JP2003526321A

JP2003526321A - 合成ベータ細胞による糖尿病の治療

Info

Publication number: JP2003526321A
Application number: JP2000560268A
Authority: JP
Inventors: デブラエイ．ヒユーレツト，; タウシフアラム，; ハンスダブリユー．ソリンジヤー，; エイミーエル．セロン，
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2003-09-09
Also published as: AU8508398A; WO2000004171A1

Abstract

(57)【要約】グルコースの生理学的レベルに応答してプロインスリン遺伝子を発現する遺伝子カセットを含んでなる複製欠損アデノウイルスベクターをトランスフェクトした肝細胞は、新規なベータ島補充細胞になる。該カセットは、活性インスリンに切断されうるように遺伝子的に改変されたヒトプロインスリンの構造遺伝子、そのプロインスリン遺伝子に作動可能に結合したプロモーター、そのプロモーターの５’側に位置するグルコース調節応答モジュールを含んでなる。プロインスリンｍＲＮＡの合成は５ｍＭ未満のグルコース濃度では消失し、約１５ｍＭで最大になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本願は１９９７年１月２１日に出願された同時係属出願第０８／７８６，６２
５号の一部継続出願である。

【０００２】発明の分野本発明は遺伝子治療の分野に関し、グルコースの存在下にその細胞内で誘導的
に発現されるプロインスリン遺伝子をトランスフェクトした正常非島細胞を使用
する方法に関する。上記細胞内で合成されるプロインスリンはさらに成熟インス
リンにプロセシングされる。

【０００３】発明の背景インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）は、自己免疫反応がラ
ンゲルハンス島のベータ細胞を破壊して、インスリン産生の停止を引き起こす場
合に起こる。長年にわたり、また現在でも多くの患者にとって、この致命的状態
を治療する唯一の頼みの綱は、動物の注射可能なインスリンの、またさらに最近
ではヒト由来の組換え体の定期的投与である。外因性インスリンの投与は長期に
わたる救命効果を示す一方で、失明、壊疽および心臓発作をもたらす循環障害な
どの重篤な副作用がよく起こる。糖尿病患者に注射されるインスリンの用量は、
注意深い食餌制限が実行される場合でさえ、近似的であるに過ぎない。最適なイ
ンスリンレベルからの逸脱に起因する、それら血中グルコースの絶え間ない不均
衡が、観察される副作用の原因または一因であると考えられている。

【０００４】インスリン療法の副作用を最小限に抑えるために数多くの試みがなされてきた
。家庭用血中および尿中グルコース検査キットは、糖尿病患者が血糖値を監視す
るのに役立つ。一部の研究者は、インスリンを持続的にかつより正確な用量で計
量供給するポンプ装置を提案している。興味深いそのような装置の一つであって
、インスリンをエアロゾルの形で送達するものは、米国特許第５，３６４，８３
８号に開示されている。ホルモンは肺から吸収されるため、より侵襲的な注射に
よる投与経路が避けられる。糖尿病の分野では、ベータ細胞機能の補充はインスリン投与より優れた治療法
になると一般に認められている。なぜなら天然の該細胞は、その微小環境中のグ
ルコースレベルに応答してインスリンを分泌するからである。そのため、この精
密に調整された制御は、インスリン投与の有害な副作用を排除することになるだ
ろう。事実、膵臓移植に成功した比較的小さな患者群では、副作用の軽減または
進行性組織損傷の停止が起こることが示されている。残念ながら膵臓移植は、罹
患者の数と比較すると、わずかな糖尿病患者しか受けることができない。その上
、移植には免疫抑制療法による著しい毒性を伴なう。

【０００５】器官移植を行なわずにベータ細胞補充の利益を得ようと、多くの代替法が提案
されている。それらの代替法では、レイシー（Ｌａｃｙ）ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，３７：３３（１９８６）で論じられているように、実際のベータ細胞
または他のインスリン分泌性膵臓由来細胞系を用いたベータ細胞機能の補充が行
なわれる。体内への外来細胞の導入は他の同種異系移植片と同様に免疫系によっ
て感知されるので、免疫活性な細胞および物質と接触しないように、それらの細
胞を隔離しておく必要がある。具体的には、細胞溶解過程を媒介するＴ細胞およ
びマクロファージからドナー島細胞を保護しなければならない。一つのアプロー
チは、マイクロカプセル化または微孔性チャンバーによる物理的な免疫隔離であ
る。これらの技術の課題は、緻密な繊維芽細胞層によって移植物を封じ込めてし
まう天然の異物拒絶過程を克服することである。移植に成功する秘訣は、生体適
合性表面と、ある程度の微細脈管形成を許す十分な多孔性の両方を与えることで
ある。これらのアプローチに関する総説として、ブラウカー（Ｂｒａｕｋｅｒ）
ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．，２９：１２号（１９９５）を参照さ
れたい。現在のところ、まだ免疫隔離法は、例えば束縛された細胞集団の生存度
と機能の損失、異物拒絶、亀裂と炎症、および免疫反応を含む、重大な課題を抱
えている。

【０００６】もう一つのアプローチは、自己組織に由来する細胞または人工的に構築された
細胞系にベータ細胞機能を組み込むことである。米国特許第５，４２７，９４０
号は、Ａｔ−Ｔ−２０ＡＣＴＨ分泌細胞という内分泌細胞を操作して生産され
た人工ベータ細胞を開示している。安定にトランスフェクトされた細胞Ａｔ−Ｔ
−２０ｉｎｓは、ヒトインスリンをコードするｃＤＮＡと構成的ＣＭＶプロモ
ーターによって駆動されるグルコーストランスポーター遺伝子ＧＬＵＴ−２とを
導入することによって得られる。この細胞系は、インスリン遺伝子のグルコース
応答性発現に必要とされる、適切なイソ型のグルコキナーゼを既に発現している
。この細胞系はグルコースに対して応答性を示すが、生理学的範囲より低い分泌
促進物質レベルで制御される。したがって、この系は興味深いものではあるが、
これらの細胞を導入された動物は慢性的に低血糖症になるので、臨床上の意義は
ない。もう一つの短所は、異種供給源に由来する上記の細胞はそれら特有の外来
抗原を保持しており、免疫隔離状態で使用しなければならないことである。さら
にもう一つの短所は、Ａｔ−Ｔ−２０が無限増殖の可能性を持つ形質転換細胞系
だということである。

【０００７】米国特許第５，５３４，４０４号は、適切に分泌促進物質調節された細胞系を
得るためのもう一つのアプローチを開示している。ベータ−ＴＣ−６細胞から出
発して、インスリン発現（Ｃａ＋＋活性化蛍光）に伴なって細胞内カルシウムイ
オン濃度が増加している細胞を認識できる細胞選別機により、初期段階で、細胞
の亜集団が選択される。連続継代後、生理学的な４〜１０ｍＭ域のグルコースに
対して典型的なシグモイド曲線で応答する細胞集団をさらに選択する。その細胞
は、治療用に、ディオンヌ（Ｄｉｏｎｎｅ）の方法（米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ
９２／０３３２７）に従って、ＰＡＮ／ＰＶＣ選択透過性中空糸膜に結合したア
ルギネートに封入された。バレラ（Ｖａｌｅｒａ）ら，ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ，８：４４０（１９
９４）には、Ｐ−エノールピルビン酸によって駆動されるＰＥＰＣＫプロモータ
ーの制御下にインスリンを発現するトランスジェニックマウス肝細胞が記載され
ている。ＰＥＰＣＫプロモーターはグルカゴン／インスリン比に対して感受性で
あり、グルコース上昇状態で活性化される。ＰＥＣＫ／インスリンキメラ遺伝子
がマウス受精卵に導入された。ストレプトゾトシンによる重篤な島抑制条件下で
、島機能の損失が、肝臓による完全なインスリンの産生および分泌によって補な
われた。

【０００８】糖尿病を治療するための遺伝子治療の戦略は、インスリン調節の複雑さと、こ
のタンパク質自体の構造によって複雑になっている。ベータ島細胞からのグルコ
ース応答性のインスリン放出は、プロセシング前タンパク質の細胞質からゴルジ
装置への移動を含む複雑な事象であり、放出の前にゴルジ装置では分泌顆粒が出
芽し、原形質膜に移動し、原形質膜と融合する。最初のタンパク質産物はＮ末端
シグナル配列を持つプレプロインスリンであり、このＮ末端シグナル配列は粗面
小胞体への輸送中に切断される。その結果生じるプロインスリンは、その後さら
に、成熟分子の２つのポリペプチドＡ鎖およびＢ鎖をつないでいるＣ−ペプチド
の削除によって、インスリンにプロセシングされる。ホスト細胞でのインスリン
の産生を設計する場合、単にＡポリペプチドとＢポリペプチドを提供するだけで
は機能的インスリンを得ることはできない。適切な折り畳みには完全な分子の合
成が必要であり、正しいコンフォメーションが獲得された後のみ、Ｃ−ペプチド
の切り取りが可能になる。したがって、成熟した機能的インスリンを発現する改
変細胞はいずれも、ニューガード（Ｎｅｗｇａｒｄ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１１１２（１９９２）に示唆されているように、ＰＣ１／ＰＣ３お
よびＰＣ２エンドペプチダーゼまたはその機能代替物質を含むＫｅｘ２酵素機構
を持っていなければならない。

