KR20130111514A

KR20130111514A - 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 ｄｎａ 요소

Info

Publication number: KR20130111514A
Application number: KR1020137000305A
Authority: KR
Inventors: 다이스케 니시미야; 다츠야 이노우에
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2013-10-10
Also published as: TW201207103A; EP2591113B1; JP2013531967A; KR101833570B1; AU2018200686B2; SG186788A1; BR112012033780A2; IL243763A0; JP5859988B2; EP2684961B1; EP3026117A1; ES2701091T3; ES2565428T3; TW201604280A; SG2014009187A; AU2016203681A1; SG10201705118RA; US20160333371A1; KR101920187B1; KR20180021246A

Abstract

본 발명에서는, 신규한 DNA 요소를 사용하여 포유류 세포에서의 외래 유전자의 높은 발현을 안정적으로 달성하기 위한 방법이 개시된다. 보다 구체적으로는, 외래 유전자 발현 단위체가 도입된 유전자자리 주변의 염색질 구조를 변화시켜 전사 활성화를 증강시키는 DNA 요소가 개시된다.

Description

외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 ＤＮＡ 요소 {DNA ELEMENT HAVING THE ACTIVITY OF ENHANCING FOREIGN GENE EXPRESSION}

본 발명은 DNA 요소를 갖는 외래 유전자 발현 벡터를 사용함으로써 외래 단백질 분비 능력이 증강된 형질전환된 포유류 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 사용하여 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술의 발달로 인해, 치료 단백질 및 항체 약물과 같은 단백질 의약품에 대한 상업적 시장은 빠르게 확장되고 있다. 특히, 항체 약물은 높은 특이성을 가지며, 인간 신체에 투여되더라도 이상 면역반응을 일으키지 않으므로, 이의 개발이 활발히 수행되고 있다.

항체 약물로 대표되는 단백질 의약품이 제조되는 숙주 세포로서, 미생물, 효모, 곤충, 동물 또는 식물 세포, 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 식물 세포 등이 사용될 수 있다. 단백질 의약품이 생물학적 활성 또는 면역원성을 갖도록 하기 위해서 접힘 (folding) 또는 글리코실화와 같은 번역-후 변형이 필수적이므로, 복잡한 번역-후 변형을 갖는 미생물로는 작업이 수행될 수 없거나, 상이한 글리칸 구조를 갖는 식물은 생물반응기로서 작동하는 숙주 세포로서 적합하지 않다. 인간의 것과 유사한 글리칸 구조를 갖고 안전하다는 것을 고려하여, 인간과 밀접히 관련된 종으로부터의 것인 CHO 세포와 같은 배양된 포유류 세포의 사용이 현재 표준이며, 이러한 세포를 사용하여 번역-후 변형이 수행될 수 있다.

배양된 포유류 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 미생물 등과 비교하여 생장률이 낮고, 생산성이 낮으며, 비용이 높은 것 등의 문제점이 존재한다 (비특허 문헌 1 참조). 또한, 임상 시험에서 단백질 의약품을 사용하기 위해서는 다량의 제품을 투여하는 것이 필요하다. 그러므로, 이의 생산 능력의 결여는 또한 전세계적인 문제점이다. 따라서, 배양된 포유류 세포에서의 외래 유전자 생산성을 향상시키기 위해서, 프로모터, 인핸서, 약물 선별 마커, 유전자 증폭 및 배양 공학 기술 등의 많은 연구가 지금까지 수행되어 왔다. 그러나 현재 상황으로는, 유전자 발현을 균일하게 증가시킬 수 있는 시스템이 아직 구축되지 못하고 있다. 외래 단백질의 낮은 생산성의 원인 중 하나로서, "위치 효과" 가 고려된다 (비특허 문헌 2 참조). 외래 유전자가 숙주 세포에 도입되는 경우, 이는 숙주 염색체 게놈 내로 무작위하게 통합되고, 외래 유전자의 전사는 외래 유전자가 통합된 부위 주변의 DNA 에 의해 크게 영향받는다. 위치 효과는 외래 유전자의 삽입 부위, 카피 수, 구조 등과 같은 인자들에 의해 영향받으나, 염색체 내의 삽입 부위를 제어하기에 매우 어렵다.

상기 문제점을 해결하기 위해서, 조절 폴리뉴클레오티드 서열 (또한 DNA 요소로서 알려져 있음) 예컨대 유전자자리 제어 부위 (LCR), 스캐폴드/매트릭스 부착 부위 (S/MAR), 인슐레이터, 유비쿼터스 (ubiquitous) 염색질 개방 요소 (UCOE) 및 항-리프레서 (STAR 요소) 가 최근에 확인되었다 (비특허 문헌 3 내지 6 참조). LCR 은 내재성 유전자자리에서 염색질 구조를 개방하는데 필요하지 않다. 그러나, LCR 은 외래 유전자가 통합된 DNA 주변의 염색질 구조를 개방하고 외래 유전자 발현 단위체와 함께 사용되는 경우 광범위한 염색질을 리모델링하는 능력을 갖는 전사 조절 요소이며, AT-풍부 부위를 필요로 하는 것으로 여겨진다 (비특허 문헌 7 참조).

LCR 로 대표되는 상기 언급한 DNA 요소는 종종 프로모터와 조합으로 사용되며, DNA 요소를 프로모터와 조합으로 사용하는 경우 외래 유전자의 발현 수준이 프로모터만 사용하는 경우에 비해 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 극소수 유형의 DNA 요소가 지금까지 보고되어 있고, 외래 유전자 발현의 증강에 기여하는 다양한 메카니즘은 서로 상이하다. 또한, DNA 요소 및 프로모터가 조합으로 사용되더라도, DNA 요소 및 프로모터의 제어 하에 충분량의 치료 단백질이 제조되지 않는다. 그러므로, 외래 단백질의 생산성을 증가시킬 수 있는 DNA 요소에 대한 충분한 지식을 얻었다고 할 수는 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 배양된 포유류 세포와 같은 숙주 세포에서의 외래 유전자 발현을 증강시키는데 있어서 높은 활성을 갖는 DNA 요소를 사용하여, 단백질 의약품에서 사용되는 외래 단백질의 제조를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

인용 목록

비특허 문헌

NPL 1: Florian M. Wurm. (2004) Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22(11): 1393-1398

NPL 2: Ted H. J. Kwaks and Arie P. Otte. (2006) Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. TRENDS in Biotechnol. 24(3): 137-142

NPL 3: Pierre-Alain Girod, Duc-Quang Nguyen, et al. (2007) Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells. Nat. Methods. 4(9) : 747-753

NPL 4: Adam C. Bell, Adam G. West, Gary Felsenfeld (2001) Insulators and Boundaries: Versatile Regulatory Elements in the Eukaryotic Genome, Science 291: 447-450

NPL 5: Steven Williams, Tracey Mustoe. et al. (2005) CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells. BMC Biotechnol. 5(17) : 1-9

NPL 6: Arie P. Otte, Ted H. J. Kwaks. et al. (2007) Various Expression-Augmenting DNA Elements Benefit from STAR-Select, a Novel High Stringency Selection System for Protein Expression Biotechnol. Prog. 23: 801-807

NPL 7: Qiliang Li, Kenneth R. Peterson, Xiangdong Fang, and George Stamatoyannopoulos, (2002) Locus control regions, Blood 100(9): 3077-3086

상기 기재한 바와 같이, 조절 폴리뉴클레오티드 서열인 DNA 요소의 유형이 아직 많지 않으며, 또한, 이들 중 극소수의 DNA 요소만이 외래 유전자 발현을 증강시키는데 있어서 매우 유효하다. 본 발명의 목적은 외래 유전자 발현 단위체가 도입되는 유전자자리 주변의 염색질 구조에서의 변화 등에 수반되는 전사 활성화를 증강시키는 DNA 요소를 사용하여 포유류 세포에서의 높은 발현을 안정적으로 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행하였고, 그 결과로, 배양된 포유류 세포에서 하나 이상의 특정 유형의 DNA 요소를 사용하여 발현되는 외래 단백질의 생산성 및 분비가 향상될 수 있다는 것을 발견하였으며, 그에 따라 발명을 완결하였다.

즉, 본 발명은 하기의 발명을 포함한다:

(1) 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(2) 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(3) 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 으로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(4) 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(5) 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(6) 서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 3000 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 2000 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(8) 서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 1500 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(10) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열 중 2 개 이상의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(12) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 중 2 개 이상의 유형으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.

(13) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.

(14) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 다량체 (multimeric) 단백질인, (13) 에 따른 외래 유전자 발현 벡터.

(15) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 이종-다량체 (hetero-multimeric) 단백질인, (14) 에 따른 외래 유전자 발현 벡터.

(16) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 항체 또는 이의 기능적 단편인, (15) 에 따른 외래 유전자 발현 벡터.

(17) (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 따른 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포.

(18) 포유류에서 유래한 배양 세포인, (17) 에 따른 형질전환 세포.

(19) 포유류에서 유래한 배양 세포가 COS-1 세포, 293 세포 및 CHO 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인, (18) 에 따른 형질전환 세포.

(20) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 다량체 단백질인, (17) 내지 (18) 중 어느 하나에 따른 형질전환 세포.

(21) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 이종-다량체 단백질인, (20) 에 따른 형질전환 세포.

(22) 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 항체 또는 이의 기능적 단편인, (21) 에 따른 형질전환 세포.

(23) (17) 내지 (22) 중 어느 하나에 따른 형질전환 세포를 배양하고, 생성된 배양 산물로부터 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 수득하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 제조 방법.

(24) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 따른 외래 유전자 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 외래 유전자 또는 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포에서의 외래 유전자 발현 증강 방법.

(25) 형질전환 세포에서의 외래 유전자 발현을 증강시키기 위한, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.

본 발명에 따라서, DNA 요소를 사용하여 외래 유전자 발현 벡터를 포유류 숙주 세포 내로 도입함으로써, 치료 단백질, 항체 등을 위한 외래 유전자의 발현이 유의하게 증강될 수 있다.

[도 1] 도 1 은 칩-온-칩 (ChIP-on-chip) 처리한 샘플이 항-아세틸화 히스톤 H3 항체로 특이적으로 염색질-면역침전되었다는 것이 GAPDH 부위의 증폭에 의해 확인된 그래프를 나타낸다.
[도 2] 도 2 는 DNA 요소가 삽입된 SEAP 발현 벡터의 모식도이다.
[도 3] 도 3 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A2, A7, A18, B5 또는 C14 를 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의, CMV 프로모터의 제어 하의 SEAP 발현을 나타내는 그래프이다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A2, A7, A18, B5 및 C14 의 효과를 확인하였다.
[도 4] 도 4 는 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A2 또는 A7 을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의, EF-1α 또는 SV40 프로모터의 제어 하의 SEAP 발현을 나타내는 2 개 그래프를 포함한다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A2 및 A7 의 효과를 확인하였다.
[도 5] 도 5 는 DNA 요소가 삽입된 항체 발현 (항체 유전자 X 중쇄 및 경쇄 동시 발현) 벡터의 모식도이다.
[도 6] 도 6 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A7 을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의, CMV 또는 EF-1α 프로모터의 제어 하의 항체 분비 수준 (ELISA 방법에 의해 측정) 을 나타내는 2 개 그래프를 포함한다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A7 의 효과를 확인하였다.
[도 7] 도 7 은 DNA 요소 A2 및 관련 서열의 서열 길이를 나타내는 표이다.
[도 8] 도 8 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A2 또는 관련 서열을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 3 개 그래프를 포함한다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A2 및 관련 서열의 효과를 확인하였다.
[도 9] 도 9 는 DNA 요소 A7 및 관련 서열의 서열 길이를 나타내는 표이다.
[도 10] 도 10 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A7 또는 관련 서열을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 3 개 그래프를 포함한다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A7 및 관련 서열의 효과를 확인하였다.
[도 11] 도 11 은 DNA 요소 A18 및 관련 서열의 서열 길이를 나타내는 표이다.
[도 12] 도 12 는 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A18 또는 관련 서열을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 그래프이다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 A18 및 관련 서열의 효과를 확인하였다.
[도 13] 도 13 은 DNA 요소 B5 및 관련 서열의 서열 길이를 나타내는 표이다.
[도 14] 도 14 는 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 B5 또는 관련 서열을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 그래프이다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 B5 및 관련 서열의 효과를 확인하였다.
[도 15] 도 15 는 DNA 요소 C14 및 관련 서열의 서열 길이를 나타내는 표이다.
[도 16] 도 16 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 C14 또는 관련 서열을 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 3 개 그래프를 포함한다. 발현 증강에 대한 DNA 요소 C14 및 관련 서열의 효과를 확인하였다.
[도 17] 도 17 은 DNA 요소가 없거나 DNA 요소 A2, A7, A18, B5 또는 C14 를 갖는 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서의 SEAP 발현을 나타내는 그래프이다. HEK293 세포에서의 발현 증강에 대한 DNA 요소 A2, A7, A18, B5 및 C14 의 효과를 확인하였다.
[도 18] 도 18 은 DNA 요소 A2, A7 또는 A18 의 전체 길이 서열을 기준으로 출발점 및 종료점에서의 뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.
[도 19] 도 19 는 DNA 요소 B5 또는 C14 의 전체 길이 서열을 기준으로 출발점 및 종료점에서의 뉴클레오티드를 나타내는 도면이다.

구현예의 설명

이하, 실시예를 참조로 하여 본 발명을 구체적으로 기재할 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범주를 제한하지 않는다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 플라스미드, 제한 효소, DNA 변형 효소 등은 시판 제품이며 통상의 절차에 따라 사용될 수 있다. 또한, DNA 클로닝, 폴리뉴클레오티드 서열 결정, 숙주 세포의 형질전환, 형질전환된 숙주 세포의 배양, 수득한 배양액으로부터의 항체 단리, 항체 정제 등에 사용된 절차는 또한 당업자에게 잘 알려져 있으며 문헌에서 이용가능하다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자" 는 DNA 뿐 아니라 이의 mRNA, cDNA, 및 이의 RNA 를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 핵산과 동일한 의미로 사용되며 또한 DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 구별 없이 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 발현" 은 mRNA 가 유전자로부터 전사되는 현상 및/또는 단백질이 mRNA 로부터 번역되는 현상을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "외래 유전자" 는 숙주 세포 내로 인위적으로 도입되는 유전자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "외래 단백질" 은 외래 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 발현 단위체" 는 전사의 판독 프레임 (frame) 방향으로, 적어도 프로모터 부위, 외래 유전자 및 전사 터미네이터 부위 (폴리 (A) 부가 신호) 를 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "외래 유전자 발현 증강 활성" 은 외래 유전자를 포함하는 유전자 발현 단위체 주변의 DNA 에 대한 전사 및 번역에 유리한 환경을 만들고 전사 및 번역 효율을 유의하게 향상시킴으로써 숙주 세포에서의 외래 단백질 제조를 증강시키는 활성을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "DNA 요소" 는 폴리뉴클레오티드가 유전자 발현 단위체 부근에 위치하거나 유전자 발현 단위체를 포함하는 외래 유전자 발현 벡터 내에 위치하는 경우 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체의 기능적 단편" 은 Fab, F(ab')₂ 등을 포함하며 항원-결합 활성을 갖는 항체의 부분적 단편을 지칭한다. 그러나, 상기 용어는 상기 단편이 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 것이면, 이들 분자에 제한되지 않는다.

1. 외래 유전자 발현 증강에 사용되는 DNA 요소

실시예 1 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 요소는 아세틸화 히스톤 H3 과 게놈 DNA 사이의 상호작용을 사용하여 수득될 수 있다. 일반적으로, 히스톤 (H3 및 H4) 의 아세틸화는 전사 활성화와 연관되는 것으로 여겨지며, 2 개의 주요 가설이 지지되고 있다. 한 가설은, 히스톤 말단부 (tail) 가 아세틸화됨으로써 이것이 전기적으로 중화되어 DNA-히스톤 상호작용의 약화를 초래하는 방식으로 히스톤의 아세틸화가 뉴클레오솜 형태에서의 변화와 연관된다는 것이다 (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6) : 320-329). 다른 가설은 히스톤의 아세틸화가 다양한 전사 인자의 리크루트먼트 (recruitment) 와 연관된다는 것이다 (Nakatani Y. (2001) Histone acetylases - versatile players. Genes Cells. 6 (2) : 79-86). 두 가설 중 어느 쪽의 가설에서나, 히스톤의 아세틸화가 전사 활성화와 연관되며, 항-아세틸화 히스톤 H3 항체를 사용하여 염색질 면역침전법 (ChIP) 을 수행함으로써, 아세틸화 히스톤 H3 과 상호작용하는 DNA 요소를 농축시킬 수 있다는 높은 가능성이 존재한다.

본 발명에서, A2 는 외래 유전자 발현 증강에 사용되는 DNA 요소의 예이다. A2 는 인간 염색체 15 번의 80966429 ~ 80974878 부위에 위치하며 8450 bp 의 폴리뉴클레오티드 서열이고, AT 함량이 62.2% 이다. A2 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 로 표기된다.

A7, A18, B5 및 C14 는 유사한 DNA 요소의 예이다. A7 은 인간 염색체 11 번의 88992123 ~ 89000542 부위에 위치하며 8420 bp 의 폴리뉴클레오티드 서열이고, AT 함량이 64.52% 이다. A7 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 로 표기된다.

A18 은 인간 염색체 4 번의 111275976 ~ 111284450 부위에 위치하며 8475 bp 의 폴리뉴클레오티드 서열이고, AT 함량이 62.54% 이다. A18 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 으로 표기된다.

B5 는 인간 염색체 1 번의 143034684 ~ 143043084 부위에 위치하며 8401 bp 의 폴리뉴클레오티드 서열이고, AT 함량이 66.37% 이다. B5 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 로 표기된다.

마지막으로, C14 는 인간 염색체 11 번의 46089056 ~ 46097482 부위에 위치하며 8427 bp 의 폴리뉴클레오티드 서열이고, AT 함량이 63.81% 이다. C14 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 로 표기된다.

본 발명에서, DNA 요소의 외래 유전자 발현 증강 활성은 지표로서 SEAP 와 같은 리포터 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 사용하여 검정될 수 있다. DNA 요소의 존재 하 리포터 단백질의 활성이 DNA 요소가 부재하는 경우에 비해 바람직하게는 2 배 이상, 보다 바람직하게는 4 배 이상, 보다 더 바람직하게는 5 배 이상 증가하는 경우, DNA 요소는 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 것으로 측정될 수 있다. 심지어 활성이 2 배 이상 증가하는 경우에도, 이것이 세포 배양 규모 및 세포 배양 시간을 감소시켜, 그 결과로 수율을 증가시키고 세포 배양 비용을 감소시킬 수 있다는 것이 예측된다. 수율이 증가하는 경우, 의약으로서 사용되는 외래 단백질을 안정적으로 공급할 수 있다. 또한, 세포 배양 비용이 감소되는 경우, 의약으로서 사용되는 외래 단백질에 대한 비용이 감소하고, 외래 단백질을 투여받을 환자에 대한 재정상의 부담이 또한 감소한다.

본 발명에서, 상기 DNA 요소 중 임의 하나는 단독으로 사용될 수 있으며, DNA 요소 1 개 유형의 2 카피 이상이 사용될 수 있다. 대안적으로는, 상기 DNA 요소의 2 개 이상의 상이한 유형이 조합으로 사용될 수 있다.

A2, A7, A18, B5 및 C14 는 본 발명에서 사용되는 DNA 요소의 바람직한 예이다.

