ES2701091T3

ES2701091T3 - Elemento de ADN que tiene actividad de aumento de expresión de un gen exógeno

Info

Publication number: ES2701091T3
Application number: ES15188915T
Authority: ES
Inventors: Daisuke Nishimiya; Tatsuya Inoue
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2019-02-20
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: WO2012005378A3; AU2016203681A1; US11060108B2; US9371543B2; KR101920187B1; TWI507523B; ES2565428T3; CA2804381A1; AU2016203681B2; TW201207103A; JP2013531967A; IL243763A0; SG186788A1; KR20130111514A; EP3026117B1; CN103080321A; TW201604280A; US10407694B2; AU2011274864B2; CN105950621A

Abstract

Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID Nº: 3 en el listado de secuencias.

Description

DESCRIPCIÓN

Elemento de ADN que tiene actividad de aumento de expresión de un gen exógeno

Campotécnico

La presente invención se refiere a una célula hospedadora de mamífero cuya capacidad para segregar una proteína exógena se ha aumentado usando un vector de expresión de un gen exógeno que tiene un elemento de ADN y a un procedimiento para producir la proteína exógena usando la célula hospedadora.

Técnicaantecedente

Debido al desarrollo de las técnicas de recombinación genética, se ha expandido rápidamente el mercado de productos farmacéuticos proteicos tales como proteínas terapéuticas y fármacos de anticuerpos. En particular, los fármacos de anticuerpos tienen una alta especificidad y no producen una reacción inmunitaria adversa incluso cuando se administran al cuerpo humano y por lo tanto, el desarrollo de los mismos se ha llevado a cabo activamente.

Como célula hospedadora en la que se produce una proteína farmacéutica tipificada por un fármaco de anticuerpo puede usarse un microorganismo, una célula de insecto, animal o vegetal, una célula de animal o vegetal transgénica, o similares. Con el fin de que la proteína farmacéutica tenga actividad biológica o inmunogenicidad, es esencial la modificación post-traduccional tal como el plegado o la glucosilación y por lo tanto no será adecuado un microorganismo en el que no se pueda llevar a cabo una complicada modificación post-traduccional o una planta que tenga una estructura de glucanos diferente como célula hospedadora que funcione como biorreactor. El uso de una célula de mamífero cultivada, tal como una célula CHO, que sea de una especie estrechamente relacionada con los seres humanos es convencional actualmente, considerando que dicha célula tenga una estructura de glucanos similar a la de los seres humanos y que sea segura, y que pueda llevarse a cabo la modificación post-traduccional usando dicha célula.

En los casos en los que se usa una célula de mamífero cultivada como célula hospedadora, existe los problemas de que la velocidad de crecimiento es baja, la productividad es baja, el coste es alto, etc., en comparación con un microorganismo o similar (véase el documento no de patente 1). Además, con el fin de usar un producto farmacéutico proteico en un ensayo clínico, es necesario administrar una gran cantidad del producto. Por lo tanto, la falta de capacidad de producción del mismo también es un problema en todo el mundo. Por consiguiente, con el fin de mejorar la productividad de un gen exógeno en una célula de mamífero en cultivo, se han llevado a cabo hasta ahora muchos estudios de promotores, amplificadores, marcadores de selección farmacológicos, técnicas de amplificación genética y de modificación de cultivos, y similares. Sin embargo, la situación actual es que no se ha establecido aún un sistema capaz de aumentar la expresión génica uniformemente. Como una de las causas de la baja productividad de una proteína exógena, se considera un “efecto de posición” (véase el documento no de patente 2). Cuando un gen exógeno se introduce en una célula hospedadora, se integra aleatoriamente en el genoma cromosómico del hospedador y la transcripción del gen exógeno se ve afectada en gran medida por el ADN que se encuentra alrededor de la región donde se ha integrado el gen exógeno. Un efecto de posición se ve afectado por factores tales como el sitio de inserción, el número de copias, la estructura, etc. del gen exógeno, sin embargo es muy difícil controlar el sitio de inserción en el cromosoma.

Con el fin de resolver el problema, se han identificado recientemente secuencias de polinucleótidos reguladoras (también conocidas como elementos de ADN) tales como la región de control del locus (LCR), la región de anclaje del armazón/matriz (S/MAR), un aislante, el elemento ubicuo de apertura de cromatina (UCOE), y un anti-represor (elemento STAR) (véanse los documentos no de patente 3 a 6). La LCR no es necesaria para abrir la estructura de cromatina en un locus génico endógeno. Sin embargo, la LCR es un elemento regulador de la transcripción que tiene la capacidad de abrir la estructura de cromatina alrededor del ADN donde se ha integrado el gen exógeno y de remodelar un amplio tramo de cromatina cuando se usa junto con la unidad de expresión de un gen exógeno y se dice que necesita una región rica en AT (véase el documento no de patente 7).

El elemento de ADN mencionado anteriormente tipificado por la LCR se usa a menudo en combinación con un promotor, se sabe que en los caos en los que se usa el elemento de ADN en combinación con un promotor, el nivel de expresión de un gen exógeno aumenta en comparación con los casos en los que solamente se usa el promotor. Sin embargo, hasta ahora se han comunicado muy pocos tipos de elementos de ADN, y los distintos mecanismos que contribuyen al aumento de la expresión de un gen exógeno son diferentes entre sí. Además, incluso si se usan en combinación un elemento de ADN y un promotor, no se producen cantidades suficientes de una proteína terapéutica bajo el control del elemento de ADN y el promotor. Por lo tanto, no se puede decir que se haya adquirido un conocimiento suficiente de un elemento de ADN que sea capaz de aumentar la productividad de una proteína exógena.

El documento no de patente 8 desvela la secuencia completa de un clon BAC de Homo sapiens de 139722 nucleótidos.

El documento de patente 1 y el documento no de patente 9 desvelan una secuencia de ADN genómico de Homo sapiens de 170489 nucleótidos.

Por consiguiente, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de una proteína exógena para su uso en un producto farmacéutico proteico usando un elemento de ADN que tenga una alta actividad de aumento de la expresión de un gen exógeno en una célula hospedadora tal como una célula de mamífero en cultivo.

Listado de citas

Documento de patente

Documento de patente 1: US 2007/161003

Bibliografía no de patente

BNP 1: Florian M. Wurm. (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398

BNP 2: Ted H. J. Kwaks y Arie P. Otte. (2006) Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. TRENDS in Biotechnol. 24(3): 137-142

BNP 3: Pierre-Alain Girod, Duc-Quang Nguyen y col. (2007) Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells. Nat. Methods. 4(9): 747-753

BNP 4: Adam C. Bell, Adam G. West, Gary Felsenfeld (2001) Insulators and Boundaries: Versatile Regulatory Elements in the Eukaryotic Genome, Science 291: 447-450

BNP 5: Steven Williams, Tracey Mustoe y col. (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol. 5(17): 1-9

BNP 6: Arie P. Otte, Ted H. J. Kwaks y col. (2007) Various Expression-Augmenting DNA Elements Benefit from STAR-Select, a Novel High Stringency Selection System for Protein Expression. Biotechnol. Prog. 23: 801-807 BNP 7: Qiliang Li, Kenneth R. Peterson, Xiangdong Fang y George Stamatoyannopoulos, (2002) Locus control regions, Blood 100(9): 3077-3086

BNP 8: BASE DE dAtOS EMBL [en línea] 11 de septiembre de 2001 (11-09-2001), "Homo sapiens BAC clone RP11-152F13 from 4, complete sequence", recuperado del número de registro EBI EM_STD: AC093770. N.° de registro de la base de datos AC093770.

BNP 9: BASE DE DATOS Geneseq [en línea] 5 de marzo de 2009 (5-3-2009), "Human hD7-063 genomic DNA sequence, SEQ ID 56.", recuperado del número de registro EBI GSN: AUL93993, Registro de la base de datos n° AUL93993.

Sumariodelainvención

Problemastécnicos

Como se ha descrito anteriormente, aún no hay muchos tipos de elementos ADN que sean secuencias de polinucleótidos reguladoras y además, hay pocos elementos de ADN entre ellos que sean altamente eficaces en potenciar la expresión de un gen exógeno. Un objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para conseguir una alta expresión de manera estable en una célula de mamífero usando un elemento de ADN que aumenta la activación de la trascripción estando acompañado por un cambio en la estructura de cromatina alrededor de un locus génico en el que se ha introducido una unidad de expresión de un gen exógeno, etc.

Soluciónalproblema

Los presentes inventores han hecho estudios exhaustivos con el fin de resolver los problemas anteriores y como resultado, descubrieron que la productividad y secreción de una proteína exógena que se va a expresar puede mejorarse usando uno o más de los tipos específicos de elementos de ADN en una célula de mamífero en cultivo, y de esta manera, completaron la invención.

Es decir, la invención incluye las siguientes invenciones.

(1) Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias.

(2) Un polinucleótido que comprende al menos 3000, 200 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias en el que el polinucleótido es un fragmento parcial de la SEC Id N°: 3 y tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

(3) Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que tiene una homología de 95 % o más o de 99 % o más con la secuencia del polinucleótido de acuerdo con los puntos (1) o (2) y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

(4) Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias del polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (3) y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

(5) Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que contiene:

- al menos una de las secuencias de polinucleótidos de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (3); y - al menos uno de:

(a) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias, secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

(b) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias, secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

(c) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias, secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

(d) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias, secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

(6) Un vector que comprende un elemento de ADN que tiene la secuencia de polinucleótido de:

(i) un polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5);

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias en el que cada secuencia de polinucleótido es un fragmento parcial de la SEC ID N°:3 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno; o

(7) Un vector de acuerdo con el punto (6), en que el vector es un vector de expresión de un gen exógeno que comprende además un gen exógeno, y en el que el elemento de ADN está posicionado con respecto al gen exógeno de una manera funcionalmente eficaz.

(8) El vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con el punto (7), en el que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína multimérica, o una proteína hetero-multimérica.

(9) El vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con el punto (8), en el que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína hetero-multimérica y es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

(10) Una célula transformada dentro de la que:

a) se han introducido el vector de acuerdo con el punto (6) y un gen exógeno, o

b) se ha introducido el vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (7) a (9).

(11) La célula transformada de acuerdo con el punto (10), en la que la célula es una célula en cultivo procedente de un mamífero, en la que la célula cultivada es una célula que se selecciona entre el grupo que consiste en células COS-1, células 293, y células CHO.

(12) La célula transformada de acuerdo con los puntos (10) u (11), en la que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína multimérica o una proteína hetero-multimérica.

(13) La célula transformada de acuerdo con el punto (12), en la que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína hetero-multimérica y es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

(14) Un procedimiento para producir una proteína caracterizado porque comprende cultivar la célula transformada de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (10) a (13) y obtener la proteína codificada por el gen exógeno a partir del producto del cultivo resultante.

(15) Un procedimiento para potenciar la expresión de un gen exógeno en una célula transformada dentro de la que se ha introducido un gen exógeno o un vector de expresión de un gen exógeno, caracterizado porque usa: (i) un polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5);

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias en el que cada secuencia de polinucleótido es un fragmento parcial de la SEQ ID N°:3 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno;

(iii) un vector de acuerdo con el punto (6) o un vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (7) a (9).

(16) El uso de:

(i) el polinucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos (1) a (5);

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias en el que cada secuencia de polinucleótido es un fragmento parcial de la SEQ ID N°:3 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno; o

(iii) un vector de acuerdo con el punto (6),

para potenciar la expresión de un gen exógeno en una célula transformada.

Efectosventajososdelainvención

De acuerdo con la invención, al introducir un vector de expresión de un gen exógeno usando un elemento de ADN en una célula hospedadora de mamífero, se puede potenciar significativamente la expresión de un gen exógeno para una proteína terapéutica, un anticuerpo o similar.