【０００９】インスリンの産生と放出の制御は、解糖フラックスの調節によって、さらに複
雑になっている。グルコースレベルの変化を感知するためにベータ細胞によって
２つのタンパク質、すなわち特異的促進拡散型グルコーストランスポーターであ
るＧｌｕｔ−２と、特別なグルコースリン酸化酵素であるグルコキナーゼＩＶと
が使用されると考えられている。どちらの酵素もそれらの近縁ファミリー内の他
の酵素よりも高いＫｍおよびＶｍａｘを持つ。また両者はグルコースに対して高
い親和性を持ち、それがその活性を生理学的なグルコース濃度範囲に大きくシフ
トさせている。ＧＬＵＴ−２の減少はインスリン産生の低下をもたらすが、グル
コキナーゼの損失はインスリン産生を急激に停止させ、グルコースリン酸化が真
の律速段階であることが確認される。これらの酵素の発現可能遺伝子による細胞
の形質転換は、インスリン産生にグルコース応答型調節特性を回復させるようで
あるが、それは生理学的な制御の範囲外であることも珍しくない。多くの研究者
が積んできた経験により、グルコースの代謝利用の操作によるインスリン産生の
制御の複雑さに付きまとう課題が強調されている。したがって、糖尿病の分野で
は、インスリン調節とベータ細胞補充の新しいモデルが必要とされている。

【００１０】（発明の要約）合成ベータ細胞におけるインスリン産生の制御は、形質転換ベータ細胞発現系
に対して天然の制御を回復させようとする試みに代わる代替調節経路によって達
成できる。正常ベータ細胞における実際のインスリン放出はまだよくわかってい
ない代謝中間体によって調節されるが、代替的制御はプロインスリン前駆体をコ
ードするｍＲＮＡの転写のレベルで行なわれる。したがって本発明の目的は、適
切なホスト細胞におけるプロインスリン遺伝子の発現に関する制御系であって、
通常の調節に含まれる代謝エフェクターおよび代謝中間体には依存しないものを
提供することである。

【００１１】さらにもう一つの目的は、インスリン産生細胞を免疫隔離する必要を避けるた
めに、患者自身の細胞にとって自己である補充ベータ細胞を提供することである
。理想的には、切除および体外での体外操作を行なわずに、調節された遺伝子転
写に依存してインスリンを合成するように操作することができる細胞集団を選択
すべきである。さらにもう一つの目的は、インスリン産生の制御が転写制御だけ
の関数となるように、正常に機能する完全なグルコーストランスポーターおよび
リン酸化系を持つ細胞集団を利用した遺伝子治療を提供することである。解糖系
のフィードバック介入を受けないプロインスリンから活性インスリンまたはイン
スリン様類似体を生成できる酵素系の提供が、この目的には合致している。

【００１２】本発明によれば、自己ホスト細胞におけるプロインスリン発現用の遺伝子カセ
ットは、そのホスト細胞に含まれるＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロ
モーターに作動可能な形で結合した、実質的に完全長のプロインスリンＤＮＡ、
最も好ましくはインスリンｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を、上記プロ
モーターの５’末端の上流に位置する少なくとも２つのグルコース誘導性調節要
素を持つグルコース応答性調節モジュールと共に含んでなる。このカセットは、
インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で適切な標的細胞に感染したときに、そのベク
ターを上記自己ホスト細胞に対して感染性を有するウイルス粒子にパッケージン
グすることができる複製欠損ウイルスゲノムを含んでなるベクターに組み込まれ
る。好ましい標的ホスト細胞は、肝細胞である。なぜなら肝臓細胞は、生理学的
範囲でのプロインスリン遺伝子のグルコース調節性転写制御に適した中間体を生
成するのに十分なＧＬＵＴ−２およびグルコキナーゼＩＶを既に発現しているか
らである。

【００１３】肝細胞はエンドペプチダーゼであるフリンも発現する。適切な部位でのフリン
切断によってＣ−ペプチドの実施的に完全な削除を行ない、それに伴なって本質
的に天然のインスリン活性を出現させることを可能にする突然変異を、プロイン
スリン遺伝子の読み枠に導入することができる。したがって本発明の一つの特徴
は、トランスフェクション法において、プロインスリンの転写的に制御された産
生が活性なホルモンに実質的に完全に変換され、グルコース濃度の上昇に応答し
てそのホルモンが肝臓実質中に構成的に分泌されるベクターを提供することであ
る。

【００１４】好ましい実施態様の詳細な説明本発明では、トランスフェクトされる細胞にとって内因的な１つまたは複数の
酵素によってインスリンに切断されうるように遺伝子的に改変された（ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ）プロインスリンを発現させるベクターを、自己細胞（好ましくは肝細
胞）のトランスフェクションによって、Ｉ型糖尿病治療用の補充ベータ細胞を構
築する。まず、プロインスリン遺伝子と、分泌促進物質（好ましくはグルコース
）によって調節されるその発現に適した制御要素とを含有する遺伝子カセットを
構築する。天然プロインスリンｃＤＮＡの単離では、正常ヒト島細胞から全ＲＮＡを抽出
し、ｍＲＮＡ画分を単離し、オリゴ（ｄＴ）_１５準備された逆転写反応でテンプ
レートとして使用した。それぞれＫｐｎＩおよびＳａｌＩの制限部位を含むセン
スおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使って、インスリンｃＤＮＡ（−２
８ｂｐ〜４４３ｂｐ）を増幅した。ＴＡ４２３およびＴＡ４１３と名付けたそれ
らの配列を表１に示し、配列番号１および２としてここに記載する。もう一つの
選択肢として、ベル（Ｂｅｌｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：５２５（１９７９
）に記載の方法に従い、そこに開示されている（ただし選択したクローニング媒
体に適合する制限部位を組み込んだ）プライマーを使用して、ｃＤＮＡを単離す
ることもできる。一般的には、プロインスリン遺伝子のオープンリーディングフ
レームに隣接するイントロンの一部を、増幅される領域に含めることが望ましい
。ヒトインスリンの全コード配列と５’および３’末端に由来する非翻訳領域の
一部とを含有する増幅されたＤＮＡ断片（−２８〜４４３ｂｐ）を、ｐＢｌｕｅ
ＳｃｒｉｐｔＳＫ＋にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ
＋は、ｐＢＳ（＋／−）のｐＵＣ１９ポリリンカーを合成ポリリンカーで置き換
えることによって誘導された２．９６ｋｂのコロニー生成ファージミドである。
このクローニング媒体は、ション（Ｓｈｏｎ）ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１６：７５８３（１９８８）に記載されている。

【００１５】本発明の好ましい一実施態様として、グルコース調節性プロインスリン遺伝子
を持つベクターにより、肝細胞がトランスフェクトされた。肝細胞は内因性エン
ドペプチダーゼフリンを発現する。フリンはプロインスリンをそのＢ−Ｃ連結部
で切断することが知られているが、Ｃ−Ａ連結部は極めて非効率的にしか切断し
ない。プロインスリンから活性インスリンへの変換に必要なＣ−ペプチドの削除
には、両方の部位での切断が必要である。単一の点突然変異（Ｔ^２６７からＧ
は、フリンの特異性に適合した改変Ｃ−Ａ連結部を生成して、アミノ酸配列ＫＱ
ＫＲをＲＱＫＲに変換する。したがって単一の内因性酵素を使って、プロインス
リンタンパク質をインスリンにプロセシングすることができる。新しいＣ−Ａ連結部を生成する突然変異は、当技術分野で知られる標準的方法
によって達成できる。例えばＬｙｓからＡｒｇへの変換は２段階で作成すること
ができる。標的領域での所望の変化に対応する点突然変異を含むセンスオリゴヌ
クレオチド（ＴＡ４０３は配列番号３を表す）を、オリジナルのインスリンアン
チセンスオリゴヌクレオチド（ＴＡ４１３）と共に使用して、インスリンの一区
間を増幅した。同様に、ＬｙｓからＡｒｇへの突然変異を含むアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（ＴＡ４０４）を、オリジナルのインスリンセンスオリゴヌクレ
オチド（ＴＡ４２３）と共に使用して、改変インスリン（Ｍ１）の第２の区間を
増幅した。このようにして作成したそれら２つの断片を精製し、それらの混合物
を、オリゴヌクレオチドＴＡ４２３およびＴＡ４１３によるＣ−Ａ改変インスリ
ンＭ１の増幅にテンプレートＤＮＡとして使用することができる。Ｃ−Ａ改変イ
ンスリンＭ１はｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＋の制限部位ＫｐｎＩおよびＳ
ａｌＩにサブクローニングされうる。実際に、ＩｎｓＭ１ＤＮＡを配列決定
して、誤りがないことがわかった。ＴＡ４１３、ＴＡ４０４およびＴＡ４２３を
表１に示し、ここに配列番号２、４および１として記載する。