본 발명에서 사용되는 DNA 요소는 SEQ ID NOS: 1 내지 5 로 표기되는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 80% 이상의 상동성은 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성이다. 폴리뉴클레오티드 서열 상동성 탐색은 예를 들어, FASTA 또는 BLAST 와 같은 프로그램을 사용하여 일본 DNA 데이터뱅크 등에서 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 DNA 요소는 엄격한 조건 하에 SEQ ID NOS: 1 내지 5 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되며 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 DNA 요소일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "엄격한 조건" 은 소위 특이적인 하이브리드가 형성되지만 비 (non)-특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 지칭한다. 예를 들어, SEQ ID NOS: 1 내지 5 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 높은 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산의 상보적 가닥이 하이브리드화하고, 낮은 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 상보적 가닥이 하이브리드화하지 않는 조건이, 예시적인 엄격한 조건이다. 보다 구체적으로, 나트륨 염의 농도가 15 내지 750 mM, 바람직하게는 50 내지 750 mM, 보다 바람직하게는 300 내지 750 mM 이고, 온도가 25 내지 70℃, 바람직하게는 50 내지 70℃, 보다 바람직하게는 55 내지 65℃ 이고, 포름아미드 농도가 0 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 50%, 보다 바람직하게는 35 내지 45% 인 조건을 예로 들 수 있다. 또한, 엄격한 조건으로서, 나트륨 염의 농도가 일반적으로 15 내지 600 mM, 바람직하게는 50 내지 600 mM, 보다 바람직하게는 300 내지 600 mM 이고 온도가 50 내지 70℃, 바람직하게는 55 내지 70℃, 보다 바람직하게는 60 내지 65℃ 인, 하이브리드화 후 필터 세척 조건을 예로 들 수 있다.

당업자는 Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)) 등을 참조로 하여 이러한 상동 유전자를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 상기 언급한 폴리뉴클레오티드 서열의 상동성은 FASTA 탐색 또는 BLAST 탐색에 의해 동일한 방식으로 측정될 수 있다.

상기 언급한 폴리뉴클레오티드 서열 내로의 돌연변이 (결실, 치환 및/또는 삽입) 도입은 이러한 기술 분야에서 알려져 있는 방법, 예컨대 쿤켈 (Kunkel) 법 또는 갭이 있는 이중체 (gapped duplex) 법에 의해, 또는 이러한 방법을 기초로 하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발 방법을 이용하는 돌연변이 도입 키트 (예를 들어, Mutant-K (TaKaRa Bio, Inc. 사제), Mutant-G (TaKaRa Bio, Inc. 사제), 또는 LA PCR 시험관내 돌연변이유발 시리즈 키트 (TaKaRa Bio, Inc. 사제)) 등이 사용될 수 있다. 이러한 돌연변이화된 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 DNA 요소로서 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA 요소로서, 서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 임의 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 3000 개 이상 또는 2000 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 부분적 단편이 사용될 수 있다. 이러한 부분적 단편의 예는 다음을 포함한다: A2 의 부분적 단편인 A2-1 내지 A2-17; A7 의 부분적 단편인 A7-1 내지 A7-18; A18 의 부분적 단편인 A18-1 내지 A18-4; B5 의 부분적 단편인 B5-1 내지 B5-6; 및 C14 의 부분적 단편인 C14-1 내지 C14-14. 그러나, DNA 요소는 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는 것이면, 이들 부분적 단편에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 부분적 단편 중 임의 하나는 단독으로 사용될 수 있으며, 부분적 단편 1 개 유형의 2 카피 이상이 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 부분적 단편의 2 개 이상의 상이한 유형이 조합으로 사용될 수 있다. 또한, 임의의 상기 언급한 DNA 요소의 전체 길이 서열 및 부분적 단편이 조합으로 사용될 수 있다. 상기 조합에서, 전체 길이 서열 및 부분적 단편은 동일한 DNA 요소 또는 상이한 DNA 요소에서 유래할 수 있다.

A2 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, A2-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 1 ~ 3000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2801 ~ 5800 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 5401 ~ 8450 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 701 ~ 2700 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-5 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 701 ~ 2200 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-6 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 701 ~ 3700 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-7 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2001 ~ 5000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-8 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 4001 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-9 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 1 ~ 3700 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-10 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2001 ~ 5800 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-11 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2801 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-12 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 701 ~ 5800 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-13 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2001 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-14 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2801 ~ 8450 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-15 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 1 ~ 5800 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-16 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 701 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A2-17 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 2001 ~ 8450 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

A7 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, A7-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 601 ~ 3600 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3601 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 5401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-5 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 4500 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-6 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 4401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-7 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-8 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 3600 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-9 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-10 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-11 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-12 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 4401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-13 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-14 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-15 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-16 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-17 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-18 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

A18 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, A18-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 1 ~ 5040 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A18-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 1001 ~ 6002 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A18-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 2001 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A18-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 3000 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

A2, A7 및 A18 의 각 단편의 출발점 및 종료점을 또한 도 18 에서 나타낸다.

B5 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, B5-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 1 ~ 4001 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; B5-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 1 ~ 3200 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; B5-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 2491 ~ 5601 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; B5-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 5373 ~ 8401 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; B5-5 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 901 ~ 4001 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; B5-6 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 의 뉴클레오티드 4001 ~ 7000 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

C14 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, C14-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 960 ~ 4015 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1987 ~ 5014 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 4020 ~ 7119 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 960 ~ 8141 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-5 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 960 ~ 6011 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-6 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 4939 ~ 8141 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-7 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 960 ~ 5014 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-8 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 2994 ~ 7119 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-9 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 4020 ~ 8141 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-10 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1 ~ 5014 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-11 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1987 ~ 7119 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-12 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 2994 ~ 8141 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-13 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 960 ~ 7119 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; C14-14 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1987 ~ 8141 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

B5 및 C14 의 각 단편의 출발점 및 종료점을 또한 도 19 에서 나타낸다.

2. 폴리뉴클레오티드의 취득

본 발명에서, 이후 기재될, 제조를 증가시킬 외래 단백질을 인코딩하는 외래 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 하기 기재된 바와 같은 통상적인 절차에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드는 외래 유전자의 단편을 기준으로 하여 합성된 DNA 프로브를 사용하여 외래 유전자 발현 세포 또는 조직에서 유래한 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. mRNA 는 이러한 기술 분야에서 통상 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포 또는 조직을 구아니딘 시약, 페놀 시약 등으로 처리하여 총 RNA 를 수득한 후, 올리고(dT) 셀룰로오스 컬럼 또는 폴리 U-세파로오스 컬럼 (담체로서 세파로오스 2B 함유) 등을 사용하는 친화성 컬럼 방법에 의해, 또는 배치 (batch) 방법에 의해 폴리 (A) + RNA (mRNA) 를 수득한다. 또한, 폴리 (A) + RNA 를 수크로오스 밀도-구배 원심분리 등에 의해 추가로 분해할 수 있다. 이후, 그에 따라 수득한 mRNA 를 주형으로 사용하고, 올리고 dT 프라이머 및 역방향 전사효소를 또한 사용하여 단일 가닥 cDNA 를 합성한다. 그에 따라 수득한 단일 가닥 cDNA 로부터, DNA 중합효소 I, DNA 리가아제, RNase H 등을 사용하여 이중 가닥 cDNA 를 합성한다. 이에 따라 합성된 이중 가닥 cDNA 를 T4 DNA 중합효소를 사용하여 평활화 (blunted) 한 후, 어댑터 (예컨대 EcoRI 어댑터) 에 라이게이션하고, 인산화 등을 수행하고, 생성된 DNA 를 λgt11 과 같은 람다 파지 내로 혼입하여 생체내 (in vivo) 패키징을 달성함으로써, cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 또한, 람다 파지 외의 플라스미드 벡터를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 그 후에, 표적 DNA 를 포함하는 클론 (양성 클론) 을 cDNA 라이브러리에서 선택할 수 있다.

외래 유전자 함유 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 제조를 증가시키기 위해 사용되는 상기 언급한 DNA 요소가 통상적인 절차 (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)) 에 따라 게놈 DNA 에서 단리되거나, 프로모터 및 터미네이터 부위 함유 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 에서 단리되는 경우, 게놈 DNA 는 수집원으로서 사용되는 유기체의 세포주로부터 추출되고, 폴리뉴클레오티드가 선택되고 단리된다. 게놈 DNA 의 추출은 예를 들어, Cryer 등의 방법 (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) 또는 P. Philippsen 등의 방법 (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)) 에 따라 수행될 수 있다.

외래 유전자 함유 표적 DNA 요소 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, PCR 방법에 의해 수득될 수 있다 (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)). PCR 방법을 사용하는 폴리뉴클레오티드 증폭에서, 20- 내지 30-mer 합성 단일 가닥 DNA 를 프라이머로서 사용하고, 게놈 DNA 를 주형으로서 사용한다. 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 확인한 후, 증폭된 유전자를 사용한다. PCR 용 주형으로서, 게놈 DNA 라이브러리 예컨대 박테리아 인공 염색체 (BAC) 를 사용할 수 있다.

한편, 서열이 알려져 있지 않은 외래 유전자 함유 폴리뉴클레오티드는 (a) 통상의 절차에 따라 유전자 라이브러리를 제조하고, (b) 제조된 유전자 라이브러리로부터 원하는 폴리뉴클레오티드를 선택하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 수득될 수 있다. 유전자 라이브러리는 염색체 DNA 를 분해하기에 적절한 제한 효소를 사용하여, 수집원으로서 사용되는 유기체의 세포주로부터 통상적인 절차에 의해 수득한 염색체 DNA 를 부분적으로 소화시키고, 수득한 단편을 적절한 벡터에 라이게이션하고, 상기 벡터를 적절한 숙주 내로 도입하여 제조될 수 있다. 유전자 라이브러리는 또한 세포로부터 mRNA 를 추출하고, mRNA 로부터 cDNA 를 합성하고, cDNA 를 적절한 벡터에 라이게이션하고, 상기 벡터를 적절한 숙주 내로 도입하여 제조될 수 있다. 이러한 제조에서 사용되는 벡터로서, 유전자 라이브러리 제조용 벡터, 파지 벡터, 코스미드 등으로 일반적으로 알려져 있는 플라스미드가 또한 사용될 수 있다. 형질전환 또는 트랜스펙션될 숙주로서, 상기 언급한 벡터의 유형에 대해 적합한 숙주가 사용될 수 있다. 외래 유전자 함유 폴리뉴클레오티드는 외래 유전자에 대해 특이적인 서열을 함유하는 표지된 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리드화 방법, 플라크 하이브리드화 방법 등에 의해 상기 언급한 유전자 라이브러리에서 선택된다.

또한, 외래 유전자 함유 폴리뉴클레오티드는 전 화학 합성 (total chemical synthesis) 에 의해 제조될 수도 있다. 예를 들어, 유전자는 두 쌍의 상보적 올리고뉴클레오티드가 제조되고 어닐링되는 방법, 여러 어닐링된 DNA 가닥이 DNA 리가아제에 의해 라이게이션되는 방법, 여러 부분 상보적 폴리뉴클레오티드가 제조되고 갭 (gap) 이 PCR 에 의해 채워지는 방법 등에 의해 합성될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열 결정은 종래의 기술, 예를 들어 디데옥시 방법 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467, (1977)) 등에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 결정은 시판되는 서열분석 키트 등을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다.

3. 외래 유전자 발현 벡터, 요소 벡터

본 발명의 외래 유전자 발현 벡터로서, 상기 언급한 DNA 요소 1 개 유형, 상기 언급한 DNA 요소 1 개 유형의 2 카피 이상, 또는 상기 언급한 DNA 요소의 2 개 이상의 상이한 유형을 조합으로 함유하고, 외래 유전자 발현 단위체를 추가로 함유하는 벡터가 제공된다. 외래 유전자가 상기 언급한 외래 유전자 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 발현되는 경우, DNA 요소는 유전자 발현 단위체의 바로 업스트림 또는 바로 다운스트림에 위치할 수 있거나, 유전자 발현 단위체에서 멀리 떨어진 장소에 위치할 수 있다. 또한, 다수의 상기 DNA 요소를 함유하는 하나의 외래 유전자 발현 벡터가 사용될 수 있다. 더욱이, DNA 요소는 유전자 발현 단위체에 대해 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용될 벡터로서, 상기 언급한 DNA 요소 1 개 유형, 상기 언급한 DNA 요소 1 개 유형의 2 카피 이상, 또는 상기 언급한 DNA 요소의 2 개 이상의 상이한 유형을 조합으로 함유하고, 유전자 발현 단위체 (이하, "요소 벡터" 로서 또한 지칭함) 를 함유하지 않는 벡터가 또한 포함된다. 이러한 요소 벡터는 DNA 요소를 함유하는 상기 언급한 외래 유전자 발현 벡터 또는 DNA 요소를 함유하지 않으며 외래 유전자 발현 단위체만을 함유하는 외래 유전자 발현 벡터와 조합으로 사용될 수 있다. 요소 벡터를 외래 유전자 발현 벡터와 공존시킴으로써 외래 유전자 발현 벡터가 단독으로 사용되는 경우와 비교하여 외래 유전자의 발현이 증강되므로, 상기 언급한 벡터의 조합이 또한 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터에 포함된다.

외래 단백질 인코딩 유전자는 특히 제한되지는 않으나, 이의 예는 리포터 유전자 예컨대 분비 알칼리 포스파타아제 (SEAP), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 루시퍼라아제; 다양한 효소 유전자 예컨대 α-아밀라아제 유전자 및 α-갈락토시다아제 유전자; 약학적으로 유용하고 생리적으로 활성인 단백질인 다양한 인터페론 예컨대 인터페론 α 및 인터페론 γ 의 유전자; 다양한 인터류킨 예컨대 IL-1 및 IL-2 의 유전자; 다양한 사이토카인 유전자 예컨대 에리트로포이에틴 (EPO) 유전자 및 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 유전자; 성장 인자 유전자; 및 항체 유전자를 포함한다. 이들 유전자는 임의의 방법으로 수득될 수 있다.

본 발명은 매우 소수성인 단백질 및 복합체 형성으로 인해 분비되고 제조되기 어려운 단백질에 대해 특히 유효하다. 따라서, 상기 언급한 외래 단백질은 다량체 단백질 예컨대 항체 또는 이의 기능적 단편인 이종다량체를 포함한다. "항체의 기능적 단편" 은 항원-결합 활성을 갖는 항체의 부분적 단편을 지칭하며 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, 디아바디, 선형 항체, 다중특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨) 등을 포함한다. 항체의 기능적 단편은 또한 환원 조건 하에 F(ab')2 를 처리하여 수득한 항체의 가변부에서의 1 가 단편인 Fab' 를 포함한다. 그러나 기능적 단편은, 단편이 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 것이면, 이들 분자에 제한되지 않는다. 또한, 이들 기능적 단편은 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적절한 효소로 처리하여 수득한 단편 뿐 아니라 유전자 조작 항체 유전자를 사용하여 적절한 숙주 세포에서 생성된 단백질을 포함한다.

유전자 발현 단위체는 전사의 판독 프레임 방향으로, 적어도 프로모터 부위, 외래 유전자 및 전사 터미네이터 부위 (폴리 (A) 부가 신호) 를 갖는다. 여기서 사용할 수 있는 프로모터는 항시성 (constitutive) 발현 프로모터 또는 유도성 (inducible) 발현 프로모터일 수 있다. 항시성 발현 프로모터의 예는 다양한 자연적 프로모터 예컨대 SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 E1A 프로모터, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터, EF-1α (인간 신장 인자-1α) 프로모터, HSP70 프로모터, MT 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터 및 액틴 프로모터; 및 인공 (융합) 프로모터 예컨대 SRα 프로모터 및 CAG 프로모터를 포함한다. 또한, 폴리 (A) 부가 서열은 프로모터로부터의 전사에 대한 전사 종결을 유도하는 활성을 갖는 서열일 수 있으며, 프로모터와 동일하거나 상이한 유전자로부터의 서열일 수 있다.

외래 단백질 제조를 증가시키기 위해서 강력한 프로모터를 사용할 필요가 있다. 그러나, 접힘을 갖기 어려운 단백질 또는 매우 활성인 프로모터를 사용하여 분비되기 어려운 단백질을 제조하고자 하는 경우, 단백질은 그 대신에 분비되지 못할 수 있다. 이는 단백질이 번역이 수행되는 리보솜 및 접힘과 분비가 수행되는 소포체의 수용력을 초과하는 양으로 제조되는 경우, 과다 제조된 단백질이 변성되고, 축적되고, 세포 내에 산재된 후 프로테오좀에 의해 분해되기 때문이다. 따라서, 생성된 단백질이 변성 또는 응집되지 않거나 생성된 단백질의 양이 분비 수용력을 초과하지 않는 정도로 발현 수준을 유지할 수 있는 프로모터가 적절히 선택되는 것이 바람직하다. 대안적으로는, 프로모터는 프로모터의 활성을 조정 (예를 들어, 감소시킴) 하여 사용된다. 다량체 단백질 중에서, 이종다량체 형성 분자, 및 특히 이종사량체인 항체와 같은 분자가 상기 언급한 효과에 민감하다. 항체는 서로 연관되는 2 개의 중쇄 분자 및 2 개의 경쇄 분자를 가지므로, 분자를 적절히 연관시키기 위해서는 이의 발현 수준이 중요한 인자가 된다.

또한, 본 발명의 외래 유전자 발현 벡터 및 요소 벡터는 각각 형질전환체를 선별하기 위한 선별 마커를 함유할 수 있다. 예를 들어, 약물 예컨대 세룰레닌 (cerulenin), 오레오바시딘 (aureobasidin), 제오신 (Zeocin), 카나바닌 (canavanine), 시클로헥시미드 (cycloheximide), 히드로마이신 (hygromycin), 퓨로마이신 (puromycin), 블라스티시딘 (blasticidin), 테트라사이클린 (tetracycline), 카나마이신 (kanamycin), 암피실린 (ampicillin) 또는 네오마이신 (neomycin) 에 대한 내성을 부여하는 약물-내성 마커를 사용하여, 형질전환체가 선별될 수 있다. 또한, 에탄올과 같은 용매에 대한 내성, 글리세롤, 염 등의 삼투압에 대한 내성, 구리 이온 등과 같은 금속 이온에 대한 내성을 부여하는 유전자가 마커로서 사용되는 경우, 형질전환체가 또한 선별될 수 있다.

본 발명의 외래 유전자 발현 벡터 및 요소 벡터는 각각 염색체 DNA 내로 혼입되지 않는 벡터일 수 있다. 일반적으로, 외래 유전자 발현 벡터는 숙주 세포에 트랜스펙션된 후, 염색체 내로 무작위하게 혼입된다. 그러나 포유류 바이러스 예컨대 유인원 바이러스 40 (SV40), 파필로마바이러스 (papillomavirus) (BPV, HPV) 또는 EBV 에서 유래한 구성 성분을 사용하여, 벡터는 트랜스펙션된 숙주 세포 내에서 자가 복제가능한 에피솜 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, SV40-유래 복제 기점 (oriP) 및 트랜스-작용 (trans-acting) 인자인 SV40 거대 T 항원 인코딩 서열을 함유하는 벡터, EBV-유래 oriP 및 EBNA-1 인코딩 서열을 함유하는 벡터 등이 사용될 수 있다. DNA 요소의 효과는 벡터 유형 또는 염색체 내로의 이의 혼입의 존재 또는 부재에 관계없이 외래 유전자 발현 증강 활성에 의해 표시될 수 있다.

4. 형질전환 세포

본 발명의 형질전환 세포는 상기 "1" 에서 기재된 DNA 요소를 함유하는 상기 "3" 에서 기재된 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포이다. 외래 유전자 발현 벡터로서, DNA 요소를 함유하는 외래 유전자 발현 벡터만이 도입될 수 있거나 (A), DNA 요소를 함유하는 외래 유전자 발현 벡터 및 또한 상기 "3" 에서 기재된 요소 벡터가 조합으로 도입될 수 있다 (B). 대안적으로, DNA 요소를 함유하지 않는 외래 유전자 발현 벡터 및 요소 벡터가 조합으로 도입될 수 있다 (C).

(B) 또는 (C) 의 상기 조합을 사용하는 숙주 세포 내 외래 유전자 발현은 예를 들어, Girod 등의 방법 (Biotechnology and Bioengineering, 91, 2-11 (2005)) 및 Otte 등의 방법 (Biotechnol. Prog., 2007, 23, 801-807 (2007)) 에 따라 수행될 수 있다.

