KR20010099687A

KR20010099687A - 돼지 소마토트로핀용 전달시스템

Info

Publication number: KR20010099687A
Application number: KR1020017004624A
Authority: KR
Inventors: 키간미첼; 조네스마크리차드; 무어제프리필립
Original assignee: 피그 리서치 앤드 디벨로프먼트 코포레이션; 월커 존 허버트; 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션; 추후제출; 유니버시티 오브 웨스턴 시드니(네핀)
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-18
Publication date: 2001-11-09
Also published as: CN1325650C; AUPP655698A0; EP1121449A4; US20060062772A1; CA2346799A1; NZ510943A; ID30149A; CN1323348A; WO2000023601A1; EP1121449A1; MXPA01003810A; BR9914547A; JP2002527112A; RU2268940C2; US6967089B1; ZA200102965B

Abstract

외인성 폴리펩티드(예를 들면, 소마토트로핀과 같은 성장호르몬)를 숙주에 전달하는데 유용한 발현구조체가 개시된다. 본 발명의 한 적용에서, 발현구조체는 숙주 내로 이식하기 위하여 반투과성 막으로 캡슐형성된 비숙주 재조합세포 속으로 도입된다. 반투과성 막은 면역감시와 세포거부반응을 저해하여 비숙주, 고발현, 재조합세포가 사용될 수 있도록 한다.

Description

돼지 소마토트로핀용 전달시스템 {DELIVERY SYSTEM FOR PORCINE SOMATOTROPIN}

포유동물에서, 소마토트로핀(somatotropin)(성장호르몬)은 일반적으로 뇌하수체로부터 분비된다. 그러나 돼지에게 소마토트로핀을 외래 투여하면 먹이효율이 15-20% 개선되고, 매일 중량증가가 10-15% 증가하고, 사체지방이 10-20% 감소하고, 무지방 고기함량이 5-10% 증가하고, 먹이섭취량이 감소한다. 불행하게도, 소마토트로핀(190아미노산의 작은 단백질)은 위산과 단백질분해가 되기 쉬워서, 유효하도록 하기기 위해서는 매일 주입을 해줄 필요가 있다. 현재, 복지와 윤리적 문제들이 공기 pST 주입총의 사용을 방해하고 매일 투여하는데 소요되는 비용때문에 전 산업에 걸쳐 받아들여지는 것이 제한된다.

최근 유전자치료가 발전함에 따라 반투과성 알긴산-폴리-L-리신-알긴산(alginate-poly-L-lysine-alginate, 이하 "APA"라 함)막 내에 캡슐형성된 유전자이입세포를 이용함으로써 면역억제치료 및 자가표적세포에대한 의존성을 피하는 전략의 개발이 가능해져 왔다. APA 캡슐환경은 세포생존성과 성장이 양립할 수 있어, 유전자이입세포가 더 긴 기간동안 성장인자를 분비하면서 생존하도록 한다. APA는 작은 단백질에 대해 투과성이고, 그 결과 유전자발현이 외부수단에 의해 제어될 수 있다. APA 장벽은 면역감시와 세포거부반응을 저해하여, 비숙주, 고발현, 세포를 캡슐 속에 적용할 수 있도록 한다. 또한 APA 장벽은 수혜자 숙주 내에서의 유전자이입세포의 제어되지 않은 증식을 방해할 수 있다. APA 캡슐은 유전자도입물질의 소비와 관련된 문제들을 없애기 위하여 제거할 수 있고, 잠재적으로 재사용할 수 있다. 또한 캡슐이 심각한 조직손상에 의해 손상된다면, 정상적인 숙주이식거부반응이 이식된 세포를 파괴할 것이다.

본 발명은 숙주에 외인성 폴리펩티드를 전달하기 위한 발현구조체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 발현구조체를 포함하는 재조합세포와 그 재조합세포를 포함하는 반투과성 캡슐에 관한 것이다.

