JP2002527112A - ブタソマトトロピンのデリバリーシステム - Google Patents

ブタソマトトロピンのデリバリーシステム

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JP2002527112A JP2000577308A JP2000577308A JP2002527112A JP 2002527112 A JP2002527112 A JP 2002527112A JP 2000577308 A JP2000577308 A JP 2000577308A JP 2000577308 A JP2000577308 A JP 2000577308A JP 2002527112 A JP2002527112 A JP 2002527112A
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Abstract

(57)【要約】 ポリペプチドをコードする異種配列に機能的に結合したインスリン分泌シグナルをコードする配列を含む発現カセットの提供。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主に対して外因性ポリペプチドをデリバリーするための発現構築
物に関する。本発明はまた、この発現構築物を含む組換え細胞、及び該組換え細
胞を含む半透過性カプセルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物において、ソマトトロピン（成長ホルモン）は通常、脳下垂体から分
泌される。しかしながら、ブタに対するソマトトロピンの外因性の投与は、食料
効率を１５−２０％改善し、毎日の体重の増加を５−１０％増大し、屠殺時の脂
肪を１０−２０％減少し、赤身の含有量を５−１０％増大し、食料摂取量を減少
することが示されている。不幸にも、ソマトトロピン（それは１９０アミノ酸の
小さなタンパク質である）は胃酸及びタンパク質切断に感受性であり、それ故有
効とするために毎日の注射が必要とされる。現在、福利と倫理上の問題により、
空気によるｐＳＴ注射ガンの使用が中止されており、毎日の投与の費用が産業上
の広い応用を制限している。
【０００３】 遺伝子治療における最近の進歩により、オートローガスな標的細胞への依存を
避けるストラテジーの開発が可能であり、半透過性アルギネート-ポリ-L-リシン
-アルギネート（ＡＰＡ）膜中にカプセル化されたトランスフェクト細胞を使用
することによる免疫抑制治療が可能となっている。ＡＰＡカプセルの環境は、ト
ランスフェクト細胞が生存を維持するように細胞生存能力及び増殖と適合的であ
り、伸長した期間で成長因子を分泌する。ＡＰＡは小さいタンパク質に対して透
過性であり、それによって遺伝子発現が外的な手段によって制御できる。非宿主
の高度に発現している細胞がカプセル中で使用できるため、ＡＰＡバリアは免疫
監視及び細胞拒絶を阻害する。ＡＰＡバリアはまた、受容者宿主中でのトランス
フェクト細胞の非制御的な増殖を妨げることができる。ＡＰＡカプセルは、トラ
ンスジェニック物質の消費に関する問題をなくすために除去でき、再使用するこ
とも可能である。さらに、もし該カプセルが、ひどい組織外傷によって損傷され
たならば、正常な宿主の移植片に対する拒絶が、移植された細胞を破壊するであ
ろう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ここで本発明者らは、宿主細胞への異種遺伝子配列の導入の前に、該異種遺伝
子配列にインスリン分泌シグナルをライゲーションすることが、該異種遺伝子産
物の分泌のレベルの驚くべき増大を導くことを見出した。この発見は、宿主内へ
の移植のための組換え細胞のカプセル化を含む、改良された遺伝子デリバリーシ
ステムの開発を導いた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従って第一の特徴点として、本発明は、ポリペプチドをコードする異種配列に
機能的に結合したインスリン分泌シグナルをコードする配列を含む、発現カセッ
トを提供する。
【０００６】 用語、「異種配列」は、インスリンをコードする配列以外の配列を意味する。
【０００７】 用語、「機能的に結合」は、インスリン分泌シグナル配列が、異種コード配列
とリーディングフレーム中で隣接ていることを意味する。
【０００８】 好ましいインスリン分泌シグナルは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有
するインスリン分泌シグナルである。しかしながら、該シグナルの生物学的活性
に負に影響することなく、該分泌シグナルに数多くの修飾を施すことができるこ
とは、当業者に予測できるであろう。例えばこれは、該分泌シグナルの全生物学
的活性に負に影響しないという条件で、ペプチド配列中の、硫酸化、リン酸化、
硝酸化、及びハロゲン化のような各種の変化；またはアミノ酸挿入、欠失、及び
保存的若しくは非保存的な置換によって達成できる。かくして、一つ以上の上述
の方法において修飾されているインスリン分泌シグナルの発現カセットを含むこ
とは、本発明によって包含されているものと考慮される。
【０００９】 異種配列は、インスリン以外の興味あるいずれかのポリペプチドをコードして
