KR20130097601A - 인트론 1을 포함하는 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자, 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 AM을 회수하는 단계를 포함하는 AM 생산방법, 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 아드레노메듈린 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자를 사용할 경우, 혈관 신생인자 중 하나인 아드레노메듈린을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 아드레노메듈린을 필요로 하는 혈관 질환 환자의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

인트론 1을 포함하는 새로운 아드레노메듈린 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법{Novel Expression Cassettes for Adrenomedullin Gene Harboring Intron 1 and Process for Preparing the Adrenomedullin Using the Same}

본 발명은 인트론 1을 포함하는 새로운 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 발현 유전자 및 상기 유전자를 이용하여 아드레노메듈린을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 AM 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자, 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 AM을 회수하는 단계를 포함하는 AM 생산방법, 상기 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

죽상경화(atherosclerosis)로 인한 동맥의 협착은 신체 장기로의 산소공급 장애를 초래하여 허혈성 심혈관 질환을 유발한다. 최근 식생활의 서구화, 영양상태의 개선, 노인인구의 증가 등에 기인하여 이로 인한 허혈성 질환의 발병률이 점차 증가하는 추세인데, 허혈성 심혈관 질환은 심근, 다리, 뇌의 혈류장애를 초래하여 협심증, 파행증상, 일과성 뇌졸중을 일으키며, 동맥경화반이 파열되면 혈전생성으로 인한 불안정형 협심증, 심근 경색증, 뇌경색, 급성 사지 허혈과 같은 병을 일으킨다. 급성 심근경색증의 경우 치료하지 않을 경우 초기 사망률이 50%에 이르며, 급성 사지허혈의 경우 다리를 절단해야 되는 심각한 질환이고, 급성 뇌경색의 경우 급사 또는 사지마비를 유발하게 되는 등 성인사망율의 수위를 차지하며, 사회/경제적으로도 질병부담율 수위를 다투는 질환이다.

이와 같은 허혈성 심혈관질환을 치료하는 방법은 크게 세 가지로서, 첫째, 약물요법, 둘째, 경피적관동맥성형술(percutaneous transluminal coronary angioplasty; PTCA), 셋째, 관상동맥우회술(coronary artery bypass graft; CABG)이며 환자가 일반적인 약물요법에 반응하지 않을 때 PTCA나 CABG의 방법을 사용하게 된다. 그러나 이러한 치료법은 항상 시행할 수 있는 것은 아니며, 기존의 치료에 적응증이 안되거나 기존의 치료법에 반응하지 않는 "no option patient"가 전체 환자의 약 20%에 이르게 된다. 이들은 결국, 심근경색, 뇌경색, 심부전 등으로 사망하거나, 다리를 절단하게 되므로, 현재 한계에 도달한 허혈성 심혈관 질환의 치료를 위해서는, 특히 "No option patient"에게는, 새로운 치료전략의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

관상동맥질환이나 뇌혈관질환에 비해, 말초동맥질환(Peripheral Arterial Disease [PAD])은 대표적인 under-appreciated disease로서 그 높은 유병율에도 불구하고 잘 치료되지 않음으로 인해 매우 높은 사망률을 보이는 질환이다. PAD 환자 중 30%가 5년 내에 죽고, 10년 뒤에는 50%가 죽는다는 통계가 있다. 또 전체 PAD 환자 중 약 10% 정도는 기존의 약물 및 수술로 치료가 되지 않는 소위 "no-option patients"로서 새로운 치료법의 개발이 절실한 실정이다. 미국에서의 통계에 의하면 2천만명이 PAD환자이고 이들이 제대로 치료받지 못함으로 인한 잠재적 순환기계통 치료제 값이 약 350억불에 달한다고 한다.("Peripheral arterial disease(PAD): prevalence, current treatments & new technologies", Sage Group, 2003)

혈관형성을 조금 더 자세히 들여다보면, 좁은 의미의 혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관에서 새로이 혈관내피세포로만 구성된 모세혈관(capillary)이 만들어지는 것을 뜻하며, arteriogenesis는 모세혈관의 주위를 pericyte나 vascular smooth muscle cell이 덮고 혈관의 내경이 증가하고 벽의 두께도 증가되어 세동맥(arteriole) 이상의 혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 실제로 만들어진 혈관이 혈류를 늘려 허혈 증상을 경감시키기 위해서는 arteriogenesis, 특히 직경 100 μm 이상의 소동맥보다 큰 혈관이 만들어져야 한다. 그러나 현재 진행 중인 국내외의 VEGF 등을 이용한 임상시험 결과에 의하면 새로이 형성되는 혈관은 모세혈관 내지는 매우 가느다란 세동맥 수준에 지나지 않아 개선된 치료전략의 개발이 요구되는 바이다. 이를 개선할 수 있는 유전자 치료 전략으로 multiple angiogeneic factor를 병합투여하는 방법과 전사인자를 통한 다수의 혈관신생 유전자 발현 촉진 전략이 연구되고 있다.

아드레노메듈린(adrenomedullin, AM)은 1993년 처음 발견된 이후 거의 모든 조직에서 발현되며 매우 다양한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌으나(vasodilation, cell growth, hormone secretion 조절, natriuresis, antimicrobial effects 등), 그 작용기전은 아직 명확히 밝혀지지 않은 상태로 cAMP와 NO 등이 중요한 역할을 수행할 것으로 추측되고 있다. AM은 통상 심혈관계의 이상에 따른 보상 반응으로 그 혈청 내 수준이 높아지는데, 실제로 허혈성 질환에서 AM의 수준이 올라가고, AM 그 자체로서 혈관신생 능력이 있음이 보고된 바 있다. 따라서, 상기와 같은 기능을 가진 AM의 대량생산 또는 AM의 발현효율을 증가시키는 방법에 관한 연구가 절실히 요구되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 AM 유전자의 엑손 1 및 2 염기서열 사이에 인트론 1의 염기서열이 도입된 구조체를 제작하여 목적 단백질의 발현 수준을 확인한 결과 인트론 1의 염기서열을 도입한 구조체를 사용할 경우, 혈관신생 능력이 있는 AM 단백질의 발현 효율이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 AM을 회수하는 단계를 포함하는 AM 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 AM 발현 유전자, 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자를 제공한다.

본 발명에서 용어 “아드레노메듈린(adrenomedullin, AM)“이란, 부신수질에서 크롬친화성 세포종의 생성에 관여하는 호르몬을 의미한다. 그의 유전자는 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 염색체 11번의 4번 엑손 및 3번 인트론에 위치하며, 185개의 아미노산 전구체를 암호화한다. 활성화된 AM은 52개의 아미노산, 6개의 환형 아미노산 구조를 가지며, 칼시토닌 유사체 그룹을 조절 펩티드로 포함하는 호르몬으로, 혈장에서 반감기는 평균 22분정도로 길고, 아미노펩티다아제의 대사활성에 관여한다.

본 발명에서 용어 "인트론(intron)"이란, 전사를 조절하는 유전자 또는 그의 전사체 내에 존재하고 유전자의 최종 RNA 산물에는 포함되지 않는 서열을 의미한다. 인트론의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열에 관한 정보를 갖지 않는다.