도 1은 인슐린분비신호 - pST 유전자 구조체,

도 2는 인슐린분비신호 - pST 펩티드 서열,

도 3은 대조구 및 개별적인 pST-L6IXS 처리돼지에 대한 (0일째부터) 중량증가속도,

도 4는 대조구 및 개별적인 pST-L6IXS 처리동물에 대한 %중량증가,

도 5는 대조구 및 개별적인 pST-L6IXS 처리동물에 대한 플라스마, pST 수준,

도 6의 기판 1은 pST-L6IXS 캡슐투여부위의 평가, 기판 2는 생체외 평가용 배지 내의 pST-L6IXS의 배치,

도 7은 숙주동물로부터 제거한 후 24시간 동안 캡슐로부터 분비되는 pST의 생체외 평가,

도 8은 pST 캡슐투여 전(흰 막대) 및 투여 1주일 후(검은 막대)(^*중요)의 (30분간격으로 3시간에 대한) 평균 플라스마 pST,

도 9는 각각 25ng/ml 및 500ng/ml을 분비하는 이식캡슐을 가진 2마리 돼지, 돼지 206과 228의 매일 플라스마 pST 농도,

도 10은 실시예 4에서 생산된 돼지에서의 kg/일 단위의 증가속도(ROG)(검은 사각형)과 P2 등지방측정,

도 11은 pST 분비 또는 대조구 면역중화 유전자치료(IGT) 캡슐로 이식한 후 수컷 돼지의 증가속도(ROG)(±SEM),

도 12는 pST 분비 또는 대조구 면역중화 유전자치료(IGT) 캡슐로 이식한 후 수컷 돼지의 등지방(P2)(±SEM),

도 13은 pST 분비 또는 대조구 면역중화 유전자치료(IGT) 캡슐로 이식한 후 수컷 돼지의 요부(눈) 근육부위(±SEM).

본 발명자들은 인슐린분비신호를 이종 유전자서열과 연결시킨 후 그 유전자서열을 숙주세포 속으로 도입하면 이종 유전자산물의 분비수준이 놀랄만큼 증가한다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 숙주속으로 이식하기 위하여 재조합세포를 캡슐형성하는 것을 포함하여 개선된 유전자 전달시스템의 발전을 가져왔다.

따라서, 제1측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 이종서열과 작동가능하게 결합된 인슐린분비신호를 암호화하는 서열을 포함하는 발현카세트를 제공한다.

"이종서열"은 인슐린을 암호화하는 서열이 아닌 서열을 의미한다.

"작동가능하게 결합된"은 인슐린분비신호가 이종 암호화서열과 근접하여 리딩 프레임 내에 있다는 것을 의미한다.

바람직한 인슐린분비서열은 SEQ ID NO:1로 나타낸 아미노산서열을 가지는 인슐린분비신호이다. 그러나, 신호의 생물학적 활성에 나쁜 영향을 미치지 않으면서 그 분비신호에 많은 변형을 가할 수 있다는 것을 당업자는 잘 알 것이다. 예를 들어, 황산화, 인산화, 질산화 및 할로겐화와 같은 다양한 변화; 또는 그러한 변화가 분비신호의 총 생물학적 활성에 나쁜 영향을 미치지 않는, 펩티드서열 내의 보존적 또는 비보존적{예를 들면, D-아미노산, 디스아미노산(desamino acid)} 아미노산삽입, 결실 및 치환에 의하여 달성될 수 있다. 따라서 상기 방법 중 하나 이상으로 변형된 인슐린분비신호를 발현카세트 내에 포함시키는 것은 본 발명에 포함되는 것으로 생각된다.

이종서열은 관심있는, 인슐린 외의 임의의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 이종서열은 호르몬, 사이토카인, 수용체 작용제 또는 길항제, 페로몬 또는 효소를 암호화할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이종서열은 성장호르몬을 암호화한다. 바람직하게는 성장호르몬은 소마토트로핀이다.

제2측면에서, 본 발명은 제1측면의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 발현카세트를 세포속으로 도입하기 위한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 적합한 벡터에는 바이러스 벡터와 박테리아 플라스미드가 포함된다.

본 발명의 제1측면의 발현카세트, 또는 제2측면의 벡터는 유전자발현을 조절하는 하나 이상의 요소를 더 포함할 수 있다. 적합한 조절요소의 예에는 (인용에 의해 본 명세서에 전체내용이 삽입된 Schrader et al, 1996에 개시된 바와 같은)멜라토닌반응요소(Melatonin Response Element, MRE) 및/또는 (인용에 의해 본 명세서에 전체내용이 삽입된 Magari et al, 1997에 개시된 바와 같은) 라파마이신매개 전사인자가 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 조절인자는 관심있는 폴리펩티드의 박동성 발현을 가능하게 한다.