も良い。例えば異種配列は、ホルモン、サイトカイン、レセプターアゴニスト若
しくはアンタゴニスト、フェロモン、または酵素をコードしても良い。好ましい
実施態様において、異種配列は、成長ホルモンをコードする。好ましくは成長ホ
ルモンはソマトトロピンである。
【００１０】 第二の特徴点として、本発明は、第一の特徴点の発現カセットを含むベクター
を提供する。該ベクターは、細胞中に該発現カセットを導入するためのいずれか
の適切なベクターである。適切なベクターは、ウイルスベクター及び細菌プラス
ミドを含む。
【００１１】 本発明の第一の特徴点の発現カセット、または第二の特徴点のベクターは、遺
伝子発現を調節する一つ以上のエレメントをさらに含んでもよい。適切な調節エ
レメントの例は、メラトニン応答エレメント（ＭＲＥ）（Schrader等に記載され
、その全体の内容は参考としてここに含まれる）、及び／またはラパマイシン介
在転写因子（Magari等に記載され、その全体の内容は参考としてここに含まれる
）を含む。好ましい実施態様として、調節エレメントは、興味あるポリペプチド
のパルス可能な発現を可能にする。
【００１２】 第三の特徴点として、本発明は、本発明の第一の特徴点に従った発現カセット
を含む組換え細胞を提供する。
【００１３】 該組換え細胞は、細菌、酵母、昆虫、若しくは哺乳動物細胞でも良い。好まし
い実施態様として、該組換え細胞は哺乳動物細胞である。さらに好ましい実施態
様として、該細胞はラット筋芽細胞（Ｌ６）である。
【００１４】 第四の特徴点として、本発明は、ポリペプチドの発現及び分泌を可能にする条
件の下で、第三の特徴点の組換え細胞を培養すること、並びに任意に該ポリペプ
チドを単離することを含む、ポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００１５】 本発明の組換え細胞は、宿主へのデリバリー若しくは移植のために、半透過性
マトリックス中にカプセル化されても良い。
【００１６】 従って第五の特徴点として、本発明は、本発明の第三の特徴点に従った一つ以
上の組換え細胞をカプセル化する半透過性膜を含む、宿主への移植のためのカプ
セルを提供する。
【００１７】 好ましい実施態様として、該半透過性膜は、アルギネート-ポリ-L-リシン-ア
ルギネート（ＡＰＡ）膜である。ＡＰＡ半透過性膜の調製は、Basic等, 1996に
記載されており、その全体の内容は参考としてここに取り込まれる。
【００１８】 第六の特徴点として、本発明は、本発明の第一の特徴点に従った発現カセット
を宿主に投与することをを含む、宿主にポリペプチドを投与する方法を提供する
。
【００１９】 第七の特徴点として、本発明は、本発明の第五の特徴点に従ったカプセルを宿
主に移植することを含む、宿主にポリペプチドを投与する方法を提供する。
【００２０】 宿主は、いずれかの動物若しくはヒトであっても良い。好ましい実施態様とし
て、宿主は家畜動物である。さらに好ましい実施態様として、宿主は牧畜のウシ
、食肉用のウシ、乳牛、ブタ及び家禽より成る群から選択される。
【００２１】 本発明は、宿主に対する遺伝的物質のデリバリーのための改良されたシステム
を提供することは、当業者に予測されるであろう。生物学的に活性なポリペプチ
ドに対するインスリン分泌シグナルのライゲーションは、組換え細胞からの該ポ
リペプチドの改良された分泌を導く。分泌に引き続き、分泌シグナルは切断され
、生物学的に活性なポリペプチドを遊離する。半透過性膜にカプセル化された場
合、組換え細胞は、顕著な量の生物学的に活性なポリペプチドを分泌する能力を
有し、半透過性膜は、外的な手段によって遺伝子発現の制御が可能である。カプ
セル化された組換え細胞の移植は、移植が最小の手術しか必要としないという点
で利点を提供する。さらに半透過性膜は免疫監視及び細胞拒絶を減少し、そのこ
とは非宿主細胞がカプセル中で使用され得ることを意味する。
【００２２】 好ましい実施態様として、細胞増殖を制限し、受容者宿主において非制御的な
増殖を妨げるという利点を提供する半透過性膜は、耐久性を有する。該カプセル
は、除去可能で再使用可能であるというさらなる利点を提供する。
【００２３】 本発明の性質をより明確に理解させるために、本発明の好ましい形態が、以下
の非制限的な実施例及び図面を参考として記載されるであろう。
【００２４】
【発明の実施の形態及び実施例】
実施例１：ＩＳＳ−ｐＳＴ構築物のクローニング ｐＳＴ遺伝子を、Southern Cross Biotechnology Pty Ltdから大腸菌細菌中の
形態で得た。ｐＳＴ遺伝子を含むプラスミド、ｐＭＧ９３９を、標準的なプラス
ミド調製法を使用して細菌から単離した。ｐＳＴ遺伝子を増幅し、ライゲーショ
ンを可能にするため５’末端にＸｈｏＩ部位を、３’末端にＸｂａＩ部位を加え
るように、ＰＣＲプライマーをデザインした。
【００２５】 引き続き、修飾ｐＳＴ遺伝子配列を、プレプロインスリンｃＤＮＡから由来す
る分泌シグナル配列（ＩＳＳ）にライゲーションした。ＮｈｅＩ(GCTAGC)及びＸ
ｂａＩ(TCTAGA)制限部位を、ＩＳＳ開始コドンの前とｐＳＴの３’末端コドンの
後にそれぞれ導入し、ｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド(Promega)中に取り込ませた。