형질전환되는 숙주 세포의 예는 진핵 세포를 포함하며, 이의 바람직한 예는 포유류 세포를 포함하고, 보다 바람직한 예는 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이 또는 소 유래의 세포를 포함한다. 이러한 포유류 세포의 예는 COS-1 세포, 293 세포 및 CHO 세포 (CHO-K1, DG44, CHO dhfr-, CHO-S) 를 포함하지만, 숙주 세포가 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 도입된 유전자가 숙주 세포에서 안정적으로 존재하고 충분히 발현되도록 하는 방법이면, 임의의 방법을 사용하여 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 일반적으로 사용되는 방법의 예는 인산칼슘법 (Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), 전기천공법 (Becker, D. M. et al., 1990; Methods. Enzymol., 194, 182-187), 스페로플라스트 (spheroplast) 법 (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), 리튬 아세테이트법 (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168) 및 리포펙션법을 포함한다.

5. 외래 단백질 제조 방법

본 발명에서 외래 단백질은, 알려져 있는 방법에 의해 상기 "3" 에서 기재된 벡터를 사용하여 외래 단백질 인코딩 유전자가 도입된 상기 "4" 에서 기재된 형질전환 세포를 배양하고, 생성된 배양 산물로부터 단백질을 수집한 후, 상기 단백질을 정제하여 제조될 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "배양 산물" 은 배양 상청액 이외에 배양된 세포 또는 세포 균질액을 지칭한다. 더욱이, 상기 "4" 에서 기재된 형질전환 세포를 사용하여 제조될 수 있는 외래 단백질로서, 단량체 단백질 뿐 아니라 다량체 단백질이 선택될 수 있다. 다수의 상이한 소단위체로 형성된 이종다량체 단백질이 제조되는 경우, 이들 소단위체를 인코딩하는 다수의 유전자를 상기 "4" 에서 기재된 숙주 세포 내로 각각 도입하는 것이 필요하다.

형질전환 세포를 배양하는 방법은 종래의 숙주 세포 배양 방법에 따라 수행될 수 있다.

형질전환 세포가 포유류 세포인 경우, 세포는 예를 들어, 약 24 내지 1000 시간의 배양 시간 동안 37℃ 및 5% 또는 8% C0₂ 의 조건 하에 배양된다. 배양은 고정, 진탕, 교반 또는 통기 조건 하 회분식 배양, 유가식 배양, 연속 배양 등을 통해 수행될 수 있다.

상기 언급한 배양 산물 (배양액) 로부터의 외래 단백질 인코딩 유전자의 발현 산물 확인은 SDS-PAGE, 웨스턴 분석, ELISA 등에 의해 수행될 수 있다. 제조된 단백질을 단리하고 정제하기 위해서, 종래의 단백질 단리 및 정제 방법이 사용될 수 있다. 배양 완료 후, 표적 단백질이 세포에서 제조되는 경우, 상기 세포는 초음파 균질기, 프랜치 프레스 (French press), 맨톤-골린 (Manton-Gaulin) 균질기, 디노밀 (Dinomil) 등을 사용하여 균질화됨으로써, 표적 단백질이 수득된다. 또한, 표적 단백질이 세포 외부에서 제조되는 경우, 배양액은 그 자체로서 사용되거나, 세포가 원심분리 등에 의해 제거된다. 그 후, 표적 단백질은 유기 용매를 사용하여 추출 등에 의해 수집된 후, 수집된 표적 단백질은 다양한 크로마토그래피 기술 (소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등), 분자 체를 사용하는 겔 여과, 및 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 전기영동 등과 같은 기술을 단독으로 또는 필요에 따라 조합으로 사용하여 단리되고 정제될 수 있다.

상기 언급한 배양 방법 및 정제 방법은 단지 예시일 뿐이며, 방법이 이에 제한되는 것은 아니다. 정제된 유전자 산물의 아미노산 서열은 알려져 있는 아미노산 분석 기술, 예컨대 에드만 (Edman) 분해법을 사용하는 자동화 아미노산 서열 결정에 의해 확인될 수 있다.

6. 항체 단백질 제조 방법

상기 "5" 에서 기재된 제조 방법을 사용하여 제조되는 이종다량체 단백질로서, 항체 단백질을 예로 들 수 있다. 항체 단백질은 중쇄 폴리펩티드 두 분자 및 경쇄 폴리펩티드 두 분자를 포함하는 사량체 단백질이다. 따라서, 항원-결합 친화성 유지 상태에서 이러한 항체 단백질을 수득하기 위해서, 중쇄 및 경쇄 유전자 모두를 상기 "4" 에서 기재된 형질전환 세포 내로 도입하는 것이 필요하다. 이러한 경우, 중쇄 및 경쇄 유전자 발현 단위체는 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터에 존재할 수 있다.

본 발명에서 제조되는 항체로서, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 실험 동물을 원하는 항원으로 면역화시켜 제조된 항체를 예로 들 수 있다. 또한, 출발 물질로서 상기 언급한 항체를 사용하여 수득한 키메라 항체 및 인간화 항체를 또한 본 발명에서 제조되는 항체로서 예로 들 수 있다. 또한, 유전자 조작 동물 또는 파지 디스플레이법을 사용하여 수득한 인간 항체가 또한 본 발명에서 제조되는 항체에 포함된다.

항체 제조에 사용되는 항체 유전자는 항체 유전자로부터 전사되고 번역되는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드의 조합이 주어진 항원 단백질에 대한 결합 활성을 갖는 것이면, 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 항체 유전자에 제한되지 않는다.

또한, 항체 유전자가 항체의 전체 길이 분자를 인코딩할 필요가 없으며, 항체의 기능적 단편을 인코딩하는 유전자가 사용될 수 있다. 이러한 이의 기능적 단편 인코딩 유전자는 항체 단백질의 전체 길이 분자 인코딩 유전자를 유전자 조작하여 수득될 수 있다.

7. 그 외의 외래 단백질 제조 방법

본 발명의 제조 방법을 사용하여 제조되는 외래 단백질의 예는, 상기 언급한 항체에 추가로, 인간 또는 비 (non)-인간 유래의 다양한 단백질, 이의 기능적 단편 및 이의 변형된 산물을 포함한다. 이러한 단백질 등의 예는 펩티드 호르몬 예컨대 심방성 나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP), C-형 나트륨이뇨 펩티드 (CNP), 바소프레신, 소마토스타틴, 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 옥시토신, 그렐린, 렙틴, 아디포넥틴, 레닌, 칼시토닌, 오스테오프로테게린 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGF); 사이토카인 예컨대 인터류킨, 케모카인, 인터페론, 종양 괴사 인자 (예컨대 TNF-α, TNF-β 및 TNF 슈퍼 패밀리), 신경 성장 인자 (예컨대 NGF), 세포 성장 인자 (예컨대 EGF, FGF, PDGF, HGF 및 TGF), 조혈 성장 인자 (예컨대 CSF, G-CSF 및 에리트로포이에틴) 및 아디포킨; 수용체 예컨대 TNF 수용체; 효소 예컨대 리소자임, 프로테아제, 프로테이나아제 및 펩티다아제; 이의 기능적 단편 (본래 단백질의 생물학적 활성의 일부 또는 전부를 갖는 단편), 및 임의의 이들 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 그러나, 상기 단백질이 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 참조로 하여 본 발명을 구체적으로 설명할 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범주를 제한하지 않는다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 플라스미드, 제한 효소, DNA 변형 효소 등은 시판 제품이며 통상적인 절차에 따라 사용될 수 있다. 또한, DNA 클로닝, 폴리뉴클레오티드 서열 결정, 숙주 세포 형질전환, 형질전환된 숙주 세포 배양, 생성된 배양 산물로부터의 단백질 수집, 단백질 정제 등에 사용된 절차는 또한 당업자에게 잘 알려져 있거나 문헌에서 발견될 수 있다.

실시예 1

DNA 요소의 추출

(1-1) 항-아세틸화 히스톤 H3 항체를 사용하는 염색질 면역침전법

항-아세틸화 히스톤 항체를 사용하는 ChIP 을, 하기 절차에 따라 EZ ChIP (Upstate) 을 사용하여 수행하였다. 더욱이, 다르게 언급하지 않는 한, 하기 절차에서 사용한 항체, 완충액 등으로서 Upstate 의 제품을 사용하였다.

먼저, 293F 세포 (Invitrogen) 를 GIBCO (등록 상표) Freestyle™ 293 배지 (Invitrogen) 를 사용하여 37℃ 및 8% C0₂ 의 조건 하에서 배양한 후, 원심분리 (1000 rpm, 5 분, 실온) 함으로써, 생장상에 있는 세포를 수집하였다. 2 x 10⁷ 세포를 1% 포름알데히드 함유 배지에서 10 분 동안 고정한 후, 10x 글리신을 이에 추가한 후, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 (3000 rpm, 5 분, 4℃) 후, 상청액을 제거하고, PBS 를 세포 펠렛에 추가하여 세포를 현탁하였다. 그런 다음, 세포 현탁액을 다시 원심분리하여 PBS 를 제거하고, 이후 SDS 용해 완충액을 세포 펠렛에 추가하여 세포를 현탁하고 용해하였다. 세포 용해에 의해 수득한 각각의 샘플을, 샘플을 빙수로 냉각시키면서 초음파 균질기 (BRANSON) 를 사용하여 DNA 파쇄를 수행하고, 단백질 G-고정 아가로오스 및 프로테아제 저해제 칵테일 함유 희석 완충액을 이에 추가하였다. 생성된 혼합물을 4℃ 에서 1 시간 동안 회전시킨 후, 원심분리하고, 이후 상청액을 수집하였다.

이후, 10 μg 의 정상 토끼 IgG 또는 α-아세틸 히스톤 H3 항체를 이에 추가한 후, 밤새 4℃ 에서 회전시켰다. 생성된 용액에, 단백질 G-고정 아가로오스를 추가하고, 생성된 혼합물을 4℃ 에서 1 시간 동안 회전시킨 후, 원심분리를 수행하고, 이후 펠렛을 수집하였다. 이에 따라 수득한 펠렛을 저염 면역 복합체 세척 완충액 (Low Salt Immune Complex Wash Buffer) 으로 2 회, 고염 면역 복합체 세척 완충액 (High Salt Immune Complex Wash Buffer) 으로 2 회, LiCl 면역 복합체 세척 완충액으로 2 회, 그리고 마지막으로 TE 완충액으로 4 회 세척하였다. 이후 용리 완충액 (20 μl 의 1 M 탄산수소나트륨, 10 μl 의 SDS 및 170 μl 의 멸균수 함유) 을 이에 추가하였다. 30 분 후, 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 수집하였다.

이후, 5 M 염화나트륨을 상청액에 추가하고, 생성된 혼합물을 밤새 65℃ 에서 가열하였다. 이후 RNase A 를 이에 추가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 0.5 M EDTA, 1 M Tris-HCl 및 프로테이나아제 K 를 이에 추가하고, 생성된 혼합물을 45℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.

마지막으로, 시약 A, B 및 C 를 프로테이나아제 K 로의 처리에 의해 수득한 용액량의 5 배 초과의 양으로 이에 추가한 후, 스핀 필터를 사용하여 원심분리 (10000 rpm, 30 초, 실온) 함으로써, 염색질-면역침전 DNA 를 정제하였다.

(1-2) 마이크로어레이 분석

GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) 키트 (Sigma) 를 사용하여, (1-1) 에서 수득한 각각의 ChIP 샘플을 증폭하였다. 절차는 키트에 수반되는 Sigma 의 프로토콜에 따라 수행하였다.

ChIP 를 확인하기 위해서, WGA 에 의해 증폭된 각각의 DNA 320 ng 을 주형으로서 사용하고 하기의 프라이머 및 SYBR (등록 상표) Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time) (TAKARA) 을 또한 사용하여, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 (GAPDH) 내부 유전자를 PCR 방법 (95℃ 에서 5 초, 그리고 60℃ 에서 20 초 x 45 사이클) 에 의해 증폭하였다. 더욱이, GAPDH 는 DNA 요소가 ChIP 에 의해 풍부해졌는지 여부를 확인하기 위한 양성 대조군으로서 사용되는 하우스 키핑 유전자 (house keeping gene) 이며, PCR 방법을 EZ ChIP (Upstate) 에 부착된 프라이머를 사용하여 수행하였다.

도 1 에서 나타낸 바와 같이, 항-아세틸화 히스톤 H3 항체로 면역침전 처리한 샘플에서 GAPDH 가 특이적으로 증폭된 것이 확인되었다. WGA 에 의해 증폭된 각각의 DNA 샘플을 마이크로어레이 분석 (NimbleGen) 하여 염색질 면역침전-온-칩 {Chromatin Immunoprecipitation-on-chip (칩-온-칩 (ChIP-on-chip))} 을 수행하였다. "칩-온-칩 (ChIP-on-chip)" 은 (1-1) 에서 풍부해진 각각의 DNA 를 마이크로어레이 분석하여 각각의 DNA 요소를 확인하기 위한 기술이다.

(1-3) DNA 요소의 추출

(1-2) 에서 수득한 칩-온-칩 (ChIP-on-chip) 분석 결과를 근거로 하여, AT 함량이 62% 이상인 5 개 서열을 추출하였다.

실시예 2

지표로서 분비 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 발현을 사용하는 DNA 요소의 효과

(2-1) SEAP 발현 벡터의 구축

주형으로서 pSEAP2-대조군 (Clontech) 을 사용하여, SEAP 유전자를 하기의 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 2 분 x 40 사이클) 에 의해 증폭하였다.

이후, 증폭된 SEAP 단편을 겔 전기영동에 의해 분리하고 겔에서 절단한 후, QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen) 를 사용하여 정제하였다. 이에 따라 수득한 DNA 단편을 삽입물로서 사용하였다. 삽입물을 제한 효소 NheI 및 BglII 로 소화시키고, 벡터 pIRES hyg3 (Clontech) 을 제한 효소 NheI 및 BamHI 으로 소화시켰다. 생성된 DNA 단편을 각각 아가로오스 겔 전기영동 처리하여 표적 단편을 분리하고, 표적 단편을 겔에서 절단한 후, 정제하였다. 그런 다음, 라이게이션 반응 및 형질전환을 수행하였다. 라이게이션 반응을 LigaFast Rapid DNA Ligation System (Promega) 을 사용하여 수행하였다. 형질전환을 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 동결된 컴피턴트 (competent) 세포 JM109 (TAKARA) 를 해동하고, 라이게이션 반응 후 수득한 10 μl 의 용액을 해동 세포의 용액에 추가하고, 생성된 혼합물을 얼음 상에 30 분 동안 정치하였다. 그후, 열 충격 (42℃, 45 초) 을 혼합물에 가하고, 혼합물을 얼음 상에서 5 분 동안 냉각하였다. 이러한 세포 현탁액에, 1 ml 의 LB 배지를 추가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 1 시간 동안 진탕하였다. 이후, 혼합물을 0.1 mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고, 상기 플레이트를 37℃ 에서 14 내지 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 알칼리 용해에 의해, 표적 플라스미드를 LB 플레이트 상에서 배양된 콜로니로부터 수집하였다. 마지막으로, 알칼리 용해에 의해 수득한 플라스미드 내 SEAP 의 폴리뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 pCMV/SEAP ires Hygro 를 구축하였다.

(2-2) DNA 요소의 클로닝

이후, 실시예 1 에서 추출한 각각의 DNA 요소를, 각각의 DNA 요소에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 로부터 BAC SUBCLONING 키트 (Gene Bridges) 를 사용하여 (2-1) 에서 수득한 SEAP 발현 벡터 내로 클로닝하였다.

먼저, (2-1) 에서 수득한 pCMV/SEAP ires Hygro 를 제한 효소 SpeI 으로 수 시간 동안 소화시킨 후, 에탄올 침전을 수행하고, 침전물을 멸균수에 용해하였다. SpeI 으로 소화시킨 벡터를 주형으로서 사용하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus- (TOYOBO) 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 10 분 x 30 사이클) 을 수행하였다.

A2D:

반응 용액 일부를 사용하여 아가로오스 겔 전기영동에 의해 증폭을 확인한 후, 나머지 반응 용액을 에탄올 침전 처리하였다. 침전물을 멸균수에 용해하고, 생성된 용액을 형질전환용 DNA 로서 사용하였다.

이후, 형질전환용 대장균 (Escherichia coli) 의 제조를 수행하였다.

실시예 1 에서 추출한 5 개 서열에 상응하는 BAC 클론은 하기와 같다:

해동한 10 μl 의 상기 언급한 BAC (Advanced GenoTechs Co.) 를 1 ml 의 배지 (15 μg/ml 의 최종 농도로 클로람페니콜 함유) 에 접종하고 밤새 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 30 μl 의 배양액을 1.4 ml 의 배지 (15 μg/ml 의 최종 농도로 클로람페니콜 함유) 에 옮기고 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 및 멸균수로의 세척을 2 회 반복하고, 세포를 20 μl 의 멸균수에 현탁하였다. 냉각된 큐벳 (0.1 cm) 에, 1 μl 의 pRED/ET (Gene Bridges) 및 대장균을 추가한 후, 전기천공 (1350 V, 10 μF) 하였다. 이후, 1 ml 의 SOC 배지를 이에 추가하고, 생성된 혼합물을 30℃ 에서 70 분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl 의 배양액을 LB 플레이트 (각각 3 μg/ml 및 15 μg/ml 의 최종 농도로 테트라사이클린 및 클로람페니콜 함유) 상에 플레이팅하고, 밤새 30℃ 에서 인큐베이션하였다. 다음날, 이에 따라 수득한 각각의 콜로니를 1 ml 의 배지 (각각 3 μg/ml 및 15 μg/ml 의 최종 농도로 테트라사이클린 및 클로람페니콜 함유) 에 접종하고, 밤새 30℃ 에서 인큐베이션하였다. 30 μl 의 배양액을 1.4 ml 의 배지 (각각 3 μg/ml 및 15 μg/ml 의 최종 농도로 테트라사이클린 및 클로람페니콜 함유) 에 옮기고, 30℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 50 μl 의 10% L-아라비노오스를 이에 추가하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션을 추가 수행하였다. 그후, 멸균수로의 세척을 2 회 반복하고, 30 μl 의 멸균수에 현탁한 대장균 및 1 μl 의 형질전환용 DNA 를 냉각한 큐벳 (0.1 cm) 에 추가한 후, 전기천공 (1350 V, 10 μF) 하였다. 이후, 1 ml 의 SOC 배지를 이에 추가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 에서 90 분 동안 인큐베이션하였다. 배양액의 총량을 LB 플레이트 (100 μg/ml 암피실린 함유) 상에 플레이팅하고, 상기 플레이트를 인큐베이션하였다. 그후, 표적 플라스미드를 알칼리 용해에 의해 수득하였다. 마지막으로, 수득한 플라스미드의 서열 및 이의 제한 효소 위치를 확인함으로써, 표적 플라스미드를 구축하였다. 벡터 구축물을 도 2 에 나타낸다.

(2-3) 지표로서 SEAP 발현을 사용하는 평가

(2-2) 에서 구축한 각각의 플라스미드를 숙주 세포 CHO-K1 (ATCC) 및 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 평가하였다.

800 μg/ml 에서의 히그로마이신으로의 항생제 선별을 트랜스펙션 2 일 후 시작하여 약 2 주 동안 수행함으로써, 안정적으로 발현하는 다클론 세포주를 확립하였다. 이에 따라 확립된 세포주를 측정 전날에 배지 교체하고, 일정 세포수를 24-웰 플레이트 (IWAKI) 에 시딩하였다. 세포 플레이팅 후 24 시간에, 배양 상청액을 수집하고, SEAP 의 활성을 측정하였다. 배양 상청액에서의 SEAP 활성을 SensoLyte™ pNPP 분비 알칼리 포스파타아제 리포터 검정 (ANASPEC) 을 사용하여 측정하였다.