【００１６】本発明の重要な特徴は、プロインスリン遺伝子の転写を、細胞外グルコースの
レベルに対して応答性にする制御要素である。酵素ＧＬＵＴ−２およびグルコキ
ナーゼはグルコース「感知」にとって必須であると考えられるので、これらの酵
素を産生する肝細胞は、補充ベータ細胞のよい候補である。「感知」の機構はわ
かっていないが、本出願人らは、ＧＬＵＴ−２とグルコキナーゼに加えて、「感
知」機構の残りの部分も（転写レベルで遺伝子発現を媒介する物質の形成を含め
て）肝細胞では損なわれていないだろうと推測した。この仮説を検証するために、本出願人らは、様々な組み合せの様々なグルコー
ス誘導性調節要素を使って、インスリンｍＲＮＡアップレギュレーションの時間
経過を決定した。本明細書で用いるグルコース誘導性調節要素（ＧＩＲＥ）は、
５塩基対によって分離された２つの完全なＣＡＣＧＴＧモチーフを含んでいる。最初の一連の実験では、使用した第１モジュール（配列Ｃとする）は、４つの
完全なＣＡＣＧＴＧモチーフを含んだ。第２のモジュール（配列Ｆとする）（配
列番号５）は、脂肪酸シンテターゼに見出されるモジュールに基づいた。最初の
２１ｂｐは２つの完全なＣＡＣＧＴＧモチーフを含むグルコース誘導性モジュー
ルと完全に一致するが、その後ろに１１ｂｐ長の区間（当該オリゴヌクレオチド
の１０〜２０ｂｐ）ＣＡＣＧＴＧＧＧＣＧＣが複数回（少なくとも２回、好まし
くは３〜６回）繰返されて、頭−尾結合した一連のグルコース誘導性調節要素の
シリーズを生成する。

【００１７】これらの構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）をヒトプレプロインスリン遺伝子の５
’非翻訳領域の上流に挿入した後、アデノウイルスベクターにクローニングし、
そのベクターを使って肝細胞をトランスフェクトした。二組の実験を行なった。
まず、生理学的レベルのグルコースに応答して起こる調節の感度をノーザンブロ
ット法で分析した。５．５ｍＭより高いグルコース濃度でインスリンｍＲＮＡ合
成の強い誘導が見られた。ゲルは、Ｆモジュールを使用したＡｄＦＡＭ構成物の
方が多少応答性が高いようではあるが、上記したようにグルコース調節モジュー
ルがどちらもほぼ同じ程度に機能的であることを示している。次に、モジュール
Ｃを含む構成物の時間的応答を調べた。この実験により、インスリンｍＲＮＡの
アップレギュレーションは、超生理学的レベルのグルコースへのばく露から３０
分以内に起こることが明らかになった。総合するとこれらの実験は、ＧＩＲＥが
肝細胞におけるインスリンｍＲＮＡ合成の転写調節をもたらすことを実証してい
る。さらにこれら構成物は、４８時間の時点でＣＡＴの総蓄積量を測定するシー
（Ｓｈｉｈ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：９３８０（１９９４、と
は対照的に、糖尿病治療用として必要な時間内に応答する。

【００１８】上記の構成物のさらなる分析により、ラットアルブミンプロモーターおよびイ
ンスリン５’−非翻訳領域は約６塩基対の逆方向反復を含んでいることが明らか
になった。この逆方向反復は、転写後プロセシングおよび翻訳を阻害するループ
をインスリンｍＲＮＡ中に形成する可能性を持っている。この課題に取り組むために、ヒトプレプロインスリンのｃＤＮＡに融合された
ラットアルブミンの５’−非翻訳領域（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番
号Ｍ１６８２５として公表された配列（参照によりここに援用する）の塩基１５
３〜１８８）を含む２つのキメラ遺伝子カセットを例３に記載するようにＰＣＲ
によって増幅した。インスリンｃＤＮＡは上述のようにフリンによって切断され
うるように前もって改変しておいた。それら構成物をＭ２ＡおよびＭ２Ｂとする
。これらの構成物は、Ｍ２ＡがヒトプレプロインスリンｃＤＮＡの末端、塩基３
８２で終わっているのに対し、Ｍ２Ｂがヒトプロプロインスリンの３’−非翻訳
領域の１８塩基を含んでいる点だけが相違した。次に、これらのプロモーターな
しの構成物を、ＣＭＶプロモーターを含んでいるプラスミドｐｃＤＮＡ３にクロ
ーニングした。これらのプラスミドからの発現をＣｏｓ７細胞で測定した。その
データ（図１１および１２に記載）から、これらの構成物がインスリンの産生と
分泌を引き起こす能力を持つことが実証される。

【００１９】本出願人らは、ラットアルブミンプロモーター、ラットアルブミン５’非翻訳
領域およびプレプロインスイン配列Ｍ２Ｂと組み合わせた１つ（配列番号８）、
２つ（配列番号９）または３つ（配列番号１０）のＧＩＲＥを含む構成物からの
インスリン産生も比較した。アデノウイルスベクターに挿入されたこれら構成物
の完全な配列を、配列番号１１（１つのＧＩＲＥを含有）、配列番号１２（２つ
のＧＩＲＥを含有）および配列番号１３（３つのＧＩＲＥを含有）として記載す
る。これらのベクターをトランスフェクトした肝細胞におけるインスリン産生を
分析した。１つのＧＩＲＥを含むベクターをトランスフェクトした肝細胞は、低
レベルのインスリン産生しか示さなかった。２つまたは３つのＧＩＲＥを含むベ
クターをトランスフェクトした肝細胞は、生理学的に適切なレベルの高血糖に応
答して高レベルのインスリン産生を示した。インスリンのベースライン産生はＧ
ＩＲＥの数が増加するにつれてプラトーになると予想される。さらに、３つのＧ
ＩＲＥを含む構成物は、１０ｍＭグルコースに対して、２つのＧＩＲＥを含む構
成物よりも強く反応した。

【００２０】シーら（前掲）は、ＣＡＴ遺伝子を駆動するＬ−ＰＫＴＡＴＡボックスと組
み合わされた完全および不完全モチーフの様々な組み合せを開示している。第１
の構成物は、ＣＡＴを駆動する野生型Ｌ−ＰＫプロモーターからなる。このプロ
モーター中のＧＩＲＥは、配列ＣＡＣＧＧＧおよびＣＣＣＧＴＧを持つ２つの不
完全モチーフからなる。これらのモチーフはそれぞれ１つの塩基対ミスマッチを
含んでいる。第２の構成物はＣＡＴ遺伝子を駆動するＬ−ＰＫＴＡＴＡボック
スと組み合わされたＳ１４野生型ＧＩＲＥからなる。この構成物中のＧＩＲＥは
、配列ＣＡＣＧＴＧを持つ１つの完全モチーフと、２つの塩基対ミスマッチを持
ち配列がＣＡＣＧＣＧである１つの不完全モチーフとからなる。第３の構成物は
、ＣＡＴ遺伝子を駆動するＬ−ＰＫＴＡＴＡボックスと組み合わされた２つの
Ｓ１４野生型ＧＩＲＥからなる。この構成物は、完全なＣＡＣＧＴＧモチーフと
、２つの塩基対ミスマッチを持ち、配列がＣＡＣＧＣＧである不完全モチーフと
をそれぞれ有する２つのＧＩＲＥを持つ。