その後ｐＳＴ構築物を単離し、配列決定してコード領域を確認した（図１）。
【００２６】 ラット筋芽細胞（Ｌ６）のトランスフェクション（細胞内へのｐＳＴ遺伝子の
取り込み）を、ＬｉｐｏＴＡＸＩ(Stratagena)を使用して、Ｌ６細胞をトリプシ
ン処理した２時間後に実施した。ｐＳＴトランスフェクトＬ６細胞クローンを培
養物中で維持し、＞１０7細胞を生ずるまでＧ４１８で選択した。培養上清の等
量物（２ｍｌ）を−２０℃で貯蔵し、その後Sydney University (Camden)のDr P
. Wynnによって確立されたｐＳＴラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において、ｐ
ＳＴ濃度を評価した。ＲＩＡ感受性は、１２．４％のオーダーでＣＶ’ｓで＞０
．４ｎｇ／ｍｌであると思われた。ポリクローナル抗血清を、ｐＳＴペプチド抗
原を使用してモルモット中で生産した。ＲＩＡの結果（表１）は、ｐＳＴ遺伝子
構築物が、ブタの脳下垂体から精製されたｐＳＴの天然形態に対して生産された
ポリクローナル抗血清によって認識されるタンパク質を生産したことを示す（図
２）。Ｌ６クローンｐＣＩ／ｐｓｔ−１.,５を、以下に記載された修飾トランス
フェクション法から生産した。
【００２７】 修飾トランスフェクションプロトコール 特徴的なことに、Ｌ６細胞は培養プレートに接着し、細胞を培養するためにト
リプシンで脱着する必要がある；トランスフェクションは、２４時間後に通常の
ように実施される。この方法により、６−１８ｎｇ／ｍｌでｐＳＴを分泌するＬ
６細胞クローン（ｎ＝１０）が生じた。トリプシン処理の２時間後に、Ｌ６細胞
に対してＬｉｐｏＴＡＸＩ(Promega)及びＩＳＳ／ｐＳＴプラスミドを適用する
と、ｐＳＴの分泌割合が１０−２０倍増大した（＞１８０ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５ク
ローン）。この高いｐＳＴ分泌割合は、増殖を促進するために必要とされる細胞
（カプセル）の数を減少する。
【００２８】 表１．ＩＳＳ−ｐＳＴでトランスフェクションされた各クローンについての濃度
（ｎｇ／ｍｌ）
【表１】
【００２９】 実施例２：ブタソマトトロピン−ラット筋芽細胞（Ｌ６）免疫中立発現システム
（ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ）の調製 Basic等, 1996に記載されたカプセル化法に、以下の修飾を付け加えた。
【００３０】 室温での細胞のカプセル化は、アルギネート（１．５％ｗ／ｖ）小滴をゲル化
するために塩化カルシウム（若しくは乳酸塩）（１００ｍＭ）を利用し、その直
後に生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄し、次いでポリ-L-リシン（０．０
５％）で５分間再懸濁する。３７℃で１０分の塩化カルシウム架橋により、細胞
生存能力とより適合可能なアルギンネートマトリックスが生じる。
【００３１】 ポリ-L-リシンでのコーティングと生理食塩水での洗浄の後、別のアルギネー
ト層を加える。室温で４分間のクエン酸ナトリウム（５５ｍＭ）処理によりカプ
セルが柔軟化され、さらなる操作の困難性を増大する固さとなる。細胞生存能力
は、クエン酸ナトリウムに４分間さらすことにより、見かけで＜３５％に減少す
る。クエン酸ナトリウム処理の前に細胞濾過器にカプセルを配置することにより
、３７℃で１分間さらすと細胞生存能力が＞９８％に改良される。
【００３２】 カプセル化プロトコールに対する方法及び装置の修飾により、細胞生存能力の
通常の増大を有するカプセル化の効率（時間及び供給源）が６４％のオーダーま
で改良された。
【００３３】 実施例３：ブタにおけるｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳの移植を含むパイロット実験（１） 成長中のマウスに投与して、ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳで得られた予備的結果は、増
大した増殖特性を示す。雄のブタ（ｎ＝９、平均生体重量６１ｋｇ）を使用した
パイロット実験において、各種の量のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳを異なる部位に投与し
た（第０日目で個々の動物の首の筋肉にｉ．ｍ．で３カプセル、首にｓ．ｃ．で
３カプセル、耳元にｓ．ｃ．で１０カプセル、首にｉ．ｍ．で２０カプセル、ま
たは首にｉ．ｍ．で２９カプセル）。投与後の第−１４，０，７，１４，２１，
２８及び３６日目で、血液サンプル（１０ｍｌ）を頸部の静脈穿刺を介して採血
し、Ｐ２超音波（ｕｓ）測定を記録した。ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ投与の部位を、実
験を通じて組織反応現象についてモニターした。第３６日目で動物を殺傷し、屠
殺体の分析（背部の脂肪の深度、ＢＦ（ｍｍ）；眼筋肉領域、ＥＭＡ（ｃｍ）；
前腕骨長、ＢＯＮＥ（ｃｍ）；心臓重量、ＨＥＡＲＴ（ｇｍ）；脾臓重量、ＳＰ
ＬＥＥＮ（ｇｍ）および肝臓重量、ＬＩＶＥＲ（ｇｍ））を記録し（表２参照）
、ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳを回収した。図３は、コントロール（ｃｏｎ、平均±ＳＥ
、ｎ＝４）及び個々の値のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理ブタについての増大割合（第
０日目から）を表す。ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理に対する重量の増大のパーセンテ
ージは、コントロール（ｃｏｎ）ブタ及び個々のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理動物に
ついて平均±ＳＥで図４に提示される。血漿ｐＳＴ（ｎｇ／ｍｌ）をラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定し、コントロール（ｃｏｎ）及び個々の濃度
のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理ブタについて平均±ＳＥで図５に表される。食肉処理
に際して、ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳカプセル投与の部位は、除去の前に評価され（図
６，プレート１，矢印）、ｐＳＴの２４時間の分泌のex-vivo評価のための培養
培地中の配置（図６，プレート２）が評価される。見かけの組織損傷または免疫
反応は、第３６日目でｉ．ｍ．若しくはｓ．ｃ．の両者で観察されなかった。し
かしながら、耳に配置された（ｓ．ｃ．）カプセルは高度に血管化しているよう
であり、１００％回収可能であった。首の領域に配置されたカプセルは、＜１０
％しか回収可能ではなかった。
【００３４】 ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳは、第３６日目以上でin vivoで効力を維持し、トランス
ジェニック物質の消費に関する問題をなくすために除去可能であるカプセル（プ
レート２）内で増殖するようであった。さらにもしカプセルが損傷されたならば
（即ちひどい組織外傷によって）、正常の宿主移植片拒絶がＬ６細胞を破壊し、
トランスフェクト物質の増殖を妨げる。マウス及びブタにおける実験は、ｐＳＴ
−Ｌ６ＩＸＳが、血漿ｐＳＴの改変、増殖特性の促進、及び動物の免疫力の潜在
的な促進において有効であることを示した。
【００３５】 表２．ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳパイロット実験： Westmill豚小屋(Young, NSW)によって提供されたブタ（オス） ＥＭＡＩでの実験、最大安全性の豚小屋 ＡＣＥＣ Ｒｅｆ Ｎｏ：９８／２０
【表２】
【００３６】 実施例４：ブタにおけるｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳの移植を含むパイロット実験（２） 毎日のｐＳＴ注射で観察されるエネルギー再分配と同様な成長応答を達成する
ための、カプセルによるｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳデリバリーを最適化するために、第
二のパイロット実験を実施した。
【００３７】 実施例１に示されるように、ｐＳＴ分泌細胞は、一定範囲の分泌割合（６−２
００ｎｇ／ｍｌ）で生産された。２−２５ｎｇ／ｍｌのオーダーのｐＳＴ分泌割
合は、ｐＳＴ分泌細胞に対してストレスの付加（即ち細菌の混在による）に引き
続き、最も安定であるように思われる（データ示さず）。従って、約５ｎｇ／ｍ
ｌ（クローンｐＣＩ／ｐｓｔ−１４）及び約１０ｎｇ／ｍｌ（ｐＣＩ／ｐｓｔ−
１２）を分泌するクローンを、このパイロット実験のために選択した。雄のブタ
（ｎ＝１０，平均肝臓重量７８．１ｋｇ）を、耳元でｓ．ｃ．で各種の数のカプ
セル（実施例２に記載された方法に従って生産された）で投与した（表３）。
【００３８】
【表３】 ａ＝クローンｐＣＩ／ｐｓｔ−１４（５ｎｇ／ｍｌ） ｂ＝クローンｐＣＩ／ｐｓｔ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）
【００３９】 体重を、実験の始めと終わりで記録した。動物を個々の囲い（２ｍ2）中に飼
い、１週間制御された環境施設（２２℃）に安定化した。動物に任意に水と標準
的なペレット成長速度（９：００の時点で３ｋｇ／日）を与え、毎日の残余物を
記録した。カテーテルを耳の静脈（ｅｖｃ）に配置し、サンプリングの２４時間
後に開始した。コントロールブタ（即ちｐＳＴカプセルを受け取っていない）の
血液血漿（１０ｍｌ）を、３時間に亘り３０分ごとに回収した。ｐＳＴカプセル
を、一連のサンプリングの直後に腫瘍耳に投与した。カテーテルを利用したまま
、血液（１０ｍｌ）をｅｃｓを介して回収した（１１：００に毎日）。処理（ｐ
ＳＴカプセルの投与の７日後）血液血漿（１０ｍｌ）を、３時間に亘り３０分ご
とに回収した。屠殺と屠殺体分析を、２１日後に約１００ｋｇの生体で実施した
。次いでｐＳＴカプセルを耳から回収し、in vitro培養に配置した（ｐＳＴアッ
セイのため）。またカプセル部位を、免疫応答について評価した（例えばリンパ
球浸入）。
【００４０】 ｐＳＴカプセル（５から１０００ｎｇ／ｍｌの間で分泌）を受け取る前及び受