제3측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1측면에 따른 발현카세트를 포함하는 재조합세포를 제공한다.

재조합세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 재조합세포는 포유동물세포이다. 더 바람직한 실시형태에서, 세포는 래트 미오블라스트(rat myoblast)(L6)세포이다.

제4측면에서, 본 발명은 폴리펩티드의 발현과 분비가 가능하고 폴리펩티드를 선택적으로 분리하는 조건 하에서 제3측면의 재조합세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 재조합세포는 숙주 속으로 전달 또는 이식하기 위하여 반투과성 매트릭스 내에 캡슐형성될 수 있다.

따라서, 제5측면에서, 본 발명은 숙주 내에 이식하기 위한 캡슐을 제공하고, 캡슐은 본 발명의 제3측면에 따른 하나 이상의 재조합세포를 캡슐형성하는 반투과성 막을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 반투과성 막은 알긴산-폴리-L-리신-알긴산(APA) 막이다. APA 반투과성 막의 제조는 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 삽입된 베이직 등(Basic et al, 1996)에 개시되어 있다.

제6측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1측면에 따른 발현카세트를 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 숙주에 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다.

제7측면에서, 본 발명은 본 발명의 제5측면에 따른 캡슐을 숙주 내로 이식하는 단계를 포함하는 숙주에 폴리펩티드를 투여하는 방법을 제공한다.

숙주는 임의의 동물 또는 사람일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 숙주는 가축이다. 더 바람직한 실시형태에서, 숙주는 방목소, 사육소, 젖소, 돼지 및 가금으로 구성된 그룹에서 선택된다.

본 발명이 유전물질을 숙주에 전달하기 위한 개선된 시스템을 제공한다는 것은 당업자들이 잘 알 것이다. 인슐린분비신호를 생물학적 활성 폴리펩티드에 연결하면 재조합세포로부터 폴리펩티드의 분비가 증가된다. 분비된 후, 분비신호는 생물학적 활성 폴리펩티드만 남기면서 절단될 수 있다. 재조합세포는, 반투과성 막내에 캡슐형성된 경우, 상당량의 생물학적 활성 폴리펩티드를 분비하는 능력을 가지고, 반투과성 막은 외부수단에 의해 유전자발현의 제어를 가능하게 한다. 캡슐형성된 재조합세포의 이식은 이식에 최소의 수술만이 필요하다는 잇점을 제공한다. 또한 반투과성 막은 비숙주세포가 캡슐 내에 적용될 수 있다는 것을 의미하는 면역감시와 세포거부반응을 감소시킨다.

바람직한 실시형태에서, 반투과성 막은 영속적이며 세포성장을 제한함으로써 수혜자숙주 내에서의 제어되지 않는 증식을 방해할 수 있다는 장점을 제공한다. 캡슐은 제거되어 재사용될 수 있다는 다른 잇점을 제공한다.

본 발명의 특성이 보다 명확하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 하기의 비제한적 실시예와 도면을 참조하여 그 바람직한 형태를 설명할 것이다.

실시예 1 : ISS-pST 구조체의 클로닝

pST 유전자는 서던 크로스 바이오테크놀로지 전매회사(Southern Cross Biotechnology Pty Ltd)로부터 대장균 내에서 얻었다. pST 유전자를 포함하는 플라스미드인 pMG939는 표준플라스미드제조기술을 사용하여 박테리아로부터 분리하였다. PCR 프라이머는 pST 유전자를 증폭시키고, 연결이 될 수 있도록XhoI 부위를 5' 말단에 첨가하고XbaI 부위를 3'말단에 첨가하도록 디자인하였다.

변형된 pST 유전자 서열을 프레프로인슐린 cDNA에서 유래된 분비신호서열(ISS)과 연결하였다.NheI(GCTAGC)와XbaI(TCTAGA)제한위치는 pCI-네오 플라스미드(Promega) 속에 삽입할 수 있도록, 각각 ISS 개시코돈의 앞과 pST의 3' 종결코돈 뒤에 구성하였다. 그 다음에 pST 융합구조체를 분리하고 암호화영역을 증명하기 위하여 서열확인하였다(도 1).