Brevedescripcióndelosdibujos

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra un gráfico en el que se confirma por amplificación de una región de GAPDH que en una muestra sometida a ChIP-on-chip se inmunoprecipitó la cromatina específicamente con un anticuerpo anti-histona H3 acetilada.

[Fig. 2] La Fig. 2 es una vista esquemática de un vector de expresión SEAP en el que se ha insertado un elemento de ADN.

[Fig. 3] La Fig. 3 es un gráfico que muestra la expresión de SEAP bajo el control de un promotor de CMV en una línea celular CHO que expresa establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A2, A7, A18, B5 o C14. Se confirmaron los efectos de los elementos A2, A7, A18, B5 y C14 sobre el potenciamiento de la expresión.

[Fig. 4] La Fig. 4 comprende dos gráficos que muestran la expresión de SEAP bajo el control de un promotor EF-1a o SV40 en una línea celular CHO que expresa establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A2 o A7. Se confirmaron los efectos de los elementos A2 y A7 sobre la potenciación de la expresión.

[Fig. 5] La Fig. 5 es una vista esquemática de un vector de expresión de anticuerpo (co-expresión del gen X de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo) en el que se ha insertado un elemento de ADN.

[Fig.6] La Fig. 6 comprende dos gráficos que muestran los niveles de secreción (medidos mediante un procedimiento ELISA) de un anticuerpo bajo el control de un promotor CMV o EF-1a en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A7. Se confirmó el efecto del elemento de ADN A7 sobre la potenciación de la expresión.

[Fig. 7] La Fig. 7 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN A2 y de secuencias relacionadas.

[Fig.8] La Fig. 8 comprende tres gráficos que muestran la expresión de SEAP en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A2 o una secuencia relacionada. Se confirmaron los efectos del elemento de ADN A2 y de las secuencias relacionadas sobre la potenciación de la expresión.

[Fig. 9] La Fig. 9 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia del elemento de ADN A7 y de secuencias relacionadas.

[Fig. 10] La Fig. 10 comprende tres gráficos que muestran la expresión de SEAP en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A7 o una secuencia relacionada. Se confirmaron los efectos del elemento de ADN A7 y secuencias relacionadas sobre la potenciación de la expresión.

[Fig. 11] La Fig. 11 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia de un elemento de ADN A18 y de secuencias relacionadas.

[Fig. 12] La Fig. 12 es un gráfico que muestra la expresión de SEAP en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A18 o una secuencia relacionada. Se confirmaron los efectos del elemento de ADN A18 y secuencias relacionadas sobre la potenciación de la expresión.

[Fig. 13] La Fig. 13 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia de un elemento de ADN B5 y de secuencias relacionadas.

[Fig. 14] La Fig. 14 es un gráfico que muestra la expresión de SEAP en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN B5 o una secuencia relacionada. Se confirmaron los efectos del elemento de ADN B5 y secuencias relacionadas sobre el aumento de la expresión.

[Fig. 15] La Fig. 15 es una tabla que muestra las longitudes de secuencia de un elemento de ADN C14 y de secuencias relacionadas.

[Fig. 16] La Fig. 16 es un gráfico que muestra la expresión de SEAP en una línea celular CHO que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN C14 o una secuencia relacionada. Se confirmaron los efectos del elemento de ADN C14 y secuencias relacionadas sobre el aumento de la expresión.

[Fig. 17] La Fig. 17 es un gráfico que muestra la expresión de SEAP en una línea celular HEK293 que expresaba establemente sin un elemento de ADN o con un elemento de ADN A2, A7, A18, B5, o C14. Se confirmaron los efectos de los elementos de ADN A2, A7, A18, B5, y C14 sobre el aumento de la expresión en células HEK293.

[Fig. 18] La Fig. 18 es una vista que muestra los nucleótidos del punto de partida y final basándose en la secuencia de longitud completa de un elemento de ADN A2, A7, o A18.

[Fig. 19] La Fig. 19 es una vista que muestra los nucleótidos del punto de partida y final basándose en la secuencia de longitud completa de un elemento de ADN B5 o C14.

Descripcióndelasrealizaciones

En lo sucesivo, la invención se describirá específicamente en referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan el ámbito técnico de la invención. Los plásmidos, enzimas de restricción, enzimas de modificación de ADN y similares que se van a usar en los ejemplos de la invención son productos disponibles en el comercio y pueden usarse de acuerdo con procedimientos comunes. Además, los procedimientos que se usan para la clonación de ADN, determinación de secuencias de polinucleótidos, transformación de una células hospedadoras, cultivo de una célula hospedadora transformada, aislamiento de un anticuerpo a partir de una solución de cultivo obtenida, purificación de un anticuerpo y similares también son bien conocidos por los expertos en la técnica o están disponibles en la bibliografía.

El término “gen” tal como se usa en el presente documento incluye no solo el ADN, sino también el ARNm del mismo, el ADNc y el ARN del mismo.

El término “polinucleótido” tal como se usa en el presente documento se usa con el mismo significado que ácido nucleico y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y cebadores.

Los términos “polipéptido” y “proteína” tal como se usan en el presente documento se usan sin distinción.

La expresión “expresión génica” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fenómeno en el que se transcribe un ARNm a partir de un gen y/o a un fenómeno en el cual se traduce una proteína a partir del ARNm. La expresión “gen exógeno” tal como se usa en el presente documento se refiere a un gen que se introduce artificialmente en una célula hospedadora.

La expresión “proteína exógena” tal como se usa en el presente documento se refiere a una proteína codificada por el gen exógeno.

La expresión “unidad de expresión génica” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que tiene, en la dirección de la fase de lectura de la transcripción, al menos una región promotora, un gen exógeno y una región de terminación de la transcripción (señal de adición de poli(A)).

La expresión “actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno” tal como se usa en el presente documento se refiere a la actividad de potenciar la producción de una proteína exógena en una célula hospedadora creando un ambiente ventajoso para la transcripción y traducción del ADN alrededor de la unidad de expresión génica que contiene un gen exógeno y que mejora significativamente la eficacia de la transcripción y traducción.

La expresión “elemento de ADN” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno en los casos en los que el polinucleótido se localiza en la vecindad de una unidad de expresión génica o en un vector de expresión de un gen exógeno que contiene una unidad de expresión génica.

La expresión “fragmento funcional de un anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno y que incluye Fab, F(ab')2, y similares. Sin embargo, la expresión no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión por un antígeno.

1. Elemento de ADN que se usa para potenciar la expresión de un gen exógeno

Tal como se muestra en el ejemplo 1, se puede obtener un elemento de ADN de acuerdo con la invención usando la interacción entre la histona H3 acetilada y el ADN genómico. En general, se dice que la acetilación de histonas (H3 y H4) se asocia con la activación de la transcripción, y se han defendido dos teorías principales. Una teoría es que la acetilación de histonas se asocia con un cambio en la conformación del nucleosoma de tal modo que las colas de histonas se acetilan, neutralizándose eléctricamente de esta manera, lo que da como resultado un debilitamiento de las interacciones ADN-histona (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6): 320-329). La otra teoría es que la acetilación de las histonas se asocia con el reclutamiento de varios factores de transcripción (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases - versatile players. Genes Cells. 6(2): 79-86). En cualquiera de las dos teorías, hay una elevada posibilidad de que la acetilación de las histonas se asocie con la activación de la transcripción y llevando a cabo la inmunoprecipitación de cromatina (ChlP) usando un anticuerpo anti-histona H3 acetilada, es posible concentrar un elemento de ADN que interactúe con la histona H3 acetilada.

En la presente invención, A18 es un ejemplo de un elemento de ADN que se va a usar para aumentar la expresión de un gen exógeno. El A18 se localiza en la región desde 111275976a 111284450del cromosoma 4 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8475pb, que tiene un contenido de AT del 62,54 %. La secuencia de polinucleótido de A18 está representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias.

A2, A7, B5 y C14 son ejemplos de elementos de ADN similares. A2 está localizado en la región desde 80966429 a 80974878 del cromosoma humano 15 y es una secuencia de polinucleótido de 8450 pb, que tiene un contenido de AT del 62,2 %. La secuencia de polinucleótido de A2 se representa por la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias. A7 está localizado en la región desde 88992123 a 89000542 del cromosoma 11 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8420 pb, que tiene un contenido de AT del 62,52 %. La secuencia de polinucleótido de A7 está representada por la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias.

B5 se localiza en la región desde 143034684 a 143043084 del cromosoma 1 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8401 pb, que tiene un contenido de AT del 66,37 %. La secuencia de polinucleótido de B5 está representada por la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias.

Finalmente, C14 se localiza en la región desde 46089056 a 46097482 del cromosoma 11 humano y es una secuencia de polinucleótido de 8427 pb, que tiene un contenido de AT del 63,81 %. La secuencia de polinucleótido de C14 está representada por la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias.

En la invención, la actividad de aumento de la expresión de un gen exógeno del elemento de ADN se puede ensayar usando la actividad de una proteína codificada por un gen indicador tal como SEAP como índice. En los casos en los que de la actividad de una proteína indicadora en presencia del elemento de ADN aumenta, preferentemente el doble o más, más preferentemente el cuádruple o más, aún más preferentemente el quíntuple o más en comparación con el caso en el que no está presente el elemento de ADN, se puede determinar que el elemento de ADN tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno. Incluso en los casos en los que la actividad aumenta al doble o más, se espera esto reduzca la escala del cultivo celular y el tiempo de cultivo celular, y como resultado, es posible aumentar el rendimiento y reducir el coste del cultivo celular. Si aumenta el rendimiento, entonces es posible suministrar de manera estable una proteína exógena para su uso como agente farmacéutico. Además, si se reduce el coste del cultivo celular, se reduce el coste de la proteína exógena que se usa como agente farmacéutico, y también se reduce la carga financiara sobre los pacientes a quienes se va a administrar la proteína exógena.

En la invención, se puede usar el elemento de ADN A18 solo, y pueden usarse dos o más copias del elemento de ADN A18. Como alternativa, puede usarse al menos un elemento de ADN A18 en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN anteriores.

A7, A7, B5 y C14 son ejemplos preferidos de diferentes tipos de elementos de ADN para su uso en la invención en combinación con el elemento de ADN A18.

El elemento de ADN que se va a usar tal como se ha descrito anteriormente puede ser una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene una homología del 95 % o más respecto de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos representadas por las SEC ID N°: 1 a 5 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno. La homología del 95 % o más es más preferentemente una homología del 99 % o más. La búsqueda de homología de secuencia de polinucleótido puede llevarse a cabo, por ejemplo, en la Base de datos de ADN de Japón o similares usando un programa tal como FASTA o BLAST.

El elemento de ADN que para su uso tal como se ha descrito anteriormente puede ser un elemento de ADN que hibride con un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido complementaria a un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de polinucleótidos representadas por las SEC ID No: 1 a 5 en condiciones rigurosas y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

La expresión “condiciones rigurosas” tal como se usa en el presente documento se refiere a condiciones en las que se forma lo que se denomina un híbrido específico pero no se forma un híbrido no específico. Por ejemplo, son condiciones rigurosas ejemplares las condiciones en las que hibrida una hebra complementaria de un ácido nucleico que consiste en una secuencia de polinucleótido que tiene una elevada homología, es decir, una secuencia de polinucleótido que tiene una homología del 95 % o más, más preferentemente del 99 % o más respecto de una secuencia de polinucleótido seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias nucleotídicas representadas por las SEC ID N°: 1 a 5 y en las que no hibrida una hebra complementaria de un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que tenga menor homología. Para ser más específicos, se pueden ejemplificar condiciones en las que la concentración de sal sódica sea de 15 a 750 mM, preferentemente de 50 a 750 mM, más preferentemente de 300 a 750 mM, la temperatura sea de 25 a 70 °C, preferentemente de 50 a 70 °C, más preferentemente de 55 a 65 °C, y la concentración de formamida sea del 0 al 50 %, preferentemente del 20 al 50 %, más preferentemente del 35 al 45 %. Además, se pueden ejemplificar como condiciones rigurosas, condiciones para el lavado de un filtro tras la hibridación en las que la concentración de sal de sodio sea generalmente de 15 a 600 mM, preferentemente de 50 a 600 mM, más preferentemente de 300 a 600 mM, y la temperatura sea de 50 a 70 °C, preferentemente de 55 a 70 °C, más preferentemente de 60 a 65 °C.

