RU2268940C2

RU2268940C2 - Капсула для имплантации и способ введения соматотропина свинье

Info

Publication number: RU2268940C2
Application number: RU2001113279/13A
Authority: RU
Inventors: Митчелл КИГАН (AU); Митчелл КИГАН; Марк Ричард ДЖОУНЗ (AU); Марк Ричард ДЖОУНЗ; Джеффри Филип М. МУР (AU); Джеффри Филип М. МУР
Original assignee: Коммонвелт Сайентифик Энд Индастриал Рисерч Организейшн; Юниверсити Оф Вестерн Сидней (Непин); Пиг Рисерч Энд Дивелопмент Корпорейшн
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2006-01-27
Also published as: NZ510943A; CN1323348A; EP1121449A1; KR20010099687A; US20060062772A1; EP1121449A4; US6967089B1; CN1325650C; MXPA01003810A; BR9914547A; AUPP655698A0; ID30149A; WO2000023601A1; CA2346799A1; ZA200102965B; JP2002527112A

Abstract

Изобретение относится к области генной и клеточной инженерии и может быть использовано в ветеринарии и животноводстве. Предложена капсула для имплантации животному, представляющая собой полупроницаемую мембрану из альгинат-поли-L-лизин-альгината, в которую заключены клетки миобластов крысы (L6), секретирующие соматотропин свиньи благодаря включенной в них экспрессионной кассете, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей секреторный сигнал инсулина и оперативно связанной с ней нуклеотидной последовательности, кодирующей активную форму соматотропина свиньи. Разработан надежный и высокотехнологичный способ обеспечения животного необходимым количеством гормона роста, предусматривающий внутримышечное введение в область шеи или в основание уха свиньи одной или большего числа капсул по изобретению. 2 н. и 2 з.п.ф-лы, 13 ил., 3 табл.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к экспрессионной конструкции, предназначенной для доставки экзогенного полипептида хозяину. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам, которые включают данную экспрессионную конструкцию, и к полупроницаемым капсулам, которые включают рекомбинантные клетки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

У млекопитающих соматотропин (гормон роста) обычно секретируется гипофизом. Однако было показано, что экзогенное введение соматотропина свиньям улучшает эффективность питания на 15-20%, увеличивает ежедневный прирост веса на 10-15%, уменьшает жировые отложения на 10-20%, увеличивает содержание постного мяса на 5-10% и уменьшает потребление пищи. К сожалению, соматотропин (который является небольшим белком, состоящим из 190 аминокислот) является чувствительным к желудочным кислотам и к процессу переваривания белков, следовательно, для достижения эффекта необходимы ежедневные инъекции. В настоящее время социальные и этические проблемы препятствуют применению пневматического ружья для инъекции, а стоимость ежедневного введения ограничивает общеотраслевое применение.

Последние достижения в генной терапии делают возможным развитие стратегий, которые позволяют избежать зависимости от аутологичных клеток-мишеней и иммуносупрессорной терапии путем применения трансфицированных клеток, заключенных в капсулу из полупроницаемой альгинат-поли-L-лизин-альгинатной (АПА (АРА)) мембраны. Среда АПА капсулы сочетается с жизнеспособностью и ростом клеток так, что трансфицированные клетки остаются жизнеспособными, секретирующими факторы роста, в течение длительных периодов. АПА является проницаемой для маленьких белков и, следовательно, экспрессия генов может контролироваться с помощью внешних средств. АПА барьер ингибирует иммунный контроль и события, связанные с отторжением клеток, так, что в капсуле могут применяться клетки, не относящиеся к хозяину, способные к интенсивной экспрессии. АПА барьер может также предотвращать неконтролируемую пролиферацию трансфицированных клеток в хозяине-реципиенте. АПА капсулу можно удалить, повторно использовать для того, чтобы исключить процессы, связанные с потреблением трансгенного материала. Кроме того, если капсула повреждена в результате тяжелой травмы ткани, нормальная реакция отторжения приведет к разрушению имплантированных клеток.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время авторы данного изобретения обнаружили, что лигирование последовательности, кодирующей секреторный сигнал инсулина, с последовательностью гетерологичного гена до введения последовательности гена в клетку-хозяина приводит к неожиданному увеличению уровня секреции продукта гетерологичного гена. Это обнаружение привело к разработке улучшенной доставочной системы генов, включающей заключение в капсулу рекомбинантных клеток, предназначенных для имплантации в организм хозяина.

Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение предоставляет экспрессионную кассету, включающую последовательность, кодирующую секреторный сигнал инсулина, оперативно связанную с гетерологичной последовательностью, кодирующей полипептид.

Под "гетерологичной последовательностью" заявители подразумевают последовательность, отличающуюся от последовательности, кодирующей инсулин.

Под "оперативно связанным" заявители подразумевают, что последовательность секреторного сигнала инсулина непосредственно прилегает к гетерологичной кодирующей последовательности и находится в одной рамке считывания с данной последовательностью.

Предпочтительный секреторный сигнал инсулина представляет собой секреторный сигнал инсулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:1. Однако специалистам в данной области понятно, что можно провести ряд модификаций данного секреторного сигнала, которые не оказывают неблагоприятного воздействия на биологическую активность сигнала. Например, данные модификации могут быть проведены путем различных изменений, таких как сульфатирование, фосфорилирование, нитрование и галогенирование; или путем вставок, удалений или замещений аминокислот, либо консервативных, либо неконсервативных (например, D-аминокислоты, дезаминокислоты), в пептидной последовательности, где такие изменения не оказывают неблагоприятного воздействия на суммарную биологическую активность секреторного сигнала. Таким образом, включение в экспрессионную кассету секреторного сигнала инсулина, модифицированного с помощью одного или нескольких из вышеупомянутых путей, должно рассматриваться как охватываемое настоящим изобретением.

Гетерологичная последовательность может кодировать любой представляющий интерес полипептид, отличный от инсулина. Например, гетерологичная последовательность может кодировать гормон, цитокин, агонист или антагонист рецептора, феромон или фермент. В предпочтительном воплощении гетерологичная последовательность кодирует гормон роста. Предпочтительно, гормоном роста является соматотропин.

Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет вектор, включающий экспрессионную кассету, предлагаемую в первом аспекте. Вектором может быть любой вектор, подходящий для введения экспрессионной кассеты в клетку. Подходящие векторы включают вирусные векторы и бактериальные плазмиды.

Экспрессионная кассета, предоставляемая в первом аспекте настоящего изобретения, или вектор, предоставляемый во втором аспекте, могут дополнительно включать один или несколько элементов, которые регулируют экспрессию генов. Примеры подходящих регуляторных элементов включают элемент мелатонинового ответа (MRE) (как описано в Schrader et al, 1996, полное содержание данной работы включено здесь в качестве ссылки), и/или рапамицин-опосредованные факторы транскрипции (как описано в Magari et al, 1997, полное содержание данной работы включено здесь в качестве ссылки). Регуляторный элемент(ы) создает возможность для дискретной экспрессии полипептида, представляющего интерес.

В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет рекомбинантную клетку, которая включает экспрессионную кассету в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.

Рекомбинантная клетка может быть бактериальной, дрожжевой клеткой или клеткой насекомого или млекопитающего. В предпочтительном воплощении рекомбинантной клеткой является клетка млекопитающего. В дополнительно предпочтительном воплощении клетка представляет собой миобласт крысы (L6).

В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения полипептида, который включает культивирование рекомбинантной клетки, предлагаемой в третьем аспекте, в условиях, создающих возможность для экспрессии и секреции полипептида, и необязательно выделение полипептида.

Рекомбинантная клетка(и) настоящего изобретения может быть заключена в полупроницаемый материал для доставки или имплантации в организм хозяина.

Соответственно в пятом аспекте настоящее изобретение предоставляет капсулу, предназначенную для имплантации в организм хозяина, причем данная капсула включает полупроницаемую мембрану, в которую заключены одна или несколько рекомбинантных клеток в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения.

В предпочтительном воплощении полупроницаемой мембраной является альгинат-поли-L-лизин-альгинатная (АПА) мембрана. Получение АПА полупроницаемой мембраны описано в Basic et al, 1996, полное содержание данной работы включено здесь в качестве ссылки.