け取った７日後の平均（３時間、３０分間隔）血漿ｐＳＴ濃度の測定結果が、図
８に示されている。図８から見出されるように、血漿ｐＳＴは、免疫中立ｐＳＴ
（５−１００ｎｇ／ｍｌ）分泌カプセルにさらした１週間に引き続き、ブタにお
いて減少する。
【００４１】 個々の血漿ｐＳＴ濃度の間及びその中での生存能力は、コントロールの一連の
サンプリング期間の間より明らかであるようであった。この現象は、平均の観察
された濃度についての標準誤差を反映する。さらに、安定なベースライン及びｐ
ＳＴパルス間隔（通常３−４時間）は、ホルモンパルスを同定するようにデザイ
ンされたコンピュータープログラムによって認識された。しかしながら、安定な
ベースライン及び別個のパルスが、ｐＳＴカプセル投与の１週間後で動物におい
て観察された（図９）。
【００４２】 動物によって示された体重増加の割合（ＲＯＧ）は、量依存的な態様でｐＳＴ
カプセル分泌に相関的であるようであった（図１０）。３０ｎｇ／ｍｌ（即ちそ
れぞれ１０ｎｇ／ｍｌを分泌する３個のカプセル）の分泌割合が、成長速度の増
加を観察するために必要な最小の量であると思われる。ｅｖｃの大部分は、２１
日間で利用されたままであり、その時点で、動物を屠殺体分析のためバルビツー
ルで安楽死させた。屠殺体の背中の脂肪の測定の分析（皮膚のないＰ２）により
、３０ｎｇ／ｍｌが、ｐＳＴカプセル投与の２１日以内でのエネルギー再分配を
観察する最小の量であることが示される（図１０）。
【００４３】 この実験を通して、１００のカプセルを受け取った動物を含めて、副作用、体
重の減少、若しくは負に作用する免疫応答の指標は存在しなかった。
【００４４】 実施例５：ブタにおけるｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳの移植を含むパイロット実験（３） 実施例４に引き続き、背中の脂肪に対する、屠殺の前の各種の時間（即ち屠殺
の２，４及び６週間前）での投与される最適なｐＳＴ分泌割合／カプセル数の効
果を評価するための調査を実施した。８匹のブタを各処理のために使用し、並び
に８匹のコントロール（即ちｐＳＴカプセルを受け取らない）を使用した。
【００４５】 体重の増加割合の測定の結果が、図１１に提供される。
【００４６】 全体の屠殺体の冷凍（４℃で２４時間）に引き続き、背中の脂肪の測定を得た
（図１２）。Ｐ２測定を、脊柱の中央から６５ｍｍの第１２肋骨で記録した。２
，４及び６週間に亘りｐＳＴを分泌するカプセルにさらされたブタは、顕著に減
少した背中の脂肪を有すると観察された。２および６週間でのこの効果は、背中
の脂肪の約４６％の減少である。４週間ｐＳＴ ＩＧＴカプセルにさらされた動
物は、背中の脂肪の応答がより可変的であり、それはこれらの動物の数から全て
のカプセルを回収できない可能性と関係があると思われる。
【００４７】 分泌カプセルにさらされた腰部の筋肉領域のみが、ｐＳＴ ＩＧＴカプセルに
さらされた６週間に引き続き、顕著に増加した（即ち２２％）。
【００４８】 数多くの変形及び／または修正が、広く記載された本発明の精神若しくは範囲
を離れることなく、特異的な実施態様に示された本発明になすことができること
は、当業者に明らかであろう。それ故この実施態様は、あらゆる意味で説明的な
ものと考慮され、制限的なものとは考慮されない。
【００４９】
【参考文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、インスリン分泌シグナル−ｐＳＴ遺伝子構築物を表す
図である。
【図２】 図２は、インスリン分泌シグナル−ｐＳＴペプチド配列を表す
図である。
【図３】 図３は、コントロール及び個々のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理ブタ
についての体重の増加（第０日目から）の割合を表す図である。
【図４】 図４は、コントロール及び個々のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理動物
についての体重の増加のパーセンテージを表す図である。
【図５】 図５は、コントロール及び個々のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳ処理動物
についての血漿ｐＳＴ濃度を表す図である。
【図６】 図６は、ｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳカプセル投与部位の評価（プレー
ト１）、及びex-vivo評価のための培養培地中のｐＳＴ−Ｌ６ＩＸＳカプセルの
配置（プレート２）を表す図である。
【図７】 図７は、宿主動物からの除去に引き続く２４時間についての、
カプセルからのｐＳＴの分泌のex-vivo評価を表す図である。
【図８】 図８は、ｐＳＴカプセル投与の前（白色の棒）及び１週間後（
黒色の棒）の平均血漿ｐＳＴ（３０分間隔で３時間以上）を表す図である（★有
意）。
【図９】 図９は、それぞれ２５ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌを分泌
する移植カプセルを使用した、二種類のブタｐｉｇ２０６と２２８の毎日の血漿
ｐＳＴ濃度を表す図である。
【図１０】 図１０は、実施例４で生産されたブタにおけるｋｇ／日での