측정 결과를 도 3 에 나타낸다. 요소를 갖지 않는 대조군의 SEAP 활성을 1 로 정규화한 경우, DNA 요소 A2, A7, A18, B5 또는 C14 를 갖는 안정적으로 발현하는 CHO 세포주의 배양 상청액에서의 SEAP 활성은 대조군보다 5 배 이상 더 높은 수치 값을 나타내었다. 결과를 근거로 하여, 5 개 유형의 DNA 요소 모두가 SEAP 발현을 급격히 증강시키는 것이 확인되었다. 더욱이, 상기 5 개 유형의 DNA 요소의 폴리뉴클레오티드 서열을 각각 서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 로 표기한다.

실시예 3

조합으로 사용되는 프로모터의 일반성

실시예 2 에서의 DNA 요소 평가에 사용한 벡터에 대한 프로모터는 CMV 프로모터였으므로, 다른 일반적인 프로모터와 조합된 DNA 요소의 사용을 실시예 3 에서 연구하였다.

(3-1) EF-1α 및 SV40 프로모터를 사용하는 SEAP 발현 벡터의 구축

pSEAP2-대조군 (Clontech) 을 주형으로서 사용하여, SEAP 유전자를 (2-1) 에서 기재된 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 2 분 x 40 사이클) 에 의해 증폭하였다. 증폭한 SEAP 를 (2-1) 에서와 동일한 방식으로 삽입물로서 제조하였다. 삽입물을 제한 효소 NheI 및 BglII 로 소화시키고, 벡터 pIRES puro3 (Clontech) 을 제한 효소 NheI 및 BamHI 으로 소화시키고, pCMV/SEAP ires Puro 를 (2-1) 에서와 동일한 방식으로 구축하였다.

이후, pEF1/V5-His A (Invitrogen) 를 주형으로서 사용하여, EF-1α 프로모터를 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 60℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 2 분 x 30 사이클) 에 의해 증폭하였다.

상기 구축한 pCMV/SEAP ires Puro 를 벡터로서 사용하여, 제한 효소 SpeI 및 EcoRV 로의 소화를 벡터 및 프로모터에 대해 수행하고, pEF/SEAP ires Puro 를 (2-1) 에서 기재된 방법에 따라 구축하였다.

유사하게, pcDNA3.1+ (Invitrogen) 을 주형으로서 사용하여, SV40 프로모터를 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 60℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 1 분 x 30 사이클) 에 의해 증폭하였다.

상기 구축한 pCMV/SEAP ires Puro 를 벡터로서 사용하여, 제한 효소 SpeI 및 EcoRV 로의 소화를 벡터 및 프로모터에 대해 수행하고, pSV40/SEAP ires Puro 를 (2-1) 에서 기재된 방법에 따라 구축하였다.

(3-2) DNA 요소 A2 또는 A7 의 클로닝

이후, DNA 요소 A2 또는 A7 의 클로닝을, (3-1) 에서 구축한 pEF/SEAP ires Puro 및 pSV40/SEAP ires Puro 를 기본 구조로서 사용하여 수행하였다.

먼저, pEF/SEAP ires Puro 및 pSV40/SEAP ires Puro 를 제한 효소 SpeI 으로 수 시간 동안 소화시킨 후, 에탄올 침전시키고, 침전물을 멸균수에 용해하였다. SpeI 으로 소화시킨 각각의 벡터를 주형으로서 사용하여, 형질전환용 DNA 를 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 10 분 x 30 사이클) 에 의해 제조하였다.

이에 따라 제조된 형질전환용 DNA 및 pRed/ET 로 트랜스펙션된 BAC 를 사용하여, DNA 요소 A2 또는 A7 을 (3-1) 에서 기재된 벡터 내로 클로닝하였다. 벡터 구축물을 도 2 에 나타낸다. 더욱이, 절차를 (2-2) 에서 기재된 방법에 따라 수행하였다.

(3-3) 지표로서 SEAP 발현을 사용하는 평가

(3-2) 에서 구축한 각각의 플라스미드를 숙주 세포 CHO-K1 (ATCC) 및 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 평가하였다.

8 μg/ml 에서의 퓨로마이신으로의 항생제 선별을 트랜스펙션 2 일 후 시작하여 약 2 주 동안 수행함으로써, 안정적으로 발현하는 다클론 세포주를 확립하였다. 이에 따라 확립된 세포주를 측정 전날에 배지 교체하고, 일정 세포수를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 플레이팅 후 24 시간에, 배양 상청액을 수집하고, SEAP 의 활성을 측정하였다. 배양 상청액에서의 SEAP 활성을 SensoLyte™ pNPP 분비 알칼리 포스파타아제 리포터 검정 (ANASPEC) 을 사용하여 측정하였다.

측정 결과를 도 4 에 나타낸다. 요소를 갖지 않는 대조군의 SEAP 활성을 1 로 정규화한 경우, DNA 요소 A2 또는 A7 은 발현 증강에 대한 효과를 나타내어, SEAP 의 활성이 EF-1α 프로모터 사용의 경우 대조군보다 2 배 이상 더 높고, SV40 프로모터 사용의 경우 대조군보다 4 배 이상 더 높았다. 결과를 근거로 하여, 이들 DNA 요소가 일반적인 프로모터와 조합으로 사용된 경우 외래 유전자 발현 증강의 효과를 나타낸다는 것이 확인되었다.

실시예 4

지표로서 항체 발현을 사용하는 평가

(4-1) 인간 경쇄 발현 벡터 pEF6KCL 의 구축

플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen) 를 주형으로서 사용하여, 위치 2174 (BGHpA 의 바로 다운스트림) 와 위치 2958 (SmaI) 사이의 DNA 단편 (f1 복제 기점 및 SV40 프로모터 및 기점을 포함하는 DNA 단편, 이하 "단편 A" 로서 지칭함, 단편 A 의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 6 으로 표기됨) 을 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법에 의해 수득하였다.

수득한 단편 A, 및 인간 κ 사슬 분비 신호, 인간 κ 사슬 불변부 및 인간 폴리 (A) 부가 신호를 인코딩하는 DNA 서열 함유 DNA 단편 (이하, "단편 B" 로서 지칭함) 을 중첩 (overlapping) PCR 에 의해 라이게이션하였다. 이에 따라 수득한, 단편 A 및 단편 B 가 라이게이션된 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 으로 소화시키고, 생성된 단편을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 으로 소화시킨 플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen) 에 라이게이션함으로써, EF-1α 프로모터의 다운스트림에 신호 서열, 클로닝 부위, 인간 κ 사슬 불변부 및 인간 폴리 (A) 부가 신호 서열을 갖는 인간 경쇄 발현 벡터 pEF6KCL 을 구축하였다.

상기 언급한 방법에 의해 수득한 pEF6KCL 을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 으로 절단하여 수득한 DNA 단편을, KpnI 및 SmaI 으로 소화시킨 pEF1/myc-HisB (Invitrogen) 에 라이게이션한 후, 형질전환, 알칼리 용해하고 이의 서열 확인을 수행함으로써, 플라스미드 pEF1KCL 을 구축하였다.

(4-2) 인간 중쇄 발현 벡터 pEF1FCCU 의 구축

인간 IgG1 신호 서열 및 불변부 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 DNA 단편 (이 DNA 단편의 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 목록에서 SEQ ID NO: 7 로 표기함) 을 제한 효소 NheI 및 PmeI 으로 소화시키고, 생성된 단편을 NheI 및 PmeI 으로 소화시킨 플라스미드 pEF1KCL 에 라이게이션함으로써, EF-1α 프로모터의 다운스트림에 신호 서열, 클로닝 부위, 인간 중쇄 불변부 및 인간 폴리 (A) 부가 신호 서열을 갖는 인간 중쇄 발현 벡터 pEF1FCCU 를 구축하였다.

(4-3) 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN#) 의 구축

(4-1) 또는 (4-2) 에서 구축한 L-사슬 또는 H-사슬 발현 벡터를 라이게이션하여, 단일 인간화 항체 발현 벡터 (pEF_LHN (가변부 결여)) 를 구축하였다.

PCR 방법에 의해, 제한 효소 SalI 부위를 프로모터의 업스트림에서 pEF1KCL 의 폴리 (A) 의 다운스트림까지의 유전자 발현 단위체의 양끝에 추가하였다. 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여, 겔에서 원하는 DNA 단편을 절단하고, DNA 단편을 정제함으로써, 삽입물을 제조하였다. (4-2) 에서 구축한 pEF1FCCU 를 제한 효소 SalI 으로 소화시켜, 벡터를 유전자 발현 단위체의 업스트림에 위치한 SalI 부위에서 선형화하였다. 이후, 선형화된 벡터를 상기 삽입물에 라이게이션한 후, 형질전환, 알칼리 용해하고 서열 확인함으로써, 단일 인간화 항체 발현 벡터 (pEF_LHN (가변부 결여)) 를 구축하였다.

이후, 하기의 올리고뉴클레오티드를 벡터 pEF_LHN (가변부 결여) 의 AatII 부위에 도입하였다.

각각의 올리고뉴클레오티드를 5 pmol 로 희석하고, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (TAKARA) 를 사용하여, 반응을 37℃ 에서 1 시간 동안 진행시켰다. 그런 다음, 10x 완충액 (TAKARA) 을 이에 추가하고, 어닐링을 96℃ 에서 1 분 동안 실온에서 수행하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 및 제한 효소 AatII 로 소화시킨 벡터 pEF_LHN 을 라이게이션한 후, 형질전환, 알칼리 용해하고, 서열 확인함으로써, pEF_LHN# (가변부 결여) 을 구축하였다.

인간화 항체 유전자 X 의 가변부를 상기 구축한 범용 (universal) 벡터 (pEF_LHN# (가변부 결여)) 내로 통합시켜, 인간화 항체 유전자 X 발현 단일 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN#) 의 구축을 완결하였다.

먼저, 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여, 인간화 항체 유전자 X 의 L-사슬 가변부를 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 1 분 x 30 사이클) 에 의해 증폭하였다.

L-사슬 가변부:

증폭된 L-사슬 가변부 단편 및 범용 벡터 (pEF_LHN# (가변부 결여)) 를 제한 효소 NdeI 및 BsiWI 으로 소화시킨 후, 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여, 겔에서 원하는 단편을 절단하고, 정제하고, 라이게이션 반응시키고, 형질전환, 알칼리 용해하고, 서열 확인함으로써, L-사슬 가변부를 벡터 내로 통합하였다. 동일한 방식으로, 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여, 인간화 항체 유전자 X 의 H-사슬 가변부를 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 1 분 x 30 사이클) 에 의해 증폭하였다.

H-사슬 가변부:

증폭된 H-사슬 가변부 단편 및 삽입된 L-사슬 가변부를 갖는 벡터를 제한 효소 BlpI 으로 소화시킨 후, 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여, 겔에서 원하는 단편을 절단하고, 정제하고, 라이게이션 반응시키고, 형질전환, 알칼리 용해하고, 서열 확인함으로써, H-사슬 가변부를 벡터 내로 통합하고 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN#) 를 구축하였다.

(4-4) 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN#) 의 구축

(4-3) 에서 구축한 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN#) 를 기본 벡터 구조로서 사용하여, 하기 절차에 따라 프로모터를 교체하여 또 다른 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN#) 를 구축하였다.

pIRES puro3 을 주형으로서 사용하여, CMV 프로모터 단편을 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 3 분 x 40 사이클) 에 의해 증폭하였다.

H-사슬의 업스트림:

L-사슬의 업스트림:

PCR 반응 용액에, 제한 효소 DpnI 을 추가하고, 반응을 37℃ 에서 1 시간 동안 진행시킨 후, miniElute 반응 정화 (Cleanup) 키트 (Qiagen) 를 사용하여 정제함으로써, In-Fusion 에서 사용하기 위한 샘플을 제조하였다. 그 동안, 인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# 을 제한 효소 HindIII, NheI, NdeI 및 FseI 으로 소화시킨 후, 아가로오스 겔 전기영동을 수행함으로써, 생성된 단편 중에서 2 개의 거대 단편을 분리하였다. 각각의 단편을 겔에서 절단하고, DNA 를 겔에서 추출하여, In-Fusion 에서 사용하기 위한 샘플을 제조하였다. In-Fusion 에서 사용하기 위한 모든 샘플을 모으고, In-Fusion™ Advantage PCR 클로닝 키트 (TAKARA) 를 사용하여 클로닝을 수행한 후, 형질전환, 알칼리 용해하고, 서열 확인함으로써, 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN#) 를 구축하였다.

(4-5) DNA 요소 A7 의 클로닝

A7 을 SEAP 발현 증강 효과를 갖는 것으로 확인된 DNA 요소 5 개 유형에서 선택하고, 항체 발현 벡터 내로 클로닝하였다.

(2-2) 에서와 동일한 방식으로, 제한 효소 NotI 으로 소화시킨 각각의 인간화 항체 유전자 X 발현 단일 벡터 (인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# 및 인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN#) 를 주형으로서 사용하여, 형질전환용 DNA 를 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 수행한 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 11 분 x 30 사이클) 에 의해 제조하였다.

인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# D:

인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# R:

인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN# D:

인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# D 사용.

인간화 항체 유전자 X/pCMV_LHN# R:

인간화 항체 유전자 X/pEF_LHN# R 사용.

상기 제조한 형질전환용 DNA 및 pRed/ET 로 트랜스펙션된 BAC 를 사용하여, DNA 요소 A7 을 (4-3) 및 (4-4) 에서 기재된 단일 인간화 항체 유전자 X 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 벡터 구축물을 도 5 에서 나타낸다. 더욱이, 절차를 (2-2) 에서 기재된 방법에 따라 수행하였다.

(4-6) 지표로서 항체 발현을 사용하는 평가

(4-5) 에서 구축한 각각의 플라스미드를 숙주 세포 CHO-K1 (ATCC) 및 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 평가하였다.

800 μg/ml 에서의 제네티신 (Roche) 으로의 항생제 선별을 트랜스펙션 2 일 후 시작하여 약 2 주 동안 수행함으로써, 안정적으로 발현하는 다클론 세포주를 확립하였다. 이에 따라 확립된 세포주를 측정 전날에 배지 교체하고, 일정 세포수를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 플레이팅 후 24 시간에, 배양 상청액을 수집하고, 배양 상청액에서의 항체의 발현 수준을 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 더욱이, ELISA 를 하기와 같이 수행하였다. 50 ng/웰에서의 항-카파 경쇄로 코팅된 96-웰 플레이트에, 100 μl 의 세포-미함유 배양 상청액을 각각의 웰에 추가하고, 상기 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 샘플 (배양 상청액) 을 제거하고, 각각의 웰을 200 μl 의 PBS-Tween (0.05%) 으로 세척하였다. 그런 다음, 100 μl 의 HRP-표지 항-인간 IgG (Fc) 를 각각의 웰에 추가하고, 플레이트를 37℃ 에서 추가 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, HRP-표지 항-인간 IgG (Fc) 를 제거하고, 각각의 웰을 PBS-Tween (0.05%) 으로 세척하였다. 그런 다음, POD 기질 ABTS 키트 (Nacalai) 를 사용하여 발색시키고, 405 nm 의 측정 파장에서 흡광도를 측정하였다. 항-카파 경쇄, 항-인간 IgG (Fc) 및 샘플의 희석을 위해서, PBS-Tween (0.05%) 을 사용하였다. 12 ng, 6 ng, 3 ng, 1.5 ng, 0.75 ng, 0.375 ng 및 0.1875 ng 으로 연속 희석한 인간 IgG 를 표준으로서 사용하여, 샘플 농도를 계산하였다.

결과를 도 6 에서 나타낸다. EF-1α 프로모터 또는 CMV 프로모터를 항체 발현 벡터에서 사용한 경우, 요소를 갖지 않는 대조군과 비교하여 DNA 요소 A7 을 갖는 샘플이 더 높은 항체 생성 증강 효과를 갖는다는 것이 확인되었다.

실시예 5

외래 유전자 발현 증강 활성을 나타내는 서열의 길이

(5-1) 상이한 서열 길이를 갖는 DNA 요소의 클로닝

실시예 2 에서 사용한 서열의 길이를 기준으로, 상이한 서열 길이를 갖는 각각의 DNA 요소를 함유하는 벡터를 구축하였다.

각각의 DNA 요소 A2, A7, A18, B5 및 C14 의 전체 길이를 기준으로 설계한 상이한 서열 길이를 갖는 DNA 요소의 세부 사항을 각각 도 7, 9, 11, 13, 15, 18 및 19 에 나타낸다. (2-1) 에서 기재된 pCMV/SEAP ires Hygro 를 수 시간 동안 제한 효소 SpeI 으로 소화시킨 후, 에탄올 침전 처리하고, 침전물을 멸균수에 용해하였다. SpeI 으로 소화시킨 벡터를 주형으로서 사용하여, 형질전환용 DNA 를 하기 프라이머 및 KOD-plus- 를 사용하여 PCR 방법 (94℃ 에서 15 초, 55℃ 에서 30 초, 그리고 68℃ 에서 10 분 x 30 사이클) 에 의해 제조하였다. 이에 따라 제조된 형질전환용 DNA 및 pRed/ET 로 트랜스펙션된 상응하는 BAC 를 사용하여, 상이한 서열 길이를 갖는 각각의 DNA 요소를 (2-1) 에서 기재된 pCMV/SEAP ires Hygro 내로 클로닝하였다. 벡터 구축물을 도 2 에 나타낸다. 더욱이, 절차를 (2-2) 에서 기재된 방법에 따라 수행하였다.

A2-5R:

A2-4R 사용.

A2-6R:

A2-4R 사용.

A2-9D:

A2-6D 사용.

A2-9R:

A2R 사용.

A2-10D:

A2-2D 사용.

A2-10R:

A2-7R 사용.

A2-11D:

A2-8D 사용.

A2-11R:

A2-2R 사용.

A2-12D:

A2-2D 사용.

A2-12R:

A2-4R 사용.

A2-13D:

A2-8D 사용.

A2-13R:

A2-7R 사용.

A2-14D:

A2D 사용.

A2-14R:

A2-2R 사용.

A2-15D:

A2-2D 사용.

A2-15R:

A2R 사용.

A2-16D:

A2-8D 사용.

A2-16R:

A2-4R 사용.

A2-17D:

A2D 사용.

A2-17R:

A2-7R 사용.

A7-1D:

A7-3D:

A7-2D 사용.

A7-8D:

A7-1D 사용.

A7-8R:

A7R 사용.

A7-9D:

A7-7D 사용.

A7-9R:

A7-5R 사용.

A7-10D:

A7-4D 사용.

A7-10R:

A7-7R 사용.

A7-11D:

A7-6D 사용.

A7-11R:

A7-4R 사용.

A7-12D:

A7-2D 사용.

A7-12R:

A7-6R 사용.

A7-13D:

A7-7D 사용.

A7-13R:

A7R 사용.

A7-14D:

A7-4D 사용.

A7-14R:

A7-5R 사용.

A7-15D:

A7-6D 사용.

A7-15R:

A7-7R 사용.

A7-16D:

A7-2D 사용.

A7-16R:

A7-4R 사용.

A7-17D:

A7-4D 사용.

A7-17R:

A7R 사용.

A7-18D:

A7-6D 사용.

A7-18R:

A7-5R 사용.

A18-1R:

A18R 사용.

A18-4D:

A18-3D 사용.

A18-4R:

B5-1R:

B5R 사용.

B5-2R:

B5R 사용.

B5-4D:

B5D 사용.

B5-4R:

B5-5D:

B5-1D 사용.

C14-4R:

C14-1R 사용.

C14-5R:

C14-1R 사용.

C14-6D:

C14-4D 사용.

C14-7D:

C14-2D 사용.

C14-7R:

C14-1R 사용.

C14-8D:

C14-3D 사용.

C14-9D:

C14-4D 사용.

C14-9R:

C14-3R 사용.

C14-10D:

C14-2D 사용.

C14-10R:

C14R 사용.

C14-11D:

C14-3D 사용.

C14-11R:

C14-2R 사용.

C14-12D:

C14-4D 사용.

C14-12R:

C14-8R 사용.

C14-13D:

C14-3D 사용.

C14-13R:

C14-1R 사용.

C14-14D:

C14-4D 사용.

C14-14R:

C14-2R 사용.