В шестом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ введения полипептида в организм хозяина, включающий введение хозяину экспрессионной кассеты в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.

В седьмом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ введения полипептида в организм хозяина, включающий имплантацию хозяину капсулы в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения.

Хозяином может быть любое животное или человек. В предпочтительном воплощении хозяином является животное, относящееся к домашнему скоту. В дальнейшем предпочтительном воплощении хозяина выбирают из группы, состоящей из выращенного на пастбище скота, получающего подкормку скота, молочных коров, свиней и домашней птицы.

Специалистам в данной области понятно, что настоящее изобретение предоставляет улучшенную систему доставки генетического материала хозяину. Лигирование секреторного сигнала инсулина с биологически активным полипептидом приводит к повышению секреции полипептида из рекомбинантных клеток. После секреции можно провести отщепление секреторного сигнала, получая биологически активный полипептид. Рекомбинантные клетки при заключении в полупроницаемую мембрану обладают способностью секретировать значительные количества биологически активного полипептида, и полупроницаемая мембрана делает возможным внешний контроль экспрессии генов. Преимущество имплантации заключенных в капсулу рекомбинантных клеток состоит в том, что для такой имплантации требуется минимальное хирургическое вмешательство. Кроме того, полупроницаемая мембрана ослабляет иммунный контроль и уменьшает отторжение клеток, это значит, что в капсуле могут использоваться клетки, не принадлежащие организму-хозяину.

В предпочтительном воплощении полупроницаемая мембрана является прочной, что обеспечивает преимущество, состоящее в том, что мембрана может ограничивать рост клеток, предотвращая, таким образом, неконтролируемую пролиферацию в реципиенте-хозяине. Дополнительное преимущество данных капсул состоит в том, что их можно удалить и использовать повторно.

Для более детального разъяснения природы настоящего изобретения его предпочтительные формы далее будут описаны со ссылкой на следующие неограничивающие примеры и фигуры.

Краткое описание иллюстраций

Фугура 1: Генная конструкция секреторный сигнал инсулина-pST.

Фигура 2: Пептидная последовательность секреторный сигнал инсулина-pST.

Фигура 3: Скорость прибавления веса (от 0 дня) для контрольных и отдельных обработанных pST-L6IXS свиней.

Фигура 4: Процент прибавления в весе для контрольных и отдельных обработанных pST-L6IXS животных.

Фигура 5: Плазма, уровни pST для контрольных и отдельных обработанных pST-L6IXS животных.

Фигура 6: Планшет 1 - Оценка участка введения pST-L6IXS капсулы

Планшет 2 - Помещение pST-L6IXS капсулы в культуральную среду для оценки ex vivo.

Фигура 7: Ex vivo оценка секреции pST из капсул в течение 24-часового периода после удаления из животного-хозяина.

Фигура 8: Средний уровень pST в плазме (в течение 3 часов с 30 мин интервалами) до (белые столбики) и через 1 неделю после введения капсулы pST (черные столбики) (* значимые).

Фигура 9: Ежедневные значения концентраций pST в плазме у двух свиней, свиней 206 и 228, с имплантированными капсулами, секретирующими 25 нг/мл и 500 нг/мл соответственно.

Фигура 10: Значения скорости прироста (ROG), кг/день (черные квадраты), и замеров жировых отложений спины Р2 у свиней, полученные в примере 4.

Фигура 11: Значения скорости прироста (ROG) у самцов свиней после имплантации капсул, секретирующих pST или контролирующих иммунонейтральную генную терапию (IGT) (±SEM стандартная ошибка средней)).

Фигура 12: Жировые отложения спины (Р2) у самцов свиней после имплантации капсул, секретирующих pST или контролирующих иммунонейтральную генную терапию (IGT) (±SEM).

Фигура 13: Область мышцы поясницы (глаз) самцов свиней после имплантации капсул, секретирующих pST или контролирующих иммунонейтральную генную терапию (IGT) (±SEM).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1: Клонирование конструкции ISS-pST

Ген pST получают из Southern Cross Biotechnology Pty Idt в бактерии Е.Coli. Плазмиду, содержащую ген pST, рMG939, выделяют из бактерии с помощью стандартных методов получения плазмид. Для амплификации гена pST конструируют праймеры для ПЦР, к 5' концу добавляют сайт Xho I и к 3' концу добавляют сайт Xba I для того, чтобы сделать возможными процессы лигирования.