増大割合（ＲＯＧ；黒色の四角）及びＰ２背中の脂肪測定を表す図である。
【図１１】 図１１は、ｐＳＴ分泌、若しくはコントロール免疫中立遺伝
子治療（ＩＧＴ）カプセルでの移植に引き続く、雄のブタの増大割合（ＲＯＧ）
を表す図である（±ＳＥＭ）。
【図１２】 図１２は、ｐＳＴ分泌、若しくはコントロール免疫中立遺伝
子治療（ＩＧＴ）カプセルでの移植に引き続く、雄のブタの背中の脂肪（Ｐ２）
を表す図である（±ＳＥＭ）。
【図１３】 図１３は、ｐＳＴ分泌、若しくはコントロール免疫中立遺伝
子治療（ＩＧＴ）カプセルでの移植に引き続く、雄のブタの腰部（眼）の筋肉領
域を表す図である（±ＳＥＭ）。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月１１日（２０００．４．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】
【参考文献】
【配列表】 Sequence listing: <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation University of Western Sydney (Nepean) Pig Research and Development Corporation <120> Delivery system for porcine somatotropin <130> F08713PA1 <140> PCT/AU99/00896 <141> 1999-10-18 <150> AU PP 6556 <151> 1998-10-16 <160> Number of SEQ ID NOs: 4 <170>Software: PatentIn Ver. 2.1 <210>SEQ ID NO: 1 <211>Length: 24 <212>Type: PRT <213>Organism: Homo sapien <400>Sequence: 1 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala 20 <210>SEQ ID NO: 2 <211>Length: 72 <212>Type: DNA <213>Organism: Homo sapien <400>Sequence: 2 atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60 ccagccgcag cc <210>SEQ ID NO: 3 <211>Length: 666 <212>Type: DNA <213>Organism: Artificial Sequence <220>Feature: <223>Other Information: Description of Artificial Sequence: ISS-pST gen e construct <400>Sequence: 3 gctagcatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60 cctgacccag ccgcagccct cgagatgttt ccagctatgc cactttcttc tctgttcgct 120 aacgctgttc ttcgggccca gcacctgcac caactggctg ccgacaccta caaggagttt 180 gagcgcgcct acatcccgga gggacagagg tactccatcc agaacgccca ggctgccttc 240 tgcttctcgg agaccatccc ggcccccacg ggcaaggacg aggcccagca gagatcggac 300 gtggagctgc tgcgcttctc gctgctgctc atccagtcgt ggctcgggcc cgtgcagttc 360 ctcagcaggg tcttcaccaa cagcctggtg tttggcacct cagaccgcgt ctacgagaag 420 ctgaaggacc tggaggaggg catccaggcc ctgatgcggg agctggagga tggcagcccc 480 cgggcaggac agatcctcaa gcaaacctac gacaaatttg acacaaactt gcgcagtgat 540 gacgcgctgc ttaagaacta cgggctgctc tcctgcttca agaaggacct gcacaaggct 600 gagacatacc tgcgggtcat gaagtgtcgc cgcttcgtgg agagcagctg tgccttctag 660 tctaga 666 <210>SEQ ID NO: 4 <211>Length: 217 <212>Type: PRT <213>Organism: Artificial Sequence <220>Feature: <223>Other Information: Description of Artificial Sequence: ISS-pST peptide sequence <400>Sequence: 4 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Leu Glu Met