본 발명에서 용어 "인트론 1"이란, 본 발명의 AM 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 도입된 염기서열로, 본 발명의 목적상 인트론 1은 서열번호 11로 표시되는 DNA 단편, 또는 상기 DNA 단편을 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 삽입된 것으로 프로모터의 활성 및 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결되는 목적 유전자의 발현 조절 활성을 가지는 DNA 단편일 수 있다. 이러한 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다. 상기 인트론 1 영역은 AM 유전자의 엑손 1의 말단에서 시작하여 엑손 2의 시작점에서 종결되며, 바람직하게는 서열번호 11로 개시된 약 450bp 크기의 DNA 단편일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 405 내지 637bp의 염기서열을 포함하는 단편일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 AM 유전자의 발현효율을 증가시키기 위하여, 엑손 1 및 엑손 2의 염기서열 사이에 인트론 1의 일부 또는 전부를 작동가능하게 연결하여 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 재조합체를 제작하였다(도 2). 본 발명의 인트론 1의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 재조합체는 인트론 서열이 포함되지 않은 기존의 AM 유전자의 염기서열 또는 인트론 2 또는 3의 서열이 포함된 AM 유전자의 염기서열에 비해 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현 효율이 증가된 것을 확인하였다(도 4 및 6).

보다 구체적으로, 본 발명의 인트론 1의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 AM 유전자는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA 단편이 될 수 있고, 상기 DNA 단편에 적어도 60% 상동성을 가지는 DNA 단편이 될 수 있는데, 바람직하게는 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 뿐만 아니라, 상기 DNA 단편을 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드의 치환 변이체는 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 염기가 제거되고 다른 염기가 그 자리에 삽입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 삽입 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 내 미리 결정된 부위에 도입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 결실 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 염기으로부터 제거된 것에 특징이 있다. 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아있도록 유도하도록 한다.

다른 양태로서, 본 발명은 상기 발현 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 "벡터"란, 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 의미한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 상기 "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 의미한다. 상기 벡터는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함할 수도 있고, 미니구형 DNA를 포함할 수 있으며, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102(2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 수행될 수 있다(Ehrhardt, A. et al.(2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S.(2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al.(2004) Gene Ther 11 : 856-64).

본 발명의 목적상 상기 벡터는 상술한 AM 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자가 도입되어 이를 숙주세포에서 발현시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pcDNA3.1(+), pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 도 2에 개시된 pcDNA3.1(+) AM Int3 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함할 수도 있고, 검출용 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 용어 "검출용 유전자(또는 리포터 유전자)"란, 상기 유전자의 효과에 기초하여 동정될 수 있는 동정하는 인자를 코딩하는 염기를 의미하며, 여기서 상기 효과는 관심 염기의 유전을 추적하거나 관심 염기를 물려받은 세포나 유기체를 동정하기 위해, 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용된다. 공지되고 당해 기술에서 사용되는 리포터 유전자는 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP)와 같은 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전이효소(CAT), 베타-갈락토시다아제(LacZ), 베타-글루쿠로니다아제(Gus) 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기에서 제조된 벡터의 목적 단백질 발현능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상기 유전자의 염기서열이 포함된 대장균 형질전환체를 제작하여 단백질의 발현수준을 비교하였다. 대조군으로는 본 발명에서 사용된 벡터의 기본 구조를 가지며, 본 발명에 따른 AM 유전자의 인트론 1 염기서열이 제거된 proAM 및 preproAM 벡터를 사용하였다. AM 단백질의 발현능을 확인한 결과, 엑손 1 및 엑손 2의 염기서열 사이에 인트론 1의 염기서열의 일부 또는 전부가 도입된 벡터를 포함하는 형질전환체의 경우 대조군에 비해 목적 단백질의 발현 수준이 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있었다(도 4 및 6).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 용어 "형질전환체"란, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 HEK293 세포일 수 있다.

본 발명의 용어 "숙주세포"란, 동물 또는 곤충으로부터 유래되어 상기 벡터가 도입되어 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 세포를 의미한다. 동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를, 염소β카세인(goat β casein)과 같은 유즙(乳汁) 중에 고유하게 생산되는 폴리 펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적으로 하는 항체를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 폴리펩티드를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Bio/Technology, Vol.12, p.699-702, 1994). 또한, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스(Baculovirus)를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다(Nature, Vol.315, p.592-594, 1985). 바람직하게 본 발명에서는 HEK293 세포를 숙주로 사용하였다.

본 발명에서 용어 "형질전환"이란, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 모든 행위를 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

상기 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 AM 발현 유전자, 재조합 벡터 또는 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본원에서의 용어, "예방"은 본 발명의 유전자 발현체에 의해 발현되는 목적 단백질 또는 그 약제학적 염을 포함하는 조성물의 투여로 혈관질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본원에서의 용어, "치료"는 본 발명에 따른 유전자 발현체에 의해 발현되는 단백질 또는 그 약제학적 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 용어 "혈관질환"이란, 관상동맥, 뇌혈관, 말초동맥질환 등에서 발생하는 질환을 의미한다. 상기 혈관질환으로는 바람직하게는 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종, 허혈성 질환 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 벡터를 상기의 개시된 용도로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터 성분과 함께, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 당업계의 공지된 보조제 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

의료용 단백질, 진단 및 치료용 항체 또는 유전자 치료용 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경우, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터를 함유하는 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 약제학적 조성물의 구성 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다.

본원에서 용어, "개체"는 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하여 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다.

본 발명의 혈관질환 예방 및 치료용 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 혈관질환 예방 및 치료용 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하고 이로부터 AM을 회수하는 단계를 포함하는 AM 생산방법에 관한 것이다.

상기 AM의 제조를 위하여 in vitro 및 in vivo 시스템을 이용할 수 있고, 바람직하게는 in vitro 시스템으로서 진핵세포 또는 원핵세포를 사용하는 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들면, 전술한 숙주 세포를 in vitro에서 배양함으로써 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 배지, F12 배지 등을 사용할 수 있다. 이때, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보충액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하고, 무혈청상태로 배양해도 무방하다. 더욱이, 트랜스액티베이터를 배지에 추가로 포함할 수 도 있다. 배양시의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 200시간동안 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기(通氣), 교반을 추가한다. 배양조건은 사용하는 세포의 종류에 따라 상이하기 때문에, 당업자는 적절히 적합한 조건을 결정할 수 있다.

또한, 동물세포 배양용의 각종 배양장치로서는, 예를 들면 발효조형 탱크 배양장치(fermentation tank-type tank culture apparatuses), 에어리프트형 배양장치(airlift-type culture apparatuses), 컬쳐 플라스크형 배양장치(culture flask-type culture apparatuses), 스피너 플라스크형 배양장치(spinner flask-type culture apparatuses), 마이크로캐리어형 배양장치(microcarrier-type culture apparatuses), 유동층형 배양장치, 홀로 파이버형 배양장치(hollow fiber-type culture apparatuses), 롤러 보틀형 배양장치(roller bottle-type culture apparatuses), 충전조형 배양장치(packed bed-type culture apparatuse) 등을 사용해서 배양할 수 있다.