【００２１】細胞を５．５または２７．５ｍＭグルコース中で４８時間培養した後、これら
の構成物からのＣＡＴ発現が測定された。細胞抽出物中のＣＡＴ活性は、クロラ
ムフェニコールのそのアセチル化体への変換率として表された。Ｌ−ＰＫ構成物
は、２７．５ｍＭグルコース中で４８時間後に高いＣＡＴ発現を示した。この構
成物中のモチーフが１つの塩基対ミスマッチを含んでいたことに注目されたい。
完全なＣＡＣＧＴＧモチーフと２つの塩基対ミスマッチを持つ不完全なモチーフ
とからなる１つのＳ１４野生型ＧＩＲＥを含んでいる構成物は、低レベルのＣＡ
Ｔ発現しか示さなかった。２つのＳ１４野生型ＧＩＲＥ（これらのＧＩＲＥはＣ
ＡＣＧＴＧという配列を持つ１つの完全モチーフと、２つの塩基対ミスマッチを
持つ１つのモチーフとからなる）からなるベクターも、高レベルのＣＡＴ発現を
示した。

【００２２】シーらがＧＩＲＥによる転写のグルコース誘導性調節を試験するために使用し
たリポーター系は、ベクターをトランスフェクトした細胞を５．５または２７．
５ｍＭの濃度のグルコースと共に４８時間培養した後に、ＣＡＴ活性を測定する
ものだった。したがってこの遺伝子発現試験は細胞抽出物へのＣＡＴタンパク質
の蓄積を測定するものであり、ｍＲＮＡ合成を直接測定するものではなかった。
したがって、細胞抽出物へのＣＡＴ活性の蓄積はＣＡＴ遺伝子からの転写の遅い
アップレギュレーションと一致する。本出願人らのデータは、２つのＧＩＲＥを
含有する構成物が、グルコースへのばく露のわずか３０分後に高レベルのインス
リンｍＲＮＡを発現させたことを実証している。

【００２３】本発明におけるグルコースに対する転写応答性のための調節モジュールは少な
くとも２つのＧＩＲＥを持つ合成オリゴヌクレオチドであり、各ＧＩＲＥはヌク
レオチドリンカー区間（配列ＧＧＣＧＣが好都合である）に隣接した２つの有効
調節モチーフ区間ＣＡＣＧＴＧを含有する。調節モジュールは好ましくは２〜８
個のＧＩＲＥを含有し、最も好ましくは３〜５個のＧＩＲＥを含有する。待機効
率（ｂｉｄｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のプラトーが予想されるので、ＧＩ
ＲＥの追加は、さらなるアップレギュレーションをもたらさないと考えられる。
しかし、５個を超える追加のＧＩＲＥは調節機能に有害ではないと思われる。二
本鎖オリゴヌクレオチドモジュールの末端は、クローニングを容易にするために
ハーフサイト制限配列を含むように合成される。例えば、後述する好ましい欠損
ウイルスベクターへのクローニングの場合、各センスオリゴヌクレオチドは５’
末端上のＮｏｔＩハーフサイトから始まり、各アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは５’末端上にＥｃｏＲＩハーフサイトを含む。

【００２４】機能的カセットは、プロインスリン遺伝子、グルコース調節モジュールおよび
プロモーターを含む。プロモーターは、通常は選択したホスト細胞中でのみ有効
であって、その５’末端側に位置する調節モジュールに応答する、比較的強い構
成的プロモーターであることが好ましい。ここで案出したカセットでは、他にも
数多くの候補が当技術分野では知られているが、たまたまラットアルブミンプロ
モーターを選択した。公表された配列（ハード（Ｈｅａｒｄ）ら著「改良型一時
発現系によって分析したラットアルブミンプロモーター組織特異性の決定因子」
（ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆＲａｔＡｌｂｕｍｉｎＰｒｏｍｏｔｅ
ｒＴｉｓｓｕｅＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＡｎａｌｙｚｅｄｂｙａｎ
ＩｍｐｒｏｖｅｄＴｒａｎｓｉｅｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ
）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：２４２５−２４３４（１９８７）、参照
によりここに援用する）を用いて、表１に示すようにＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ
Ｉ制限部位を含有するＰＣＲプライマーを合成し、配列番号ＴＡ４２０（６）
およびＴＡ４２１（７）と名付けた。続いて、ヌクレオチド１〜１８４を増幅し
た。増幅されたラットアルブミンプロモーター断片を精製し、制限酵素Ｋｐｎ
ＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングした
後、従来の配列決定法でその配列を確認した。好ましくは、他のポリメラーゼよ
り有意に低い誤り率を持ちストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手で
きるｐｆｕポリメラーゼを使ってＰＣＲ増幅を行なう。

【００２５】インスリンの５’非翻訳領域を、正しい読み枠配列で（順方向に）実質的に完
全長のヒトプレプロインスリンｃＤＮＡと融合したラットアルブミンの５’非翻
訳領域に置き換える。ラットアルブミン５’非翻訳領域の代わりに他の５’−非
翻訳領域を使用できることは、当業者に理解されるだろう。ＧＩＲＥモジュール
と転写開始部位の間に十分な間隔（約２５塩基対）をとることと、リボゾームへ
の適切な結合とリボゾームによる適切なプロセシングが起こるように、５’非翻
訳領域はできる限りわずかな二次構造を含むことが重要である。したがって、ラ
ットアルブミンの５’非翻訳領域の使用は、他のカセットの構築の指針であると
見ることができる。実質的に完全長のヒトプレプロインスリンｃＤＮＡとは、完
全長ヒトプレプロインスリンｃＤＮＡ、ならびに、その転写および翻訳によって
生物学的活性を持つインスリンが生成する切断型または置換型プレプロインスリ
ンｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを意味する。

【００２６】５’から３’に向かってグルコース調節応答モジュール、その転写レベルをグ
ルコース応答モジュールによってさらに増加させることのできる転写プロモータ
ー、およびホスト細胞内因性エンドペプチダーゼによって切断されうるように遺
伝子的に改変されたプロインスリンの構造遺伝子を含んでなるカセットを従来の
技術でスプライスし、結合させる。そのポリヌクレオチドカセットの分子末端は
、それを挿入しようとするベクター上の相補的ハーフサイトに対応するハーフ制
限サイトを規定する一本鎖配列を持つことが好ましい。

【００２７】最も役立つベクターは、アデノウイルスゲノムに由来するヘルパーフリー複製
欠損プラスミドであり、ニューガードら著「グルコース調節性インスリン分泌」
（Ｇｌｕｃｏｓｅ−ＲｅｇｕｌａｔｅｄＩｎｓｕｌｉｎＳｅｃｒｅｔｉｏｎ
）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＤｉａｂｅｔｅｓ、ドラズニン
（Ｄｒａｚｎｉｎ）ら編、ヒューマナプレス（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）、
１９９２に記載されている。図２〜５は、上記遺伝子カセットを含むベクターの
遺伝成分と構造を図解したものである。このベクターの利点としては、ヘルパー
ウイルスが存在しないのでウイルスの増殖が避けられることと、高効率のホスト
細胞感染性が挙げられる。これには、複製する細胞から希釈除去されるという短
所がある。というのは、アデノウイルスはホスト細胞ゲノムに極めて低い効率で
しか組み込まれないからである。本発明で役立つ他の形質導入系には、特定の組
込み型レトロウイルス系、および米国特許第５，４３６，１４６号に開示されて
いるもう一つのヘルパーフリー組換えアデノウイルス系がある。

【００２８】ウイルス由来ベクターのもう一つの利点は、無傷の動物中の標的細胞への送達
に、組織の切除、インビトロ感染および再移植が必要でないことである。ただし
免疫抑制条件下に同種異系の細胞源を使用することを排除する理由もないだろう
。ウイルス粒子は肝毛管床を貫通して肝細胞と接触するので、精製ウイルススト
ック（１標的細胞あたり２〜４０感染単位）を肝門脈に注入すると、効率のよい
感染率を得ることができる。このようにして、正常な細胞構造を乱すことなく、
補充ベータ部位がインシトウ（ｉｎｓｉｔｕ）で生成される。本発明のさら
なる利点は、以下の例から明らかになるだろう。もう一つの選択肢として、肝細
胞をエクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）でトランスフェクトした後、それをそのヒト
に移植してもよい。

【００２９】グルコース調節性の制御が望まれる任意の構造遺伝子を、従来の組換え技術に
よって上記遺伝子カセットに挿入し、それを適当なホスト細胞中で発現させうる
ことは明らかだろう。さらなるプロセシングを必要としないタンパク質の場合、
肝細胞のフシン（ｆｕｃｉｎ）酵素はもちろん余分である。グルコース応答媒介
性のタンパク質機能の回復に本発明が治療上の価値を発揮する代謝性疾患は数多
く特定することができる。