Затем модифицированную последовательность гена pST сшивают с последовательностью секреторного сигнала (ISS), полученной из кДНК препроинсулина. Сайты рестрикции Nhe I (GCTAGC) и Xba I (TCTAGA) вводят перед стартовым кодоном ISS и после 3' терминирующего кодона pST соответственно для того, чтобы создать возможность для введения в плазмиду pCI-neo (Promega). Затем гибридную конструкцию pST выделяют и секвенируют для подтверждения последовательности кодирующего участка (фигура 1).

Трансфицирование миобластов крысы (L6) (в клетки вводит ген pST) проводят, используя LipoTAXI (Stratagene), через 2 часа клетки L6 обрабатывают трипсином. Трансфицированные pST клоны клеток L6, отобранные с помощью G418, поддерживают в культуре до достижения плотности клеток >10. Аликвоты (2 мл) супернатанта культуры хранят при -20°С до определения концентраций pST с помощью радиоиммуноанализа (RIA), разработанного Dr P.Wynn /Sydney University (Camden)/. Считается, что чувствительность RIA составляет >0,4 нг/мл с величиной коэффициента вариации (CV) порядка 12,4%. Поликлональную сыворотку получали от морских свинок с использованием пептидного антигена pST. Результаты RIA (таблица 1) показывают, что с помощью генной конструкции pST продуцируется белок (фигура 2), который распознается поликлональной антисывороткой, полученной против нативной формы pST, выделенной из свиного гипофиза. Клоны L6 pCI/pst-1...5 получали с помощью модифицированного метода трансфекции, как описано ниже.

Модифицированный метод трансфекции

Обычно клетки L6 прилипают к планшетам для культивирования и для переноса клеток требуется отделить их с помощью трипсина; трансфицирование обычно проводят спустя 24 часа. Эта процедура приводит к образованию клонов клеток L6 (n=10), секретирующих pST с концентрацией 6-18 нг/мл. Применение для L6 клеток LipoTAXI (Promega) и плазмиды ISS/pST через 2 часа после обработки трипсином увеличивает скорость секреции pST в 10-20 раз (>180 кг/мл, n=5 клонов). Такие увеличенные скорости секреции pST уменьшают число клеток (капсул), необходимое для увеличения роста.

ТАБЛИЦА 1
Концентрации (нг/мл) для каждого клона, трансфицированного ISS-pST.
Клон L6	pST (нг/мл)
pCI/pst-1*	182
pCI/pst-2*	188
pCI/pst-3*	188
pCI/pst-4*	140
pCI/pst-5*	200
pCI/pst-6	17
pCI/pst-7	12
pCI/pst-8	8
pCI/pst-9	9
pCI/pst-10	7
pCI/pst-11	7
pCI/pst-12	10
pCI/pst-13	8
pCI/pst-14	6
pCI/pst-15	18

Пример 2: Получение иммунонейтральной экспрессионной системы свиной соматотропин-крысиный миобласт (L6) (pST-L6IXS)

Процедура заключения в капсулу, описанная в Basic et al., 1996, сопровождалась следующими модификациями.

При заключение клеток в капсулу при комнатной температуре используют хлорид (или лактат) кальция [100 мМ] для образования геля из альгинатных (1/5% мас./об.) капель, после чего сразу промывают физиологическим солевым раствором (0,9% NaCl), затем ресуспендируют в поли-L-лизине [0,05%] в течение 5 мин. Поперечная сшивка с помощью хлорида кальция в течение 10 мин при 37°С приводит к образованию альгинатной матрицы, которая является более совместимой с жизнеспособностью клеток.

После покрытия поли-L-лизином и промывания физиологическим раствором добавляют другой альгинатный слой. Обработка цитратом натрия [55 мМ] в течение 4 мин при комнатной температуре смягчает капсулу до консистенции, которая затрудняет дальнейшие манипуляции. В результате 4 минутного воздействия цитрата натрия жизнеспособность клеток, по-видимому, уменьшается до <35%. Помещение капсул в клеточный фильтр перед обработкой цитратом натрия делает возможным воздействие в течение 1 мин, при 37°С, улучшая жизнеспособность клеток до >98%.