아울러, 상기 방법은 혈관질환 치료제의 제조시에도 응용될 수 있다. 구체적으로, 상기 혈관질환 치료제는 (ⅰ) 상기 형질전환체를 배양하여 AM을 생산하는 단계; 및, (ⅱ) 상기 생산된 AM을 포함하는 혈관질환의 치료제를 제조하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 방법을 이용하면 인트론이 삽입되지 않은 AM 유전자 또는 다른 종류의 인트론이 삽입된 AM 유전자가 포함된 발현벡터를 배양한 경우보다도 AM을 높은 효율로 대량생산할 수 있다.

본 발명의 AM 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태의 새로운 AM 발현 유전자를 사용할 경우, 혈관 신생인자 중 하나인 AM을 대량으로 생산할 수 있으므로, 상기 AM을 필요로 하는 혈관 질환 환자의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 새롭게 제작한 유전자의 구조체 구성을 나타낸 그림이다.
도 2는 발명한 유전자 구조체를 발현벡터에 삽입, 발현 및 정제 과정을 나타낸 개략도이다.
도 3은 각각의 클로닝된 AM 구조체를 나타내는 개략도이다.
도 4는 각각의 클로닝된 AM 구조체로부터 발현된 AM의 mRNA 수준을 정량화하여 비교한 그래프로서, 상기 mRNA 수준은 실시간 PCR에 의하여 측정되었고, 측정된 데이터는 GAPDH의 mRNA의 수준과 전이효율에 의해 정상화되었다.
도 5는 AM 유전자 구조체의 단백질을 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)분석 장치를 통하여 찾아낸 AM peak을 나타낸 그래프로서, 화살표는 AM의 위치를 나타낸다. AM은 X-Bridge BEH300 C18 컬럼(4.6 X 250 mm; Waters, USA)을 이용한 역상 HPLC에 의해 분석되었다. AM은 0.05%(v/v) TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 0 내지 40%의 아세토니트릴 농도구배 용매를 사용하여 1ml/min의 유속으로 50분동안 용출함으로써 검출하였다.
도 6은 HPLC 분석을 이용하여 각각의 클로닝된 AM 구조체로부터 발현된 AM의 발현수준을 비교한 그래프로서, 각각의 AM은 Sep-Pak C18 cartridge(Waters, Ireland)를 이용하여 정제하였다. 구체적으로, 상기 Sep-Pak C18 cartridge를 각각 5ml의 물과 아세토니트릴로 전처리하고, 각각의 시료 1ml을 적용한 다음, 3ml의 20% 아세토니트릴로 세척하고, 2ml의 100% 아세토니트릴로 용출하여 정제하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아드레노메둘린(AM)의 cDNA 와 gDNA 의 클로닝

실시예 1-1: 세포배양

인간의 아드레노메둘린(AM) 유전자의 cDNA와 gDNA를 얻기 위하여 AM이 많이 분비되는 폐 세포(lung cell)중 IMR90(Human lung fibroblast)을 선택하여 MEM(Minimum Essential Medium) 배지(Gibco BRL, Invitrogen, USA)에 FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco BRL, Invitrogen, USA) 10%(v/v)와 항생제(페니실린-스트렙토마이신, Gibco BRL, Invitrogen, USA) 1%(v/v)를 포함시킨 배지로 가습된 동물세포 배양기에서 5% CO₂, 37℃ 조건하에서 배양하였으며, 3 내지 4일마다 계대배양하였다. 이때 1XPBS(8 g NaCl, 0.2 g KCl. 1.14 g Na₂HPO₄, 0.2 g KH₄PO₄/ℓ)로 세포를 세척한 후, 1X트립신/EDTA(Gibco BRL, invitrogen, USA) 1㎖을 처리하여 CO₂ 배양기에 1~3분간 두었다. 배지 9㎖로 트립신을 불활성화시킨 뒤 1,500 g으로 2분 30초간 원심분리하여 상등액을 제거하고 배지로 재현탁하였다. 100 mm 배양접시에 재현탁한 양의 1/3을 접종하여 배양하였다. 또한 gDNA의 돌연변이 때문에 단핵세포인 U-937 세포를 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640) 배지(Hyclone, USA)에 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%와 항생제 1%(v/v)를 포함시킨 배지로 위와 같은 조건하에 배양하였다. U-937 세포는 현탁세포(suspension cell)로 계대배양할 때에는 세포와 상등액을 50㎖ 튜브에 그대로 모아 1,500 g로 2분 30초간 원심분리하여 상등액을 제거하고 배지로 재현탁하였다.

실시예 1-2: gDNA 분리

AM의 gDNA를 수득하기 위하여, IMR90 세포와 U-937 세포를 사용하였다. QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN, USA)으로 gDNA를 추출하였으며 2X10⁷이하의 IMR90 세포와 U-937 세포를 1㎖의 배지에 현탁시킨 후, QIAGEN 단백질 분해효소(QIAGEN Protease) 100㎕를 첨가하였으며, AL 완충액을 1.2㎖를 넣은 후 15번 천천히 혼합하면서 10분 동안 반응(incubation)시킨 후 100% 에탄올을 1㎕ 가하고 다시 10번 천천히 혼합하였다. 그 후 QIAamp Midi 컬럼에 천천히 적용하고, 1,850 g에서 3분 동안 원심분리하여 여과하였다. 여과액을 제거하고, AW1 완충액 2㎖을 컬럼에 넣고 다시 4,500 g에 1 분 동안 원심분리하여 여과액을 제거하였으며, AW2 완충액 2㎖을 컬럼에 넣고 4,500 g에 15 분동안 원심분리하였다. 컬럼을 빼내어 새로운 15㎖ 튜브에 넣어 200㎕의 증류수를 컬럼에 가하고 상온에서 5 분동안 반응시킨 후 4,500 g 에서 2 분 동안 원심분리하였다. 그 후 1%(w/v) TAE 아가로스 겔로 gDNA(서열번호 14)를 확인하였다.

실시예 1-3: PCR

상기 실시예 1-2에서 얻은 gDNA 50 ng을 주형으로 ExTaq(Takara, Japan)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 10X 완충액 2㎕와 GAPDH 프라이머(10 pmol/) 센스와 안티센스 각각 1㎕, dNTP mix(2.5mM) 4㎕, Taq polimerase(ExTaq) 0.5㎕, 증류수 11.5㎕를 넣고 94℃ 5분, 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 2분, 72℃ 7분으로 PCR 반응을 수행하였다. 그 후 AM의 특이적인 프라이머를 제작하여 94℃ 5분, 94℃ 1분, 60℃ 2분, 72℃ 2분, 7℃ 7분으로 PCR 반응을 수행하여 1 % TAE 아가로스 겔에서 확인하였다.