A7 의 각 단편의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는, A7-1 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 601 ~ 3600 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-2 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3601 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-3 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 5401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-4 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-5 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 4500 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-6 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 4401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-7 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-8 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 3600 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-9 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-10 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-11 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-12 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 4401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-13 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 5400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-14 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-15 는 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 2401 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-16 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 3401 ~ 8420 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-17 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1 ~ 6400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하고; A7-18 은 서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 의 뉴클레오티드 1501 ~ 7400 의 폴리뉴클레오티드 서열에 상응한다.

전체 길이 서열에서의 각 단편의 출발점 및 종료점을 또한 도 18 및 19 에 나타낸다.

(5-2) 상이한 서열 길이를 갖는 DNA 요소의 평가

(5-1) 에서 구축한 각각의 플라스미드를 숙주 세포 CHO-K1 (ATCC) 및 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 평가하였다.

(2-3) 에서와 동일한 방식으로, 히그로마이신으로의 항생제 선별을 트랜스펙션 후 수행함으로써, 안정적으로 발현하는 다클론 세포주를 확립하였다. 이에 따라 확립된 세포주를 측정 전날에 배지 교체하고, 일정 세포수를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 플레이팅 후 24 시간에, 배양 상청액을 수집하고, SEAP 의 활성을 측정하였다.

측정 결과를 도 8, 10, 12, 14 및 16 에 나타낸다. 전체 길이 DNA 요소 뿐 아니라 전체 길이보다 짧은 서열 길이를 갖는 클론이 발현 증강 효과를 갖는다는 것이 확인되었다. 결과를 근거로 하여, DNA 요소 A2, A7, A18, B5 및 C14 가 전체 길이보다 짧은 서열 길이를 갖는 경우에도 외래 유전자 발현 증강 활성을 갖는다는 것이 확인되었다. 그러나, 이는 서열 길이가 전체 길이인 경우 최고 효과를 나타낸다.

실시예 6

CHO 세포주 외의 숙주 세포 사용의 효과

CHO 세포주를 실시예 2 내지 5 에서의 평가에서 세포주로서 사용하였다. 그러나, 실시예 6 에서는 HEK293 세포주를 CHO 세포주 외의 세포주로서 선택하였다. HEK293 세포주를 10% FCS 를 함유하는 DMEM 배지 (Invitrogen) 를 사용하여 37℃ 에서 5% C0₂ 의 존재 하에 정치 배양하고, 일정 세포수를 트랜스펙션 전날에 6-웰 플레이트에 시딩하였다. (3-2) 에서 구축한 각각의 DNA 요소를 함유하는 SEAP 발현 벡터를 평가하기 위해서, 각각의 플라스미드 및 트랜스펙션 시약 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 을 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 히그로마이신으로의 항생제 선별을 트랜스펙션 2 일 후에 시작하여 약 2 주 동안 수행함으로써, 안정적으로 발현하는 다클론 세포주를 확립하였다. 이에 따라 확립된 세포주를 측정 전날에 배지 교체하고, 일정 세포수를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 플레이팅 후 24 시간에, 세포 상청액을 수집하고, SEAP 의 활성을 측정하였다. 배양 상청액에서의 SEAP 활성을 SensoLyte™ pNPP 분비 알칼리 포스파타아제 리포터 검정 (ANASPEC) 을 사용하여 측정하였다.

측정 결과를 도 17 에 나타낸다. 실시예 3 에서와 동일한 방식으로, HEK293 세포주에서의 외래 유전자 (SEAP) 발현 증강에 있어서, 각각의 요소가 또한 매우 유효하다는 것이 확인되었다.

본 발명에 따른 DNA 요소를 사용하여 외래 유전자 발현 벡터를 포유류 숙주 세포에 도입함으로써, 치료 단백질, 항체 등의 외래 유전자의 생산성이 향상될 수 있다.