Процедурные модификации и модификации оборудования в методике капсулирования, улучшающие эффективность (время и средства) по сравнению с общепринятой практикой, увеличивают жизнеспособность клеток на величину порядка 64%.

Пример 3: Пилотный эксперимент (1), включающий имплантацию pST-L6IXS свиньям

Предварительные результаты, полученные с pST-L6IXS, введенной растущим мышам, показывают увеличение характеристик роста. В пилотном эксперименте с самцами свиней (n=9, средний живой вес 61 кг) различные количества pST-L6IXS вводят в различные участки (3 капсулы в.м. в мышцу шеи, 3 капсулы п.к. в шею, 10 капсул п.к. в основание уха, 20 капсул в.м. в шею или 29 капсул в.м. в шею отдельным животным на 0 день). Образцы крови (10 мл) собирают посредством яремной венепункции и ультразвуковые (УЗ) измерения Р2 регистрируют на -14, 0, 7, 14, 21, 28 и 36 дни после введения. На участках введения pST-L6IXS регистрируют события тканевой реакции на протяжении всего эксперимента. На 36 день животных подвергают эвтаназии и анализу туши (регистрировали глубину жировых отложений спины, BF (мм); область глазной мышцы, ЕМА (см); длину кости предплечья, BONE (см); вес сердца, HEART (г); вес селезенки, SPLEEN (г); и вес печени, LIVER (г) (см. таблицу 2) и выделяют pST-L6IXS. На фигуре 3 представлены значения скорость прироста (от 0 дня) для контрольных (контр., ср. значение±SE (стандартная ошибка), n=4) и отдельных обработанных pST-L6IXS свиней. Процент прироста веса для обработанных pST-L6IXS представлен на фигуре 4 как ср. значение±3Е для контрольных (контр.) свиней и отдельных обоаботанных pST-L6IXS животных. Концентрация pST в плазме нг/мл), определенная с помощью радиоиммуноанализа (RIA), представлена на фигуре 5 как ср. значение±SE контрольных (контр.) и индивидуальных концентраций обработанных pST-L6IXS свиней. При забое участок введения капсулы pST-L6IXS анализируют (фигура 6, планшет 1, стрелка) до удаления и помещают в культуральную среду для ex vivo анализа (фигура 6, планшет 2) 24 часовой секреции pST (фигура 6). Никаких видимых повреждений ткани или иммунных реакций не наблюдали на 36 день ни при в.м., ни при п.к. введении. Однако капсулы, помещенные в ухо (п.к.), оказывались в высокой степени васкуляризованными и восстанавливались в 100% случаев. Капсулы, помещенные в область шеи, восстанавливались в <10% случаев.

pST-L6IXS остается активной в течение 36 дней in vivo и, очевидно, имеет способность к пролиферации в пределах капсулы (планшет 2), которая может быть удалена для устранения событий, касающихся потребления трансгенного материала. Кроме того, если капсула повреждена (например, в результате тяжелой травмы ткани), то в результате нормальной реакции отторжения хозяин-трансплантант клетки L6 разрушается, предотвращая распространение трансфицированного материала.

Эксперименты на мышах и свиньях продемонстрировали, что pST-L6IXS являются эффективными в изменении уровня pST в плазме, увеличении характеристик роста и потенциально иммунной компетентности животных.

ТАБЛИЦА 2

pST-L6IXS пилотный эксперимент

Свиньи (самцы) получены из свинарника Westmill (Young, NSW)

Эксперимент в EMAI, максимально безопасном свинарнике

АСЕС Ref No: 98/20

				Живой вес (кг)
				Дата
				###	##	###	##	###	###	9/07/98
				День						(забой)	Туша
	Загон	Обработка	Животное	-14	0	7	14	21	28	36	Р2уз (мм)	BF (мм)	ЕМА (см)	BONE (см)	HEART (г)	SPLEEN (г)	LIVER (г)
	А	Контр.	291	24	67	NR	NR	89	95	100	11	9	54.5	24.5	388.6,	159.8	1720.2
С	A	Контр.	292	25	61	NR	NR	84	90	90	8	10	54.9	23.7	381.5	103.2	1703.6
С	В	Контр.	294	22	74	NR	NR	94	103	104	12	15	46.5	24.4.	391.5	173.2	1636.5
С		Контр.	295	22	55	NR	NR	76	84	91	9	7	50,6	20,0	396.6	138.2	1561.8