L6세포를 트립신으로 처리하고 2시간 후, LipoTAXI(Stratagene)으로 래트 미오블라스트(L6)세포의 유전자이입(세포 속으로 pST 유전자삽입)을 행하였다. pST 유전자이입된 L6세포 클론을 배지에서 유지하고 G418로 선택하여, >10⁷세포를 생성하였다. 배지상등액의 분획(2ml)을 -20℃에서 저장한 후 시드니대학(Camden)에서 윈(P. Wynn)박사가 정립한 pST 방사선면역분석(RIA)에서 pST농도를 평가하였다. RIA감도는 대략 12.4%의 CV로 > 0.4ng/ml가 된다고 생각되었다. 폴리클로날 항혈청을 pST 펩티드항원을 가진 기니안 피그에서 증량시켰다. RIA 결과(표 1)는 pST 유전자 구조체가 돼지 뇌하수체로부터 정제된 천연형태의 pST에 대해 증량된 폴리클로날 항혈청에 의해 인식되는 단백질(도 2)을 생산하였다는 것을 나타낸다. L6 클론 pCI/pst-1..5를 하기에서 설명한 바와 같은 변형된 유전자이입기술로 생성하였다.

변형된 유전자이입 프로토콜

특징적으로, L6세포는 배양기판에 부착하고 통과세포에 트립신으로 탈착할 필요가 있다; 유전자이입은 24시간 후에 정해진 순서로 행해진다. 이 절차에서 6-18ng/ml로 pST를 분비하는 L6 세포 클론(n=10)이 얻어진다. 트립신처리 2시간 후 L6 세포에 LipoTAXI(Promega)와 ISS/pST 플라스미드를 적용하면 pST의 분비속도가 10-20배(> 180ng/ml, n=5 클론) 증가하였다. 이러한 더 높은 pST 분비속도는 성장을 증진시키는데 필요한 세포(캡슐)의 수를 감소시킨다.

ISS-pST로 유전자이입된 각 클론에 대한 농도(ng/ml)

L6클론	pST(ng/ml)
pCI/pst-1^*	182
pCI/pst-2^*	188
pCI/pst-3^*	188
pCI/pst-4^*	140
pCI/pst-5^*	200
pCI/pst-6	17
pCI/pst-7	12
pCI/pst-8	8
pCI/pst-9	9
pCI/pst-10	7
pCI/pst-11	7
pCI/pst-12	10
pCI/pst-13	8
pCI/pst-14	6
pCI/pst-15	18

실시예 2 : 돼지의 소마토트로핀-래트 미오블라스트(L6) 면역중화발현시스템(pST-L6IXS)의 제조

베이직 등(Basic et al, 1996)에 개시된 캡슐형성절차를 다음과 같이 변형시켰다.

실온에서 세포의 캡슐형성은 알긴산(1.5w/v%)방울을 교질화시키기 위하여 염화칼슘(또는 락테이트)[100mM]을 사용한 후 즉시 식염수(0.9% NaCl)로 세척하고, 폴리-L-리신[0.05%]에 5분간 재현탁시켰다. 37℃에서 10분간 염화칼슘 교차결합시켜 세포 생존성과 더 양립할 수 있는 알긴산 매트릭스를 얻었다.

폴리-L-리신코팅과 식염수세척 후 다른 알긴산층을 첨가한다. 실온에서 4분간 시트르산 나트륨[55mM]처리하여 추가 조작의 어려움을 증가시키는 점도까지 캡슐을 부드럽게 한다. 세포생존성은 시트르산 나트륨에 4분간 노출로 <35%로 명백히 감소하였다. 시트르산 나트륨처리 전에 캡슐을 세포 여과기 내에 위치시키면 37℃에서 1분간 노출로 세포생존성을 >98%로 개선할 수 있었다.

캡슐형성 프로토콜에 대한 절차적 및 장치변형은 세포 생존성을 대략 64%의 통상적으로 증가시키면서 캡슐형성의 유효성(시간 및 공급원)을 개선하였다.