Un experto en la técnica puede obtener fácilmente un gen homólogo con referencia a Molecular Cloning (Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)) o similar. Además, la homología de la secuencia de polinucleótido mencionada anteriormente se puede determinar con una búsqueda con FASTA o una búsqueda con bLaST de la misma manera.

La introducción de una mutación (eliminación, sustitución y/o adición) en la secuencia de polinucleótido mencionada anteriormente se puede llevar a cabo mediante un procedimiento conocido en este campo técnico tal como un procedimiento Kunkel o un procedimiento dúplex con espacios, o basándose en este procedimiento. Por ejemplo, se puede usar un kit de introducción de mutación usando un procedimiento de mutagénesis de sitio dirigido (por ejemplo, Mutant-K (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.), Mutant-G (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.), o un kit LA PCR in vitro de la serie Mutagenesis (fabricado por TaKaRa Bio, Inc.)), o similares. Dicho polinucleótido mutado se puede usar también como el elemento de ADN de la invención.

Como el elemento de ADN de la invención, se puede usar un fragmento parcial que comprenda al menos 3000 o al menos 2000 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias. Los ejemplos de dichos fragmentos parciales incluyen: A18-1 a A18-4 que son fragmentos parciales de A18. También se desvelan en el presente documento A2-1 a A2-17 que son fragmentos parciales de A2; A7-1 a A7-18 que son fragmentos parciales de A7; B5-1 a B5-6 que son fragmentos parciales de b5; y C14-1 a C14-14 que son fragmentos parciales de C14. Sin embargo, el elemento de ADN no está limitado a estos fragmentos parciales siempre que tenga una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

En la invención, puede usarse cualquiera de los fragmentos de A18 anteriores solo y también se pueden usar dos o más copias de un tipo de los fragmentos parciales de A18. Como alternativa, se pueden usar en combinación dos o más tipos diferentes de los fragmentos parciales de A18. Además, se puede usar en combinación una secuencia de longitud completa y/o un fragmento parcial del elemento de ADN A18 mencionado anteriormente. Además, se puede usar al menos una secuencia de longitud completa y/o un fragmento parcial del elemento de ADN A18 en combinación con al menos una secuencia de longitud completa y/o un fragmento parcial de diferentes elementos de ADN.

En cuanto a las secuencias de polinucleótido de los respectivos fragmentos de A2, A2-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 5401 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 2700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 2200 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 3700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-7 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 5000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-8 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-9 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-10 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-11 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-12 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-13 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-14 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-15 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-16 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; y A2-17 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A7, A7-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 601 a 3600 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3601 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 5401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 4500 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-7 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-8 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3600 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-9 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-10 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-11 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-12 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-13 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-14 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-15 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-16 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-17 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; y A7-18 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A18, A18-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5040 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; A18-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1001 a 6002 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; A18-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; y A18-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3000 a 7000 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias.

Los puntos de inicio y terminación de los respectivos fragmentos de A2, A7 y A18 se exponen también en la Figura 18.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de B5, B5-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 4001 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias; B5-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3200 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias; B5-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2491 a 5601 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias; B5-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 5373 a 8401 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias; B5-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 901 a 4001 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias; y B5-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de C14, C14-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 960 a 4015 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1987 a 5014 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4020 a 7119 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 960 a 8141 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 960 a 6011 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4939 a 8141 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-7 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 960 a 5014 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-8 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2994 a 7119 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-9 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4020 a 8141 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-10 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5014 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-11 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1987 a 7119 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-12 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2994 a 8141 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; C14-13 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 960 a 7119 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias; y C14-14 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1987 a 8141 de la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias.

Los puntos de inicio y terminación de los respectivos fragmentos de B5 y C14 también se exponen en la Figura 19.

2. Adquisición del polinucleótido

En la invención, se puede obtener un polinucleótido que contiene un gen exógeno que codifica una proteína exógena cuya producción va a aumentar, lo que se describirá más adelante, por procedimientos comunes como se describen a continuación. Por ejemplo, dicho polinucleótido puede aislarse explorando una biblioteca de ADNc procedente de células o tejidos que expresan el gen exógeno usando una sonda de ADN que se sintetiza basándose en un fragmento del gen exógeno. El ARNm se puede preparar por procedimientos que se usan comúnmente en este campo técnico. Por ejemplo, las células o tejidos se tratan con un reactivo de guanidina, un reactivo de fenol, etc., obteniendo de esta manera el ARN total, y a partir de este, se obtiene el poli(A) ARN (ARNm) mediante un procedimiento en columna de afinidad usando una columna de celulosa oligo (dT) o una columna de Sepharose-poli U que contiene Sepharose 2B como portador, o similares, o mediante un procedimiento discontinuo. Además, también se puede fraccionar el poli(A) ARN por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa o similares. Luego, se sintetiza un ADNc monocatenario usando el ARNm obtenido de esta manera como molde, y también usando cebadores dT y una transcriptasa inversa. A partir del ADNc de cadena sencilla que se obtiene de esta manera, se sintetiza un ADNc de doble cadena usando una ADN polimerasa I, ADN ligasa, RNasa H, y similares. El ADNc de doble cadena sintetizado de esta manera se trunca usando ADN polimerasa T4, seguido de la unión a un adaptador (tal como el adaptador EcoRI), fosforilación, y similares, y el ADN resultante se incorpora en un fago lambda tal como el Agt11 para conseguir un empaquetamiento in vivo, de esta manera se puede preparar una biblioteca de ADNc. También es posible usar una biblioteca de ADNc usando un vector plásmido distinto de fagos lambda. A partir de entonces, se puede seleccionar un clon que contenga el ADN diana (un clon positivo) a partir de la biblioteca de ADNc.

En los casos en los que el elemento de ADN mencionado anteriormente que se va a usar para aumentar la producción de una proteína o un polinucleótido que contiene un gen exógeno se aísle a partir de ADN genómico, o en el que se aísle un polinucleótido que contiene las regiones promotoras y de terminación a partir de ADN genómico, de acuerdo con un procedimiento común (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)), se extrae el ADN genómico de una línea celular de un organismo para usarse como fuente de recolección y se selecciona y aísla un polinucleótido. La extracción del ADN genómico se puede llevar a cabo de acuerdo con, por ejemplo, el procedimiento de Cryer y col. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) o el procedimiento de P. Philippsen y col. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)).

El elemento de ADN diana o el polinucleótido que contiene un gen exógeno se puede obtener también, por ejemplo, por el procedimiento PCR (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)). En la amplificación de un polinucleótido usando el procedimiento PCR, se usan 20 o 30meros de ADN monocatenarios sintéticos como cebadores y se usa el ADN genómico como molde. El gen amplificado se usa después de confirmarse la secuencia de polinucleótido del gen. Como molde para la PCR, se puede usar una biblioteca de ADN genómico tal como un cromosoma bacteriano artificial (BAC).

Por otra parte, el polinucleótido que contiene un gen exógeno cuya secuencia no se conoce se puede obtener (a) preparando una biblioteca génica de acuerdo con un procedimiento común, y (b) seleccionando un polinucleótido deseado de la biblioteca génica que se ha preparado y amplificando el polinucleótido. La biblioteca génica se puede preparar por digestión parcial del ADN cromosómico que se obtiene mediante un procedimiento común a partir de una línea celular de un organismo que se va a usar como fuente de recolección usando una enzima de restricción adecuada para el fragmento de ADN cromosómico, uniendo los fragmentos obtenidos en un vector adecuado, e introduciendo el vector en un hospedador adecuado. La biblioteca génica se puede preparar también por extracción del ARNm de las células, sintetizando el ADNc a partir de ARNm, uniendo el ADNc a un vector adecuado, e introduciendo el vector en un hospedador adecuado. Como vector para su uso en dicha preparación, también se puede usar un plásmido que se sepa en general que es un vector para la preparación de la biblioteca génica, un vector de fago, un cósmido o similares. Como hospedador que se va a transformar o transfectar se puede usar un hospedador adecuado para el tipo de vector mencionado anteriormente. El polinucleótido que contiene el gen exógeno se selecciona de la biblioteca génica mencionada anteriormente mediante un procedimiento de hibridación de colonias, un procedimiento de hibridación en placas, o similares, usando una sonda marcada que contiene una secuencia específica para el gen exógeno.

Además, el polinucleótido que contiene el gen exógeno también se puede producir mediante síntesis química total. Por ejemplo, el gen se puede sintetizar mediante un procedimiento en el que se preparan y se hibridan dos pares de oligonucleótidos complementarios, un procedimiento en el que se unen varias hebras de ADN hibridadas por una ADN ligasa, un procedimiento en el que se preparan varios polinucleótidos parcialmente complementarios y los huecos se rellenan por PCR o similares.

La determinación de una secuencia de polinucleótido se puede llevar a cabo por una técnica convencional, por ejemplo, un procedimiento didesoxi (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467, (1977)), o similares. Además, la determinación anterior de una secuencia de polinucleótido también se puede llevar a cabo fácilmente usando un kit de secuenciación disponible en el comercio o similar.

3. Vector de expresión de un gen exógeno, vector de elemento

Como vector de expresión de un gen exógeno de la invención, se proporciona un vector que contiene un elemento de ADN del tipo A18 mencionado anteriormente, dos o más copias de un elemento de ADN del tipo A18 mencionado anteriormente en combinación, o al menos uno de elemento de ADN del tipo A18 mencionados anteriormente en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN y que contienen además una unidad de expresión de un gen exógeno. Cuando se expresa un gen exógeno en una célula hospedadora usando el vector de expresión de un gen exógeno mencionado anteriormente, el elemento de ADN se puede situar inmediatamente cadena arriba o cadena abajo de la unidad de expresión génica, o se puede localizar en una posición lejana de la unidad de expresión génica. Además, se puede usar un vector de expresión de un gen exógeno que contenga una diversidad de dichos elementos de ADN. De hecho, el elemento de ADN se puede insertar tanto en orientación directa como inversa con respecto a la unidad de expresión génica.

Además, como un vector que se usa en la invención, también se incluye un vector que contiene un elemento de ADN del tipo A18 mencionado anteriormente, dos o más copias de un tipo del elemento de ADN 18 mencionado anteriormente, dos o más diferentes tipos del elemento de ADN A18 mencionado anteriormente en combinación, o al menos uno de los tipos de elemento de ADN A18 en combinación con al menos uno de los diferentes tipos de elementos de ADN diferentes y que no contenga una unidad de expresión génica (de aquí en adelante denominado también “vector de elemento”). Dicho vector de elemento se puede usar en combinación con el vector de expresión de un gen exógeno mencionado anteriormente que contiene el elemento de ADN o un vector de expresión de un gen exógeno que no contiene un elemento de ADN y solamente contiene la unidad de expresión de un gen exógeno. Permitiendo la coexistencia del vector de elemento con el vector de expresión de un gen exógeno, la expresión de un gen exógeno aumenta en comparación con los casos en los que se usa solo el vector de expresión de un gen exógeno, por lo tanto, la combinación de los vectores mencionados anteriormente también se incluye en el vector de expresión de un gen exógeno de la invención.