【００３０】例１プラスミドｐＡＣｄｅｌｔａＣＭＶへのインスリン遺伝子カセットの作成およびクローニング目的の遺伝子を含有する複製欠損組換えアデノウイルスを作成するためのベク
ターとして使用したプラスミドｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ（図２）を、制限酵素Ｓ
ａｌＩで完全に、かつ酵素ＮｏｔＩで部分的に切断した。ＣＭＶプロモータ
ーを欠くＫＮＡの８．３ｋｂ片をゲル精製し、インスリン遺伝子カセットを挿入
するためのベクターとして使用した。ＧＩＲＥの一つに相当するオリゴヌクレオチド対をゲル精製したＥｃｏＲＩ
−ＫｐｎＩアルブミンプロモーターおよびＫｐｎＩ−ＳａｌＩＩｎｓＭ
１ＤＮＡ断片と混合し、その混合物を上記のプラスミドベクターｐＡＣΔＣＭ
Ｖと結合させた。グルコース調節応答モジュールＣまたはＦ（図１）、アルブミ
ンプロモーターおよび突然変異型インスリンｃＤＮＡの組み合わせで、合計２つ
の構成物を作成した。両構成物の完全性を配列分析によって確認した。２つの構
成物のそれぞれを、上述のようにプラスミドｐＪＭ１７と共にホスト２９３細胞
系に同時トランスフェクトして、組換え複製欠損アデノウイルス構成物、すなわ
ちＡｄ．ＣＡＭ１およびＡｄ．ＦＡＭ１（図５参照）を作成した。

【００３１】例２様々なグルコース濃度での肝細胞におけるインスリンの発現記載されているように、補足平衡ハンクス溶液中で０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナ
ーゼのインシトウ灌流によってラット肝細胞を調製した（クリーマー（Ｋｒｅ
ａｍｅｒ）ら（１９８６）ＩｎＶｉｔｒｏ２２，２０１−２１１）。単離さ
れた肝細胞の生存度は９０％以上だった。それぞれに１×１０^６個の肝細胞を含有する６枚のコラーゲン被覆６０ｍｍプ
レートを、５×１０^７ｐｆｕ／プレートでトランスフェクトした。トランスフェ
クトされた肝細胞を、１０％ウシ胎仔血清、３０μｇ／ｍｌプロリン、５μｇ／
ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび５μｇ／ｍｌセレンを補
足したＲＰＭＩ中の３種類のグルコース濃度、３．３ｍＭ、５．６ｍＭおよび２
７．５ｍＭにばく露した。３６時間後に、試験した各グルコース濃度の２枚のプ
レートのうちの１枚を使ってＲＮＡを調製し、他方のプレートは肝細胞の生存度
のチェックに使用した。肝細胞生存度は試験した全てのグルコース濃度で１０％
を超えて相違することはなかった。各試料から得た１０μｇのＲＮＡをホルムア
ルデヒド−２％アガロースゲルで電気泳動的に分割し、そのＲＮＡをナイロン膜
に転写し、ＵＶ架橋し、ジゴキシゲニン標識インスリンｃＲＮＡとハイブリッド
形成させた。膜結合プローブの検出は化学発光によって行ない、結果を様々な時
間にわたるＸ線フィルムへの多重露出として記録し、デジタル画像解析によって
定量した。

【００３２】図６および７について述べると、ノーザン分析により、プロインスリン転写物
の予想サイズに対応する約１．３５ｋｂのポリヌクレオチドの位置に移動するＲ
ＮＡは、トランスフェクトされた肝細胞を２７．５ｍＭグルコースの存在下で培
養した場合にのみ明らかになることがわかった。重要なことに、バックグラウン
ドを超えるプロインスリン遺伝子の誘導は、３．３または５．５ｍＭグルコース
では認められない。誘導が準生理学的グルコースレベルで起こる、人工的誘導性
インスリン産生補充細胞を構築しようとする他の試みとは異なり、本トランスフ
ェクト肝細胞は、生理学的範囲または超生理学的範囲でのみ応答を示す。５．５
ｍＭより高いグルコース濃度では強い誘導が見られる。１０ｍＭでは強い応答が
明白である。これらのゲルは、Ｆモジュールを使用したＡｄＦＡＭ構成物の方が
多少応答性が高いように思われるものの、上述のように両グルコース調節モジュ
ールはほぼ同程度に機能的であることを示している。対照として、目的の遺伝子
（プロインスリンまたはベータ−ガラクトシダーゼ）が構成的ＣＭＶプロモータ
ーの制御下にあるＡｄ．ＣＭＰ−Ｉｎｓは、グルコース濃度とは無関係に特徴的
なサイズのＲＮＡを生成し、これをインスリンｍＲＮＡの量の定量に使用した（
図６、７および８）。

【００３３】ホスホイメージングによる定量を表２に要約する。その結果は、２７．５ｍＭ
での３．０６という値とは対照的に、３．３ｍＭグルコースと５．６ｍＭグルコ
ースの間では相対発現量がわずかしか相違しないことを示している。図９は、ｒ
ＲＮＡおよびｍＲＮＡを３．０６の値に達するように規格化したゲルを示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】例３ラットアルブミン５’非翻訳領域を持つインスリン構成物のクローニング
ヒトインスリンｍＲＮＡの５’非翻訳領域を除去し、その領域をラットアルブ
ミンの５’非翻訳領域（ジェンバンク受託番号Ｍ１６８２５（参照によりここに
援用する）に公表された塩基１５３〜１８８）で置き換えることにより、例１の
キメラインスリン遺伝子をさらに改変した。この改変は、３つのオリゴヌクレオ
チドプライマー（表３に挙げる配列）を使ったｈＩｎｓＭ２のＰＣＲ増幅によっ
て達成した。オリゴヌクレオチドＴＡ４５５は（５’から３’）制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ認識部位に相当する配列、アルブミンの５’非翻訳領域に相当するアルブミ
ンプロモーターの塩基１５３〜１８８、およびヒトプレプロインスリンｍＲＮＡ
に相当する配列（最初のアミノ酸から始まるもの）を含む。リバース（アンチセ
ンス）オリゴヌクレオチドＴＡ４５２はヒトインスリンｃＤＮＡ配列の翻訳配列
の末端（塩基３９２）で終わっている。リバース（アンチセンス）オリゴヌクレ
オチドＴＡ４５４は、ヒトプレプロインスリンＣＤＮＡの３’領域に加えてヒト
インスリンの３’非翻訳領域の１８塩基（塩基３９３〜４１０）に相当する。こ
れらの両リバースオリゴヌクレオチドには、例１に記載の小さいｐＡＣＣＭＶ系
プラズマへの生成した産物のクローニングを容易にするために、ＳａｌＩ制限
部位も含めた。ＴＡ４５５およびＴＡ４５２の増幅産物を突然変異体Ｍ２Ａと名
付けた。ＴＡ４５５およびＴＡ４５４の増幅産物を突然変異体Ｍ２Ｂと名付けた
。

【００３７】増幅後、改変キメラインスリン遺伝子を、それらのプロモーター配列を伴なわ
ないで、ＣＭＶプロモーターを含有する市販のプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３
にクローニングした。クローニングと発現に関係する工程を図１０に概要的に図
解する。ｐｃＤＮＡ３は独自のＳａｌＩ部位を持たないので、ＫｐｎＩとＥ
ｃｏＲＶを使って挿入の向きを制御した。インスリン遺伝子突然変異体Ｍ２Ａお
よびＭ２ＢをＫｐｎＩで処理し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに個別に結合させた。
結合したＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換した後、上記２つのインスリン突然変
異体を含有するプラスミドを調製し、それらをＣｏｓ７細胞のトランスフェクシ
ョンに使用した。

【００３８】例４：ラットアルブミンの５’非翻訳領域を含有するインスリン構成物をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からのインスリンの分泌Ｃｏｓ７細胞を使って、例３に記載の構成物の、インスリンを合成および分泌
する能力を試験した。トランス・イット（ＴｈｅＴＲＡＮＳＩＴ）(登録商
標)トランスフェクション試薬（パン・ベラ・コーポレーション（ＰａｎＶｅ
ｒａＣｏｒｐ．）、マディソン、ウィスコンシン）を使って、一時発現のため
に、Ｍ２ＡおよびＭ２Ｂ突然変異体を含有するプラスミドをＣｏｓ７細胞にトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションのために４時間インキュベートした後
、１０％ウシ胎仔血清を補足した新鮮なＤＭＥＭと細胞を終夜インキュベートし
た。次に培地を変え、１０％または５％ウシ胎仔血清を含有する培地中で、プレ
ートを２日間インキュベートした。培地と細胞を別々に収集し、細胞を１％ＮＰ
−４０およびプロテアーゼ阻害剤（トリプシンインヒビターおよびＰＭＳＦ）を
含有するトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．６）中で溶解した。培地と細胞溶解液の両
方をインスリンの存在について抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した。