실시예 1-4: 총 RNA 분리

AM의 cDNA를 만들어 RT-PCR을 수행하기 위해 IMR90 세포에서 총 RNA를 분리하였다. Reagent는 Trizol(Invitrogen)을 사용하였다. 제공되는 메뉴얼을 기본으로 하여 각각 세포들이 100 mm에 80~90 %로 채워졌을때 1XPBS로 세척하고 Trizol 2㎖을 처리하여 5분간 상온에서 배양하였다. Pipetting으로 세포를 용해시킨 후 1.5㎖ 튜브에 500㎕씩 나누어 담고 각 튜브에 100㎕씩 chlorofrom(Sigma, USA)을 첨가하고 교반(vortex)한 후 5분간 실온에서 반응시켰다. 4℃ 원심분리기에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리한 후 상등액 200㎕를 새로운 튜브에 옮긴 후 동일 부피의 이소프로판올을 첨가하여 교반한 후 상온에서 15분간 반응시켰다. 4℃ 원심분리기에서 30분간 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 70 % 에탄올을 200㎕ 첨가하여 7분 동안 4℃ 원심분리기에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 DEPC를 처리한 증류수에 용해시켜서 총 RNA를 수득하였다.

실시예 1-5: 역전사 반응

상기 실시예 1-4에서 분리한 총 RNA중 5ug 을 18mer의 Oligo dT(10 pmol)와 섞은 후 65℃ 에서 5분간 방치시킨 다음 0℃ 에서 5분간 방치시켰다. 4X RT buffer, dNTP mix(4 mM), AMV Reverse Transcriptase(Promega, USA)를 첨가한 후 DEPC-treated water로 총 20㎕를 만들어 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 95℃에서 5분간 반응시켜 AMV enzyme의 활성을 완전히 제거한 후 -20℃ 에 보관하였다.

역전사 반응을 마친 cDNA(서열번호 15)를 사용하여 10X 완충액, dNTP(2.5 mM), GAPDH 프라이머, ExTaq 폴리머라제(Takara, Japan), dH₂O를 이용하여 PCR반응을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 5분, 94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 72℃ 7분으로 진행하였으며, 하우스 킵핑 유전자(house keeping gene)인 GAPDH를 확인하여 역전사 반응이 잘 되었음을 확인하였다. 이후 AM의 특이적 프라이머를 이용하여 4℃ 5분, 94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분, 72℃ 7분의 조건으로 PCR을 수행하여 AM의 cDNA와 가공(processing)과정 중에 있는 preproAM, proAM을 제작하여 TAE agarose gel로 확인하였다.

실시예 1-6: 페놀 추출 & 에탄올 침전

상기 실시예 1-5에서 수득한 PCR 산물에 동량의 혼합용매(페놀:클로로포름:이소아밀 알콜 = 25:24:1, v/v/v)를 가하고 교반기(vortex)를 이용하여 완전히 혼합한 다음, 4℃ 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전체 산물의 80%만을 1.5㎖ 튜브에 옮긴 후 원래 튜브에 덜어낸 양만큼 dH₂O를 넣어 교반하였다. 동일하게 원심분리하여 다시 전체 80%를 앞서 옮겨놓은 튜브에 가하였다. 2배 부피의 100% 에탄올과 1/10 부피의 3 M 아세트산 나트륨(3M)를 넣어 잘 섞어준 뒤 -80℃에 30분간 가하였다. 4℃에서 10000 g로 30분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% 에탄올 400㎕를 넣어 골고루 벽면을 씻은 다음 10분간 원심분리를 한 후 에탄올을 모두 제거한 후 3분 동안 진공(vaccum)을 돌려 에탄올을 증발시키고 dH₂O에 용해시켰다.

실시예 1-7: 라이게이션( Ligation )

T-Blunt(Solgent, Korea) 벡터와 7번에서 얻은 DNA(AM cDNA, gDNA)를 각각 벡터 : 인서트(cDNA) = 1 : 36 , 벡터 : 인서트(gDNA) = 1 : 4의 비율로 6X 완충액과 dH₂O를 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

실시예 1-8: 형질전환( Transformation )

라이게이션 산물을 E. coli(DH5α) strain에 형질전환하기 위해 CaCl₂를 이용하여 적격 세포(competent cell)로 제작된 DH5α에 라이게이션 산물을 첨가하여 ice에서 30분 동안 반응한 뒤 42℃에서 1분 30초간 열충격(heatshock)을 주어 형질전환시켰다. 그런 다음, 5분간 ice에 보관하고 1㎖의 새로운 LB배지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 카나마이신이 첨가된 고체 LB 플레이트에 골고루 플레이팅(plating)한 후 37℃ 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 얻어진 콜로니 중 무작위로 선택하여 카나마이신이 함유된 5ml 액체 LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 220 rpm으로 교반 배양(shaking incubation)하였다.

실시예 1-9: DNA 추출

상기 실시예 1-9에서 배양시킨 콜로니를 4℃ 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 Mini-preparation 키트(Bio Basic, Korea)에 적용하여 DNA를 추출하였다. Sol I(50 mM 포도당, 25 mM Tris-Cl: pH8.0, EDTA: pH8.0)를 넣고 피펫팅한 후 Sol II(1% SDS, 0.2 N NaOH) 200㎕를 넣어 천천히 혼합한 후 2분간 반응시켰다. Sol III(5 M potassium acrtate, glacial acetic acid, D.W)를 넣고 천천히 반응시킨 후 상온에서 12,000 rpm에 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액만을 컬럼으로 옮기고 상온에서 1,000 rpm에 2분 동안 원심분리 하였다. 여과된 상등액을 제거한 후, 세척 용액(에탄올 80%)을 500㎕ 첨가한 후 10,000 rpm으로 2분 동안 원심분리 하는 것을 2번 반복하였다. 마지막으로 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리 하여 막을 건조시킨 후 dH2O 50㎕를 넣어 상온에서 1분 동안 반응시키고 1,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여, 목적하는 DNA를 추출하였다.

실시예 1-10: 제한효소 절단 확인

상기 실시예 1-10에서 얻어진 플라스미드 DNA를 정량하여 원하는 DNA가 T-Blunt 벡터에 들어갔는지 확인하기 위해 AM cDNA는 Apa1(Roche, Switzerland)으로, AM gDNA는 Kpn(Roche, Switzerland)으로 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시켜 절단된 단편을 확인함으로써 정상적으로 AM cDNA와 AM gDNA가 수득되었는지를 확인하였다.

실시예 1-11: 서열분석

상기 실시예 1-11에서 확인하여 최종적으로 얻어진 플라스미드 DNA를 유전자분석업체(Bionics, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 이후 Multiple sequence alignment program(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)을 이용하여 염기서열을 분석하였다.

실시예 2: AM 의 AM Int3 구조체의 클로닝

실시예 2-1: 하이브리드 PCR 을 이용한 인트론이 삽입된 구조체의 제작

앞서 제작한 AM의 cDNA와 gDNA의 클론을 주형으로 사용하여 인트론 1, 2 또는 3을 포함하는 구조체를 하이브리드 PCR 방법을 이용하여 제작하였다.