El gen que codifica la proteína exógena no está limitado particularmente, sin embargo, los ejemplos del mismo incluyen los genes indicadores tales como el de la fosfatasa alcalina secretora (SEAP), la proteína verde fluorescente (GFP), y luciferasa; varios genes de enzimas tales como el gen de la a-amilasa, y el gen de la a-galactosidasa; genes de varios interferones que son útiles farmacéuticamente y proteínas fisiológicamente activas tales como el interferón a y el interferón ^y; genes de varias interleucinas tales como IL-1 e IL-2; varios genes de citocinas tales como un gen de eritropoyetina (EPO) y un gen de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); genes de factores de crecimiento; y genes de anticuerpos. Estos genes se pueden obtener mediante cualquier procedimiento.

La invención es particularmente eficaz en relación con una proteína que sea altamente hidrófoba y una proteína que sea difícil de producir y secretar debido a su formación compuesta. Por lo tanto, las proteínas exógenas mencionadas anteriormente incluyen una proteína multimérica tal como un heteromultímero que es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El “fragmento funcional de un anticuerpo” se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno y que incluye Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, y similares. El fragmento funcional de un anticuerpo también incluye al Fab' que es un fragmento monovalente de una región variable de un anticuerpo que se obtiene tratando el F(ab')2 en condiciones reductoras. Además, estos fragmentos funcionales incluyen no solamente un fragmento obtenido mediante el tratamiento de una molécula de una proteína de anticuerpo de longitud completa con una enzima adecuada, sino también una proteína producida en una célula hospedadora adecuada usando un gen de anticuerpo modificado genéticamente.

La unidad de expresión génica tiene, en la dirección de la fase de lectura de transcripción, al menos una región promotora, un gen exógeno, y una región de terminación de la transcripción (señal de adición de poli(A)). El promotor que se puede usar en el presente documento puede ser un promotor de expresión constitutivo o un promotor de expresión inducible. Los ejemplos de promotor de expresión constitutivo incluyen varios promotores naturales tales como un promotor temprano de SV40, un promotor de adenovirus E1A, un promotor de CMV (citomegalovirus), un promotor EF-1a (factor-1a de elongación humano), un promotor de HSP70, un promotor MT, un promotor de RSV, un promotor de UBC, y un promotor actina, y promotores artificiales (de fusión) tales como un promotor SRa y un promotor CAG. Además, la secuencia de adición de poli(A) puede ser una secuencia que tiene la actividad de provocar la terminación de la transcripción para la transcripción a partir del promotor, y puede ser una secuencia de un gen igual o diferente al del promotor.

Es necesario usar un promotor fuerte con el fin de aumentar la producción de una proteína exógena. Sin embargo, cuando se intenta producir una proteína que sea difícil que se pliegue o una proteína que sea difícil de secretar usando un promotor altamente activo, la proteína puede no llegar a secretarse. Esto es debido a que cuando la proteína se produce en una cantidad que excede la capacidad del ribosoma en el que se lleva a cabo la traducción y la del retículo endoplásmico donde se lleva a cabo el plegamiento y la secreción, la proteína producida en exceso se desnaturaliza, se acumula y se ubiquitina en las células, y luego se degrada en los proteosomas. Por consiguiente, es preferible que se seleccione adecuadamente un promotor que pueda alcanzar un nivel de expresión tal que la proteína no se desnaturalice o agregue o que la cantidad de la proteína resultante no exceda la capacidad de secreción. Como alternativa, el promotor se usa ajustando (por ejemplo, disminuyendo) la actividad del promotor. Entre las proteínas multiméricas, una molécula que forma un heteromultímero es susceptible del efecto descrito anteriormente y en particular una molécula, tal como un anticuerpo, que es un heterotetrámero. Un anticuerpo tiene dos moléculas de cadena pesada y dos moléculas de cadena ligera que se asocian entre sí y por lo tanto, con el fin de asociar adecuadamente las moléculas, el nivel de expresión de las mismas es un factor importante.

Además, el vector de expresión de un gen exógeno y el vector de elemento de la invención pueden contener cada uno un marcador de selección para seleccionar un transformante. Se puede seleccionar un transformante, por ejemplo, mediante el uso de un marcador de resistencia a un fármaco que dé lugar a resistencia a un fármaco tal como cerulenina, aureobasidina, zeocina, canavanina, cicloheximida, higromicina, puromicina, blasticidina, tetraciclina, kanamicina, ampicilina o neomicina. Además, también se puede seleccionar un transformante cuando se usa como marcador un gen que da lugar a resistencia a disolventes tales como etanol, resistencia a la presión osmótica de glicerol, de una sal, o similares, la resistencia a un ion metálico tal como el ion cobre, o similares.

El vector de expresión de un gen exógeno y el vector de elemento de la invención pueden ser cada uno un vector que no se incorpora en el ADN cromosómico. En general, el vector de expresión de un gen exógeno se transfecta en una célula hospedadora y entonces se incorpora aleatoriamente en el cromosoma. Sin embargo, usando un componente constituyente procedente de un virus de mamífero tal como un virus de simio 40 (SV40), un papilomavirus (BPV, HPV), o EBV, se puede usar el vector como un vector episómico que es auto-replicable en la célula hospedadora transfectada. Por ejemplo, se puede usar un vector que contiene un origen de replicación (oriP) procedente de SV40 y una secuencia que codifica un gran antígeno T de SV40 que es un factor trans-actuante, un vector que contiene un oriP procedente de EBV y una secuencia que codifica EBNA-1, o similares. El efecto del elemento de ADN se puede expresar por la actividad de aumento de la expresión del gen exógeno independientemente del tipo de vector o de la presencia o ausencia de la incorporación del mismo en el cromosoma.

4. Célula transformada

La célula transformada de la invención es una célula transformada en la que se ha introducido el vector de expresión de un gen exógeno descrito en el artículo “3” anterior que contiene el elemento de ADN descrito en el artículo “1”. Como vector de expresión de un gen exógeno, se puede introducir solamente un vector de expresión de un gen exógeno que contenga un elemento de ADN (a), o se pueden introducir en combinación un vector de expresión de un gen exógeno que contiene un elemento de ADN y también un vector de elemento descrito en el artículo “3” anterior (B). Como alternativa, se pueden introducir en combinación un vector de expresión de un gen exógeno que no contiene un elemento de ADN y un vector elemento (C).

La expresión de un gen exógeno en una célula hospedadora usando la combinación anterior de (B) o (C) se puede llevar a cabo, por ejemplo, según el procedimiento de Girod y col. (Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005)) y el procedimiento de Otte y col. (Biotechnol. Prog., 2007, 23, 801-807 (2007)).

Los ejemplos de la célula hospedadora que se va a transformar incluyen células eucariotas, incluyendo los ejemplos preferidos de las mismas células de mamífero, incluyendo los ejemplos más preferidos células procedentes de seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, monos, o ganado. Los ejemplos de dichas células de mamífero incluyen las células COS-1, células 293, y células CHO (CHO-K1, dG44, CHO dhfr-, CHO-S), sin embargo, la célula hospedadora no se limita a estas.

En la invención, se puede usar cualquier procedimiento para introducir el vector de expresión en la célula hospedadora siempre que el procedimiento permita que gen introducido esté presente de manera estable en la célula hospedadora y se exprese en la misma de manera adecuada. Los ejemplos del método que se usa generalmente incluyen un procedimiento de fosfato cálcico (Ito y col., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), un procedimiento de electroporación (Becker, D. M. y col., 1990; Methods. Enzymol., 194, 182-187), un procedimiento de esferoplastos (Creggh y col., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), un procedimiento de acetato de litio (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168), y un procedimiento de lipofección.

5. Procedimiento para producir proteína exógena

En la invención, se puede producir una proteína exógena mediante el cultivo de la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior, en la que se ha introducido un gen que codifica la proteína exógena usando el vector descrito en el artículo “3” anterior mediante un procedimiento conocido, la recogida de la proteína del producto del cultivo resultante, seguido de la purificación de la proteína. La expresión “producto del cultivo” tal como se usa en el presente documento se refiere a células cultivadas o a un homogenado celular además de a un sobrenadante del cultivo. De hecho, puede seleccionarse como proteína exógena que puede producirse usando la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior, no solo una proteína monomérica, sino también una proteína multimérica. En los casos en los que se produce una proteína hetero-multimérica formada de una pluralidad de diferentes subunidades, es necesario introducir una pluralidad de genes que codifican estas subunidades en la célula hospedadora que se describe en el artículo “4” anterior, respectivamente.

El procedimiento para el cultivo de la célula transformada se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales para cultivar células hospedadoras.

En los casos en que la célula transformada sea una célula de mamífero, la célula se cultiva en condiciones, por ejemplo, de 37 °C, y un 5 % o un 8 % de CO2 durante un tiempo de cultivo de aproximadamente 24 a 1000 horas. El cultivo se puede llevar a cabo por medio de cultivo discontinuo, cultivo de alimentación discontinua, cultivo continuo y similares en condiciones estáticas, de agitación, removido o aireación.

La confirmación del producto de expresión del gen que codifica la proteína exógena a partir del producto de cultivo (solución de cultivo) mencionado anteriormente se puede llevar a cabo por SDS-PAGE, análisis de Western, ELISA o similares. Con el fin de aislar y purificar la proteína producida, se puede usar un procedimiento de purificación y aislamiento de proteínas convencional. Tras completar el cultivo, en los casos en los que la proteína diana se produce en células, se homogenizan las células usando un homogeneizador ultrasónico, una prensa de French, un homogeneizador de Manton-Gaulin, Dinomil, o similar, obteniendo de esta manera la proteína diana. Además, en los casos en los que se produce la proteína diana fuera de las células, la solución el cultivo se usa como tal, o se eliminan las células por centrifugación o similar. A continuación se recoge la proteína diana por extracción o similar usando un disolvente orgánico y luego se aísla y purifica la proteína diana usando técnicas tales como varias técnicas de cromatografía (cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.), filtración en gel usando un tamiz molecular y electroforesis usando un gel de poliacrilamida o similar solo o en combinación según las necesidades.

Los procedimientos de cultivo mencionados anteriormente y los procedimientos de purificación son solo a modo de ejemplo, y los procedimientos no se limitan a estos. La secuencia de aminoácidos del producto genético purificado se puede confirmar por una técnica de análisis de aminoácidos conocida, tal como la determinación de secuencia de aminoácidos automatizada usando el procedimiento de degradación de Edman.

6. Procedimiento para producir una proteína de anticuerpo

Como proteína hetero-multimérica que se va a producir usando el procedimiento de producción descrito en el artículo “5” anterior, puede ejemplificarse una proteína de anticuerpo. La proteína de anticuerpo es una proteína tetramérica que comprende dos moléculas de polipéptido de cadena pesada y dos moléculas de polipéptido de cadena ligera. Por consiguiente, para obtener dicha proteína de anticuerpo en un estado que mantenga la afinidad de unión a antígeno, es necesario introducir ambos genes de cadena pesada y ligera en la célula transformada descrita en el artículo “4” anterior. En este caso, las unidades de expresión génica de la cadena pesada y ligera pueden estar presentes en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión.

Como anticuerpo que se va a producir en la invención, puede ejemplificarse un anticuerpo preparado mediante la inmunización de un animal experimental, tal como un conejo, un ratón o una rata con un antígeno deseado. Además, también puede ejemplificarse como el anticuerpo que se va a producir en la invención un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado obtenido mediante el uso del anticuerpo anteriormente mencionado como material de partida. Además, también se incluye como anticuerpo que se va a producir en la invención un anticuerpo humano obtenido usando un animal modificado genéticamente o un procedimiento de presentación en fagos.

El gen de anticuerpo que se va a usar para la producción del anticuerpo no está limitado a un gen de anticuerpo que tenga una secuencia de polinucleótido específica, siempre que la combinación de polipéptido de cadena pesada y polipéptido de cadena ligera que se van a transcribir y traducir a partir del gen de anticuerpo tenga la actividad de unión a una proteína antigénica dada.