Phe Pro Ala Met Pro 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg Ala Gln His Leu His 35 40 45 Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu Arg Ala Tyr Ile Pro 50 55 60 Glu Gly Gln Arg Tyr Ser Ile Gln Asn Ala Gln Ala Ala Phe Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg 85 90 95 Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Gly Pro Val Gln Phe Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val 115 120 125 Phe Gly Thr Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu 130 135 140 Gly Ile Gln Ala Leu Met Arg Glu Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Ala 145 150 155 160 Gly Gln Ile Leu Lys Gln Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg 165 170 175 Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 180 185 190 Lys Asp Leu His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys Cys Arg 195 200 205 Arg Phe Val Glu Ser Ser Cys Ala Phe 210 215
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月５日（２００１．１．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｐ 5/02 ４Ｃ０８４ 48/00 37/04 Ａ６１Ｐ 3/00 43/00 １１１ 5/02 Ｃ１２Ｎ 11/04 37/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 43/00 １１１ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 11/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/36 Ｃ１２Ｒ 1:91） 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ユニヴァーシティ・オブ・ウエスタン・シ ドニー（ネピアン) オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2747・キングズウッド・セカンド・ アヴェニュ（番地なし) (71)出願人 ピッグ・リサーチ・アンド・ディヴェロプ メント・コーポレーション オーストラリア・オーストラリアン・キャ ピタル・テリトリー・2600・バートン・ナ ショナル・サーキット・10・コンピュータ ー・アソシエイツ・ハウス・サード・フロ ア (72)発明者 ミッチェル・ケーガン オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2747・ウェーリントン・アルバー ト・ストリート・19／105−109 (72)発明者 マーク・リチャード・ジョーンズ オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2754・テニーソン・テニーソン・ロ ード・203 (72)発明者 ジェフリー・フィリップ・エム・モーア オーストラリア・ニュー・サウス・ウェー ルズ・2130・サマー・ヒル・カーリント ン・ストリート・17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA03 BA21 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 HA17 4B033 NA00 NA14 NA16 NB48 NB70 NC08 ND12 NF04 NF06 4B064 AG13 AG16 CA10 CC24 DA01 4B065 AA91X AB01 AC14 BA02 BC47 CA24 CA44 4C076 AA53 BB32 CC30 EE41 EE59 FF67 FF68 4C084 AA02 AA03 AA13 BA03 CA21 CA28 DB22 MA05 MA37 MA67 NA06 NA10 NA12 ZA66 ZC04 ZC21

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリペプチドをコードする異種配列に機能的に結合したイン
    スリン分泌シグナルをコードする配列を含む発現カセット。