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> DNA elements that have an effect on increasing transgene expression <130> DSPCT-FP1124 <150> JP2010-154782 <151> 2010-07-07 <160> 7 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 8450 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 attttgcttg aaaggatagc atcaaggaag tgaaatgaca acccacagaa tgagagataa 60 tttttgcaaa tcatgtatct gataagggac ctgtagtcag aatatgcaaa gaacccttac 120 aattcaataa gacaacccaa tttaaaaaca ggcaaaggat gtgaataggc atttctccaa 180 agatacggaa aaacggccaa taagcacata aaaagatgct caaaatcatt tgccatttgg 240 gaaatgcaat caaaaccaca atgaggtatc acttcacgcc cattagggtg gctatagatc 300 agaaagtcag ataacatgtg ttggcaagca catggaaaca ctgaagtcct tacacactgc 360 tggtaggaat gtaaaatggt gcagccactg tggaaaacag ttttccaatt tctcaaaatg 420 ttaaacacag ttatcataca cccaagcaat tctactctta ggtatatacc caagagaaat 480 gaaaacatat gtcttcacca gaacttgctg ttcacagcag cattatgcat aatagaccaa 540 aagtggaaac aactcaactg cccatcaact ggtgaatgga taagtaaaat gtgatgtaac 600 cagtcattgg actgtcattc attaataaaa agaacaaggt actgattcat gttctaacat 660 gagtgaatct tgaaaacact atgctaaatt aaagaagcca gtcacaaaag gccgtgtatt 720 gcatgatttt atatatacat gaacttttat atatatataa ttatatatat tatatataat 780 tttatatata taaatttcta tatataaata tataaaatca tatatatgat atatattttt 840 tcatatacat catatatatt tacaaaaatt atatatcata tatcatatga tatatgagat 900 atatatcatg atatatatga tatatgatat atatcatatg agatatatga tatcatgaga 960 tatatgatat catatgatat atatgatata gatatcatat gatatatata taatatatat 1020 atgatagata tattatatat gatagatatg atagatatca tattatatat gatagatatg 1080 atagatatca tattatatat gatagatata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1140 gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1200 gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1260 gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1320 gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1380 gatatcatat tatatatgat agatatgata gatatcatat tatatatgat agatatgata 1440 gatatcatat tatatatgat atcatatata taccacatac atcatatata catcatatat 1500 acatcatata tatcatacat atatatgaac tttccagaat aggtatatca ataaagacag 1560 gaagtataca agtggttgcc acagcctgag aggagcaggg aatggtgagt gactgctaat 1620 ggatatggca ctttttttgg ggggtgatga aaatgttctg gtcagacaat ggcaattaca 1680 aaactgtata cacacgaaaa accaaagaat cacacacttt aaaagggagg atttagctcg 1740 gcatggtggc atgcgcctgt actcccagtt actcgggagg ctgaagcagg actgcttaga 1800 gcccaggact tcaaggctgc agcgagctat gatcgctcca ctgcactcca acaaggatga 1860 cagtgcgaga cccgttttct aaataataat aataataata ataataaata acccaaggta 1920 cccagttcac atgcaaaacc actggtaaac ataaattatc tccaagtaat ctagaaagaa 1980 aatgagcaca taagacgtct tctaaaaaca cacatatatt tctttacatg ttacatttaa 2040 cgtaaaaatc agctatgcag aagttacatg aacattttat gttggaaagg taaatgacta 2100 ttattaatac agaatggtta agtacattta tgtttttatg tacaaacgca taaaaggaaa 2160 agcatcctta aaataaacac catcaatggc tcctcggtgg tcacaaaaca aaatcctcac 2220 acctttgtct tccttcacaa ttgagcttta tccacctttt caggcttatc tcccattatt 2280 acctgacaca aacttgggtg ggccagagtt tccactgacc atcccccgac tattcatcca 2340 acactatgtt cactgcctcc cattcctgac catttgcctt ttgtcttcaa ctaattctgg 2400 ggacgttttg tccaaataaa tgatccatat tcttgaaggc tggaatcaag tcctattaca 2460 aatatatttt ctcaccctct ccagagcata gcaacccagc atctactggc ctctcacagc 2520 tctaaccatc cacaacccta agctggcttc tcatcaaacg ggtacttttc accacccaaa 2580 ttcaattaat tcactcttac aataatgaag aatagtcgcc tacagcctac cttttccagc 2640 cttgattcaa tcatttatca attttatctt caaagtccct cacttcaggg agatgatata 2700 tcagctttca cccagagtcc taaagaaaac agcactcttg ccaatgacat agtgccacct 2760 agtggcaaca taaggtaaat cacagtggca gtagaaggat ctccacacta cttttacagg 2820 aatgcactgc aggtaaaaaa taagaagcta cagtactgtt tggcaggaca atttgtttca 2880 tacgtgcata ctatcgccct gactaaatta actcgcaagt cttacaggta ttatttgttt 2940 tcagttccat gcacagatta gccatttagt acttactaaa tcaaactcaa tttctgaagt 3000 gtcttacacc aatatattca tgcacatatg gttaaaattt tccttgagga tctatcatgt 3060 gagagtgtgg cttattataa caagtaaaca gaacaaataa atacaaaatg aaaagaaatc 3120 gtatgattta ctcgcatata agggagcttg ttgtggatta agtttcatga cccaggacac 3180 tgaaacagaa atggaataaa tgagaataaa attaaaagtt gtcatcaaaa atatagaagc 3240 catctaaaga cctaggtgtc aagcatagct ctatgagtac aatcccgtgc ctgagattac 3300 catatgccca gctgtatgct atacactaag agatttagga aggaagcggg gtcagggatt 3360 gaccccagac tccatctttt caagtgggga agaaagatct tccgattgaa aaataaaggc 3420 aaaaaaggct tcaccgtcac agaagtttca acaaccaaca ggatatttaa aacagttatc 3480 aaagcaaaac cattgtatgt tcacttacat ttttacatag tccctcaaac tcacaaaatg 3540 ctgtttactc agggacttct tccggtctta ctagggagcc tggaaagtga cgggaggatt 3600 gcaagggacc actagaaccc tcttcctcaa ttccccttct ctgagaaggg aggctacagc 3660 ttgcctctct aaccactaaa aggcatgacc ctcctcaaag ttaatagccg gattccctga 3720 tagatatttt cactaaatga attctcataa aactctcact aagatttaga gaaggcttcc 3780 agggttgaat tcctgaacat taagaacagc atgtttttta aaagtttaac ttggtgattg 3840 gaccaggact tcatctaggc tatgaatgct cagaatggta ggtcctttac caaacagctt 3900 gagtttgtgt ataaagtgat ctcatcctct taagagtcag agaaacagaa ccaagcgact 3960 tcactataat ttgatctgag gaagtttctt actcacaata ggtaaatgaa ggcacatact 4020 aaccagcaat ataaacaaca atatcaagtg tcattcacac atgcaaaaaa cagacaaaat 4080 cccaaactct gtgttctaac aaatcgcaaa aacctcacta acaataaatt gaaatgacca 4140 aatgtttgga ctgaaaagca atgccttggt agcctagcca tgcctaactc aaataacaga 4200 accatctcga tgttaaaatc ctcacagatc aagctgtgta tgtctcgggt caagacttcg 4260 ccaaaaagca gtgagcacac acttaagagg gaaaaaatct acctcagcct cctaaatgca 4320 atcatctcta cacgagttgc aggccccaag cttcaacgtg ttctgctgga caacgcagta 4380 gaaagctgac aagcaggtgg ccttcccaca ctgactgaac cacctccatg cccatgtcca 4440 ttcattttct tgcccacccc atgtgctata acagacctcc tggctcaggg cactctttcc 4500 ttcctgactg ccttcactta atgactttgt acttttaggt gcaaaaatta tctgcagaaa 4560 tccacactga aaaccaagct tgagaaaggc agcaataacc aacattttta caagaagaac 4620 aaggtcaata tcaagcccat cagattcaaa tagcaagcat ggatgaaaat gaaagattga 4680 aaggcttgag tgccttctta atgtattaaa tatccattta atttacaatt aagctcactg 4740 tgctcactgg ccttttaatc agctttccag gtcctgctca gacttgccta ggacatggga 4800 atgaaagaac ctatacattt atggaccaat ctaccttaac taacttgtca agtgttcctg 4860 catcaagcag aagaaacatc agtgaaactg atacaggaat taaccccttg ttaatccata 4920 aaacttaaag gagcgggatc caatcttctg gcttccctgg gccacgctgg aagaagaatt 4980 gtcttgcgcc acacataaaa tacacgaaca ctaataatag ctgctaagct ttaaaaaaat 5040 tgcaaaaaag gaaaatctca taattttttg tttgttgtga ggtggagcct cactctgtca 5100 cccaggccgg agtgcagtgg caccatcttg gctcactgca acctctgcct cctgggttca 5160 agccattctc ctgcctcagc ctcccgagta gctgggatga taggcgtgtg ccaccatgcc 5220 cagctaattt tcgtattttt agtagagacg gggtttcacc atgttggcca ggctggtctc 5280 aaactcctga cctcaggtga tccacccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt 5340 gtgagccacc gtgcccggcc aatgttttaa gaacgtttac gaatttgtat tgggccacat 5400 tcaaagcctt cacaggctgc atgcagcctg caggccgcgg ttggacaagc ttggattaga 5460 gaaatctaca gagacaaact agtgacttag tagccctctg atagctcatg atttgcaaga 5520 aacttaggat gactatgtgt aaagaccaca aacatcaatt taactgaatg gttcccgcca 5580 cactggaatg aggaagctga gcaaactcag aggactctaa gaaagggctg atgtcatctg 5640 aactgttcgg aattataaac tcctctaaac atgtttcaaa gccagaactt gtaggagttg 5700 ttctgataca cggattaaaa gagggatgac aaagtgtctg tcccccacac tggtcaaagg 5760 gacaggtcat tgttatgctg gcaatgcagg ctgctgaaaa gaatgtatct gtcaaaagta 5820 atcaaagtaa tgaccccaga aggctccaga aacagactgg taaattcagg ttgctttcag 5880 acttccacaa tgctggcaca caaggggaaa gacaaaacta acatttacag agcattatat 5940 ttgatattac atttaatccc cattaaaaag atactatttc ccgtttcact agtgaaaaag 6000 ttgatctttc aaaggttaaa ttatttaaca ccaaggtcaa agggtaagtt ggagagacca 6060 gattcaaacc cagtctgaca ttaaaacatg tgttttcccc ccacatcgtc tcctgctaat 6120 aacctcaaat ctaaaaactg acttgcccta caccttgagc cccatcctac aaactctccc 6180 tgacgttatt aattcagctg tcactgtgca cctacaacgt gccagacacc atactcctca 6240 acactctgta ggcacagaag gaacagataa aaatccctac cttcatagat attattctag 6300 gggtaacaca ggtaaataaa acattaaaat agttttcaca tagtagcaaa ttccatatag 6360 caaaataaaa cagaagaagg aatagcaaat gagggagatg ccctcttaaa catggtgctg 6420 agggaaggcc tccctgagaa agatatcatt taccccaaaa ataaaaaagc aagtaataga 6480 aaaaacaggt aaaaggtgtt ctagacactt aaacctgcca cattgagaac tcagggttct 6540 gatgcaaaac ctcgctgcat agaatgcatt aacttatttt tatacattta aacaaacaaa 6600 ctctacttaa gaactgtgtt ctaaaggaag gagcatatta caggaaggca atttttggtc 6660 agagtagaca cacttaaaaa ctaaacctat tgaaagacca agaacaactg aaagtctttg 6720 ctttgtcaga tttttgacca aaaggaaaat taaagaaaca caccgtgccc atccaatgat 6780 ttcaccaagg aattttaaga gagaaaatcc tacttcttcc tcacccagta gccagtgaaa 6840 tgactgagca aattcacaag ttcactgggg ctgctttcat gtaacacagg gacaacacat 6900 gacagacaca gtggaaccct acaggttgcc tagtatttga aagactgtga agaggaggag 6960 atgtcaaaat tcaaagtctt aaatgatgta gttttaagta tgttcagcaa tttcaccact 7020 cagtagtaaa gccagctaca gttgaaagca atcagaaatt tgaggggtgt gaaataagca 7080 gaagcacaga agttaaggat ttgtattctt cccacatttt ccactttatt ttatactgct 7140 gagaaaaaac aaatttaata gttttctgct gtataagaga gacacattca ctttatgtca 7200 cagtaagagt cactcaattt taatacaact atctcaatgt ataaattaac attctccccc 7260 ctgcccacac atagtaagtc tcttatgatg ttgctgatta gagaagcaaa agttgccgct 7320 acaattctct tcctgcattt taatataaac aatcatcagt cttttcttca tagagtgcag 7380 tgtgggcact atcatcagaa tgtaccagca ctgggtgtgc aaagtttaca aagattagca 7440 agagcaaaag tgttgagatt tttgaaattc atgctgctgc aaagaagtat gtaaaaactc 7500 actcaccata gaggaccaca cagaaactca ggcatgaagt tatatggctg tgtgagtggt 7560 ttgggagaag gaacggaaag cacttccacc aacctatatg cctgagcaaa ttaatgcaaa 7620 acctcagaag ctacaaaaaa gtttatctac ctaaattaaa attggtgtcc acagcagtag 7680 ccagcaaaat gcctgcgaag cgcaaagtgg taaatatttt agggtctgta ggtcatatgg 7740 tctctgttaa acaatatgta aatgaatggg tgtggctgtg ttccaataaa acttcattta 7800 taaaaagagg cagcatggta catccagtca gcaagctata atgtaccaac ccccggtcta 7860 acactaacca aatacctctt aataagccaa agaaactgtg tcctcttagg ccggaagcgg 7920 tggctcacac ctataatccc agcattttgg gaggccgagg cggggagatc acctgaggtc 7980 aggagtttga gaccatcctg gccaacatgg tgaaacccta tttctactaa aaatacaaaa 8040 attagccagg cgtgctggcg ggcgcctgta atgccaacta ctggggaggc tgaagcacga 8100 gaatcgcttg aacccaggag gcagaggttg cagcgagcct agatcacgcc attgcactcc 8160 agcctgggca acaagagaga aactccgtct caaaaaaaaa aaaggaaata aaagtataca 8220 aagtgaaaac aaagaaatta aactgccctt atttgccagt gacattactg tctatgcaca 8280 aaattccaaa aatctacaaa aaagcttcta gtactaaaaa tgagtttagc aaggttgtag 8340 aatccaaggt cagcatataa cataaaatca ccttcctata tactagcaat caccaactgg 8400 aaattgagaa gtatcattca caacagtacc acaaacatga aataaatgtg 8450 <210> 2 <211> 8420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcttagtatg gtaaaccttt tgaagtagat tcaaatgaga atgggaagag agaaaaggga 60 gagaagcaac ataagaaatc tcttttaagg aattttatat agagagaaac agaggaatca 120 gttgatagtt ggaaattatt ttaaagaaaa tgggttattt taaagaaaaa aggtattaca 180 acatgtttgc actattgtgg gaataatcaa gttgagacag aaaattattt tttaaggaag 240 agtctaattg ctgaagtgaa agagaatgaa tgagaccctg tgcataagtg tgatcagata 300 ggagcatgta cagctcaagt aagaacagga agaaagagac aataaacatg tacagatagg 360 atgggctggt cgatgtggtg gtgaaaagac atgcgagtta ttactgatta cttctatttc 420 cccagtgaaa taggaagcca ggttcataaa ccaaaatgaa gaggagcgag gcagtattgg 480 aagttcagga aaagtaatag gtgtaaaaat atgtaaagta gaattaccag ggagtatgaa 540 gatacatttc caattaagga tgaagaattt aaagtgaggc cagccaatac ccctgctttg 600 cttcagctac atcagctgca taggttcagg cacagaatac atggaacatt gtatttaaat 660 agggcctgga ttttacaaaa gtaacacaat gaagaagaga gatgcaaggc tatttgaggg 720 tgtttgtggg agagattgta aaatattagc taagtaagaa ggggactgca aattttagtg 780 gtataaagga atgaggaaaa gtgtaaatac agtggggtca aagaatgttt ggagccaagg 840 cactagaggc aattagctga aaatgtaggt gattattggt gagtgacatg gtttaaatga 900 aaagtataga agggtacaat tatccatcat gaaaagttct agggtacaac taagatctga 960 gtagctgaag tagaatgaaa gtagaatgga cctttccata tccagccagg ttcagtgaca 1020 gaaggttagg aaacaaatta taaaccactt gagagaacat atcccctaag ttgtttttgc 1080 tatttttctt tcagcatata tttgttggaa tgccaactat gttcagttca attaatatgg 1140 gcttcttaaa taagggctcc agcactggat aatcctgcca tttattttga tacattccat 1200 cctgctgctc agatctattg gcatctacag gatgtctttt gagaagatgg gcattcacat 1260 ccctatgtcc tagcaaattt ccaactcaga aaaccacatt aggcttctct atatatcttc 1320 caactatttc aatggaaaat acaattctct gatttcttcc tatgatattt atcaaagaga 1380 atggtgcctg ccagttctag ggtgggggaa ctcaatacaa atcaccaacc tttagatgac 1440 accctgtctt caaagtgctt tcaaagtctg gcagaaaaaa agtacccagt ggctataaga 1500 ccacccagga gttcagtcat gcattctaag tagcagatca ctggaatgta attggctagt 1560 gagttcattt tactcttctc ttcttggtca catgttaccg cccttgtacc ctgcacgttc 1620 tctttcccag acttacaaag catgttctct tgaattcgtt ctctttttaa attcacacag 1680 tcttaatgat tcttctttca caagagtctt tcactcttac aattcagttc aagtcatcca 1740 catgcttatt atgagcaagg gtctgggact taggggaaaa gggaataaaa agatgaatga 1800 aatgtgatcc ctgcagtcca agagcttgct gtgaaaaagg aagtttggct tacattgcct 1860 ccctaatccc ttggctaggc cagaacagaa tattgtctaa aacctcctca cgtcagcagt 1920 cctctggggt ggtgactgga agtagaattt aaacaaaaat ataattgaca cataataatt 1980 gtgcatactt atagggtaca atctgatgtt tcgatatgtg tttaaatggg tgcattgtgt 2040 aatgatcaaa ttgaggtaat ttatccacca ccttgaagag agatttttca atattctcat 2100 tgcgaagaag caggaatttt tagcagacaa ctgagatgct tcttgttcac actaagtcat 2160 tctgacgatg gatttacata acttgttgtt ttttttgtgt gtgtgttttt gagacagagt 2220 cttactttgt cgactaggct gaagtgcagt ggcacaatct cggctcactg caacctccac 2280 ctcccgggtt caaacgattc tcctgcctca gcctcctgag tagctgggat tacaggtgca 2340 tgcaactagg cctggctaat ttttatattt ttaatacaga tgggatttca ccatgttggc 2400 cctgctggtg tcaaattcgt ggcctcaagt gatctaccag ctgcggcctc ccaaagtgca 2460 gggattacag gtgtgagaca ccaagcctgg tacatttaca tttcttatct ggatctttcc 2520 tttagtaagt gctaaggaat cctacttccc ccaatatttt ttcctatttc aatgttttag 2580 catgtatcat gttactactt tgcagacatt tgattttccc ctttgtttac tgtaaagtat 2640 atttttatag cctttgtaat agaagtattc taaaatctgc ctgcaaccta tctttctgac 2700 tctgcatttt agggaataat tctctgttgt ggaatgaaaa aaaaaacaga gcctgtggag 2760 tcagagatct catttcaaat tatagttatc cctaggaata aatctgagtg acaggtagta 2820 tagtataata ataagtataa agctatggtt aaggaaaact caacaacctt atctgtaaat 2880 tgggatgaca acagcctacg tcaaaaaaat gtgaaggtaa atgagataat gtaaggctga 2940 tacttagtaa gcaatttaaa aacacccaaa aaactattgc catgattact ctacttactc 3000 tatttctcta tgctccaggc aaatgaacta ctaatgaccc aggggtcctt ccccattctc 3060 ttcttcacaa ggaaatattc tctctctgtg tgctgtttat taaaatctac tgcccctttt 3120 agaagccttt ccagatcatc ccatggccaa gaacgatcgc tgcttcctct tctttacata 3180 cagatgtttt tctcctgctt gacaattatt tttgtgcaat tattttcctt ttgattgtgt 3240 ttttaatgtc ccccccaccc cacaattttc cagactgttt gctccacgag agaggagacc 3300 atcatctctg tgctcaccgt tgtatgacca gtatcctgag gagtggctgt tacataatta 3360 catcaggcac tcaataaaaa tttgatgaat aaacactgga ttttaaggca ggtatcatat 3420 cttacatagc atatcatatc ttacatttta tgtccctcac ataaatacca cagagtgaag 3480 tatatgacag ataaggtcat ttctcttgat aagtacatag tccagtctga aacagatatg 3540 ccaaaaaaaa acaaaactgg agtaaacaag atgaattgtt ttaatagagg cactgtatta 3600 gtttcctagg actgccagaa caaatcacct caaacttagt ggctgaaaac aacaaaaatt 3660 tattgtctca cagttataga tgttagaagt ataaaattaa ggtgtcagtg ggattggttc 3720 cttctggggg ctgtggaaga gaatctgtcc caagccttca cactgtaaag tacagtactg 3780 gagggatagg acttcaactt gctctatctc agatagagag gagccatttg ttgtgaattg 3840 agaagagggg tatgttgaat ccataataag cacataaaaa cttggctggt tcataggaga 3900 agtaacatgt ttccagctct agtaaaaaac aaattgaagt ggcctataaa aaggtacaga 3960 gtacgacaga atgaaaaata aatgaacaag aatacagaga ggatgtggta aattatcatg 4020 tttccctaat atgttattgg acactaaatg gtattagaat tatttatcaa taataattct 4080 aaactgttgc aattgaaaga atatattaag tggtgttata tgagaagtgc cagggcattc 4140 tcatttctgt ccaatgggag aaacattttc gtttgagacc tccgtgaata atacagtctt 4200 ttagttagga gagctgcatt ttgagtggtg caggcagaat ggcgatctct cacccacaca 4260 aacactaaga tagagagaga cagagacaga gacagagaca gcagagagag acagagaaag 4320 gaagtacagg tactcagata gagataagcc atttcttgac attaagaaat aaagtagaat 4380 ccattggagg gaaataaaac tgcctcagga acagagttaa ttcacataca catgcaggta 4440 aacacacact gcttgatact tactgtggac tttgaaaatt atgaatgtgt gtgtgtgtgt 4500 gtgtgtacat tcagccctcc atatccatgg attttgcatt cacagattca accaaccatg 4560 aattaaaaac atttggaaat aacaaacatt aaaatataac aatacaacaa taaaaataat 4620 acaaataaaa aatatagtgt aacaactgtt tacatagcat gtatgttgta ttaagtagta 4680 taaatctaga gattacttaa tgtataccag aggatgcata ggctatatgc aaatactatg 4740 ccactttaaa ctgataagaa cagatactaa acttcatctt agccaaaagt cagagaaaca 4800 atataactat gccattttac ataagggact tgagctgagc atcctcagat ttcagtatct 4860 ttggagttcc tggaaacaat tccttgtttt atatatatat atgtgtgtgt atatatatat 4920 atatatatac acacatatat atatatatat atatatgata gctactgagt gacaggtgat 4980 attataccat accacttgtc actcagtagc tgtatatgca tatgtatata tatacatata 5040 catatatgtg tgtatgtgta tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtatg ctgtctttcc 5100 tcggtatcac agggaattgg agatatatat attcttttca gtacaaaaaa aattgaacac 5160 agatgggtat ggtaccagaa cagaaggtaa agacacatga aaaaaatttg caacaacatg 5220 aatggaactg gagatcatta tttgaggaga aataatccag gcacagaaaa acaagcattt 5280 tattatttta ggtgaaagac aaacatttta ttttaggtga aataatccag gcacagaaag 5340 acaaacattg catgttctca tttatttgtg ggatgtaaaa atcaaaacaa tagaacgtat 5400 ggaggtagac agcagaagga tagttaccaa aggctgcaaa gggtagtgta ggctttgagg 5460 gtgaggtggg gatggttatt gggtacaaaa aatagttaga aagaataaat aatatctagt 5520 atttaatagc acaacaggtt gactatagtc aaaataacat aattgtacaa tttaaatatg 5580 aaattaaata tatatacaag actagaacac caagttgaat gactccagct tgcgaaaccc 5640 acattgatca ccatgcttgc cccaagggaa gctgtacaat gtctggctcg tccagaaccc 5700 catcatttat cactagcaat ctattgtcca taatcatgtt taaattaata gcattttaaa 5760 ggtacaaata ttttttaaaa aacaaataat tatttaattc gccttttaaa agctttttaa 5820 aaacgttttt aaaaactttt ttaaagtcct gaggactatt ttctttaaag tgctcagtta 5880 cagagctcca tatattgggc tatgatagcc ttacctgatt cttgccaaga atctagtgcc 5940 cagaaaatgc aaatacaaag taagcaactg aaaaataaac aaataagttg gaggtatgct 6000 acctgttgaa atatgaccta gcgcaaacac ctatgccact tgcttatgaa atcatatagg 6060 ttttcggtgt gcagttttga ctgaatgagg gagtttacgc tggaccacaa gggggcccct 6120 ctgtcaataa cgtactccat ttgtgtatta agtcaaaaat gaaatggaag agaaaagaaa 6180 catcgatgac cccaagtctc tttaattgaa tggaggtaaa agggaaacaa cgaatgagaa 6240 aagtactctg cccttttaag aatcttgcat tcacattcct gatgaagtta tttttcctcc 6300 tctcactgat tcccatttca ctctattaca tagcaccgtg ttccccagga gctcctgaat 6360 gaaggacatc actcagctgt gttaagtatc tggaacaata aatatactag tttcaatgtc 6420 taggctatgg gtattccttt ttactgaagg tatgacatat agctgcccag gcctgactaa 6480 attaatagta ataataatta ataatggcaa atttttattc tattaagtta cttggcttga 6540 cttgtagaaa tagcaacatt catctgaaat gccccctcct acacttatgt ctaaggacaa 6600 atcccacata caccacagat aacttcattt tacatgtttt attctgttac caaactaaat 6660 ttttatcata tagtctgttg ctcactgaac tcttcagtaa ttctcaacat accatgtaaa 6720 gcattaagca cagttccaac acagagcaaa tgagcaataa ctgttagtta ttataacatt 6780 attatgtgtt ttcagtgcat taaaccactg gtctgatacc tagcccaaca ttctattaaa 6840 ccacataatc cagttgaata atatatgata atataataaa atggcgataa gtgctaaata 6900 tccagataga aacacagatg gaatcagaca gctttcccaa gaaatagaga aaatagtaga 6960 taggcgatct aggcctaagc actctaagca gaagctaagt tatcacagga tatcttggca 7020 atctgtggca cgtgaaccct tttcttctgg agtctggaac tatgttgcaa ctctcacttt 7080 ctccctatct agagactcag tttgttccct tgtgattatc agcagttgag aaatccttag 7140 accttctgaa aggactactt tttaaattta tatatataat atttaaaata catatcttta 7200 tatataatat atatttaaat atataatatt taaattaata tatatttaaa tatataatat 7260 ttaaattaat atatatttaa ataaataaat ttatatttaa atatataata attaaaatat 7320 atttttaatg aacagagagt aaaggattat tttgaagaga aactcctggt tcccacttaa 7380 aatcctttct tgtttccaag tttttcaaat ggagccctct ttaccagctt gccccctcag 7440 agataagctg ttcccctact tattcagatc tgagatctga aaacattcct tttcctgtga 7500 gttcagctag gacaaagatg gagctttttg ataaaatttg gcaaacacat tttttaaaga 7560 tgaaaatttt taaaaattga aaaaaaaaca tttatagaaa gagacttcta atccaaattt 7620 aacttctcaa actatgtttt gaccggctag cataatgttt cagtctttct ggagaatgcc 7680 ccttgaaact gttttcttct acacaacttc ctcctttcct ttgactttcc tgctctggaa 7740 gggaagaaca ggaagaggac agatcaaatt actcaagagg aaggacaaga aataaggaac 7800 caaattatca acaattggag aaagaaagct gatgtcagta tcatttcata tatgattatg 7860 tcagagtcag gtggataagc caatcctgtt gaatagcata cttttcctgc tactcctgaa 7920 gggtaaagag gtctttctct tacaaagccg tcctagctag taatcttaca ggtgcaaaaa 7980 gcttgttttc atgttatttc ttagtaactc aaaatacctc taaagttata catattatga 8040 aagtactaca gtcacagtgc tgagaaaagg agtaaataag acaatgtata taaaaacact 8100 tggctcagcc cctggctctg tggttgataa atattaagtt agtattcatt attattataa 8160 tttccaaaga gtccattaaa agatatagaa gaagggaggc agcaataaca ctaagagaaa 8220 attccattat ctccaactat ttatcctcta gcccaaaata attgccatta gaaagagcaa 8280 ctttaacaaa aattttaagt tgcaatagat gttcaacttt aaatccatcc cagaaaaatt 8340 tctaaccaaa ggagcataga agatttgatc ttattttcta agtagtatag acttaattgt 8400 gagaacaaaa taaaaacttg 8420 <210> 3 <211> 8475 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcataacttg taagaaatgg agtgaggtct cagttcaaac tggcttctgt atgacttcaa 60 agccaaagtc agcaacttag aaggcaaaaa ttataattta gttggcaaat acgagaaaag 120 gtcagaaaca catgaaatga agctcaatag gaacacttac agggtagcag ggtagtagcc 180 tagggaaaaa agtcagacac taaaattgtt taaataggta agttcaaggg acaggtaaag 240 accttagtgg gtaagaagcc aatcagcaga cgaactgcaa gcaagcactg tctctctttc 300 ccttctgtct cctcttgtag taactgacca caattaaggc tgcctagggg aataatgaag 360 taatcctcct attatcagca atggtctgat ccagtgccag gcaccacaga caacttggtg 420 ttcagagaag atccttcaag atgaacaaag ggtcaaaata aaaaattcta gaagagagaa 480 gactgatcac aatttaatgt aaggcttgga aggaactgat ctctaccttc cttaacatct 540 caagaacttc ctcagattca ttggatgttg agtgtgtgtg agtctagtag aaaaatgaat 600 ttttgtttct taacttggat atgtgattag gatgttaata attaagtctg ggctaatatt 660 gaaggtatct tatgatgggc ttcttaaagc attgatcaca aagactgcat gttcataaac 720 tgagctgcac ttgttaggat tctagatgtt tgaaatttct tgtgttattt tggtctcaga 780 tttctagaca aattttctca aattcctatt tcactttttg acatatcatg agtgactcaa 840 atgtttgccc ttgagtcgga aaacacccag cattaggaat aggcacataa acataatact 900 tcaagcttca gatttaagct caattataaa gtgtttaaag gctgtgctga tagttcttct 960 gagtagaatt cctacaacta tgggtttgtc tataataaaa tgttcactct atattgaacg 1020 ccttatttaa aactcgaaat gtgtaagtag taataaagaa aatatgtcct cctgtaacca 1080 aagctaggac cgattacatg ttcacttgac tgacagatac aatcacctat attaggagca 1140 atcagcactt ccttacaaac taacaacttg agatgtagtg ttcccattgg ctatgaagat 1200 tttctttatt tactcagaat agtctgtagg atctgccagc tgcccctgat tataccagct 1260 gcacccaatg atcacagtga acattatttt acattctaaa taactggtgc aaggtgagcc 1320 atggttttct gagtttccta tcacctttgt gtttcaggtc ctcaaatgtt aatttgtaaa 1380 gctgctgttt caggcaaaac taacaaaatt agcatctaat caataaccat actatgtcca 1440 cccatatcct ataacacaga agtaggggaa gagtgagaaa ggtggaagtg gagaaataga 1500 ggcccaaaaa gaaagtttta tcacaggaat atctagatgt cttctgggat tgtctgttaa 1560 agagctgtga cactcatata aatgcagaat tactctcttt cttccttgtt ggttagaagg 1620 ccaagggtgc catggtaata ctaccaaaca tatatcaaag cttggcagga aaaatggtac 1680 cttcagaaat tttataatct gatatcaaat aggtcaagaa atataataaa actagtttct 1740 ttggtttcct tagaaacctg gaaaacttta aattagaaac ttagaaagct ttaaatcaga 1800 ctttgtagtt aaaaaaggaa attttagttc cttccagcat tagaattccg tgattctctg 1860 actctgagcc tggattaaat ctagcccagc tgagtggaaa cttaagtaac tagctggttg 1920 cctttagtga tcttccactt tatggctgct tccgcctaag aagttcatca tcgtgactta 1980 ctttctttgg ggcaaagtcg tgactaactt tctttggggc aaagttggaa agcagaggtc 2040 aaagtcaatc agaaatggga caaactcact tcctactgcc tggtgaaggg gccattttca 2100 gtagcccctt ttcaagatta gtttcattca agatttgata agctgttttg actttactat 2160 agatcttatt atccatgtca gttaagttta tgcttccact aaatctatct gaattcaaaa 2220 ggtaaaaagc taatgctcag tcttatcaga tttatcttat ttattaatag aatgtggatt 2280 tttttaagca tataacaata atagtaatga taggaccata aatgtggatg gctctttaca 2340 agtcactaac attacataaa ttcctcaaca acacactctg aggccataac aaacttttag 2400 aaataacaca attggctacg gaactccagc catctagctt catgggctcc cactttaatt 2460 tcaaaacaac agaactgtgc acattcattt acatgattag ggcagagctt aactgtatct 2520 catgtagcac ctacatcatt cttcagacaa acttattgcc ttttacagac aagaaaactg 2580 gggctcaaaa aaggacttgc ttataactgg ctaataaaga ggaactctgg gttcaaagtg 2640 agtccaattc tttcttccac ccacagcttc tgctaaagtc attacagaaa tgcatagagc 2700 agttcttcca cgttattgct taggtttcta aagagcagtg acctaataca acatgctcta 2760 taatttatta ctgatttaac tatttcacta aggattcact tttaactttt aacttgtaaa 2820 tatgtctaat aaacaccact gaaatagcaa cctctttctt catggccttg tggttgtaaa 2880 gcaagctagt aatatatgtc tgtggatttg tgctaataaa gttctataca cctcattaat 2940 tccacaaatc ctactgggta tttcttatct gccagatcct acgctaggta ctggatacac 3000 agtactgaac aaaatgggta caaatgagcc tcacagagct tgtttcattg aaaagcagag 3060 agatacacac taatcaacaa attaatagta acacactacg atgtgttttg aaggaaaatt 3120 agagcatcaa agagacggtg ttagcaggtg gaggggagct cttttagatg gagaatgaga 3180 atgcctccct aaagacatgg gaataaattg agatcacaaa aaatgagaaa tagccagcct 3240 tgagaagagc agaaggaaga acattcaaag gaaaagaaag tgcatactgg aaagcctgaa 3300 cactagagtt tggtgtatgt aaggagctga gcaatggtca cttgtgtgat aagatgtgtg 3360 gatgtggggt ggggggcagg ggtgagtccc acgcagctct taagtgtgtc ctcagactcc 3420 tgtggtttcc atcagccaca acctgaataa ctgtgtggta atccaaaaat gattacagat 3480 taaacatata aaaatatcat tacacccata gtacctaagc caaggacaca gtattctatc 3540 ttttcaatga agatctgcat gaagtaaaat tattatatat aattttaggt attgatatag 3600 atacatcagt ggatagatat agatatgtgt ctctggtata gaaaaaagtt ttaaagggat 3660 attaaaagtt cttatcttgc agggttgaag attgtggcaa ctttcatttc tttttaattt 3720 taagaaaaaa gtggtattat gggggattag catgtttgtg ggtatatgta tatttttaat 3780 taaaaaataa acaacaaaat gaaaacgttt ttcttctatg aaagcctaat aagaagaaat 3840 ttcagctgtt ttaacttagg gagctaaaaa catcaaatcc aagaatgttc tctggaactg 3900 agctcaatac atttttattt gagtaagaat tggatacatt tccatcccct tggggctcca 3960 gtctgtcaat attttacttt tcagcgataa aaagacacat gtagataatc acagtgacct 4020 cagtaacttt ccttctctta tttaagttta ttttatttct atcgtagttt tccctgttaa 4080 agattttttc tttttgctta catatataat tttagagaat aacaatgcac acacaaaaaa 4140 ttcctcttgt tctgctagac ctggactttt tctctaatat atatctccat tttttgtctt 4200 ttttcagacg tattttggaa gcaaaggaga gaattgctat atagctgact tcctcttctc 4260 atcaacagtg ttttaacagt ttttaagcaa aagtcagctt tgtttatcta agattttttt 4320 tgctggcatt taacctaccc ctgcctcccc tttcccaagt ccacttcagc caacctctca 4380 ttcgacaggt accaccctct aacataactg aaataatgtc taccattact ggatcttgct 4440 agcaaagaat ctcaaatttt cccacttggt tgtaaattat tttgtaatct ctagtgttta 4500 aggtgcgctt gtcctatcta atcccctccc tggcaggaca