Además, no es necesario que el gen de anticuerpo codifique la molécula de longitud completa del anticuerpo, puede usarse un gen que codifica un fragmento funcional del anticuerpo. Dicho gen que codifica un fragmento funcional del mismo puede obtenerse modificando genéticamente un gen que codifica la molécula de longitud completa de la proteína de anticuerpo.

7. Procedimiento de producción de otras proteínas exógenas

Los ejemplos de proteínas exógenas que se van a producir usando el procedimiento de producción de la invención incluyen, además de los anticuerpos mencionados anteriormente, varias proteínas procedentes de seres humanos y no humanos, fragmentos funcionales de las mismas, y productos modificados de las mismas. Los ejemplos de dichas proteínas y similares incluyen hormonas peptídicas tales como el péptido natriurético auricular (ANP), péptido natriurético cerebral (BNP), péptido natriurético tipo C (CNP), vasopresina, somatostatina, hormona de crecimiento (GH), insulina, oxitocina, grelina, leptina, adiponectina, renina, calcitonina, osteoprotegerina, y factor de crecimiento insulínico (IGF); citocinas tales como interleucinas, quimiocinas, interferón, factores de necrosis tumoral (tales como TNF-a ,TNF-p, y la superfamilia de TNF), factores de crecimiento nerviosos (tales como NGF), factores de crecimiento celular (tal como EGF, FGF, PDGF, HGF, y TGF), factores de crecimiento hematopoyético (tales como CSF, G-CSF, y eritropoyetina), y adipocina; receptores tales como los receptores de TNF; enzimas tales como lisozima, proteasas, proteinasas, y peptidasas; fragmentos funcionales de las mismas (fragmentos que tienen la totalidad o parte de la actividad biológica de la proteína original), y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de estas proteínas. Sin embargo, las proteínas no se limitan a estas.

Ejemplos

En lo sucesivo, la invención se describirá específicamente en referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan el ámbito técnico de la invención. Los plásmidos, enzimas de restricción, enzimas de modificación de ADN, y similares que se van a usar en los ejemplos de la invención son productos disponibles en el mercado y se pueden usar según procedimientos comunes. Además, los procedimientos que se usan para la clonación de a Dn , la determinación de la secuencia de polinucleótido, la transformación de una célula hospedadora, el cultivo de una célula hospedadora transformada, la recogida de una proteína a partir del producto de cultivo resultante, la purificación de una proteína y similares también son bien conocidos por los expertos en la técnica o se pueden encontrar en la bibliografía.

Ejemplo1

Extracción del elemento de ADN

(1-1) Inmunoprecipitación de cromatina usando un anticuerpo anti-histona H3 acetilada

Se llevó a cabo una ChIP usando un anticuerpo anti-histona H3 acetilada usando EZ ChIP (Upstate) de acuerdo con el siguiente procedimiento. De hecho, a menos que se indique lo contrario, se usaron productos de Upstate como anticuerpos, tampones y similares en el siguiente procedimiento.

En primer lugar, se cultivaron células 293F (Invitrogen) usando Medio 293 FreeStyle™ GIBCO (marca registrada) (Invitrogen) en condiciones de 37 °C y un 8 % de CO2, seguido de centrifugación (1000 rpm, 5 min, a temperatura ambiente), por la que se recogieron las células en fase de crecimiento. Después se fijaron 2 x 107 células en un medio que contenía un 1 % de formaldehido durante 10 minutos, se añadió al mismo 10 x de glicina, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Tras la centrifugación (3000 rpm, 5 min, 4 °C), se retiró el sobrenadante, y se añadió PBS al sedimento celular para suspender las células. Entonces, la suspensión celular se centrifugó de nuevo para retirar el PBS, y a continuación se añadió un tampón de lisis SDS al sedimento celular para suspender y lisar las células. Cada muestra que se obtenía por lisis celular se sometió a fragmentación de ADN usando un homogeneizador ultrasónico (BRANSON) mientras se enfriaba la muestra con agua helada, y se añadió a la misma un tampón de dilución que contenía un cóctel inhibidor de proteasas y proteína G inmovilizada en agarosa. La mezcla resultante se sometió a rotación a 4 °C durante 1 hora, seguido de centrifugación, y luego se recolectó el sobrenadante. Posteriormente, se añadieron al mismo 10 |jg de IgG normal de conejo o de un anticuerpo a-acetil histona H3, seguido de rotación durante una noche a 4 °C. A la solución resultante, se añadió proteína G inmovilizada en agarosa y la mezcla resultante se sometió a rotación a 4 °C durante 1 hora, seguido de centrifugación, y luego se recolectó el sedimento. El sedimento obtenido de esta manera se lavó dos veces en tampón de lavado de complejo inmunitario bajo en sal, dos veces con tampón de lavado de complejo inmunitario alto en sal, dos veces con tampón de lavado de complejo inmunitario LiCl, y finalmente cuatro veces con tampón TE. Luego se añadió al mismo un tampón de elución (que contenía 20 j l de hidrógeno carbonato sódico 1M, 10 j l de SDS, y 170 j l de agua estéril). Tras 30 minutos, se centrifugó la mezcla, y se recogió el sobrenadante.

Posteriormente, se añadieron 5 M de cloruro sódico al sobrenadante y la mezcla resultante se calentó durante una noche a 65 °C. Después se añadió a la misma RNasa A, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Luego se añadió a la misma 0,5 M de EDTA, 1 M de Tris-HCl y Proteinasa K, y la mezcla resultante se incubó a 45 °C durante 2 horas.

Finalmente se añadieron a la misma los Reactivos A, B y C en una cantidad 5 veces mayor que la de la solución obtenida por el tratamiento con Proteinasa K, seguido de centrifugación (10000 rpm, 30 seg, a temperatura ambiente) usando un filtro Spin. Por el que se purificó el ADN de la inmunoprecipitación de cromatina.

(1-2) Análisis de micromatriz

Mediante el uso del kit GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA, amplificación de genoma completo) (Sigma), se amplificó cada muestra de ChIP obtenida en (1-1). El procedimiento fue de acuerdo con el protocolo de Sigma adjunto en el kit.

Con el fin de confirmar la ChIP, usando 320 ng de cada ADN amplificado por WGA como molde, y usando también los siguientes cebadores y SYBR (marca registrada) Premix Ex Taq™ (Tiempo real perfecto) (TAKARA), se amplificó un gen interno de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) por el procedimiento de PCR (95 °C durante 5 s y 60 °C durante 20 s x 45 ciclos). De hecho, el GAPDH es un gen constitutivo que se va a usar como control positivo para confirmar si se había enriquecido el elemento de ADN mediante ChIP y se llevó a cabo el procedimiento PCR usando cebadores unidos al EZ ChIP (Upstate).

5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'

5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'

Tal como se muestra en la Fig. 1, se confirmó que GAPDH estaba amplificado específicamente en la muestra sometida a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-histona H3 acetilada. Cada una de las muestras de ADN amplificado por WGA se sometió a análisis de micromatriz (NimbleGen) para llevar a cabo la inmunoprecipitación de cromatina sobre chip (ChIP-on-chip). “ChIP-on-chip” es una técnica para identificar cada elemento de ADN sometiendo cada ADN enriquecido en (1-1) a análisis de micromatriz.

(1-3) Extracción del elemento de ADN

Basándose en los resultados del análisis ChIP-on-chip que se obtienen en (1-2), se extrajeron 5 secuencias que tienen un contenido en AT del 62 % o más.

A2: cromosoma 15 (80966429 a 80974878)

A7: cromosoma 11 (88992123 a 89000542)

A18: cromosoma 4 (111275976 a 111284450)

B5: cromosoma 1 (143034684 a 143043084)

C14: cromosoma 11 (46089056 a 46097482)

Ejemplo2

Efecto del elemento de ADN usando la expresión de fosfatasa alcalina secretora (SEAP) como índice

(2-1) Construcción de un vector de expresión de SEAP

Utilizando el pSEAP2-control (Clontech) como molde, se amplificó el gen SEAP mediante el procedimiento PCR (94 °C durante 30 s y 68 °C durante 2 min x 40 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus- (TOYOBO). 5'-AAAGCTAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC-3'

5'-AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC-3'

Posteriormente, el fragmento de SEAP amplificado se separó por electroforesis en gel de agarosa y se recortó del gel, seguido de purificación usando un kit de extracción de Gel QIAquick (Qiagen). El fragmento de ADN obtenido de esta manera se usó como inserción. La inserción se digirió con las enzimas de restricción Nhel y BgIII, y se digirió el vector pIRES hyg3 (Clontech) con las enzimas de restricción Nhel y BamHI. Los fragmentos de ADN resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos diana, respectivamente y los fragmentos diana se recortaron del gel, seguido de purificación. Luego, se llevó a cabo una reacción de ligadura y transformación. La reacción de ligadura se llevó a cabo usando el sistema de ligadura de ADN LigaFast Rapid (Promega). La transformación se llevó a cabo de la siguiente manera. En primer lugar, se descongelaron células JM109 competentes (TAKARA) congeladas, y se añadieron 10 pl de una solución obtenida tras la reacción de ligadura a una solución de las células descongeladas y la mezcla resultante se dejó en reposo en hielo durante 30 minutos. A continuación, se aplicó un choque térmico (42 °C, 45 seg) a la mezcla, y se enfrió la mezcla en hielo durante 5 minutos. A esta suspensión celular se le añadió 1 ml de medio LB y la mezcla resultante se agitó a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente se emplacó la mezcla sobre una placa LB que contenía 0,1 mg/ml de ampicilina, y se incubó la placa a 37 °C durante 14 a 16 horas. A continuación, por lisis alcalina, se recolectó un plásmido diana de las colonias cultivadas en la placa LB. Finalmente, se determinó la secuencia de polinucleótido de SEAP en el plásmido que se obtuvo por lisis alcalina, de esta manera se construyó el pCMV/SEAP ires Hygro.

(2-2) Clonación del elemento de ADN

Posteriormente, se clonó cada uno de los elementos de ADN extraídos en el ejemplo 1 en el vector de expresión de SEAP que se obtuvo en (2-1) usando el kit BAC SUBCLONING (Gene Bridges) a partir de un cromosoma bacteriano artificial (BAC) que contenía una secuencia de polinucleótido que se correspondía con cada uno de los elementos de ADN.

En primer lugar, el pCMV/SEAP ires Hygro obtenido en (2-1) se digirió con la enzima de restricción Spel durante varias horas, seguido de precipitación en etanol y el precipitado se disolvió en agua estéril. Utilizando el vector digerido con SpeI como molde, se llevó a cabo el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus- (TOYOBO).

A2D:

5-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGGAT CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2R:

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

A7D:

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7R:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACCTAG TCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18D:

5'-CGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGTGGATCACCTGAGGTCGA TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18R:

5'-CATACAGAAGCCAGTTTGAACTGAGACCTCACTCCATTTCTTACAAGTTATGCCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5D:

5'-ACCGTTTTATATTGTTTAAGCATTTCCTAGACATATTTGGCTACAAATCTAGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5R:

5'-GATCTTAGGGGGGCTGATTATATAAAACAATAGAAATGTAGTCTTAGATGAAACC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14D:

5'-CACAAAGTTCACTGTCAAGGCCAGGTGATGAGGCCCACACATGCCCGGACCTTGA TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14R:

5'-CAAAACCTCATCTCTACTGAAAATAGAAAATTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGTGCC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

Tras confirmarse la amplificación por electroforesis en gel de agarosa usando una porción de la solución de reacción, el resto de la solución de reacción se sometió a precipitación en etanol. El precipitado se disolvió en agua estéril, y la solución resultante se usó para la transformación de ADN.

Posteriormente, se llevó a cabo la preparación de Eschericha coli para la transformación.