【００３９】予備的結果から、両クローンがインスリンの合成と分泌を引き起こす能力を持
つことが実証される。Ｍ２Ｂはより高いインスリン産生をもたらす傾向を示す（
図１１および１２参照）。合成されたインスリンの全てではないとしても大半が
分泌されることも明らかである（図１２）。インサートを持たないベクターｐｃ
ＤＮＡ３をトランスフェクトした対照細胞はインスリンを産生しなかった。これ
らの対照で測定されるインスリンのレベルは、インスリン標準曲線のベースライ
ンと有意に異ならなかった。

【００４０】

【表３】

【００４１】例５：インスリンおよび１、２または３個のＧＩＲＥを含有するアデノウイルス構成物をトランスフェクトした肝細胞からのグルコース依存性インスリン放出の定量上記の例には、グルコース誘導性調節要素（ＧＩＲＥ）を含むキメラ血清アル
ブミンプロモーターの制御下にｈＩｎｓｃＤＮＡを持つ遺伝子構成物によって
、ラット肝細胞におけるｈＩｎｓのグルコース誘導性転写が達成されることを示
すデータを記載した。またｈＩｎｓｍＲＮＡのインスリンタンパク質を産生お
よび分泌する能力に関する情報も、ＣＯＳ７細胞を使って提供された。肝細胞での発現を研究するために、１、２または３個のＧＩＲＥ単位を含む３
種類のキメラヒトインスリン構成物をアデノウイルス中に構築した。各構成物は
、特定の数のＧＩＲＥの後ろに、アルブミンプロモーターおよびヒトインスリン
ｃＤＮＡ（プロインスリンからインスリンへのフリンが介するプロセシングを助
ける２組の突然変異を含むもの）を含んでいる。ｈＩｎｓ構成物の組み立てる際の一般的方針は、本質的に上述したもの同じと
した。１または２つのＧＩＲＥに対応するセンスおよびアンチセンスオリゴヌク
レオチドを化学的に合成した。オリゴヌクレオチド対の各セットは、ともにアニ
ールさせた時に、その二本鎖ＤＮＡが、制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ
に適合する付着末端をそれぞれ５’および３’末端に含有するように設計された
。１つのＧＩＲＥに対応するもう一対のオリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩお
よびＸｂａＩ部位をそれぞれ５’および３’末端に含有するように作成した。ラ
ットアルブミンプロモーターの増幅に使用したオリジナルのセンスオリゴヌクレ
オチドはＥｃｏＲＩ部位を含有し、その後ろにＸｂａＩ部位が続いている。
最後のオリゴヌクレオチド対（１ＧＩＲＥ）を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩを使
って、２つのＧＩＲＥを含んでいる構成物に挿入し、３つのＧＩＲＥを有する構
成物を生じた。

【００４２】先に記載したラットアルブミンプロモーター配列を、ラットアルブミンの全５
’非翻訳領域を含むようにＰＣＲによって伸長した。先に記載した構成物から、
プロインスリンのＢ／ＣおよびＣ／Ａ連結部に相当する、２組の突然変異を含む
ヒトインスリンｃＤＮＡを改変して、ＰＣＲによってｈＩｎｓｃＤＮＡに由来
する５’非翻訳領域を除去した。それら２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応における
オーバーラップ伸長によって互いにつなぎ合わせた。この反応の産物は（５’−
＞３’）アルブミンプロモーター、アルブミンの５’−ＵＴＲ、およびフリンと適合するように改変されたｈＩｎｓの翻訳配列を含有した。ＥｃｏＲＩおよび
ＳａｌＩ制限酵素部位をそれぞれ５’および３’末端に含有するこのＤＮＡ断
片をそれら２つの酵素で処理し、上述の１つまたは２つのＧＩＲＥに対応するア
ニールさせたオリゴヌクレオチド対と混合し、アデノウイルスの作成に使用する
プラスミドベクター（ＣＭＶプロモーターが削除されたｐＡＣＣＭＶ）に結合さ
せた。

【００４３】次に本出願人らは、ｈＩｎｓｍＲＮＡのグルコース誘導性アップレギュレー
ションが、ｈＩｎｓタンパク質の対応するグルコース誘導性分泌を伴なうかどう
か、グルコース誘導性インスリン分泌の程度が１構成物あたりのＧＩＲＥ単位の
数に依存して変化するかどうかを決定した。１、２または３個のＧＩＲＥに対応
するプラスミドを個別にプラスミドｐＪＭ１７と混合し、その２種類のプラスミ
ドＤＮＡの混合物をＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトして、（先に記載
したように）組換え複製欠損アデノウイルスを作成した。各組換えｈＩｎｓ構成
物を配列決定して、ＰＣＲによってまたはそれ以降のクローニング操作中に誤り
が導入されていないことを確認した。新たに調製した肝細胞をコラーゲン被覆し
た３０ｍｍプレートに播種し、表示したとおりに１個（Ａｄ１ＳＡＭ２Ｂ）、２
個（Ａｄ２ＳＡＭ２Ｂ）または３個（Ａｄ３ＳＡＭ２Ｂ）のＧＩＲＥを持つイン
スリン構成物を含んでいるアデノウイルスをトランスフェクトした（ＭＯＩ＝４
）。トランスフェクションの１６時間後に、培養培地を、表示した通りに２．５
、５．６、１０または２７．５ｍＭグルコースを含む培地に変えた。３２時間後
に、培地中に存在するインスリンを抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって測定した（表４
に示す数字はｎｇインスリン／ｍｌ＋ＳＤを表す）。その結果を図１５、１６お
よび１７と表４に示す。

【００４４】遺伝子構成物が２個（図１６）または３個（図１７）のＧＩＲＥを含んでいる
場合は、形質導入された肝細胞から分泌されるインスリンのグルコース依存性の
増加がはっきりわかる。しかし構成物が１つ（図１５）のＧＩＲＥを持つ場合は
、総インスリン分泌量もグルコース誘導もごくわずかだった。さらに、３つのＧ
ＩＲＥを含有する構成物は、２７．５ｍＭグルコースでのより高い最大誘導（同
一条件下で２つのＧＩＲＥを持つ構成物の場合の６．５倍に対して、２．５また
は５．６ｍＭでのレベルから約９倍の増加）に加えて、１０ｍＭグルコースでの
インスリン分泌量にも２倍を超える増加を示す。

【００４５】

【表４】

【００４６】例６．生理学的レベルのグルコースに対するＧＩＲＥ構成物の時間的応答それぞれ１×１０^６個の肝細胞を含んでいるコラーゲン被覆した６０ｍｍのプ
レートまたは培養皿に、インスリン遺伝子と２つのＧＩＲＥとを含む試験アデノ
ウイルス３．５×１０^６ｐｆｕ／プレートをトランスフェクトした。対照プレー
トはウイルスなし、または細菌Ｂ−ガラクトシダーゼをコードするウイルスを受
領した。次に、１０％ウシ胎仔血清、３０μｇ／ｍｌプロリン、５μｇ／ｍｌイ
ンスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび５μｇ／ｍｌセレンを補足した
ＲＭＰＩ中の５．６ｍＭグルコースに、肝細胞を摂氏３７度で１６時間ばく露し
た。次に、トランスフェクトされた細胞を含んでいるプレートを二群に分割し、
一方の群には５．６ｍＭグルコースを含む新鮮な培地を与え、第２の群には２７
．５ｍＭグルコースを含む新鮮な培地を与えた。これら二群のそれぞれから、３
０分、１時間、２時間、４時間、８時間および１６時間後に個々のプレートを取
り除き、培地をデカントし、細胞を液体窒素で凍結した。全ＲＮＡを抽出し、ノ
ーザンブロット法によりｈＩｎｓｍＲＮＡについて分析した。

【００４７】図１３のノーザンブロットは、２７．５ｍＭグルコースへのばく露後に、ｈＩ
ｎｓｍＲＮＡが、一番初めの３０分の時点で検出可能であり、その後、時間依
存的に増加したことを示している。正常グルコースレベル（５．６ｍＭ）では、
シグナルははるかに低い。バンドの定量は２７．５ｍＭで観察されたインスリン
メッセージのアップレギュレーションは、５．６ｍＭ処理と比較して、およそ１
０倍であることを示した。これらのデータは、２つのＧＩＲＥを含有するベクター構成物が、島細胞に匹
敵する時間枠で、上昇したグルコースレベルに応答して転写を開始することを実
証している。上昇したグルコースレベルに対するこの迅速な時間的応答は、ＧＬ
ＵＴ−２およびグリコキナーゼ経路によるグルコース検出に起因する制御機構に
加えて、あるレベルのインスリン合成の制御を与える。またこれらのデータは、
生理学的レベルのグルコースに対する正確で正しい応答も実証している。インス
リンｍＲＮＡ産生は、血流中のグルコースの定常状態濃度である、５．６ｍＭグ
ルコースの存在下ではアップレギュレートされない。インスリンｍＲＮＡ合成は
、上昇した（５．６ｍＭより高い）グルコースレベルによって刺激される。