Т	В	3 п.к. шея*	297	23	67	NR	NR	85	90	91	9	12	45,2	23,5	385,3	177,0	1817,7
										CvTp<0,05
			*Участок, инфицированный капсулой							CvTp<0,05	nsd	nsd	CvTp<0,05	nsd	CvTp<0,05	nsd	nsd

Пример 4: Пилотный эксперимент (2), включающий имплантацию pST-L6IXS свиньям

Второй пилотный эксперимент проводят для того, чтобы оптимизировать доставку pST-L6IXS с помощью капсул так, чтобы достигать ростовые ответы, сходные с перераспределением энергии, наблюдаемым при ежеденевных инъекциях pST.

Как показано в примере 1, секретирующие клетки продуцируют pST со скоростью секреции, находящейся в интервале 6-200 нг/мл. Оказывается, что скорости секреции pST порядка 2-25 нг/мл очевидно являются наиболее стабильными после перенесения стресса (например, в результате бактериального загрязнения) клетками, секретирующими pST (данные не показаны). Соответственно для этого пилотного эксперимента отбирают клоны, секретирующие приблизительно 5 нг/мл (клон pCI/pst-14), и приблизительно 10 нг/мл (клон pCI/pst-12). Самцам свиней (n=10, средний живой вес 78,1 кг) вводят разные количества капсул (полученных в соответствии с методикой, описанной в примере 2) п.к. в основание уха (таблица 3).

Свинья	Число капсул	Клон
204	1	а
216	1	b
230	3	а
202	3	b
226	5	а
206	5	b
208	10	а
224	10	b
222	100	a
228	100	b

a=клон pCI/pst-14 (5 нг/мл)

b=клон pCI/pst-12 (10 нг/мл)

Вес тела регистрируют в начале и в конце эксперимента. Животных держат в индивидуальных загонах (2 м²) и выдерживают при контролируемых условиях окружающей среды (22°С) в течение 1 недели. Животные получают воду по желанию и стандартные гранулированные растительные рационы (3 кг/день в 09:00 часов) и ежедневно регистрируют остатки. В ушные вены помещают катетеры (evc) и через 24 часа начинают сбор образцов. Плазму крови (10 мл) контрольных свиней (pST капсулы отсутствуют) собирают через каждые 30 минут в течение 3 часов. pST капсулы вводят в ухе с той же стороны сразу после взятия серии образцов. Кровь (10 мл) собирают через evc (ежедневно в 11:00 часов) пока катетеры остаются открытыми. Обработанную (через 7 дней после введения капсулы) плазму крови (10 мл) собирают каждые 30 минут в течение 3 часов. Забой и анализ туши проводят приблизительно при 100 кг живого веса спустя 21 день. Затем pST капсулы удаляют из уха и помещают в in vitro культуру (для анализа на pST). В участке внедрения капсулы также оценивают иммунные ответы (напр., инфильтрацию лимфоцитов).

Результаты измерений средней концентрации pST в плазме свиней (3 часа, 30 минутные интервалы) до и через 7 дней после введения pST капсул (секретирующих от 5 до 1000 нг/мл) показаны на фигуре 8. Как очевидно следует из фигуры 8, уровень pST в плазме свиней уменьшается через 1 неделю после введения иммунонейтральных секретирующих pST (5-100 нг/мл) капсул.

Вариабельность между и в пределах отдельных концентраций pST в плазме оказывается более очевидной в течение контрольного периода серийного взятия образцов. Это явление отражено в стандартных ошибках около наблюдаемых средних значений концентраций. Кроме того, стабильная базовая линия и пульсирующие интервалы pST (обычно 3-4 часа) не распознается компьютерными программами, созданными для идентификации пульсации гормонов. Однако стабильные базовые линии и различные пульсации pST наблюдаются у животных через 1 неделю после введения pST капсулы (фигура 9).