Los clones de BAC que correspondían a las 5 secuencias extraídas en el ejemplo 1 son los siguientes.

10 |jl del BAC mencionado anteriormente (Avanced Geno Techs Co.) que se habían descongelado, se inocularon en 1 ml de un medio (que contenía cloranfenicol a una concentración final de 15 jg/ml) y se incubaron durante una noche a 37 °C. Se trasfirieron 30 j l de la solución de cultivo a 1,4 ml de un medio (que contenía cloranfenicol a una concentración final de 15 jg/ml) y se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Se repitió dos veces una centrifugación y lavado con agua estéril, y se suspendieron las células en 20 j l de agua estéril. Se añadieron en una cubeta enfriada (0,1 cm) 1 j l de pRED/ET (Gene Bridges) y Escherichia coli, seguido de electroporación (1350 V, 10 jF). Después, se añadió a esto 1 ml de medio SOC, y la mezcla resultante se incubó a 30 °C durante 70 minutos. Se emplacaron 100 j l de la solución de cultivo en una placa LB (que contenía tetraciclina y cloranfenicol a concentraciones finales de 3 jg/ml y 15 jg/ml, respectivamente), y se incubó una noche a 30 °C. Se transfirieron 30 j l de la solución de cultivo a 1,4 ml de un medio (que contenía tetraciclina y cloranfenicol a concentraciones finales de 3 jg/ml y 15 jg/ml, respectivamente), y se incubaron a 30 °C durante 2 horas. Luego, se añadieron a la misma 50 j l de L-arabinosa al 10 %, y se llevó a cabo una incubación adicional a 37 °C durante 1 hora. A continuación se repitió dos veces un lavado con agua estéril, y se añadieron las Escherichia coli que se suspendieron en 30 j l de agua estéril y 1 j l del ADN para la transformación a una cubeta enfriada (0,1 cm), seguido de electroporación 1350 V, 10 jF). Luego, se añadió a esto 1 ml de medio SOC, y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 90 minutos. La cantidad total de la solución de cultivo se emplacó en una placa LB (que contenía 100 jg/ml de ampicilina), y la placa se incubó. A continuación se obtuvo el plásmido diana por lisis alcalina. Finalmente, se confirmaron la secuencia del plásmido que se obtuvo y los sitios de la enzima de restricción del mismo, por lo que se construyó el plásmido diana. El vector construido se muestra en la Fig. 2.

(2-3) Evaluación usando la expresión de SEAP como índice

Se evaluó cada plásmido construido en (2-2) usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen)

Se llevó a cabo la selección con antibióticos con higromicina a 800 jg/ml durante aproximadamente 2 semanas comenzando 2 días tras la transfección, por lo que se estableció una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a un remplazo de medio el día antes de la medición, y se sembraron un número determinado de células en una placa de 24 pocillos (IWAKI). A las 24 horas tras poner las células en las placas, se recolectó el sobrenadante, y se midió la actividad de SEAP. La actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo se midió usando el Ensayo de Fosfatasa Alcalina Segregada indicadora SensoLyte™ pNPP (ANASPEC).

Los resultados medidos se muestran en la Fig. 3. Cuando la actividad de SEAP del control sin elemento se normalizó a 1, la actividad SEAP en el sobrenadante del cultivo de la línea celular CHO que expresaba establemente que tenía el elemento de ADN A2, A7, A18, B5 o C14 mostraba un valor numérico cinco veces mayor o más que el del control. Basándose en los resultados, se confirmó que los 5 tipos de elementos de ADN aumentan drásticamente la expresión de SEAP. De hecho, las secuencias de polinucleótidos de los 5 tipos de elementos de ADN anteriores se representan en las SEC ID N°: 1 a 5 del listado de secuencias, respectivamente.

Ejemplodereferencia1

Generalidad de promotores que se va a usar en combinación

El promotor para el vector que se usa en la evaluación de los elementos de ADN del ejemplo 2 era un promotor de CMV, y de esta manera se estudió en el ejemplo de referencia 1 el uso de elementos de ADN en combinación con otros promotores generales.

(1-1) Construcción del vector de expresión de SEAP usando promotores EF-1a y SV40

Utilizando el pSEAP2-control (Clontech) como molde, se amplificó el gen SEAP por el procedimiento PCR (94 °C durante 30 s y 68 °C durante 2 min x 40 ciclos) usando los cebadores descritos en (2-1) y KOD-plus-. El SEAP amplificado se preparó como una inserción de la misma manera que en (2-1). La inserción se digirió con las enzimas de restricción Nhel y BglII, y se digirió un vector pIRES puro3 (Clontech) con las enzimas de restricción Nhel y BamHI, y se construyó el pCMv/SEAP ires Puro de la misma manera que en (2-1).

Posteriormente, usando el PEF1/V5-His A (Invitrogen) como molde, se amplificó un promotor EF-1a por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 seg, 60 °C durante 30 seg, y 68 1C durante 2 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus-.

5'-AAAACTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC-3'

5'-AAAGATATCCCTAGCCAGCTTGGGTGGTACCAAGC-3'

Utilizando el pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como vector, se llevó a cabo la digestión con las enzimas de restricción Spel y EcoRV para el vector y el promotor, y se construyó el pEF/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-1).

De manera similar, usando el pcDNA3.1+ (Invitrogen) como molde, se amplificó un promotor de SV40 por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, y 68 1C durante 1 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus.

5'-AAAACTAGTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG-3'

5'-AAAGATATCAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTC-3'

Utilizando el pCMV/SEAP ires Puro construido anteriormente como vector, se llevó a cabo la digestión con las enzimas de restricción SpeI y EcoRV para el vector y el promotor, y se construyó el pSV40/SEAP ires Puro de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-1).

(1-2) Clonación del elemento de ADN A2 o A7

Posteriormente, se llevó a cabo la clonación del elemento de ADN A2 o A7 usando el pEF/SEAP ires Puro y pSV40/SEAP ires Puro construidos (en el ejemplo de referencia 1-1) como estructuras básicas.

Primero se digirieron el pEF/SEAP ires Puro y el pSV40/SEAP ires Puro con la enzima de restricción SpeI durante varias horas, seguido de precipitación en etanol, y el precipitado se disolvió en agua estéril. Utilizando los respectivos vectores digeridos con SpeI como moldes, se preparó el ADN para la transformación por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus.

A2 (EF/D):

5-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTA

GTCAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3'

A2 (SV40/D):

5'-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTA

GTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3'

A2 (EF y SV40/R) :

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATT TTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3'

A7 (EF/D):

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAG TCAGAGAGGAATCTTTGCAGC-3'

A7 (SV40/D):

5'-CTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGCTAG TCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3'

A7 (EF y SV40/R):

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAACTAG TTTTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3'

Utilizando el ADN preparado de esta manera para la transformación y el BAC transfectado con pRed/ET, se clonó el elemento de ADN a 2 o A7 en el vector descrito en el ejemplo de referencia 1-1. La construcción del vector se muestra en la Fig. 2. De hecho, el procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-2). (1-3) Evaluación usando la expresión de SEAP como índice

Cada plásmido construido en el ejemplo de referencia 1-2, se evaluó usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen).

Se llevó a cabo una selección por antibiótico con puromicina a 8 pg/ml durante aproximadamente 2 semanas comenzando a los 2 días tras la transfección, de esta manera se estableció una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a una sustitución del medio el día antes de la medición, y se sembró un número determinado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas tras colocar las células en la placa, se recolectó el sobrenadante, y se midió la actividad SEAP. La actividad de SEAP en el sobrenadante del cultivo se midió usando el Ensayo Indicador de Fosfatasa Alcalina segregada pNPP SensoLyte™ (ANASPEC).

Los resultados de la medición se muestran en la Fig. 4. Cuando la actividad de SEAP del control sin elemento se normalizaba a 1, el elemento de ADN A2 o A7 mostraba un efecto de aumento de la expresión tal que la actividad de SEAP era mayor en dos veces o más en el caso del uso del promotor EF-1a , y mayor en cuatro veces o más en el caso del uso del promotor SV40 que el del control. Basándose en los resultados, se confirmó que estos elementos de ADN muestran el efecto de aumento de expresión de un gen exógeno cuando se usa en combinación con un promotor general.

Ejemplodereferencia2

Evaluación usando la expresión de anticuerpo como índice

(2-1) Construcción de un vector pEF6KCL de expresión de cadena ligera humana

Utilizando el plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) como molde, se obtuvo un fragmento de ADN entre la posición 2174 (inmediatamente cadena abajo de BGHpA) y la posición 2958 (Smal) (un fragmento de ADN que contiene un origen de replicación f1 y un promotor y origen de SV40, de aquí en adelante denominado “fragmento A”, estando la secuencia de polinucleótido del fragmento A representada por la SEC ID N°: 6 del listado de secuencias) por el procedimiento PCR usando los siguientes cebadores y KOD-plus-.

5'-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3'

5'-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3'

El fragmento A obtenido y un fragmento de ADN que contenía una secuencia de ADN que codifica una señal secretora de cadena k humana, una región constante de cadena k humana, y una señal de adición de poli(A) humana (de aquí en adelante denominado “fragmento B”) se unieron por PCR de solapamiento. El fragmento de ADN que se obtuvo de esta manera en la que se ligaron el fragmento A y el fragmento B, se digirió con enzimas de restricción KpnI y SmaI, y el fragmento resultante se unió al plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) que se digirió con las enzimas de restricción KpnI y SmaI, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL que tiene una secuencia de señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena ^khumana, y una secuencia de señal de adición de poli(A) humana cadena abajo del promotor EF-1a .

El fragmento de ADN que se obtiene por escisión del pEF6KCL obtenido por el procedimiento mencionado anteriormente con las enzimas de restricción KpnI y SmaI se unió al pEF1/myc-HisB (Invitrogen) que se digirió con KpnI y SmaI, seguido de la transformación por lisis alcalina, y su confirmación de secuencia, por lo que se construyó el plásmido pEF1KCL.

(2-2) Construcción del vector de expresión de cadena pesada humana pEF1FCCU

Un fragmento de ADN (la secuencia de polinucleótido de este fragmento de ADN está representada por la SEC ID N°: 7 en el listado de secuencias) que contenía una secuencia de ADN que codificaba una secuencia de señal de IgG1 humana y una secuencia de aminoácidos de una región constante se digirieron con las enzimas de restricción Nhel y Pmel, y el fragmento resultante se unió a un plásmido pEFIKCL que se digirió con Nhel y Pmel, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada humana pEFIFCCU que tenía una secuencia de señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena pesada humana, y una secuencia de señal de adición de poli(A) humana cadena abajo del promotor EF-1a .

(2-3) Construcción de un vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#)

Uniendo el vector de expresión de cadena L o cadena H construido en el ejemplo de referencia 2-1 o en el ejemplo de referencia 2-2, se construyó un vector de expresión de anticuerpo humanizado sencillo (pEF_LHN (que carece de región variable).

Se añadió un sitio de enzima de restricción Salí por el procedimiento de PCR a ambos extremos de la unidad de expresión génica desde cadena arriba del promotor a cadena abajo del poli(A) del pEFIKCL. Se llevaron a cabo entonces la electroforesis en gel, el recorte de un fragmento de ADN deseado del gel, y la purificación del fragmento de ADN, preparando de este modo la inserción. Digiriendo el pEFIFCCU construido en el ejemplo de referencia 2-2 con la enzima de restricción Salí, se linealizó el vector y el sitio de Salí localizado cadena arriba de la unidad de expresión génica. Entonces, el vector linealizado se unió con la inserción anterior, seguido de transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencias, construyendo de esta manera un vector de expresión de anticuerpo humanizado sencillo (pEF_LHN (que carece de región variable)).

Posteriormente, se introdujeron los siguientes oligonucleótidos en un sitio Aatll del vector PEF_LHN (que carece de región variable).