【００４８】例７．２つのＧＩＲＥを含む構成物をトランスフェクトした肝細胞による生理学的範囲でのインスリン合成新たに調製したラット肝細胞に、Ｍ１突然変異型インスリン遺伝子を含有する
２つの異なるアデノウイルス構成物：ＡｄＳＡＭ１（２つのＧＩＲＥを含有する
ように改変されたラットアルブミンプロモーターを含んでいる）およびＡｄＣＭ
ＶＩｎｓＭ１（構成的で著しく活性なＣＭＶプロモーターを含んでいる）をトラ
ンスフェクトした。ＡｄＣＭＶ．β−Ｇａｌをトランスフェクトした肝細胞と、
非トランスフェクト肝細胞とを、対照として使用した。肝細胞のプレート４枚に
、各アデノウイルス調製物をトランスフェクトし、２枚のプレートを低い（３．
３ｍＭ）グルコース濃度にばく露し、残る２枚のプレートを高い（２７．５ｍＭ
）グルコース濃度にばく露した。３６時間後に、ロイシンを省いた２ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン、３０μｇ／ｍｌプロリン、５μｇ／ｍｌインスリン、５μ
ｇ／ｍｌトランスフェリンおよび５μｇ／ｍｌセレンを補足し、ＲＭＰＩ中の５
．６ｍＭまたは２７．５ｍＭグルコースに、摂氏３７度で１６時間ばく露した。

【００４９】６時間のロイシン消耗後に、低または高グルコース濃度含有合成培地２ｍｌア
リコートを適当なプレートに加えた。使用した各アデノウイルスについて、各グ
ルコース濃度につき１枚のプレートに、０．２ｍＣｉ ^３Ｈ−ロイシン（５００
Ｃｉ／ミリモル）を添加した。残りのプレートには、等量の非標識ロイシンを添
加し、すべてのインキュベーションの終了時に、生存度の決定に使用した。ロイシン取り込みを１６時間行なった後、非標識ロイシンを用いて４時間のチ
ェイスを行なった。培養培地を吸引し、細胞片を除去し、その上清を分泌された
産物の分析に使用した。各プレート上の細胞を、２０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液
（ｐＨ７．６）、２ｍＭＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌトリプシンインヒビター、５
０μＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１％トリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む０．８ｍｌの溶液で溶解した。その溶解物を微
量遠心機中、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを捨て、上清溶
液を、標識された細胞内産物の分析に使用した。

【００５０】分泌されたインスリンの免疫沈降による各分析には、０．８ｍｌの培養上清を
使用し、細胞内インスリンの各分析には、０．４ｍｌの細胞溶解上清を使用した
。この操作中に起こる標識タンパク質の非特異的沈降を減らすために、特異的抗
体の不在下に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）で試料を予備浄化
した。すなわち、ホルマリン固定ブドウ球菌細胞（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ）製）の１０％懸濁液５０μｌを各チューブに加え、チューブを絶え
間なく混合しながら３０分間室温に保ち、遠心分離（１６，０００×ｇ、４分）
し、その上清をそれ以降の分析に使用した。インスリンおよびインスリン関連産
物の免疫沈降を行なうために、２．５μｌのポリクローナルモルモット抗ヒトイ
ンスリン（シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．））を、上記の段階で得た上清溶液に加え、混合し、４５分間室温に保った
後、ブドウ球菌細胞を添加して、３０分間インキュベートし、上記と全く同様に
遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、０．１５ＭＮａＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００で４〜５回
洗浄した。

【００５１】そのペレットを、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１．２％ＳＤＳ、
２％β−メルカプトエタノールを含む４０μｌの溶液中に懸濁し、沸騰水浴で４
分間加熱し、遠心分離し、上清をポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル電気泳動によ
って分析した。試料間変動に関する試料の内部対照として、もう一組のチューブ
には、２μｌのウサギ抗ラットアルブミンポリクローナル抗血清を抗インスリン
抗血清と共に含めて、その後の一段階でヒトインスリンと内因性ラットアルブミ
ンを共沈させうるようにした。免疫沈降した物質の特異性は、無関係な遺伝子（
β−ガラクトシダーゼ）を導入した対照細胞および非トランスフェクト細胞を使
って確証した。免疫沈降した物質の正体をさらに確かめるために、別の一組のチ
ューブに、非標識インスリンおよびラット血清を加えてそれぞれ標識インスリン
およびアルブミンと競争させ、チューブを同時に処理した。

【００５２】インスリンＢ鎖およびＡ鎖とラットアルブミンの分割に最適なゲル系は、シャ
ガー（Ｓｃｈａｇｇｅｒ）およびジャゴウ（Ｊａｇｏｗ）の記載（Ａｎａｌｙｔ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８−３７９，１９８７）に基づくＳＤＳ／トリ
ス−トリシン１０−２０％直線的ポリアクリルアミド勾配であることがわかった
。各試料から得たＳＤＳ−βＭＥ処理済の免疫沈降物質１５μｌアリコートをバ
イオラッド（ＢｉｏＲａｄ）製のペプチドサイズマーカーと共にゲル上で分割し
た。ゲルを固定し、染色し、脱染色し、「アンプリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ）」
溶液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に浸漬し、真空乾燥し、−８０℃でＸ
線フィルムにさらした。

【００５３】我々の結果（図１４）は、インスリンｃＤＮＡ含有構成物ＡｄＳＡＭ１（グル
コース誘導性）とＡｄＣＭＶ．ＩｎｓＭ１（構成性）のどちらをトランスフェク
トした肝細胞の細胞抽出物中に抗インスリン抗体結合バンドが存在することを示
している。上記方法の項で述べたように、両構成物はＣ／Ａ連結部のコード領域
が突然変異したＭ１インスリンｃＤＮＡを含有する。ＡｄＳＡＭ１はラットアル
ブミンプロモーターに結合した２つのグルコース誘導性調節要素を含み、ＡｄＣ
ＭＶ．ＩｎｓＭ１はサイトメガロウイルス前／初期プロモーターを含有する。Ａ
ｄＳＡＭ１を使用した場合、インスリンバンドは高グルコースにばく露した肝細
胞にだけ現れ、低グルコースにばく露した肝細胞には現れなかった。ＡｄＣＭＶ
．ＩｎｓＭ１を使用した場合、インスリン陽性バンドはグルコース濃度とは無関
係にほぼ等しい量で存在した。これらの結果は、ラット血清アルブミンを共沈さ
せ、それを内部標準として使用することにより、ゲル装填量の可能な相違および
試料間変動の他の原因、３．３ｍＭ対２７．５ｍＭグルコースでのインキュベー
ション後の肝細胞生存率の相違（低グルコースでは生存度が１０〜１５％低い）
を含む、について調整されていることに留意すべきである。

【００５４】インスリン陽性バンドのサイズは７，７００ダルトンと決定された。これは成
熟インスリンＢ鎖およびＡ鎖のサイズとは異なるが、おそらくプロインスリンの
不完全なプロセシングの結果としてインスリンのＣ＋Ｂペプチドを含んでいるよ
うである。ラットアルブミンのサイズは、既知のサイズに匹敵する６７，０００
ダルトンであると決定された。観察されたバンドがインスリンおよびアルブミン
と同一であることは、免疫沈降の間に過剰の非標識インスリンおよび正常ラット
血清を含めると、シグナルがほとんど完全に消失するという事実によって確認さ
れた。デジタルデンシトメトリーを用いた予備的決定により、高グルコースにお
ける細胞内インスリンタンパク質発現は、ＡｄＳＡＭ１に使用したキメラアルブ
ミンプロモーターによって駆動された場合、ＡｄＣＭＶ．ＩｎｓＭ１中のＣＭＶ
プロモーターによって駆動された場合の約２０分の１に過ぎないことが明らかに
なった。これは極めて有望な結果である。なぜならＣＭＶプロモーターは大半の
インビボおよびエクスビボ哺乳類系で最も活性な既知プロモーターだからである
。ＣＭＶプロモーターによって達成されるレベルでインスリンを発現させること
は望ましくはないだろう。