실시예 3 : 돼지 내 pST-L6IXS의 이식을 포함하는 예비실험(1)

성장하는 마우스에 투여된 pST-L6IXS로 얻어진 예비결과는 증진된 성장특성을 나타낸다. 수컷 돼지(n=9, 평균생체중량 61kg)를 사용한 예비실험에서, 다양한 수의 pST-L6IXS를 다른 부위{0일째 개별적인 동물의, 3캡슐은 목근육 내의 근육내 주사(i.m), 3캡슐은 목내에 피하주사(s.c.), 10캡슐은 귀의 기저부에서 피하주사., 20캡슐은 목 내에 근육내 주사 또는 29캡슐은 목 내에 근육내 주사}. 혈액시료(10ml)는 경정맥 구멍을 통해 모았고, P2 초음파(us)측정은 투여 후 -14, 0, 7, 14, 21, 28 및 36일에 기록하였다. 실험 전과정에서, pST-L6IXS 투여부위를 조직반응에 대해 조사하였다. 36일째, 동물을 안락사시켜 사체분석[등지방깊이, BF(mm); 눈근육부위, EMA(cm); 앞발뼈길이, BONE(cm); 심장중량 HEART(gm); 비장중량, SPLEEN(gm) 및 간중량 LIVER(gm)]을 기록하고(표 2 참조), pST-L6IXS를 회수하였다. 도 3는 대조구(con, 평균±SE, n=4)와 pST-L6IXS 처리된 돼지에 대한 개별값에 대한 (0일째부터) 증가속도를 나타낸다. pST-L6IXS 처리에 대한 %중량증가는 대조구(con) 돼지와 개별 pST-L6IXS 처리동물에 대한 평균±SE로 도 4에 나타낸다. 플라스마 pST(ng/ml)를 방사선면역분석(RIA)으로 결정하여, 평균±SE 대조구(con)와 pST-L6IXS 처리돼지에 대한 개별적인 농도로 도 5에 나타내었다. 도축시, pST-L6IXS 캡슐투여부위를 평가한(도 6, 기판 1, 화살표) 후 제거하여 pST의 24시간 분비의 생체외평가(도 6, 기판 2)를 위한 배양액에 위치시켰다(도 6). 36일째 근육내 주사(i.m.) 또는 피하주사(s.c.)에서 명백한 조직손상이나 면역반응은 관찰되지 않았다. 그러나, 귀(피하주사) 속에 위치한 캡슐은 고도로 혈과화된 것으로 나타났고 100% 회수가능하였다. 목부위에 위치한 캡슐은 <10% 회수할 수 있었다.

pST-L6IXS는 생체 내에서 36일 이상 명백히 남아있었고, 유전자도입물질의 소비에 관한 문제점을 없애기 위하여 제거될 수 있는 캡슐(기판 2) 내에서 증식하는 것으로 나타났다. 또한, 캡슐이 손상된다면(즉, 심각한 조직손상에 의해), 정상적인 숙주이식거부반응은 유전자이입된 물질의 증식을 방해하는 L6세포를 파괴한다. 쥐와 돼지에서의 실험은 pST-L6IXS가 플라스마 pST를 변화시키고, 동물의 강력한 면역 경쟁성과 성장특성을 증진시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.

실시예 4: 돼지 내 pST-L6IXS의 이식을 포함하는 예비실험(2)

제2예비실험은 매일 pST 주사로 관찰된 에너지재분배와 유사한 성장반응을 이루기 위하여 캡슐에 의한 pST-L6IXS전달을 최적화하기 위하여 행하였다.

실시예 1에서 본 바와 같이, pST분비세포는 6-200ng/ml의 분비속도로 생산되었다. 대략 2-25ng/ml의 pST 분비속도는 pST 분비세포에 대한 스트레스를 부과한(즉, 박테리아 감염에 의한) 후에 가장 안정한 것으로 나타난다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 이 예비실험을 위하여 약 5ng/ml(클론 pCI/pst-14) 및 약 10ng/ml(pCI/pst-12)를 분비하는 클론을 선택하였다. 수컷 돼지(n=10, 평균생체중량 78.1kg)에 귀의 기저부에서 피하주사로 다양한 수의 캡슐(실시예 2에서 설명된 방법에 따라 생산됨)을 투여하였다(표 3).