5'-CGCGGCCGCACTAGTGACGT-3'

5'-CACTAGTGCGGCCGCGACGT-3'

Los respectivos oligonucleótidos se diluyeron hasta 5 pmol, y usando la T4 polinucleótido cinasa (TAKARA), se permitió que se produjera una reacción a 37 °C durante 1 hora. Luego, se añadió a esto 10 x de tampón (TAKARA), y se llevó a cabo la hibridación a 96 °C durante 1 min a temperatura ambiente. Estos oligonucleótidos y el vector pER_LHN que se había digerido con la enzima de restricción Aatll se unieron, seguido de transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, construyéndose así el pEF_LHN# (que carece de región variable).

Mediante la integración de la región variable del gen X de anticuerpo humanizado en el vector universal construido anteriormente (pEF_LHN# (que carece de región variable)), se completó la construcción de un vector único de expresión del gen X de anticuerpo humanizado (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#).

En primer lugar, usando los siguientes cebadores y KOD-plus-, se amplificó una región variable de cadena L del gen X de anticuerpo humanizado por el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos). Región variable de cadena L:

5' -AAACATATGGCGACATCCAGATGAC-3'

5'-AAACGTACGCTTGATCTCCACCTTGG-3'

El fragmento de región variable de cadena L amplificado y el vector universal (pEF_LHN# (que carece de región variable)) se digirieron con las enzimas de restricción Ndel y BsiWl, seguido de electroforesis en gel de agarosa, recorte de un fragmento deseado del gel, purificación, reacción de ligadura, transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, por lo que se integró la región variable de cadena L en el vector. De la misma manera, usando los siguientes cebadores y KOD-plus-, se amplificó la región variable de cadena H del gen X de anticuerpo humanizado por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 1 min x 30 ciclos). Región variable de cadena H:

5'-AAAGCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGG-3'

5'-AAAGCTGAGCTCACGGTCACCAGGGTTC-3'

El fragmento de región variable de la cadena H y el vector que tenía insertada la región variable de cadena L en él se digirieron con la enzima de restricción Blpl, seguido de electroforesis en gel de agarosa, recorte de un fragmento deseado del gel, purificación, reacción de ligadura, transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, se integró de esta manera la región variable de la cadena H en el vector y se construyó un vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#).

(2-4) Construcción de un vector de expresión de un gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN#)

Utilizando el vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#) construido en (2-3) como estructura básica de vector, se construyó otro vector de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN#) sustituyendo el promotor de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Utilizando pIRES puro3 como molde, se amplificó un fragmento del promotor CMV por el procedimiento PCR (94 °C durante 30 s y 68 °C durante 3 min x 40 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus-.

Cadena arriba de la cadena H:

5'-CTTTTGCAAAAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3'

5'-TTCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3'

Cadena arriba de la cadena L:

5'-TGACGTCGACAAGCTTCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC-3'

5'-CTGGATGTCGCCATATGCGCCGGAGATCCACAGCAGCAGGGAGATGAACACCTGG GTCTGCAGCACCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-3'

A la solución de reacción de PCR se le añadió la enzima de restricción DpnI, y se permitió que se produjera la reacción a 37 °C durante 1 hora, seguido de purificación usando un kit Cleanup reaction miniElute (Qiagen), por lo que se preparó una muestra para su uso en In-Fusion. Mientras tanto, se digirió el gen X de anticuerpo humanizado/pEF-LHN# con las enzimas de restricción HindIII, NheI, y FseI, seguido de electroforesis en gel de agarosa, separando de esta manera dos grandes fragmentos entre los fragmentos resultantes. Cada uno de los fragmentos se recortó del gel, y se extrajo el ADN del gel, preparando de esta manera una muestra para su uso en el kit de clonación PCR Advantage In-Fusión™ (TAKArA), seguido de la transformación, lisis alcalina, y confirmación de secuencia, construyendo de esta manera un vector de expresión del gen X de un anticuerpo humano sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN#).

(2-5) Clonación de un elemento de ADN A7

Se seleccionó A7 de entre los 5 tipos de elementos de ADN que se confirmó que tenían un efecto de aumento de la expresión de SEAP, y se clonó en un vector de expresión de anticuerpo.

De la misma manera que en (2-2), usando cada uno de los vectores de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo (gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN# y gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN#) digeridos con la enzima de restricción NotI como molde, se preparó el ADN para la transformación por el procedimiento de PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 11 min x 30 ciclos) que se llevó a cabo usando los siguientes cebadores y KOD-plus-.

Gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN# D:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGACTCGA GGCACTAGTGACGTCAGGTGGCACT-3'

Gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN# R:

5'-CTCTTCCCATTCTCATTTGAATCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAGCACT AGTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGG-3'

Gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN# D:

Se usó el gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN#D

Gen X de anticuerpo humanizado/pCMV_LHN# R:

Se usó el gen X de anticuerpo humanizado/pEF_LHN# R.

Utilizando el ADN preparado anteriormente para la transformación y el BAC transfectado con pRed/ET, se clonó el elemento de ADN A7 en los vectores de expresión del gen X de anticuerpo humanizado sencillo que se describen en el ejemplo de referencia 2-3. La construcción del vector se muestra en la Fig. 5. De hecho, se llevó a cabo el procedimiento de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-2).

(2-6) Evaluación usando la expresión de anticuerpo como índice

Cada plásmido que se construyó en el ejemplo de referencia 1-5, se evaluó usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen).

Se llevó a cabo la selección por antibiótico con Geneticina (Roche) a 800 |jg/ml durante aproximadamente 2 semanas comenzando 2 días después de la transfección, estableciendo de esta manera una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a sustitución del medio el día antes de la medición, y se sembró un número determinado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas tras la colocación en placas de las células, se recolectó el sobrenadante del cultivo, y se midió el nivel de expresión del anticuerpo en el sobrenadante del cultivo por el procedimiento ELISA. De hecho, el ELISA se llevó a cabo de la siguiente manera. Se añadieron 100 j l del sobrenadante del cultivo libre de células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos revestidos con un anti-cadena ligera kappa a 50 ng/pocillo, y se incubó la placa a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, se retiró la muestra (sobrenadante del cultivo), y cada pocillo se lavó con 200 j l de PBS-Tween (0,05 %). Luego, se añadieron 100 j l de IgG (Fc) anti-humano marcada con HRP a cada pocillo y la placa se incubó a 37 °C durante 1 hora adicional. A continuación, se retiró la IgG (Fc) anti-humana marcada con HRP, y se lavó cada pocillo con PBS-Tween (0,05 %). Luego se reveló el color usando un kit ABTS (Nacalai) de sustrato POD, y se midió la absorbancia a una longitud de onda determinada de 405 nm. Para la dilución de la anti-cadena ligera kappa, la IgG (Fc) anti-humano y la muestra, se usó PBS-Tween (0,05 %). Utilizando la IgG humana diluida en serie a 12 ng, 6 ng, 3 ng, 0,75 ng, 0,375 ng, y 0,1875 ng como referencia, se calculó la concentración de la muestra.

Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se confirmó que la muestra que tenía el elemento de ADN A7 tenía un efecto mayor de aumento de producción de anticuerpo en comparación con un control sin elemento cuando se usaba el promotor EF-1a o el promotor CMV en el vector de expresión de anticuerpo.

Ejemplo3

Longitud de la secuencia que muestra actividad de aumento de expresión de un gen exógeno

(3-1) Clonación de elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia

Basándose en la longitud de secuencia que se usa en el ejemplo 2, se construyeron vectores que contenían cada uno de los elementos de ADN pero tenían diferentes longitudes de secuencia.

Los detalles de los elementos de ADN que tenían diferentes longitudes de secuencia que fueron diseñados basándose en la longitud completa de cada elemento de ADN A2, A7, A18, B5 y C14 se muestran en las Figs. 7, 9, 11, 13, 15, 18 y 19 respectivamente. El pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (2-1) se digirió con la enzima de restricción SpeI durante varias horas, seguido de precipitación en etanol, y se disolvió el precipitado en agua estéril. Utilizando el vector digerido con SpeI como molde, se preparó el ADN para la transformación por el procedimiento PCR (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s, y 68 °C durante 10 min x 30 ciclos) usando los siguientes cebadores y KOD-plus-. Utilizando el ADN preparado de esta manera para la transformación y el correspondiente BAC transfectado con pRed/ET, cada elemento de ADN que tenía una diferente longitud de secuencia se clonó en el pCMV/SEAP ires Hygro descrito en (2-1). La construcción del vector se muestra en la Fig. 2. De hecho, el procedimiento se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en (2-2).

A2-1D:

5'-CATGCACAGATTAGCCATTTAGTACTTACTAAATCAAACTCAATTTCTGAAGTCT AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-1R:

5'-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCAAAATT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-2D:

5'-ACACTGGTCAAAGGGACAGGTCATTGTTATGCTGGCAATGCAGGCTGCTGAAAAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-2R:

5-ACTGTAGCTTCTTATTTTTTACCTGCAGTGCATTCCTGTAAAAGTAGTGTGGAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-3D:

5'-CTGGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-3R:

5'-CCAAGCTTGTCCAACCGCGGCCTGCAGGCTGCATGCAGCCTGTGAAGGCTTTGAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-4D:

5'-TCAATCATTTATCAATTTTATCTTCAAAGTCCCTCACTTCAGGGAGATGATATAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-4R:

5'-ATATATAAAAGTTCATGTATATATAAAATCATGCAATACACGGCCTTTTGTGACT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-5D:

5' -CGCATAAAAGGAAAAGCATCCTTAAAATAAACACCATCAATGGCTCCTCGGTGGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-5R:

Se usó A2-4R.

A2-6D:

5' -GGGAGGCTACAGCTTGCCTCTCTAACCACTAAAAGGCATGACCCTCCTCAAAGCT AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-6R:

Se usó A2-4R.

A2-7D:

5'-TCTGGCTTCCCTGGGCCACGCTGGAAGAAGAATTGTCTTGCGCCACACATAAAAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-7R:

5'-AGCTGATTTTTACGTTAAATGTAACATGTAAAGAAATATATGTGTGTTTTTAGAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-8D:

5'-GTGAAGAGGAGGAGATGTCAAAATTCAAAGTCTTAAATGATGTAGTTTTAAGTAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A2-8R:

5'-ATGACACTTGATATTGTTGTTTATATTGCTGGTTAGTATGTGCCTTCATTTACCT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A2-9D:

Se usó A2-6D.

A2-9R:

Se usó A2R.

A2-10D:

Se usó A2-2D.

A2-10R:

Se usó A2-7R.

A2-11D:

Se usó A2-8D.

A2-11R:

Se usó A2-2R.

A2-12D:

Se usó A2-2D.

A2-12R:

Se usó A2-4R.

A2-13D:

Se usó A2-8D.

A2-13R:

Se usó A2-7R.

A2-14D:

Se usó A2D.

A2-14R:

Se usó A2-2R.

A2-15D:

Se usó A2-2D.

A2-15R:

Se usó A2R.

A2-16D:

Se usó A2-8D.

A2-16R:

Se usó A2-4R.

A2-17D:

Se usó A2D.

A2-17R:

Se usó A2-7R.

A7-1D:

5'-AAAAACAAAACTGGAGTAAACAAGATGAATTGTTTTAATAGAGGCACTGTATTAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-1R:

5'-ATACAATGTTCCATGTATTCTGTGCCTGAACCTATGCAGCTGATGTAGCTGAAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-2D:

5'-GATCTTATTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-2R:

5'-TGTTGTTTTCAGCCACTAAGTTTGAGGTGATTTGTTCTGGCAGTCCTAGGAAACT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-3D:

Se usó A7-2D.