Скорость прироста (ROG), показанная животными, является дозозависимым ответом на секрецию pST из капсулы (фигура 10). Скорость секреции, составляющая 30 нг/мл (т.е. 3 капсулы, каждая из которых секретирует 10 нг/мл), является минимальной дозой, требующейся для наблюдения увеличения скорости роста. Большинство evc's остаются открытыми в течение 21 дня, когда животных умерщвляют с помощью барбитурата для анализа туши. Анализ измерений жировых отложений спины туши (Р2 без кожи) дополнительно показывает, что 30 нг/мл является минимальной дозой для наблюдения перераспределения энергии в течение 21 дня после введения pST капсулы (фигура 10).

На протяжении всего эксперимента не было обнаружено неблагоприятных реакций, уменьшения прироста веса или неблагоприятных иммунных ответов, включая животных, которые получали 100 капсул.

Пример 5: Пилотный эксперимент (3), включающий имплантацию pST-L6IXS свиньям

После примера 4 проводят исследования для анализа влияния введения свиньям оптимального соотношения скорость секреции pST/количество капсул в разное время до забоя (т.е. 3а 2, 4 и 6 недель до забоя) на жировые отложения спины. Для каждой обработки использовали 8 свиней, а также 8 контрольных свиней (т.е. у которых pST капсулы отсутствуют).

Результаты измерений скорости прироста предоставлены на фигуре 11.

Измерения жировых отложений спины проводили после полного охлаждения туши (24 часа при 4°С) (фигура 12). Измерения Р2 регистрировали на 12^ом ребре на расстоянии 65 мм от центра позвоночника. Было обнаружено, что свиньи, подвергающиеся воздействию капсул, секретирующих pST, в течение 2, 4 и 6 недель имеют существенно уменьшенные жировые отложения спины. Этот эффект в 2- и 6-недельных периодах составлял приблизительно 46% уменьшение жировых отложений спицы. Ответы животных, подвергающихся воздействию капсул pST IGT в течение 4 недель, были более вариабельными в отношении жировых отложений спины, которые могут иметь отношение к возможным неудачам в отношении удаления капсул из ряда данных животных.

Область мышцы поясницы у свиней, подвергающихся воздействию секретирующих капсул, была значительно увеличена (т.е. на 22%) после 6 недель воздействия pST капсул иммунонейтральной генной терапии (IGT) капсул (фигура 13).

Специалистам в данной области следует понимать, что многочисленные вариации и/или модификации данного изобретения могут быть сделаны, как показано в конкретных воплощениях, без отступления от духа и сферы данного изобретения, как всесторонне описано. Следовательно, воплощения настоящего изобретения следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, но не ограничивающие.

Ссылки:

Basic et al, (1996) Microencapsulation and transplantation of genetically engineered cells: A new approach to somatic gene therapy. Art. Cells, Blood subs. and Immob. Biotech 24(3): 219-255.

Magari et al, (1997) Pharmacological control of humanised gene therapy system implanted into nude mice. J.Clin. invest. 100: 2865-2872.

Schrader et al, (1996) Identification of natural monomeric response elements of the nuclear receptor R2R/ROR. They also bind to COUP-TF homodimers. J.Biol. Chem. 271: 19732-19736.

Claims

1. Капсула для имплантации свинье, где капсула включает полупроницаемую мембрану из альгинат-поли-L-лизин-альгината, инкапсулирующую клетки миобластов крысы (L6), в которые включена экспрессионная кассета, содержащая последовательность, кодирующую секреторный сигнал инсулина, оперативно связанную с гетерологичной последовательностью, которая кодирует соматотропин свиньи.

2. Капсула по п.1, где секреторный сигнал инсулина имеет аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID No:1.

3. Капсула по п.1, где секреторным сигналом инсулина является модифицированный секреторный сигнал инсулина, имеющий одну или более аминокислотных модификаций в аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID No:1, где упомянутые модификации не оказывают неблагоприятного влияния на биологическую активность секреторного сигнала инсулина.

4. Способ введения свинье соматотропина свиньи, где указанный способ включает внутримышечное имплантирование одной или более капсул по п.1 в шею или в основание уха указанной свиньи.