ccttacagaa cctacccctt 4560 acactagtca ttaagcacca tcagggacgg atggctgtgt cactggtctg tttggtattc 4620 cctactgatc ctaccatgtg gtgattatct atgacttccc taatccctgg ctgccttagc 4680 tgggactggc tgacatgctt ctcaggttgc cgctggcttt acagtccttt actgcccatg 4740 ccactttgga gataggcagg gctagtactt ttctatataa gcccccaaac ttgactttgt 4800 gtttcacagt aggtgaaaaa gttgggtctc ttttctttta cttttctttc cacaagatga 4860 taaagctagg ggaagcctgt ggacatggtt tatttctgca actgcaatga ttgattggtg 4920 cttcctgctg cttacttcct aaactttgtg ctcagtgtca gatccctagc agtttctatc 4980 ccctgctctg ctaaaaaaga atggatgttg actctcaggc cctagttctt tttaattaaa 5040 ttgtattttt gttatcatta ttattattat tattttgaga tggggtctta ctctgtcgcc 5100 caggctgaag tgcagtggtg caatcacagc tcactgtttt agcctcctga gtagctggga 5160 ctacaagcgt catgccacca tgcttctttt taatttttta aaatggtttt ctgccttcaa 5220 ttctaagcac ttctcaattg taaccaagag ataatacttt ttatgaattc ttaaagttat 5280 caacagatac tcaaagtttt agcaaagtct aaatgatatt aagcttgtcc ttattgccca 5340 agtgacttca atgactattt gttaattgca accaagggtc attttttaaa tgaatatata 5400 ttattattat atatataata ttaaggtcct caaataccta aaagtttagc aaaatctaaa 5460 taatattgtg catattcttt tattactgta ttagtccgtt ttcatgttgc tgataaagac 5520 atacccaaga ctgggcaatt tacaaaagaa agaggttcac tggactcaca gttccacgtg 5580 gctggggagg cctcacaatc acggcagctt acgggattgt tgagaaatga cacttctcaa 5640 gctggggcta aactatctct gtggtagttg ttctgattca agtattgaat tggttttttt 5700 tgtttttttt gagatggagt ttcgttcttg ttgcccaggc tggagtgcaa tggcacgatc 5760 tcagctcacc gcaacctctg cctcccgggt tcaagtgatt ctcctgcttc agcctcccaa 5820 gtagctggga ctacaggcat gagccaccac acccagctaa ttttgtattt ttagtagaga 5880 catggtttct ccatgttggt caggctggtc tcaaactccc aacctcaggt gatccacctg 5940 ccttggcctc ctaaagtgct gggattacag gcataagcca ccgtgcccgg ctggagcatt 6000 ggtatataaa agctgcctag gtaactctaa cctttggccc catacatctg aaggatacct 6060 acaatgcacc tgaaaaatgc aactgaaaca gtagttccct gggaccacac actcagaaag 6120 ggggtgtatc aggagatcta gggaccagga gggtggaaga cctaaggcag cactacagat 6180 gatggagaaa aacccactgg ggaggggcga tcctaacctt gagaatcact gagatcatgc 6240 agaagtattt gatcctacag cattaatatt gtattgtatt gtattagtat atatatatag 6300 tgtatatata tagtattagt atatatattg tattgtatta gcatatatat actaattgta 6360 ttgtattgta tttatatata tagtattgta ttagtatata tatacagtat atatgtatat 6420 atactaatac aatgtactaa tacaatacaa taccatatat atatacacta acacaataca 6480 attagtatat atatatatat atatactaat acaatacaat actatatata tactaataca 6540 atatatacat atatactcac caagacatat tagtggtctg atgtctggct gccacactca 6600 tcttctacct tcagctctgc tctaccaaat atcatttgtt tctgggatct ttgcagtcca 6660 aggaacttca tccttgatat cccacccctt actaactttt tttttttttt ttttttttga 6720 gacggagtct cgctgtgtca cccaggctgg agtgcagtgg tgtgatctcg gctcactgca 6780 agctccacct cctgggatca caccattctc ctgcctcagc ctcccaagta gctgggacta 6840 caggtgcccg ccaccacacc aggctaatgt tttaccgtgt tagcaaggat ggtctcgatc 6900 tcctgacctc atgatccatc cgccttggcc tcctaaagtg ctgggattac aggcataagc 6960 caccgcaccc ggccacccct tactaatttt tagtaacgtc caaggattaa aggaaatttg 7020 ccttacctat ttaacaggaa tcaacagggt taatctcact ccctttctaa aaataattta 7080 taaacattgc agacaatctc atctatccct gtctaaactg tgtggaatta ctgccattta 7140 atgtaatcag tctactcatt tagtttgcct aaggaatttt tgaaaaaaca gttaaatgaa 7200 tgacttaatg gaataaccag gaagttgaag tctccaatag taagaatgaa ctcttgctct 7260 ctggataatc aaatgggtcc ttcctccttc aggtagatca tgccatttcc tcacttacac 7320 tgaacaggta aacaacataa ttactgactt caacttctag ttaattcctt cttttatcac 7380 tgagtatcct ttggctggga gttttgttgg ctatgctgcc attttttcta gttatcacag 7440 tcctataaca taccaatcct tcaatataac tcatctttaa attgtggttt taccttctca 7500 agaagttatt aattatgcca gtgctaaatc ttctaaaatg attgttgact tgttgattag 7560 cccccatgca attcccctct cccgtccctc agcacgtaag gaatggccct ttgcttactt 7620 ccacagatcc ttaaatctac cagttagaag ctaatagcct acctctctac caggaaggaa 7680 ctgtgggctg gaacataata catgttgact tataatttct tagaaaattg tgtgagaaac 7740 atcaaactcc tgattccagg atatgccaaa gacacatcat taaaaagcaa aacaaaacaa 7800 aacaaacctc atttgacgtt gctagtagtg gcatatttca tcaagatcag ctcaaataaa 7860 tagaagtgag attttcacac aaattagact gtagtgcttt tttttttaac ttatctttac 7920 catatgattt ttaacggtaa aaaaaatcgt ttgagatatt agatgtataa tatttatcat 7980 ccaattactt cattagttca atcttttttc aatggcgctc ctgcatctga gaataaggtc 8040 agaaaatttc atgttctgat ttcatgctga ttttcagaag aaaaatgtta gttttgtata 8100 gaataaccca tcctaagaaa tacatttctt attatatttc ttatcttata tttcttagga 8160 caatgagcta ttcaaagggt gatgataacc agcaccatca gtcagcatta tctaagaata 8220 agaatctgtg tttctacata cagacctcct aaaaaggaac ctacacttaa caggattccc 8280 caggcaattt ggatgcacat taaagcttga gcaacactgc attagaaagt tagttttcca 8340 tcacaaaaac agtaacaaaa ggaatataaa gtaagttact ttaataatat aagaagaggg 8400 gcaggccggg cgcagtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc tgaggcgggt 8460 ggatcacctg aggtc 8475 <210> 4 <211> 8401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tttcatctaa gactacattt ctattgtttt atataatcag cccccctaag atcaacatgt 60 ccacattttt tggcaaagac aaagcctact gatttcagga tcattatttt cctttttcaa 120 aagcacaaac ccaaactgag aaataaatca agagaaattc tccttttttc tatgctaatt 180 tagaagtaga gtctttattt cttttcaaac ccaaagagaa tcagacatac aatatgaatt 240 tatctacttt cgcttgctca gactgagagg aaagattaat attttcaggc tgttagtcaa 300 aactgttcat tcaaatatta tttaataaaa tccaagaacc agctaaaaag tcgcttaagc 360 taagaaacct tcaccagcct catgggaaat tgtgtacagt tttccactag aatagcctat 420 aaatgcttac tgaaaatgtc taagttcata tcttggtaac taacatttta attcaatctg 480 cagaataata tatgcttctt tagtgctaag atatgaatat tagaggcatt ctttcttaaa 540 atttctattt agttatactt tcacaaataa ctatataata ttaaaattct gcatgtggca 600 taaaacatat tttaatggag aaggtaatgt gtagggagtt tatttctgtt tgctattaga 660 acttgtgttt attcttggtt aaaaaaactg cagattacaa catagaaaaa aacaaaagta 720 tgttgtatat ctcttacagt agaagataaa gagtagttct aaatttagaa aggaaaaata 780 aatatacaca gtgaaaatat gtgtcagtga gatgttaatc aaagatcaac tattgctgag 840 accagcaata ttaaatccct gcacaattac tcatattata atgagaattt taaaaagaaa 900 atatgaacac ataacataat gaaggcagaa gtcactctca tccttcatct ttgtattccc 960 aattcaggaa gctggtatag tatcttcatt ataattacta ttcaacaaac atttgtaaaa 1020 tgaatgaata aggaatgaat gatgagaaaa atgataaaca tctccctctg tctcctggga 1080 gttaactgca ctactttctt ttaaatttaa ttaatcctca atgtccttgt aaaatagcca 1140 aagggaaaat gtatttacat tactctaaat attgatgcaa tctacaaaaa gtgttaaaca 1200 acttcctcaa agtaaataaa atgttcacaa tccagctagg ataaaaggat ttaaatcatt 1260 tcctaggtag agggctttca attagagccc ctgctgcatt aaccatggga actcatctca 1320 ctctcttcat gatggagccc tgagtgttgc tgctaatctg tactctacca ttctaatgct 1380 tttaaggttc cttttcagcc cttcctcctc gtaatccaca aatactgaga ccaaggcatt 1440 ttttgggtca gtcctaattt caagcattct atcctgccct ccccaaatga actcacactt 1500 attagaccat atgttcctat attagttcag gaagggggaa aaaatgttaa tcacacttgt 1560 atataagaga tcatagaaaa acagtttact aacctgtgaa aataccattc attctctgtt 1620 tacctctggt ccacagctaa gcaatcagca ggatataaat gtaccctatg ttcactattc 1680 agtattcata agtatactac ttatgaattg gaaatctgac acaacattta catgacctaa 1740 ttttgaaaat ttaaaatagt gtaaggcccc taggcttaat tttacagggg aaagattaaa 1800 gggacacaag caaacatata ttctctctct gtgctgtggg acactggtaa ttttttgact 1860 taaaatattt gatacttaaa atgccaaact tctacatttc tgcagtaaca aggcagttat 1920 catattgaat accatttctt tctctccagt aagtagagtt aatattagca catgaactga 1980 aaatattaag tgattataaa aacgtccaaa taaattcatt aaaatttagc ttggcaaaat 2040 gttagtttca tgttcttggt agaagtcctt ttatatttat attcaaatga aatgaacaat 2100 ttacaagcaa aggaaatggc atcaaatatt tcacaccctg cctcccaagg tgtattgatt 2160 catgcttttt gctcagatct aggtttctcc actcaggaaa agaggagaat gtacccatac 2220 ttgggaaaac aagtttccga tggcacagct ttgatcaaac agcaaaattc tatccatcta 2280 tgtattgcca tctgacagta tgacaaatgg tcccatgtgc gatattcaca ctgcattgca 2340 gtcaaacctg taagtcaaag gatatgaaat aatagtaact atacattaag cacagaagaa 2400 aatgaaacaa acaaaaaggt tttaaaccaa ccaaaaatat gtcttatttt ggatgttcta 2460 tatgttctta cattctctca ggtcttttgt gtcattatga acacaattct aacaagcttg 2520 attattttat ttccattcac atattacagg caacaagctg aaaaagtaga acggggtgta 2580 gagagacagg acaaagtaca gattagggct tgaagtgccc ctgaccagtc gacagcaacc 2640 acatggaata atgactcatg tgcattaatg atcacactaa atgatatttg tttttttacc 2700 tagtccttca actgacagct taaagaactt caggttgttc tgattcttga gcctcctcta 2760 cagcttcaga gaggactttc attttatttt ggatcaaatg ctccacaact agttgaaact 2820 ggaattaaat tttatatgaa gttcctagat gatttaaagc tgtaagaaga agaataatga 2880 atcataagaa aacttgctgc tacagatatc aaaaaggaat gttaccatcc ctcatgctaa 2940 tccttttcat tttaaataaa caggatctaa aaaaaataat gctgggaagt cctaaccaca 3000 tcaagaatgc ctcagatcag tgacccaggg aaccttccag aatggatgaa atagacccaa 3060 agctgaattc acctaatttt agggccaaaa acccaaaaaa caaaacaaga ccaaaaaaat 3120 cttcagatac tgggagaaca aatctcaatt gctcaattgt atcttatgaa aacaattttt 3180 caaaataaaa caagagatat ttaagattca ttaagttctt gtcatttcaa attttaagaa 3240 aaatattttc taatggaatt acatatattt atatgattct tctagttata tccatggtaa 3300 taaatactct tttcagttgg aaataaaacc catttgtgct atattattag ggaaaatatc 3360 tacataaatt agtttttaat ttaactaaag tctatctttt gaattcataa gcataaaatt 3420 ttaaccactt gcaaaattta taacacactt aaggtagtca gatgccttgt caagtagttt 3480 aacaaaagtg attttcacct gtttgtttta ataacagtgc atcgatttta tgaaaatcag 3540 gcatgccctc gggtcctaac aaagtatacg aagctgaatg gatctatgcc aaatatgcca 3600 gattttactt tctgagtctg attttatact tctgtcctct ttcttaccac atggcttcca 3660 gtatcactta cagactaacc cttcaaaagg agaaggctaa gttactaaca tttggaaggc 3720 ttatgaaagt gaagcatagt tatgagccag caatgttttt atttagggaa tgtgtgcaaa 3780 ccatacactt aagcaagctc tggggaatga gagttggggg gaatcaactc ttttatttgc 3840 taattggtat ttcctttaaa agatagagtt cttccagatt ttaactgtgt taatagttac 3900 tctagaaaaa ttggagattt gtgtgcatat attttatgtt gtaaacagac acatacccag 3960 agacactgag agagacagac agacagtaaa cagaggagca ctaaccacaa acggtttaca 4020 aatgacctct gtgctcattc acctgtctgt tccccacctt gccttttata gcaactatag 4080 caacagccat gagagtcatt gtggaaagaa ataaaataaa attaaaaaat cctggaagct 4140 tgtaaagaat gtgagcaaag gggaggaagt tgtgaaaaaa atgaataaag ggcaccgatc 4200 cagagtattg aagaaggcag agtggagagc ctagtaatga gtatctggta ccccagtatc 4260 ctctcccaca gaatctgtac agctctccgt ttatgacagt ttaaacttaa tttaaattat 4320 caaacagaca ctttcctcaa acatataaat gatgaggcag ttcattcagg ctgtatgtat 4380 aaagttgttc cagccacctt tttctaatgg cttctctata tcttttacat ggagacaatg 4440 agagatttgc ttaggacaat ttgactgtaa tttagaagta ggaaatggga agtatttgta 4500 tcttctttgc ctaactcaca ttagttactc aagtaagcat ttcttccgtt attgcatttt 4560 cctgattaca agttttatgt tttctctaaa acacatatca aaagaaatgt cctaagcact 4620 atgcaggggg aagccatgac atttatccac cactgtcagc aaaaacatga acttagccct 4680 caacagaata tttcacttca ttctagtgtc acctctgcgt cacctgcact ggagtcacca 4740 cttgcctgtt gggtaagacc aggatgcacc gctgaaataa aaaggggtca gacaatacaa 4800 gaaaagccag tagaaattgc caaatgtatc agaatacaca caggctttct aaggatatgg 4860 cccaagagga aggctctaga gcccaccctg aaacaggatt tttgacttca cagataaatt 4920 atttaatttt caataacaca attcaattaa agaaagggaa atacaaggct aaacaaataa 4980 gaaatgaaga caaaaaccca acctttcaaa tctaaagaaa ataatctgtt ttaaagacac 5040 agatgaagat caggaaccca aaacagaaga aaggaaaggc aattaacgct ggcatctgat 5100 aacaacgaaa agtatggagt ctggagaatc gctagactct aaaaattata aaggtttaga 5160 cttggacttt gtacactgaa gaaaagaaaa ctgcatgcat ttatactgac caatgtacac 5220 tattgctgct ttttaacttt tgtgtatatg tagggtagat ttttttttaa gtgaaagcaa 5280 gcttattaag aaagtaaaag aataaaaagg tggcttctcc ataggcagaa aactagcgta 5340 gtttttttat tagaaattgt tattcaataa tagtacatgt tacaaataaa taccatttta 5400 aactgaaaaa attgtagact ttcaaatcag ttagggtggt caccctaaaa aagggcattt 5460 tttcccctta gtctccttgt tcatgttgct cacaacaaga aatgggctaa tgctatgaat 5520 aataataaca aacactgcct tctgtcaggc cctgtgctga ataccgtctg catatgtata 5580 ggaaagggtt aactcagcag gtcttgtttg cccagactct gtacatttcc aagaaaggtc 5640 tgcctttagg actggtcctt ggccagctcc tggagaatga gctctcagct tttagaaaat 5700 tctatctgct aagaatagtt ttgcatgtct caggtcttgg gccacaaaat atcagtttaa 5760 tcagatggtt tatgttaaca agtatgattt atggcaaaca tagatctcta atctccattt 5820 ctctctcata tatctatatt tatctatcca tatatatgta cctatatata tcaaatatga 5880 agatatgttt atagcaattg catataaata gagagatagt atgtagtagg aagagagaca 5940 tagatattat tcttcatttt agaatgttat cttggtatgt ttaaaaggaa aaacttaaga 6000 tgtgttgcaa ttgcagtatg agtttcaggt atgtacatgt tatgtgtgtg tgtgagagac 6060 acacacaaac acatttcaaa catgttttat gtttaagctc aatattcaaa cacagaaata 6120 taacatctat tcttaatatg ttttatgtaa gtacagcagc agcattatta aatactgtat 6180 ttctatggtg attgaaaatt agtaggcaga gaatttttgt aatggttctt aataattttt 6240 gtaatagtaa atgattactt tttgtttagt atagttttat aatctataca tgaataaagt 6300 ggatatttct attcatatag aaatgtgatt tactctcatg tacttatcta catgctaaaa 6360 ccataagtta tcaattttag ttctgtgcca aggcactttt actgaataaa aataatcagc 6420 taattttata ttttcctgat tcaaatttat atgcccgtgt aatgttccgg ggtttttttt 6480 tttaatttct gtaaatcaga atattcagat gttgaaaaag tctttgcctt cagatttaaa 6540 agataccttt gaaatgtagc atatcccaaa atgcaaccca gaggctggca atgtcaacat 6600 ttttctgttt taaaaaacct cttatgaaaa ctattgccat actaaatttt ttacttgctg 6660 atgacttaca gctggaaagg attctgtaca tataagacat caaatattga ggatactgga 6720 acttttaaat taatggcaaa gaaagtcaac aaaggaagtt catatgaaat caaactagta 6780 atatgattac aaaaaaaaaa gtttaaaatt tttcttggcc ccagtcttat catttctgag 6840 ccaaatacaa ttctatcgaa atcacctgaa actgaaatca ccattctagg ctggttttcc 6900 cataaagatg gactgctcca aaaagaggaa tcaagaaaga atttggctca cagtgaatta 6960 ttcactttgt cttagttaag taaaaataaa atctgactgt taactacaga aatcatttca 7020 aattctgtgg tgataataaa gtaatgacca cttttcagct ggagggacta acttcttttt 7080 tttttttgct gcatatatag ctgtggtaca ttttaatgtg aaatgatgac tgcatcagct 7140 tatatccatg gagcagattt tagcattcag cttgggtctc ccagtcaata tctacgagtc 7200 tcttcttaag gagatcgatg acacagatac atacagacta acaaatgtga taccaataat 7260 caagaattca ctcagttaag attttgccca ctgatttcca cacaagaaac ctagaattta 7320 ctagattctt gtgcctgtga ggctccactc atttccctga atcacaaaag ctacagagta 7380 tttagataga aatataccta ctcttaacat gaaccatttt aaatatatgt attactgtgt 7440 ccacaggagt acactttaaa gcagggactt cactcttcaa tctctccaat cacgtgttac 7500 ctaaagtggc atgtggttcc ctaaagctta ataactgaca ttgccttaaa aaaggggttt 7560 gcttcccgac taatgtggaa aaagtctgaa aaatgatttt aaatctttca ctaaatttct 7620 catttggtca cgtggaggaa aatgatttca ccaaatagat actctcatta attttttaat 7680 gtaatttatc aaagaaatga aatatttaga taaattccag atttccccca ccatgagctt 7740 ctccgaaagt atactccatc acagactgct cactaagaag ctctactgca gtcaaagtga 7800 ccgaatttaa ggggacataa tgactacttc tgctacacag aaacattatc catctctaac 7860 acttccctat gagatggaag acggacttct aatcaggtac cagagagggc tctgccaact 7920 tcagggcttt gatgaataag aatggttgag agcgctcatc ataaatgaat tcagtataac 7980 tgagtgagaa agtgagagaa ccagagaaat aaatcctcat gtagaaaatt taggggtatg 8040 aaatgccaaa tgccagttaa ccaaagcttt ctttgtcata aagcaacttc tataaaaatt 8100 gctgaaaata aattcttcat ggctcaatgt gaatcagtaa tttccatctc tattacactg 8160 ttgtttaccc aaaaactatt tttaatgact aagactcaga gtttgccaga gtgttttcca 8220 caaaacaact gttttgagat actccagatc tgtaatcaag taagtctgaa aaaccccaaa 8280 tacctcactc acctcttgga tatgcataaa gcacactaat atataacgtt ctaaaaagcc 8340 aatcattaaa accgttttat attgtttaag catttcctag acatatttgg ctacaaatct 8400 a 8401 <210> 5 <211> 8427 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gcacctgcca ccacgcccag ctaattttct attttcagta gagatgaggt tttgccatgt 60 tggccaggct ggtctcgaac tcttgacctc aggtgatcca cccgcctcag cctaccaaag 120 agctgggatt acaggcgtga gccaccgcgc ctggccatat taacaaattt taaatcacaa 180 ctatgtgggg ggggaggcta gtattattac agcagattgg tttgctatat aaacaagtac 240 tttaaaaaat atttcttggg ccaggcgtgg tggctcacgc ctgtaatccc agcactttgg 300 gaggccgagg tgggcagatc acttgaggcc aagagttaag agaccagcct ggccaacatg 360 gtgaaacccc atctctacta aaaatataac aattagccag gcatggaggt gcatgcctgt 420 aattccagct gctcgagagg ctgaggcatg agaactgctg gatcctggga ggcagaggtt 480 gcagtgagct gatattgcgc cactgcactc catatccagc ctgggcaaca tggcaagact 540 ccgtctcaaa taaataaata aataaataaa taaaactaaa ggcagagttt tcttaaataa 600 acatggtagc cctcagcaac aatattgtaa gaactcctcg caagagaaaa agctggaata 660 agatactggc taagcaagta agaaaggcac tgccctgctt ctgcatacat tcaaactaag 720 acatatacat tgcagcttac acttacattt tccaatatcc ccaggcatcc ctttcccttc 780 tcaaacagcc aaaaggaacc agccatgcaa ataaaaatac aagttcaaga gcctaaaaga 840 agtcagtgtc ctaaaagaga aaattaatgt aaagaattaa gattttttga aactacactt 900 tctttctggg gctgtttact ggcctccaat acatcaatcc tgtaacactg tgaactacag 960 tgatagattg gtacatgctt ctaaacacaa cagaattttt ccaaggttac atacactgta 1020 acaaaagggg cattttgcag catcttattt tccttaatca actagtttgg atattctaac 1080 agtgcaaaca ttgtaaacaa taaattttca ttaccttttg aactttctga agtcaaccaa 1140 aggcttgtgg tatggatgca atgagtacta gacaggcaga gctgaatact agtcaaaata 1200 ttcagttact ggtgtgatag tccttttggg ggcatacatc acttagggag aaactgaggt 1260 gcaaggacat tttacacaca gcaaaaacat tctcaggaat ttgtcacatc attaccataa 1320 gccaaaaatc tcaaggtctt agaacagcct gagcttctga tcaaattata ttgtaaaaag 1380 agaggaaaaa aatgtgaagc gtgctatttt ttaaaataac agtaactact actactgctg 1440 ctgctgctaa ttctaaacgt ttactgagcc cttattatgt gccaagcacc gtgctaggta 1500 cggtcataga ttttaacaat taatccctgt aacaaccctc tgatattagt taataaaatt 1560 aaagtagaat cctcaccaaa aaaatttaaa ctttccaaat aaaaatataa ataaattatt 1620 aaagacattt cacctctttc tctgcctcag actacatttt caagtattaa atttacacta 1680 aaaccacatt tattttcagg aattccagtt aaagcgtaca gatattcaag atgttgacaa 1740 ttattacaga agaatcacag aactctgaaa ttaaatactg gcacagaaaa ccttccatcc 1800 aaccttacgg aacaactatc cccattttaa aaaaaaagga acagcatata tatcaggctt 1860 gataataaga ggcttctcat gcccacacta gcaatgaatg atgccataat tataaagaga 1920 cctgtatcgc cacatgcata aaaataattt acatctgcta agtcaagttt tcaatatatt 1980 attttgtgtg taaaccttat agtagctgat aaaaaataca ataaactaat ctaaggtaaa 2040 ctaaaacact aggttgtttc tgaagactca ctttagaatt tgagcagcat aataatcata 2100 atattagtaa tcaaactact tagcagaaag ttcttagagg gctgggaagc tgtgtataat 2160 aaaatggagc agacaagaag gaagggtttt ccgtactgtt taaatcaact acaggtccca 2220 gcatgcagtg ctctaatctg aagttaagca aaaactgcaa tgcatactgg gacttgtagt 2280 aagtaaacca cgttatcaca gcaagtttca agaaagtctg aactatctag cacaatttga 2340 ctatatctta ttatcagagt ctaatcaaat ttaaatcaaa tttgtatgtt ctctgatgtg 2400 gcacacagtt tctctagcac ataccggaaa aagtatcaat atttagacca acattttcac 2460 attagaaaaa tcttacgtag gagaagcaca gaaaaaaatg ctgaaaaagc aaaaaaactt 2520 gatgaataaa aaatataatt tttgaaatag ttttttaaag tttgaatgga tccatttcaa 2580 cattctctaa tcctccccca caaaaagttt aattgttttg gccgggcgcg gtggctcacg 2640 cctgtaatcc caacacttta ggaggctgag gcgggtgaat tacgagatca agagatcgag 2700 accatcctgg ccaacatggt gaaaccatct ctactaaaaa tacaaaaatt agttgggcgt 2760 ggtggcgcac gcctgtagtc ccagctactc aggaggctga gacaggagaa ttgcttgaac 2820 ctgggaggtg gaggctgcag tgagctaata tcgcaccact gcactccagc ctggtgacag 2880 tgtgagattc attctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagttta attgttttaa caggttgctt 2940 tttaacaatt attcaagatg tattttataa ataatttttc ttgaagaaaa ttctcagaag 3000 caaacattcc ccatattcta atattgccca ccaggaaata atttttttag taatacgcac 3060 acaccccatc acaaaaacaa acaaaaaaca ctgaagttct gcttttgtca agtccttact 3120 caatatttat gccctccatt cctcacctct aattccctac acacacacac acacacgcac 3180 acatccccac acacacacgc ttctacaaag aacacttaga aaaacagtat tccaactaca 3240 agcccacttc tctcatccac tgacctcttc tgaaaacaca aaagattttt taagctatca 3300 gtaacacgtc caaacacaag ctgataagtt tgagctagaa tttacatata tacagttgct 3360 acacaccctc ctattttctg caagtctgtg gaaggaggct gggaaagaac taagtgcaat 3420 ctgcatcagg aggcctaaca caggtggtgg gttattttca ggcaacagca ccttcacaaa 3480 catgttttgg aatatagtcc aagaaattcc taacaaggaa agataagctg gcacacaaat 3540 ttaacgcaat ccagctaaaa atcatctgca acacatgcta ctacatttca ccataaaagt 3600 gacgggctac tataaaggat ttgaagcttc gtcaatacaa catactgtcc ataaggccag 3660 agatagcagt tgccatggtt actataccca cttttatcag gaaattactg tcattacccc 3720 aaagttttgg gtacttattt aaaatttaaa aaaaacacac acaatttagg gttctgactg 3780 ttaattgagt gaaataatca actactgttt gatttgtaag tatgtcgctt tggagatgca 3840 catggttaac aatacttgga tctgcagcag aaaaaaaatc aattcctttc tgctgctcct 3900 tctcctcaag tactgacagt ttgtattctc aatgcagcca aaacaataaa acaaaaccca 3960 tctttttggc ttctgtgttt aagttatttt tcccctaggc ccacaaacag agtcaaaata 4020 aagcctagat catcaacctg ttaggcctca tccccttcct atcccctcca tactggttca 4080 ctttcttgac tacttagaaa aggcagaaaa catttctgta actgattcca aagtatagaa 4140 aagaatagtt gccttcaact gagatatttt caccaaagtc ttttttattt actttttttt 4200 taaggcaggg agaggggaga gacttgcagg gtactgaaag ggagaagtgg aggagtattc 4260 aaattgccac acaagtctag tgtaagaaag ttgctttaga agagtccaaa ggatggctga 4320 acctcacata taatttctaa aagctttgga agagttcacc ataattttaa gactgaattg 4380 agggacaagt aatagaaaag ttattcataa agtctacttc aacattttta caaaagataa 4440 ctattcaaaa atttaacaca catataagaa ttatacgaaa gcctacaaaa tagtatggcc 4500 acatatacac acaaacatac aaagtagaaa acataagcta tttaagaaat aattatctac 4560 aataaattca atgcaatgtt aacatattat ctctttttta aaaaatcgca aagcagcaaa 4620 aacatacacc tgagaaaatt aatgtgatca aaacgttaaa gaattcttag gcctataaaa 4680 aaagcccatg tacaaaagct cctgagaagt caacataaat cattaatatt tcccagcaca 4740 aaataatatg aaaattcaaa catgtttcaa gaaatcagtt ctagatatag atataaaaga 4800 attccattaa aggtcagaga cctaaaactt taattccttc ccttctctgt ttgaatagta 4860 attaaataca aaagccttca gcaataaaat actaaggata caaaatttaa aagcacatta 4920 atataagctt aacttcagta tgtcttcaca gaaagcttta ctattcactg tctgtaggat 4980 gaaaaagtta ataacaccct gagaggtttc atttttatct aaacagttaa gtgtttttct 5040 caccgttcac agaagcaagt ttctatattt actttctaaa gggggcaatt tcaaaagaat 5100 agtcacttct aaaatttaag atactatacc ttttgatagg ctcataaaca cagggttcct 5160 aattatctat attttacttt aaaatgtttc tattccaaat ttgtgagcag agtttataag 5220 aaagctgaaa ctcaaggctt taaacttttg ggttattttt acacaaaaat atttcagtgc 5280 actcctctag atttgagtag tcatttcctt gtgcatcctt ctaaaataga aaaacaaaaa 5340 tgatatatcc atatatacct aatactaaca catacagata tacatctttt tcactgtgaa 5400 acaagcttga aagctttagg cagtaagaat ttttcagaaa gttagcagag tcagtcaaaa 5460 cattcaaaac ttgaaccatg acatctgtta ctctgtcaat aagagtctat agaagaatca 5520 gggaacttac atactcacta aaatcaacta ctatcacatc acatcaatgg agaaatgaag 5580 aaaaactgta ataggggaca tacaattcac aggatcttca aaagggaaaa tgatcttttt 5640 ttttttttta aattatgaga aactgactag gcagcatttt ttcaaaagca gcttcaaaac 5700 tataacaaag acatttttgg taaccacagc agtatttaaa aaacaaaaat ttaggccggg 5760 cgtggtggct cacgcctata atcccagcac tttgggaggc caaggcaggt ggatcacctg 5820 agtcaggagt tcaagaccag cctgaccaac atggtgatac cccgtctcta ctcaaaatac 5880 aaaacttagc cgggcgtagt ggcggacacc tctataatca cagctactca ggaggctgag 5940 aggcaggaga atcgcttgaa cctgggaggc agaggttgca gtgagccgag atcacgccgt 6000 tgcactccag cctgggaaac agagcgagac tccgtctcaa aaaataaaaa aataaaaaaa 6060 ctatagtgtc cagggtgcac tttaaatgta ttactttctc aactgatatg gaaaaagtta 6120 gcatttaaag acagaagctt ctgtccatgt attaattagt tacctatctc aacaacttaa 6180 tatctgcatg ctttcttacc atttatgaag aacttttata tgtattatct catttggtct 6240 tactgagaaa acagtatttt gcctacaaaa tagacaaaat tcaaagcaga tttatcaaac 6300 tttctagcat ccccaaattt ttaaaacttc gacacaaaac tttacaagca accacagtgg 6360 catgatattt tcagtgataa tcaattcacc taacactaac agagtttcaa aggaccatgt 6420 gctataaatg ctatgaaact gttaaagtag ctatattcat ctttatgcag ttactgttac 6480 atcaacaatg acctaccact gatacaactt gacttacagt tcaagaatct cagtctttgc 6540 aggctaactt aagtacatca accatatgta tttataaagc cgagtgccta aaaattgatc 6600 tatattagaa tcatagtctg taaatccgag gggaaaaaac tacaagaagt ctaaaatttt 6660 ttcaacacac tatacccctt tccaaaatct caactactct atatcctatt tgtattaata 6720 ttatagggat gataacaagg cttaaagccc taaatcatac caactacttt tgtttataac 6780 aattacaaat aattttttaa aatacatgct caacatccca ctcatcaaca caagactaat 6840 tccccttcca aataaaataa ttctaaacag tgctctgtac caagggccag aatccttata 6900 ctatccgcaa tcgcacatct actttgtaca gtcaaagact tcactttcaa gtagcaaaca 6960 ttatttatga atggaatttt taaatggact tactcaaaat ctttctggaa ctttaaggtg 7020 ttaatcctgt tgcttagctg aagctaagca gagctgtaat aagtagcaag accctcaaaa 7080 ttcaaaaatt tcctttatct tgctgtagca cctcctgctg gatagcattt agagatcttc 7140 atgtaagcag aagaagagta tttcagaggc agctccttcc agaagactga ataggaaaaa 7200 ggatggaccc ttcaaagcta aaagaaatag gccccatcca tcacttatac cttctaaaaa 7260 tacaatttag cccaggtagg tgtctttttc atctattact actccagttc cacaaagact 7320 tgcctcagtc caaaatacaa catgcttaaa taaagcctgc aaaattgtct aaaaactaag 7380 ttaaaaagca ttcaatagca cccaagcaaa acactttatt atgggcagcc aagcaatgtc 7440 agtcaaactg taaatactat tatgttacca aaagcaaaag tctgatgtta aaaaaaaaaa 7500 aaaaaaagcc cctggaatat tcgtaacatg ttagccagat gtttgtgttt tgagaacttt 7560 gtgcactatt actatgctct tcacttaagg atagttgtac atctacaaac gttttaagta 7620 cagaaatttt tttataaaca ttagcataac tgtacacaaa atttcctctt tgccatgaaa 7680 agataggtcc tgggatttga aaatgtattt ttcagacatt tttaatgacc ccctaaaata 7740 aactagtttt aagcccacaa caccgattcc ataaacaagt aaagacagaa gaagagaata 7800 agaaggaact taccaaaatt aaaatgaata atagtatttc cagtaaaaat gtagtaacag 7860 tttccaacaa tgctgtaaac caaataaatt gtgaaactta aaaaaggaag gagggggcca 7920 gtcttcaaag accaaaagca aagctgacct atttatttct attgcttaga gtgaacacca 7980 gatgtaaaca aatatcataa acactgaaaa gtacgcttac atggtttagc ctcaatttca 8040 gtacccttac caggccctca ataaagctac agatgttggt gagaactcgc tcaaaaagga 8100 gataattcca gcccctcgcc ttaaagaatc cctatcaagt gaacctgtga aaagacttcc 8160 ttcccagagt gcacaactgc tttaaaaaaa aaaaactttc atcagcccaa attaatctga 8220 ttctaatatt caactatcca ttatttatat ataaatgttc ttccctctct aactttccca 8280 gctcgagcat ctacattcct gacaccgact attagcaaaa atgcacaact ccttccccag 8340 ctatggggca aatctttgaa atctgaaaca cagccacaaa gttcactgtc aaggccaggt 8400 gatgaggccc acacatgccc ggacctt 8427 <210> 6 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment A <400> 6 ggtaccaccc aagctggcta ggtaagcttg ctagcgccac catggtgctg cagacccagg 60 tgttcatctc cctgctgctg tggatctccg gcgcatatgg cgatatcgtg atgattaaac 120 gtacggtggc cgccccctcc gtgttcatct tccccccctc cgacgagcag ctgaagtccg 180 gcaccgcctc cgtggtgtgc ctgctgaata acttctaccc cagagaggcc aaggtgcagt 240 ggaaggtgga caacgccctg cagtccggga actcccagga gagcgtgacc gagcaggaca 300 gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaagcc gactacgaga 360 agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagctccccc gtcaccaaga 420 gcttcaacag gggggagtgt taggggcccg tttaaacggg tggcatccct gtgacccctc 480 cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 540 aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 7 <211> 1120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 signal + human IgG1 constant <400> 7 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080 cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa acgggtggca 1120