【００５５】これらのデータは、２つのＧＩＲＥの制御下にプロインスリン遺伝子を含んで
いるベクターをトランスフェクトした肝細胞で、生理学的レベルのグルコースに
応答して起こるインスリンの合成を実証している。３．３ｍＭグルコースでは検
出可能なインスリンの合成は起こらず、２７．５ｍＭグルコースではインスリン
合成は容易に検出できる。転写レベルでの追加の制御機構を提供する、２つのＧ
ＩＲＥをベクターに加えることによって、インスリンの合成は、適切な生理学的
範囲で正しく調節される。インスリンｍＲＮＡとインスリンは、５．６ｍＭを超
えるグルコース濃度では合成されるが、５．６ｍＭグルコース濃度では合成され
ない。この特徴により、ＧＩＲＥを含むベクターは、１型糖尿病の治療に比類な
く好適であって、先行技術ベクターより優れたものになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はそれぞれグルコース調節モジュールＣおよびＦのヌクレオチド配列を示
す概要図である。

【図２】プロインスリン用発現カセットのためのクローニング部位と数個のアデノウイ
ルス遺伝子を含むｐＡＣＣＭＶ．ｐｌｐＡ８．８ｋｂプラスミドの遺伝子地図
である。

【図３Ａ】図３ＡはｐＡＣＣＭＶ．ｐ．Ａプラスミド上の様々なマーカーとの関連で発現
カセットの挿入図を示す遺伝子地図である。図３Ｂは遺伝要素の順序を５’から
３’に向かって示している。

【図３Ｂ】図３ＡはｐＡＣＣＭＶ．ｐ．Ａプラスミド上の様々なマーカーとの関連で発現
カセットの挿入図を示す遺伝子地図である。図３Ｂは遺伝要素の順序を５’から
３’に向かって示している。

【図４】トランスフェクション用の最終組換えベクターの作成に使用した大きい４０．
３ｋｂのｐＪＭ１７プラスミドの遺伝子地図である。

【図５】ベクターｐＡＣＣＭＶ．ｐｌｐＡとｐＪＭ１７の組換えによるＡｄＣ／ＦＡＭ
構成物の生成を示す遺伝子地図である。

【図６】発現カセットを含有する組換えプラスミドベクターをトランスフェクトし、様
々なレベルのグルコースの存在下で培養した肝細胞から単離されたＲＮＡノーザ
ンブロットのゲル複写図である。

【図７】より長時間にわたってＣＭＶ制御にばく露した結果を示す他は、図６と同一な
ノーザンブロットのゲル複写図である。

【図８】構成的ＣＭＶプロモーターの制御下にあるｍＲＮＡの対照バンドの移動位置を
示す他は、図６で表されたものの複製物である。

【図９】ｒＲＮＡ結合を様々なレベルのグルコースの存在下で肝細胞から得られるｍＲ
ＮＡと比較するゲル複写図である。

【図１０】Ｍ２ＡおよびＭ２Ｂをクローン化するために使用した工程の概要図である。

【図１１】組換えプラスミドをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞から放出されるインス
リンの量を比較するグラフである。

【図１２】組換えプラスミドをトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞におけるインスリンの
分泌および細胞内保持を比較するグラフである。

【図１３】トランスフェクトされた肝細胞におけるｈＩｎｓｍＲＮＡのグルコース誘導
性アップレギュレーションに対する時間の効果を示すオートラジオグラフである
。（レーン１、２および３：２７．５ｍＭグルコースでそれぞれ．５時間、１
時間および１６時間のｈＩｎｓｍＲＮＡ発現。レーン４、５および６：５．６
ｍＭグルコースでそれぞれ．５時間、１時間および１６時間のｈＩｎｓｍＲ
ＮＡ発現。）

【図１４】グルコース応答性ヒトインスリン産生が、形質導入されたラット肝細胞から得
られる細胞溶解物中に観察されることを示すオートラジオグラフである。（細胞
にグルコース誘導性構成物（レーン１および２）をトランスフェクトし、３．３
ｍＭグルコース（レーン１）または２７．５ｍＭグルコース（レーン２）で培養
した。レーン３はＣＭＶプロモーターの制御下にあるプロインスリンをトランス
フェクトした細胞の対照レーンである。レーン４は、インスリン特異抗体による
免疫沈降段階に先立って過剰の非標識インスリンを加えたことを除いて、レーン
３と同じ物質を表す。）

【図１５】様々なグルコース濃度で１つのＧＩＲＥを含有する構成物をトランスフェクト
した肝細胞によって産生されるインスリンを比較した棒グラフである。

【図１６】様々なグルコース濃度で２つのＧＩＲＥを含有する構成物をトランスフェクト
した肝細胞によって産生されるインスリンを比較した棒グラフである。

【図１７】様々なグルコース濃度で３つのＧＩＲＥを含有する構成物をトランスフェクト
した肝細胞によって産生されるインスリンを比較した棒グラフである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アラム，タウシフアメリカ合衆国ウイスコンシン 53705 マデイソンユニバーシテイハウシズ 310 (72)発明者ソリンジヤー，ハンスダブリユー．アメリカ合衆国ウイスコンシン 53703 マデイソンシヤーマンアベニユー 1202 (72)発明者セロン，エイミーエル．アメリカ合衆国ウイスコンシン 53705 マデイソンウオルナツトストリート 614 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA04 CA05 CA09 CA10 CA12 CA20 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 GA11 GA13 GA18 HA13 HA14 HA17 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA19 BA20 BA21 BA22 BA23 DB34 NA14 NA15 ZC352

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホスト細胞中でプロインスリン遺伝子を発現させるための遺
伝子カセットであって、活性インスリンに切断されうるプロインスリンをコードし、かつ、該ホスト細
胞に含まれるＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列に作動可
能な形で結合しているヌクレオチド配列、およびリンカー配列によって分離された４つまたはそれ以上のＣＡＣＧＴＧモチーフ
を含んでなる、該プロモーターの５’側に位置するグルコース応答性調節モジュ
ールを含んでなる遺伝子カセット。
【請求項２】前記プロモーター配列と前記プロインスリン配列との間に順
方向に配置されたラットアルブミンの５’非翻訳領域をコードするヌクレオチド
配列をさらに含んでなる、請求項１の遺伝子カセット。
【請求項３】当該ベクターに含まれるプロインスリン遺伝子を転写できる
ようにホスト細胞をトランスフェクトするためのベクターであって、活性インスリンに切断されうるプロインスリンをコードし、かつ、該ホスト細
胞中で転写可能なプロモーターに作動可能な形で結合しているヌクレオチド配列
および該プロモーターの５’側に位置する調節モジュールからなる遺伝子カセッ
ト、およびインビボで、該ホスト細胞に対して感染性を有するウイルス粒子に該ベクター
をパッケージングするのに必要な遺伝子群を発現できる複製欠損ウイルスゲノム
を含んでなるベクター。
【請求項４】該ホスト細胞が肝細胞である請求項３のベクター。
【請求項５】４つまたはそれ以上のＣＡＣＧＴＧモチーフを含んでなり、
該ＣＡＣＧＴＧモチーフがリンカー区間によって分離されている、合成グルコー
ス応答性調節モジュール。
【請求項６】該ＣＡＣＧＴＧモチーフをつなぐ該リンカー区間が５’−Ｇ
ＧＣＧＣ−３’である請求項５のグルコース応答性調節モジュール。
【請求項７】ホスト細胞における構造遺伝子のグルコース調節性発現のた
めの遺伝子カセットであって、該ホスト細胞に含まれるＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター
に作動可能な形で結合している該構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列、お
よびリンカー配列によって分離された４つまたはそれ以上のＣＡＣＧＴＧモチーフ
を含んでなる、該プロモーターの５’側に位置するグルコース応答性調節モジュ
ールを含んでなる遺伝子カセット。
【請求項８】グルコーストランスポーター２、グルコキナーゼおよび遺伝
子的に改変されたプロインスリンを切断してインスリン活性を持つタンパク質を
与えることができる酵素を発現する細胞に、該細胞中で転写可能なプロモーターに作動可能な形で結合された実質的に完全
長のプロインスリン遺伝子をコードするヌクレオチド配列および該プロモーター
の５’側に位置する調節モジュールからなる遺伝子カセット、インビボで当該ベクターを該細胞に対して感染性を有するウイルス粒子にパッ
ケージングするのに必要な遺伝子群を発現できる複製欠損ウイルスゲノムを含んでなるベクターでトランスフェクトすることを含んでなる糖尿病の治療方法。
【請求項９】該細胞が肝細胞である請求項４の方法。