인트론 1을 포함하는 구조체는 다음과 같이 제작하였다:

우선, AM의 gDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon1 sense primer와 Exon2 antisense primer를 이용한 PCR을 수행하여(4℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 7분), 인트론 1(서열번호 11)이 들어가 있는 PCR 산물을 제작하였다.

다음으로, AM의 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon2 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 엑손 2 부분부터 엑손 4까지 인트론이 없는 PCR 산물을 제작하였다.

끝으로, 상기 수득한 두가지 PCR 산물을 주형으로 사용하고, Exon1 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 인트론 1이 엑손 1과 엑손 2사이에 삽입된 형태의 AM 유전자(서열번호 16)를 포함하는 구조체를 제작하였다.

인트론 2를 포함하는 구조체는 다음과 같이 두번의 하이브리드 PCR을 수행하여 제작하였다:

첫 번째 하이브리드 PCR은 다음과 같이 수행하였다.

우선, AM의 gDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon2 sense primer와 Exon3 antisense primer를 이용한 PCR을 수행하여(4℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 7분), 인트론 2(서열번호 12)가 들어가 있는 PCR 산물을 제작하였다.

다음으로, AM의 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon1 sense primer와 Exon2 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, PCR 산물을 제작하였다.

끝으로, 상기 수득한 두가지 PCR 산물을 주형으로 사용하고, Exon1 sense primer와 Exon3 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 엑손 1, 엑손 2 및 인트론 2가 순차적으로 연결된 PCR 산물(Exon12Intron2)을 제작하였다.

두 번째 하이브리드 PCR은 다음과 같이 수행하였다.

우선, AM의 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon3 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, PCR 산물을 제작하였다.

상기 제작된 PCR 산물과 상기 첫 번째 하이브리드 PCR을 통해 제작된 PCR 산물(Exon12Intron2)을 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon1 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 인트론 2가 엑손 2와 엑손 3사이에 삽입된 형태의 AM 유전자(서열번호 17)를 포함하는 구조체를 제작하였다.

인트론 3을 포함하는 구조체는 다음과 같이 제작하였다:

우선, AM의 gDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon3 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 PCR을 수행하여(4℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 7분), 인트론 3(서열번호 13)이 들어가 있는 PCR 산물을 제작하였다.

다음으로, AM의 cDNA를 주형으로 사용하고, 하기 표 1의 Exon1 sense primer와 Exon3 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 엑손 1 부분부터 엑손 3까지 인트론이 없는 PCR 산물을 제작하였다.

끝으로, 상기 수득한 두가지 PCR 산물을 주형으로 사용하고, Exon1 sense primer와 Exon4 antisense primer를 이용한 동일한 조건의 PCR을 수행하여, 인트론 3이 엑손 3과 엑손 4사이에 삽입된 형태의 AM 유전자(서열번호 18)를 포함하는 구조체를 제작하였다.(도 3). 도 3은 각각의 클로닝된 AM 구조체를 나타내는 개략도이다.

프라이머의 염기서열

서열번호	프라이머 명칭	염기서열(5'-3')
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	GAPDH sense GAPDH antisense Exon1 sense Exon4 antisense Exon2 sense Exon2 antisense Exon3 sense Exon3 antisense AM sense AM antisense	TGACATCAAGAAGGTGGTGA TCCACCACCCTGTTGCTGTA CTGGATAGAACAGCTCAAGCC GGTTTGCTGTTCGCATATCAC CTTCCTAGGCGCTGACACCGC TCCAACCGAGCGGTGTCAGCG CTCTGAGTCGTCGGAAGAGGG TCCGCAGTTCCCTCTTCCCAC TACCGCCAGAGCATGAACAAC GTAGCCCTGGGGGCTGATCTT

실시예 2-2: 효소 절단 및 용리( Enzyme cut & Elution )

T-Blunt 벡터는 EcoRI으로 잘라내면 인서트가 나오게 된다. 모든 구조체는 EcoR으로 잘리지 않기 때문에 EcoRI으로 잘라 벡터와 인서트를 분리해 내었다. 10X 완충액, EcoR(Roche, Germany), DNA를 넣어 37℃ 배양기에서 16시간 반응하였다. TAE 아가로스 겔에 로딩하여 잘려진 구조체를 용리하였다.

또한 pcDNA3.1(+) 벡터를 EcoRI으로 잘라 TAE 겔에 로딩하여 크기를 확인하였다.

실시예 2-3: 알카라인 포스파타제( Alkaline phosphatase )

상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 구조체와 상기 실시예 2-2에서 얻어진 pcDNA3.1(+) 벡터를 라이게이션하기 위해 pcDNA3.1(+) 벡터에 알카라인 포스파타제를 처리하였다. 알카라인 포스파타제를 처리하면 벡터의 5' 프라임에 있는 인산기가 일부 손실되어 self-ligation을 막아주게 된다. 이로써 벡터와 인서트의 EcoRI부분이 만나 라이게이션이 될 수 있게 된다. Shrimp 알카라인 포스파타제(Roche, Switzerland)를 사용하여 10X 완충액 2㎕, DNA 1㎕, AP 효소 1㎕, dH2O를 20㎕까지 맞추고 37℃ 배양기에서 30분 반응 시킨후 72℃에서 2분 동안 불활성화시켰다.

실시예 2-4: 라이게이션

AP 처리가된 pcDNA3.1(+) 벡터와 EcoR1으로 잘린 인서트들을 T4 라이게이즈(Roche, USA)를 이용하여 10X 완충액 1㎕, 벡터 1㎕, 인서트 7㎕, T4 라이게이즈 1㎕(1 Unit)을 넣어 4℃에서 16시간 동안 반응하였다.

실시예 2-5: 형질전환

상기 실시예 2-4에서 라이게이션된 DNA를 DH5α 적격 세포에 형질전환하여 암피실린이 들어있는 LB배지에 플레이팅하여 37℃에 16시간 동안 반응시킨 후, 콜로니를 암피실린이 들어있는 5ml LB배지에 접종하여 mini-preparation하여 클로닝을 진행하였다.

실시예 3: 결과분석

실시예 3-1: 실시간 PCR 을 이용한 AM mRNA 수준의 분석

실시간 PCR 방법으로 AM의 mRNA 발현수준을 확인하고자, GAPDH의 mRNA 발현수준과 AM의 mRNA 발현수준을 각각 실시간 PCR 방법으로 확인하고, GAPDH의 mRNA 발현수준을 이용하여 정상화시켰다(도 4). 도 4는 각각의 클로닝된 AM 구조체로부터 발현된 AM의 mRNA 수준을 정량화하여 비교한 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 인트론 1이 삽입된 구조체에서 AN의 mRNA가 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 이로부터, 인트론 1이 AM의 발현량을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-2: HPLC 를 이용한 AM 단백질 수준의 분석

HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 분석 장치를 이용하여 AM 단백질 수준을 분석하였다.