Claims

서열 목록에서 SEQ ID NO: 1 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NO: 2 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NO: 3 으로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NO: 4 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NO: 5 로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 3000 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 2000 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
서열 목록에서 SEQ ID NOS: 1 내지 5 중 어느 하나로 표기되는 폴리뉴클레오티드 서열의 1500 개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 95% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열 중 2 개 이상의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 중 2 개 이상의 유형으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 외래 유전자 발현 벡터.
제 13 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 다량체 (multimeric) 단백질인 외래 유전자 발현 벡터.
제 13 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 이종-다량체 (hetero-multimeric) 단백질인 외래 유전자 발현 벡터.
제 15 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 항체 또는 이의 기능적 단편인 외래 유전자 발현 벡터.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포.
제 17 항에 있어서, 포유류에서 유래한 배양 세포인 형질전환 세포.
제 18 항에 있어서, 포유류에서 유래한 배양 세포가 COS-1 세포, 293 세포 및 CHO 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 형질전환 세포.
제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 다량체 단백질인 형질전환 세포.
제 20 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 이종-다량체 단백질인 형질전환 세포.
제 21 항에 있어서, 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 항체 또는 이의 기능적 단편인 형질전환 세포.
제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 형질전환 세포를 배양하고, 생성된 배양 산물로부터 외래 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 수득하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 제조 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 외래 유전자 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 외래 유전자 또는 외래 유전자 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포에서의 외래 유전자 발현 증강 방법.
형질전환 세포에서의 외래 유전자 발현을 증강시키기 위한, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도.