  2. 【請求項２】 該インスリン分泌シグナルが、配列番号１に示されたアミノ
    酸配列を有する、請求項１記載の発現カセット。
  3. 【請求項３】 該インスリン分泌シグナルが、配列番号１に示されたアミノ
    酸配列を有するインスリン分泌シグナルと実質的に同等の全生物学的活性を有す
    る修飾インスリン分泌シグナルである、請求項１記載の発現カセット。
  4. 【請求項４】 該異種配列が、ホルモン、サイトカイン、レセプターアゴニ
    スト、レセプターアンタゴニスト、フェロモン、及び酵素から選択されるポリペ
    プチドをコードする、請求項１から３のいずれか一項記載の発現カセット。
  5. 【請求項５】 該ポリペプチドが成長ホルモンである、請求項４記載の発現
    カセット。
  6. 【請求項６】 該ポリペプチドがソマトトロピンである、請求項５記載の発
    現カセット。
  7. 【請求項７】 該異種配列のパルス可能な発現を可能にする一つ以上の調節
    エレメントをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項記載の発現カセット。
  8. 【請求項８】 請求項１から７のいずれか一項記載の発現カセットを含むベ
    クター。
  9. 【請求項９】 請求項１から７のいずれか一項記載の発現カセットを含む組
    換え細胞。
  10. 【請求項１０】 該細胞が、細菌、酵母、昆虫、若しくは哺乳動物細胞であ
    る、請求項９記載の組換え細胞。
  11. 【請求項１１】 該細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０記載の組換え細
    胞。
  12. 【請求項１２】 該細胞がラット筋芽細胞（Ｌ６）である、請求項１１記載
    の哺乳動物細胞。
  13. 【請求項１３】 該ポリペプチドの発現及び分泌が可能な条件下で、請求項
    ９から１２のいずれか一項記載の組換え細胞を培養すること、並びに任意に該ポ
    リペプチドを単離することを含む、ポリペプチドを生産する方法。
  14. 【請求項１４】 請求項９から１２のいずれか一項記載の組換え細胞をカプ
    セル化する半透過性膜を含む、宿主中に移植するためのカプセル。
  15. 【請求項１５】 該半透過性膜が、アルギネート-ポリ-L-リシン-アルギネ
    ート（ＡＰＡ）膜である、請求項１４記載のカプセル。
  16. 【請求項１６】 請求項１から７のいずれか一項記載の発現カセットを宿主
    に投与することを含む、宿主にポリペプチドを投与する方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１４または１５記載のカプセルを宿主中に移植する
    ことを含む、宿主にポリペプチドを投与する方法。
  18. 【請求項１８】 該宿主が動物若しくはヒトである、請求項１６または１７
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該宿主が家畜動物である、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該家畜動物がブタである、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 組換え細胞をカプセル化する半透過性膜を含むカプセルを
    ブタに移植することを含み、上記組換え細胞がソマトトロピンをコードする異種
    配列に機能的に結合したインスリン分泌シグナルをコードする配列を含む発現カ
    セットを含み、且つそれを発現し、上記膜が発現されるソマトトロピンに対して
    透過性である、ブタにソマトトロピンを投与する方法。
  22. 【請求項２２】 該インスリン分泌シグナルが、配列番号１に示されたアミ
    ノ酸配列を有する、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該インスリン分泌シグナルが、配列番号１に示されたアミ
    ノ酸配列を有するインスリン分泌シグナルと実質的に同等の全生物学的活性を有
    する修飾インスリン分泌シグナルである、請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１から２３
    のいずれか一項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該哺乳動物細胞がラット筋芽細胞（Ｌ６）である、請求項
    ２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該半透過性膜が、アルギネート-ポリ-L-リシン-アルギネ
    ート（ＡＰＡ）膜である、請求項２１から２５のいずれか一項記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該ブタが、少なくとも３０ｎｇ／ｍｌのソマトトロピンの
    分泌を達成するために十分な一つ以上のカプセルで移植される、請求項２１から
    ２６のいずれか一項記載の方法。
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