구체적으로, X-Bridge BEH300 C18 컬럼(4.6 X 250 mm; Waters, USA)을 이용한 역상 HPLC에 의해 분석되었다. AM은 0.05%(v/v) TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 0 내지 40%의 아세토니트릴 농도구배 용매를 사용하여 1ml/min의 유속으로 50분동안 용출하여 분석하였다(도 5). 도 5는 AM 유전자 구조체의 단백질을 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)분석 장치를 통하여 찾아낸 AM peak을 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 표준시료를 이용하여 AM 단백질이 검출되는 peak 시간을 확인한 결과 28분경임을 확인하였다.

상기 도 5의 결과에 기초하여 AM 단백질 수준을 측정하였다.

상기 실시예 2-1에서 제작한 각각의 구조체를 포유동물세포에 도입하여 각각의 형질전환체를 제작하고, 상기 각 형질전환체로부터 각각의 AM을 발현시켰다. 이어, 각 형질전환체를 파쇄하고, 상기 파쇄물을 Sep-Pak C18 cartridge(Waters, Ireland)에 적용하여 AM을 정제하였다. 구체적으로, 상기 Sep-Pak C18 cartridge를 각각 5ml의 물과 아세토니트릴로 전처리하고, 각각의 시료 1ml을 적용한 다음, 3ml의 20% 아세토니트릴로 세척하고, 2ml의 100% 아세토니트릴로 용출하여 정제하였다(도 6). 도 6은 HPLC 분석을 이용하여 각각의 클로닝된 AM 구조체로부터 발현된 AM의 발현수준을 비교한 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 도 4의 결과와 유사하게 인트론 1이 삽입된 구조체에서 가장 높은 수준으로 AM이 발현됨을 알 수 있었다.