A7-3R:

5'-AGCCTACACTACCCTTTGCAGCCTTTGGTAACTATCCTTCTGCTGTCTACCTCCT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-4D:

5'-AGGAGCTCCTGAATGAAGGACATCACTCAGCTGTGTTAAGTATCTGGAACAATAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-4R:

5'-GACATAAAATGTAAGATATGATATGCTATGTAAGATATGATACCTGCCTTAAAAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-5D:

5'-CACTGCTTGATACTTACTGTGGACTTTGAAAATTATGAATGTGTGTGTGTGTGTC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-5R:

5'-CAATTACATTCCAGTGATCTGCTACTTAGAATGCATGACTGAACTCCTGGGTGGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-6D:

5'-TTATTTTGAAGAGAAACTCCTGGTTCCCACTTAAAATCCTTTCTTGTTTCCAAGC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-6R:

5'-AAGCAGTGTGTGTTTACCTGCATGTGTATGTGAATTAACTCTGTTCCTGAGGCAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-7D:

5'-ATTGCATGTTCTCATTTATTTGTGGGATGTAAAAATCAAAACAATAGAACGTATC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A7-7R:

5'-TTGGGAGGCCGCAGCTGGTAGATCACTTGAGGCCACGAATTTGACACCAGCAGGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3'

A7-8D:

Se usó A7-1D.

A7-8R:

Se usó A7R.

A7-9D:

Se usó A7-7D.

A7-9R:

Se usó A7-5R.

A7-10D:

Se usó A7-4D.

A7-10R:

Se usó A7-7R.

A7-11D:

Se usó A7-6D.

A7-11R:

Se usó A7-4R.

A7-12D:

Se usó A7-2D.

A7-12R:

Se usó A7-6R.

A7-13D:

Se usó A7-7D.

A7-13R:

Se usó A7R.

A7-14D:

Se usó A7-4D.

A7-14R:

Se usó A7-5R.

A7-15D:

Se usó A7-6D.

A7-15R:

Se usó A7-7R.

A7-16D:

Se usó A7-2D.

A7-16R:

Se usó A7-4R.

A7-17D:

Se usó A7-4D.

A7-17R:

Se usó A7R.

A7-18D:

Se usó A7-6D.

A7-18R

Se usó A7-5R.

A18-1:

5'-ATCCCCTGCTCTGCTAAAAAAGAATGGATGTTGACTCTCAGGCCCTAGTTCTTGA TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18-1R:

Se usó A18R.

A18-2D:

5'-CTAAAGTGCTGGGATTACAGGCATAAGCCACCGTGCCCGGCTGGAGCATTGGGAT CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18-2R:

5'-ACTACTTACACATTTCGAGTTTTAAATAAGGCGTTCAATATAGAGTGAACACCTA GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18-3D:

5'-CAGGCATAAGCCACCGCACCCGGCCACCCCTTACTAATTTTTAGTAACGTCGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

A18-3R:

5'-CTGATTGACTTTGACCTCTGCTTTCCAACTTTGCCCCAAAGAAAGTTAGTCACCT AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

A18-4D:

Se usó A18-3D.

A18-4R:

5'-TTCAATGAAACAAGCTCTGTGAGGCTCATTTGTACCCATTTTGTTCAGTACTGCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-1D:

5'-ACATACCCAGAGACACTGAGAGAGACAGACAGACAGTAAACAGAGGAGCACGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-1R:

Se usó B5R.

B5-2D:

5' -GCTCAATTGTATCTTATGAAAACAATTTTTCAAAATAAAACAAGAGATATGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-2R:

Se usó B5R.

B5-3D:

5'-CCTGTGCTGAATACCGTCTGCATATGTATAGGAAAGGGTTAACTCAGCAGGGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-3R:

5' -TATGTGAATGGAAATAAAATAATCAAGCTTGTTAGAATTGTGTTCATAATGACCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-4D:

Se usó B5D.

B5-4R:

5'-GAAAGTCTACAATTTTTTCAGTTTAAAATGGTATTTATTTGTAACATGTACCCTA GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-5D:

Se usó B5-1D.

B5-5R:

5'-CAAAGATGAAGGATGAGAGTGACTTCTGCCTTCATTATGTTATGTGTTCATATCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

B5-6D:

5'-CAGTGAATTATTCACTTTGTCTTAGTTAAGTAAAAATAAAATCTGACTGTGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

B5-6R:

5'-GAACAGACAGGTGAATGAGCACAGAGGTCATTTGTAAACCGTTTGTGGTTAGCCT AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-1D:

5'-CTTTTTGGCTTCTGTGTTTAAGTTATTTTTCCCCTAGGCCCACAAACAGAGTCGA TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-1R:

5'-AACCTTGGAAAAATTCTGTTGTGTTTAGAAGCATGTACCAATCTATCACTCCTAG TCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-2D:

5'-CTATTCACTGTCTGTAGGATGAAAAAGTTAATAACACCCTGAGAGGTTTCGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-2R:

5'-CCTTAGATTAGTTTATTGTATTTTTTATCAGCTACTATAAGGTTTACACACCCTA GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-3D:

5'-CAAGACCCTCAAAATTCAAAAATTTCCTTTATCTTGCTGTAGCACCTCCTGCGAT CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-3R:

5'-GGAGGGGATAGGAAGGGGATGAGGCCTAACAGGTTGATGATCTAGGCTTTACCTA GTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-4D:

5'-CTCAAAAAGGAGATAATTCCAGCCCCTCGCCTTAAAGAATCCCTATCAAGTGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-4R:

Se usó C14-1R.

C14-5D:

5'-CGCTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGTTGGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3'

C14-5R:

Se usó C14-1R.

C14-6D:

Se usó C14-4D.

C14-6R:

5'-TTAACTTTTTCATCCTACAGACAGTGAATAGTAAAGCTTTCTGTGAAGACATACC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-7D:

Se usó C14-2D.

C14-7R:

Se usó C14-1R.

C14-8D:

Se usó C14-3D.

C14-8R:

5'-AAATTATTTCCTGGTGGGCAATATTAGAATATGGGGAATGTTTGCTTCTGAGCCT AGTCAATAATCAATGTCAACG-3'

C14-9D:

Se usó C14-4D.

C14-9R:

Se usó C14-3R.

C14-10D:

Se usó C14-2D.

C14-10R:

Se usó C14R.

C14-11D:

Se usó C14-3D.

C14-11R:

Se usó C14-2R.

C14-12D:

Se usó C14-4D.

C14-12R:

Se usó C14-8R.

C14-13D:

Se usó C14-3D.

C14-13R:

Se usó C14-1R.

C14-14D:

Se usó C14-4D.

C14-14R:

Se usó C14-2R.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A2, A2-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 5401 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 2700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 2200 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 3700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-7 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 5000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-8 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4001 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-9 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3700 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-10 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-11 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-12 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-13 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-14 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2801 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-15 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5800 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; A2-16 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 701 a 7000 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias; y A2-17 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 8450 de la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias.

En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A7, A7-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 601 a 3600 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3601 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 5401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-5 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 4500 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-6 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-7 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-8 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 3600 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-9 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-10 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-11 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-12 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 4401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-13 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-14 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-15 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2401 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-16 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3401 a 8420 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; A7-17 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 6400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias; y A7-18 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1501 a 7400 de la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias. En cuanto a las secuencias de polinucleótidos de los respectivos fragmentos de A18, A18-1 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1 a 5040 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; A18-2 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 1001 a 6002 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; A18-3 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 2001 a 7000 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias; y A18-4 se corresponde con la secuencia de polinucleótido de los nucleótidos 3000 a 7000 de la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias.

Los puntos de inicio y final de los respectivos fragmentos de la secuencia de longitud completa se muestran también en las Figs. 18 y 19.

(3-2) Evaluación de los elementos de ADN que tienen diferentes longitudes de secuencia

Cada plásmido construido en (3-1) se evaluó usando la célula hospedadora CHO-K1 (ATCC) y el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen).

De la misma manera que en (2-3), se llevó a cabo una selección por antibiótico con higromicina tras la transfección, estableciendo de esta manera una línea celular policlonal que expresaba establemente. La línea celular establecida de esta manera se sometió a sustitución del medio el día antes de la medición, y se sembró un número determinado de células en una placa de 24 pocillos. A las 24 horas tras la colocación en placa de las células, se recolectó el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de SEAP.

Los resultados de la medición se muestran en las Fig. 8, 10, 12, 14 y 16. Se confirmó que no solo el elemento de ADN de longitud completa, sino también los clones que tenían una longitud de secuencia más corta que el de longitud completa tenían un efecto de aumento de la expresión. Basándose en los resultados, se confirmó que los elementos de ADN A2, A7, A18, B5, y C14 tienen una actividad de aumento de la expresión de un gen exógeno incluso en los casos en los que tienen una longitud de secuencia más corta que el de longitud completa. Sin embargo, muestran el mayor efecto cuando la longitud de secuencia es la longitud completa.

Ejemplo4

Efecto del uso de células hospedadoras distintas a la línea celular CHO

Se usó una línea celular CHO como la línea celular en la evaluación de los Ejemplos 2 y 3 y en los ejemplos de Referencia 1 y 2 Sin embargo, en el ejemplo 4 se seleccionó una línea celular HEK293 como una línea celular distinta a la línea celular CHO. La línea celular HEK293 se sometió a cultivo estático a 37 °C en presencia de un 5 % de CO2 usando un medio DMEM (Invitrogen) que contenía un 10 % de FCS, y se sembró un número determinado de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias.

2. Un polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias, en el que el polinucleótido es un fragmento parcial de la SEC ID N°: 3 y tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

3. Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que tiene una homología del 95 % o más o del 99 % o más respecto de la secuencia de polinucleótido del polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

4. Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

5. Un polinucleótido que consiste en una secuencia de polinucleótido que contiene:

- al menos una de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

- al menos uno de

(a) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 1 en el listado de secuencias, un secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

(b) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 2 en el listado de secuencias, una secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

(c) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 4 en el listado de secuencias, una secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos; y/o

(d) una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 5 en el listado de secuencias, una secuencia que tiene una homología del 95 % o más respecto de la misma o un fragmento parcial de cualquiera de las dos;

y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno.

6. Un vector que comprende un elemento de ADN que tiene la secuencia de polinucleótido de:

(i) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno;

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el vector es un vector de expresión de un gen exógeno que comprende además un gen exógeno, y en el que el elemento de ADN se posiciona con respecto al gen exógeno de una manera funcionalmente eficaz.

8. El vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína multimérica o una proteína hetero-multimérica.

9. El vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína hetero-multimérica y es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

10. Una célula transformada en la que:

a) se ha introducido el vector de acuerdo con la reivindicación 6 y un gen exógeno, o

b) se ha introducido el vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

11. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la célula es una célula cultivada procedente de un mamífero preferentemente en la que la célula cultivada es una célula que se selecciona de entre el grupo que consiste en células COS-1, células 293, y células CHO.

12. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en la que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína multimérica o una proteína hetero-multimérica.

13. La célula transformada de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la proteína codificada por el gen exógeno es una proteína hetero-multimérica y es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

14. Un procedimiento de producción de una proteína caracterizadoporque comprende cultivar la célula transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 y obtener la proteína codificada por el gen exógeno a partir del producto de cultivo resultante.

15. Un procedimiento para potenciar la expresión de un gen exógeno en una célula transformada en la que se ha introducido un gen exógeno o un vector de expresión de un gen exógeno, caracterizadoporque usa:

(ii) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene dos o más de las secuencias de polinucleótido del polinucleótido que comprende al menos 3000, 2000 o 1500 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido representada por la SEC ID N°: 3 en el listado de secuencias y que tiene una actividad de potenciar la expresión de un gen exógeno; o

(iii) un vector de acuerdo con la reivindicación 6 o un vector de expresión de un gen exógeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

16. El uso de:

(i) el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

(iii) un vector de acuerdo con la reivindicación 6,

para potenciar la expresión de un gen exógeno en una célula transformada.