 ㎕, AP 효소 1 ㎕, dH₂O를 20 ㎕까지 맞추고 37℃ 배양기에서 30분 반응 시킨후 72℃에서 2분 동안 불활성화시켰다.

실시예 2-4: 라이게이션

AP 처리가된 pcDNA3.1(+) 벡터와 EcoR1으로 잘린 인서트들을 T4 라이게이즈 (Roche, USA)를 이용하여 10X 완충액 1 ㎕, 벡터 1 ㎕, 인서트 7 ㎕, T4 라이게이즈 1 ㎕ (1 Unit)을 넣어 4℃에서 16시간 동안 반응하였다.

실시예 2-5: 형질전환

상기 실시예 2-4에서 라이게이션된 DNA를 DH5α 적격 세포에 형질전환하여 암피실린이 들어있는 LB배지에 플레이팅하여 37℃에 16시간 동안 반응시킨 후, 선별한 콜로니를 암피실린이 들어있는 5ml LB배지에 접종하고, 접종된 배지로부터 균주를 선택한 다음, 이로부터 플라스미드를 추출하여 상기 라이게이션된 DNA가 정상적으로 도입되었는지를 확인함으로써, 형질전환체를 수득하였다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Novel Expression Cassettes for Adrenomedullin Gene Harboring Intron 3 and Process for Preparing the Adrenomedullin Using the Same <130> PA110238KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon1 sense <400> 1 ctggatagaa cagctcaagc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon3 antisense <400> 2 tccgcagttc cctcttccca c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon3 sense <400> 3 ctctgagtcg tgggaagagg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon4 antisense <400> 4 ggtttgctgt tcgcatatca c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM sense <400> 5 taccgccaga gcatgaacaa c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM antisense <400> 6 gtagccctgg gggctgatct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gDNA Hybrid sense <400> 7 ctcacggcgt gtcaccccac c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gDNA Hybrid antisense <400> 8 aatagtgagg cttgcgccct g 21 <210> 9 <211> 1682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adrenomedullin Gene Harboring Intron 3 <400> 9 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg 180 atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg 240 gagtttcgaa agaagtggaa taagtgggct ctgagtcgtg gaagagggaa ctgcggatgt 300 ccagcagcta ccccaccggg ctcgctgacg tgaaggccgg gcctgcccag acccttattc 360 ggccccagga catgaagggt gcctctcgaa gccccgaaga caggtaacta cgccctgtgc 420 tgtccaggga cgggagggaa ggaaggtgtg cgggaggagt tctctgtctc cactcccctg 480 gcccggggga tcgtcggggc tggaccgcag ctcagatggc gcgagcagtt tccagcctcc 540 ctctggctct agaatggctc ccgttcccgg tgttggggcc aaagctctgc ttgatggggt 600 ctcaagttgc ctttcttccc cctccccccg cccgcagcag tccggatgcc gcccgcatcc 660 gagtcaagcg ctaccgccag agcatgaaca acttccaggg cctccggagc tttggctgcc 720 gcttcgggac gtgcacggtg cagaagctgg cacaccagat ctaccagttc acagataagg 780 acaaggacaa cgtcgccccc aggagcaaga tcagccccca gggctacggc cgccggcgcc 840 ggcgctccct gcccgaggcc ggcccgggtc ggactctggt gtcttctaag ccacaagcac 900 acggggctcc agcccccccg agtggaagtg ctccccactt tctttaggat ttaggcgccc 960 atggtacaag gaatagtcgc gcaagcatcc cgctggtgcc tcccgggacg aaggacttcc 1020 cgagcggtgt ggggaccggg ctctgacagc cctgcggaga ccctgagtcc gggaggcacc 1080 gtccggcggc gagctctggc tttgcaaggg cccctccttc tgggggcttc gcttccttag 1140 ccttgctcag gtgcaagtgc cccagggggc ggggtgcaga agaatccgag tgtttgccag 1200 gcttaaggag aggagaaact gagaaatgaa tgctgagacc cccggagcag gggtctgagc 1260 cacagccgtg ctcgcccaca aactgatttc tcacggcgtg tcaccccacc agggcgcaag 1320 cctcactatt acttgaactt tccaaaacct aaagaggaaa agtgcaatgc gtgttgtaca 1380 tacagaggta actatcaata tttaagtttg ttgctgtcaa gatttttttt gtaacttcaa 1440 atatagagat atttttgtac gttatatatt gtattaaggg cattttaaaa gcaattatat 1500 tgtcctcccc tattttaaga cgtgaatgtc tcagcgaggt gtaaagttgt tcgccgcgtg 1560 gaatgtgagt gtgtttgtgt gcatgaaaga gaaagactga ttacctcctg tgtggaagaa 1620 ggaaacaccg agtctctgta taatctattt acataaaatg ggtgatatgc gaacagcaaa 1680 cc 1682

Claims (7)

1. 아드레노메듈린 유전자의 액손 3 및 액손 4 사이에 인트론 3이 삽입된 형태를 가지는 아드레노메듈린 발현 유전자.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 9로 개시되는 염기서열로 구성되는 것인 아드레노메듈린 발현 유전자.
   
3. 제1항의 아드레노메듈린 발현 유전자를 포함하는 발현 벡터.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 발현 벡터는 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 pcDNA3.1(+)AM Int3 벡터인 것인 발현 벡터.
   
5. 제3항 또는 제4항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
   
6. 제5항의 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법
   
7. 제3항 또는 제4항의 발현벡터 또는 제5항의 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   

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