상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과를 종합하면, 인트론 1이 AM의 유전자 발현량을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Novel Expression Cassettes for Adrenomedullin Gene Harboring Intron 1 and Process for Preparing the Adrenomedullin Using the Same <130> PA120153/KR <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 1 tgacatcaag aaggtggtga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 2 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon1 sense primer <400> 3 ctggatagaa cagctcaagc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon4 antisense primer <400> 4 ggtttgctgt tcgcatatca c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon2 sense primer <400> 5 cttcctaggc gctgacaccg c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon2 antisense primer <400> 6 tccaaccgag cggtgtcagc g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon3 sense primer <400> 7 ctctgagtcg tcggaagagg g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon3 antisense primer <400> 8 tccgcagttc cctcttccca c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM sense primer <400> 9 taccgccaga gcatgaacaa c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM antisense primer <400> 10 gtagccctgg gggctgatct t 21 <210> 11 <211> 450 <212> DNA <213> intron 1 <400> 11 gtaggtgccg cagaccctgc gggttaagag gtggggtggg gggcagtgct tgccaaggcc 60 ctaaactggg agcgctgggt gaggggaaca acccactttg gagggttctc tgagagatag 120 atacacccca tatcctgggc ccagctcgtg cacacagctg gaggtccaga gacccagtcc 180 cctctgctcc gtcagccaag ttccaagaag ttgagcagag accctctggg agcctggcgg 240 ggtgcagcgg cctcccctgc ggggcctgtc acccggccgg cgcgtgcaaa cgcctctggc 300 gcctctctgc gcggagggag ataagcgtct gagccaggga aagcgcgggc taaacccgcc 360 tcgccggggc ccctgcccgc cctccgtgcc ccgcccgggc ggtgcagctg gcccgggtgc 420 tcacgctcga ctctctttct tcttttccag 450 <210> 12 <211> 150 <212> DNA <213> intron 2 <400> 12 gtgagtccgg gcagcgcctt cccccttgct ggtacctggc aggcaagggg aactgaccgt 60 tggtcccgaa ggtctagaag tgaatgggag cagggacagg cctgggcgtc acctgaacgc 120 acgcgaatcg ggtctgcttg tgttttccag 150 <210> 13 <211> 233 <212> DNA <213> intron 3 <400> 13 gtaactacgc cctgtgctgt ccagggacgg gagggaagga aggtgtgcgg gaggagttct 60 ctgtctccac tcccctggcc cgggggatcg tcggggctgg accgcagctc agatggcgcg 120 agcagtttcc agctccctct ggctctagaa tggctcccgt tcccggtgtt ggggccaaag 180 ctctgcttga tggggtctca agttgccttt cttccccctc cccccgcccg cag 233 <210> 14 <211> 2282 <212> DNA <213> AM gDNA <400> 14 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcaggtagg tgccgcagac cctgcgggtt aagaggtggg gtggggggca 180 gtgcttgcca aggccctaaa ctgggagcgc tgggtgaggg gaacaaccca ctttggaggg 240 ttctctgaga gatagataca ccccatatcc tgggcccagc tcgtgcacac agctggaggt 300 ccagagaccc agtcccctct gctccgtcag ccaagttcca agaagttgag cagagaccct 360 ctgggagcct ggcggggtgc agcggcctcc cctgcggggc ctgtcacccg gccggcgcgt 420 gcaaacgcct ctggcgcctc tctgcgcgga gggagataag cgtctgagcc agggaaagcg 480 cgggctaaac ccgcctcgcc ggggcccctg cccgccctcc gtgccccgcc cgggcggtgc 540 agctggcccg ggtgctcacg ctcgactctc tttcttcttt tccagggtct gcgcttcgca 600 gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc 660 gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg gagtttcgaa agaagtgagt ccgggcagcg 720 ccttccccct tgctggtacc tggcaggcaa ggggaactga ccgttggtcc cgaaggtcta 780 gaagtgaatg ggagcaggga caggcctggg cgtcacctga acgcacgcga atcgggtctg 840 cttgtgtttt ccaggtggaa taagtgggct ctgagtcgtg ggaagaggga actgcggatg 900 tccagcagct accccaccgg gctcgctgac gtgaaggccg ggcctgccca gacccttatt 960 cggccccagg acatgaaggg tgcctctcga agccccgaag acaggtaact acgccctgtg 1020 ctgtccaggg acgggaggga aggaaggtgt gcgggaggag ttctctgtct ccactcccct 1080 ggcccggggg atcgtcgggg ctggaccgca gctcagatgg cgcgagcagt ttccagctcc 1140 ctctggctct agaatggctc ccgttcccgg tgttggggcc aaagctctgc ttgatggggt 1200 ctcaagttgc ctttcttccc cctccccccg cccgcagcag tccggatgcc gcccgcatcc 1260 gagtcaagcg ctaccgccag agcatgaaca acttccaggg cctccggagc tttggctgcc 1320 gcttcgggac gtgcacggtg cagaagctgg cacaccagat ctaccagttc acagataagg 1380 acaaggacaa cgtcgccccc aggagcaaga tcagccccca gggctacggc cgccggcgcc 1440 ggcgctccct gcccgaggcc ggcccgggtc ggactctggt gtcttctaag ccacaagcac 1500 acggggctcc agcccccccg agtggaagtg ctccccactt tctttaggat ttaggcgccc 1560 atggtacaag gaatagtcgc gcaagcatcc cgctggtgcc tcccgggacg aaggacttcc 1620 cgagcggtgt ggggaccggg ctctgacagc cctgcggaga ccctgagtcc gggaggcacc 1680 gtccggcggc gagctctggc tttgcaaggg cccctccttc tgggggcttc gcttccttag 1740 ccttgctcag gtgcaagtgc cccagggggc ggggtgcaga agaatccgag tgtttgccag 1800 gcttaaggag aggagaaact gagaaatgaa tgctgagacc cccggagcag gggtctgagc 1860 cacagccgtg ctcgcccaca aactgatttc tcacggcgtg tcaccccacc agggcgcaag 1920 cctcactatt acttgaactt tccaaaacct aaagaggaaa agtgcaatgc gtgttgtaca 1980 tacagaggta actatcaata tttaagtttg ttgctgtcaa gatttttttt gtaacttcaa 2040 atatagagat atttttgtac gttatatatt gtattaaggg cattttaaaa gcaattatat 2100 tgtcctcccc tattttaaga cgtgaatgtc tcagcgaggt gtaaagttgt tcgccgcgtg 2160 gaatgtgagt gtgtttgtgt gcatgaaaga gaaagactga ttacctcctg tgtggaagaa 2220 ggaaacaccg agtctctgta taatctattt acataaaatg ggtgatatgc gaacagcaaa 2280 cc 2282 <210> 15 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM cDNA <400> 15 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg 180 atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg 240 gagtttcgaa agaagtggaa taagtgggct ctgagtcgtg ggaagaggga actgcggatg 300 tccagcagct accccaccgg gctcgctgac gtgaaggccg ggcctgccca gacccttatt 360 cggccccagg acatgaaggg tgcctctcga agccccgaag acagcagtcc ggatgccgcc 420 cgcatccgag tcaagcgcta ccgccagagc atgaacaact tccagggcct ccggagcttt 480 ggctgccgct tcgggacgtg cacggtgcag aagctggcac accagatcta ccagttcaca 540 gataaggaca aggacaacgt cgcccccagg agcaagatca gcccccaggg ctacggccgc 600 cggcgccggc gctccctgcc cgaggccggc ccgggtcgga ctctggtgtc ttctaagcca 660 caagcacacg gggctccagc ccccccgagt ggaagtgctc cccactttct ttaggattta 720 ggcgcccatg gtacaaggaa tagtcgcgca agcatcccgc tggtgcctcc cgggacgaag 780 gacttcccga gcggtgtggg gaccgggctc tgacagccct gcggagaccc tgagtccggg 840 aggcaccgtc cggcggcgag ctctggcttt gcaagggccc ctccttctgg gggcttcgct 900 tccttagcct tgctcaggtg caagtgcccc agggggcggg gtgcagaaga atccgagtgt 960 ttgccaggct taaggagagg agaaactgag aaatgaatgc tgagaccccc ggagcagggg 1020 tctgagccac agccgtgctc gcccacaaac tgatttctca cggcgtgtca ccccaccagg 1080 gcgcaagcct cactattact tgaactttcc aaaacctaaa gaggaaaagt gcaatgcgtg 1140 ttgtacatac agaggtaact atcaatattt aagtttgttg ctgtcaagat tttttttgta 1200 acttcaaata tagagatatt tttgtacgtt atatattgta ttaagggcat tttaaaagca 1260 attatattgt cctcccctat tttaagacgt gaatgtctca gcgaggtgta aagttgttcg 1320 ccgcgtggaa tgtgagtgtg tttgtgtgca tgaaagagaa agactgatta cctcctgtgt 1380 ggaagaagga aacaccgagt ctctgtataa tctatttaca taaaatgggt gatatgcgaa 1440 cagcaaacc 1449 <210> 16 <211> 1868 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM cDNA containing intron 1 <400> 16 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcaggtagg tgccgcagac cctgcgggtt aagaggtggg gtggggggca 180 gtgcttgcca aggccctaaa ctgggagcgc tgggtgaggg gaacaaccca ctttggaggg 240 ttctctgaga gatagataca ccccatatcc tgggcccagc tcgtgcacac agctggaggt 300 ccagagaccc agtcccctct gctccgtcag ccaagttcca agaagttgag cagagaccct 360 ctgggagcct ggcggggtgc agcggcctcc cctgcggggc ctgtcacccg gccggcgcgt 420 gcaaacgcct ctggcgcctc tctgcgcgga gggagataag cgtctgagcc agggaaagcg 480 cgggctaaac ccgcctcgcc ggggcccctg cccgccctcc gtgccccgcc cgggcggtgc 540 agctggcccg ggtgctcacg ctcgactctc tttcttcttt tccagggtct gcgcttcgca 600 gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc 660 gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg gagtttcgaa agaaggtctg cgcttcgcag 720 ccgggatgaa gctggtttcc gtcgccctga tgtacctggg ttcgctcgcc ttcctaggcg 780 ctgacaccgc tcggttggat gtcgcgtcgg agtttcgaaa gaacagtccg gatgccgccc 840 gcatccgagt caagcgctac cgccagagca tgaacaactt ccagggcctc cggagctttg 900 gctgccgctt cgggacgtgc acggtgcaga agctggcaca ccagatctac cagttcacag 960 ataaggacaa ggacaacgtc gcccccagga gcaagatcag cccccagggc tacggccgcc 1020 ggcgccggcg ctccctgccc gaggccggcc cgggtcggac tctggtgtct tctaagccac 1080 aagcacacgg ggctccagcc cccccgagtg gaagtgctcc ccactttctt taggatttag 1140 gcgcccatgg tacaaggaat agtcgcgcaa gcatcccgct ggtgcctccc gggacgaagg 1200 acttcccgag cggtgtgggg accgggctct gacagccctg cggagaccct gagtccggga 1260 ggcaccgtcc ggcggcgagc tctggctttg caagggcccc tccttctggg ggcttcgctt 1320 ccttagcctt gctcaggtgc aagtgcccca gggggcgggg tgcagaagaa tccgagtgtt 1380 tgccaggctt aaggagagga gaaactgaga aatgaatgct gagacccccg gagcaggggt 1440 ctgagccaca gccgtgctcg cccacaaact gatttctcac ggcgtgtcac cccaccaggg 1500 cgcaagcctc actattactt gaactttcca aaacctaaag aggaaaagtg caatgcgtgt 1560 tgtacataca gaggtaacta tcaatattta agtttgttgc tgtcaagatt ttttttgtaa 1620 cttcaaatat agagatattt ttgtacgtta tatattgtat taagggcatt ttaaaagcaa 1680 ttatattgtc ctcccctatt ttaagacgtg aatgtctcag cgaggtgtaa agttgttcgc 1740 cgcgtggaat gtgagtgtgt ttgtgtgcat gaaagagaaa gactgattac ctcctgtgtg 1800 gaagaaggaa acaccgagtc tctgtataat ctatttacat aaaatgggtg atatgcgaac 1860 agcaaacc 1868 <210> 17 <211> 1599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM cDNA containing intron 2 <400> 17 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg 180 atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg 240 gagtttcgaa agaagtgagt ccgggcagcg ccttccccct tgctggtacc tggcaggcaa 300 ggggaactga ccgttggtcc cgaaggtcta gaagtgaatg ggagcaggga caggcctggg 360 cgtcacctga acgcacgcga atcgggtctg cttgtgtttt ccaggtggaa taagtgggct 420 ctgagtcgtg ggaagaggga actgcggatg tccagcagct accccaccgg gctcgctgac 480 gtgaaggccg ggcctgccca gacccttatt cggccccagg acatgaaggg tgcctctcga 540 agccccgaag acagcagtcc ggatgccgcc cgcatccgag tcaagcgcta ccgccagagc 600 atgaacaact tccagggcct ccggagcttt ggctgccgct tcgggacgtg cacggtgcag 660 aagctggcac accagatcta ccagttcaca gataaggaca aggacaacgt cgcccccagg 720 agcaagatca gcccccaggg ctacggccgc cggcgccggc gctccctgcc cgaggccggc 780 ccgggtcgga ctctggtgtc ttctaagcca caagcacacg gggctccagc ccccccgagt 840 ggaagtgctc cccactttct ttaggattta ggcgcccatg gtacaaggaa tagtcgcgca 900 agcatcccgc tggtgcctcc cgggacgaag gacttcccga gcggtgtggg gaccgggctc 960 tgacagccct gcggagaccc tgagtccggg aggcaccgtc cggcggcgag ctctggcttt 1020 gcaagggccc ctccttctgg gggcttcgct tccttagcct tgctcaggtg caagtgcccc 1080 agggggcggg gtgcagaaga atccgagtgt ttgccaggct taaggagagg agaaactgag 1140 aaatgaatgc tgagaccccc ggagcagggg tctgagccac agccgtgctc gcccacaaac 1200 tgatttctca cggcgtgtca ccccaccagg gcgcaagcct cactattact tgaactttcc 1260 aaaacctaaa gaggaaaagt gcaatgcgtg ttgtacatac agaggtaact atcaatattt 1320 aagtttgttg ctgtcaagat tttttttgta acttcaaata tagagatatt tttgtacgtt 1380 atatattgta ttaagggcat tttaaaagca attatattgt cctcccctat tttaagacgt 1440 gaatgtctca gcgaggtgta aagttgttcg ccgcgtggaa tgtgagtgtg tttgtgtgca 1500 tgaaagagaa agactgatta cctcctgtgt ggaagaagga aacaccgagt ctctgtataa 1560 tctatttaca taaaatgggt gatatgcgaa cagcaaacc 1599 <210> 18 <211> 1682 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AM cDNA containing intron 3 <400> 18 ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60 tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120 tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccgggatga agctggtttc cgtcgccctg 180 atgtacctgg gttcgctcgc cttcctaggc gctgacaccg ctcggttgga tgtcgcgtcg 240 gagtttcgaa agaagtggaa taagtgggct ctgagtcgtg ggaagaggga actgcggatg 300 tccagcagct accccaccgg gctcgctgac gtgaaggccg ggcctgccca gacccttatt 360 cggccccagg acatgaaggg tgcctctcga agccccgaag acaggtaact acgccctgtg 420 ctgtccaggg acgggaggga aggaaggtgt gcgggaggag ttctctgtct ccactcccct 480 ggcccggggg atcgtcgggg ctggaccgca gctcagatgg cgcgagcagt ttccagctcc 540 ctctggctct agaatggctc ccgttcccgg tgttggggcc aaagctctgc ttgatggggt 600 ctcaagttgc ctttcttccc cctccccccg cccgcagcag tccggatgcc gcccgcatcc 660 gagtcaagcg ctaccgccag agcatgaaca acttccaggg cctccggagc tttggctgcc 720 gcttcgggac gtgcacggtg cagaagctgg cacaccagat ctaccagttc acagataagg 780 acaaggacaa cgtcgccccc aggagcaaga tcagccccca gggctacggc cgccggcgcc 840 ggcgctccct gcccgaggcc ggcccgggtc ggactctggt gtcttctaag ccacaagcac 900 acggggctcc agcccccccg agtggaagtg ctccccactt tctttaggat ttaggcgccc 960 atggtacaag gaatagtcgc gcaagcatcc cgctggtgcc tcccgggacg aaggacttcc 1020 cgagcggtgt ggggaccggg ctctgacagc cctgcggaga ccctgagtcc gggaggcacc 1080 gtccggcggc gagctctggc tttgcaaggg cccctccttc tgggggcttc gcttccttag 1140 ccttgctcag gtgcaagtgc cccagggggc ggggtgcaga agaatccgag tgtttgccag 1200 gcttaaggag aggagaaact gagaaatgaa tgctgagacc cccggagcag gggtctgagc 1260 cacagccgtg ctcgcccaca aactgatttc tcacggcgtg tcaccccacc agggcgcaag 1320 cctcactatt acttgaactt tccaaaacct aaagaggaaa agtgcaatgc gtgttgtaca 1380 tacagaggta actatcaata tttaagtttg ttgctgtcaa gatttttttt gtaacttcaa 1440 atatagagat atttttgtac gttatatatt gtattaaggg cattttaaaa gcaattatat 1500 tgtcctcccc tattttaaga cgtgaatgtc tcagcgaggt gtaaagttgt tcgccgcgtg 1560 gaatgtgagt gtgtttgtgt gcatgaaaga gaaagactga ttacctcctg tgtggaagaa 1620 ggaaacaccg agtctctgta taatctattt acataaaatg ggtgatatgc gaacagcaaa 1680 cc 1682 <210> 19 <211> 156 <212> DNA <213> AM <400> 19 accgccagag catgaacaac ttccagggcc tccggagctt tggctgccgc ttcgggacgt 60 gcacggtgca gaagctggca caccagatct accagttcac agataaggac aaggacaacg 120 tcgcccccag gagcaagatc agcccccagg gctacg 156

Claims (9)

1. 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM) 유전자의 엑손 1 및 엑손 2 사이에 인트론 1이 삽입된 형태를 가지는 아드레노메듈린 발현 유전자.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 것인 아드레노메듈린 발현 유전자.
   
3. 제1항의 아드레노메듈린 발현 유전자를 포함하는 발현 벡터.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 발현 벡터는 도 2에 개시된 개열지도를 갖는 pcDNA3.1(+)AM Int3 벡터인 것인 발현 벡터.
   
5. 제3항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
   
6. 제5항의 형질전환체를 배양하고 이로부터 아드레노메듈린을 회수하는 단계를 포함하는 아드레노메듈린 생산방법
   
7. 제3항의 발현벡터 또는 제5항의 형질전환체를 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 혈관질환은 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종 및 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 조성물.
   
9. (ⅰ) 상기 형질전환체를 배양하여 아드레노메듈린(adrenomedullin, AM)을 생산하는 단계; 및,
   (ⅱ) 상기 생산된 AM을 포함하는 혈관질환의 치료제를 제조하는 단계를 포함하는, 혈관질환 예방 및 치료제의 제조방법.

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