돼지	캡슐수	클론
204	1	a
216	1	b
230	3	a
202	3	b
226	5	a
206	5	b
208	10	a
224	10	b
222	100	a
228	100	b

a = 클론 pCI/pst-14 (5ng/ml)

b = 클론 pCI/pst-12 (10ng/ml)

실험의 시작과 끝에서 체중을 기록하였다. 동물들은 개별우리(2㎡)에 넣고 1주일동안 제어된 환경시설(22℃)에서 안정화시켰다. 동물들에게 무제한 물과 표준펠렛사육자 사료(9시에 3kg/일)를 주고, 매일 잔여량을 기록하였다. 귀 정맥(evc) 내에 카테터를 위치시키고 24시간 후 시료채취를 시작하였다. 대조구 돼지(즉, 무 pST 캡슐) 플라스마(10ml)를 3시간 동안 매 30분마다 모았다. 연속적인 시료채취 후 즉시 동측 귀에 pST 캡슐을 투여하였다. 카테터가 명백하게 남아있는 동안 evc를 통해 혈액(10ml)을 모았다(11시에 매일). 처리(pST 캡슐 투여 7일 후) 혈액 플라스마(10ml)를 3시간 동안 매 30분마다 모았다. 21일 후 약 100kg 생체중량에서 도축 및 사체분석을 하였다. 그 다음에 pST 캡슐을 귀에서 회수하고 (pST분석을 위하여) 시험관 내 배양액에 넣었다. 캡슐부위는 면역반응(즉, 림프구 침투)에 대해서도 평가하였다.

pST 캡슐을 받기 전 및 받은 후 7일의 평균(3시간, 30분 간격) 플라스마 pST농도의 측정결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 플라스마 pST는 면역중화 pST(5-100 ng/ml) 분비 캡슐에 1주일 노출한 후 돼지에서 감소하는 것이 명백하다.

개별 플라스마 농도간 및 상기 농도 내의 다양성은 대조구 일련 시료채취기간동안 보다 명백한 것으로 나타났다. 이러한 현상은 평균측정농도에 대한 표준오차로 반영된다. 또한, 안정한 기본선과 pST 펄스 간격(일반적으로 3-4시간)은 호르몬펄스를 확인하도록 디자인된 컴퓨터 프로그램에 의해 확인되지 않았다. 그러나 안정한 기본선과 다른 pST 펄스는 pST 캡슐투여 1주일 후의 동물에서 관찰되었다(도 9).

동물들이 나타내는 증가속도(ROG)는 투여량의존방식으로, pST 캡슐분비에 반응하는 것으로 나타났다(도 10). 30ng/ml의 분비속도(즉, 각각 10ng/ml를 분비하는 3캡슐)는 성장속도증가를 관찰하는데 필요한 최소투여량으로 보인다. 대부분의 evc는 사체분석을 위하여 바르비투르산염으로 동물들을 안락사시킨 때로부터 21일동안 명백히 남아있었다. 사체 등지방(피부없는 P2)측정의 분석은 30ng/ml가 pST 캡슐투여의 21일 내에 에너지재분배를 관찰하기 위한 최소투여량이라는 것을 또한 나타낸다(도 10).

실험 전체에서, 100캡슐을 받은 동물들을 포함하는, 불리한 반응, 중량증가에서의 감소 또는 불리한 면역반응의 징후는 없었다.

실시예 5 : 돼지 내 pST-L6IXS의 이식을 포함하는 예비실험(3)

실시예 4 후에, 등지방에 대한 도축 전 다양한 시간(즉, 도축전 2, 4 및 6주)에서 돼지에 대한 투여 최적 pST 분비속도/캡슐수의 효과를 평가하기 위하여 조사를 하였다. 각 처리에 대해 8마리의 대조구(즉, 무 pST 캡슐)와 8마리의 돼지를 사용하였다.

증가속도측정의 결과를 도 11에 제공한다.

등지방측정은 전체 사체냉각(4℃에서 24시간)한 후 얻었다(도 12). P2 측정은 척주의 중심에서 12번째 갈비뼈 65mm에서 기록하였다. 2, 4 및 6주 동안 pST를 분비하는 캡슐에 노출된 돼지는 등지방이 상당히 감소된 것으로 관찰되었다. 2 및 6주에서의 이러한 효과는 대략 등지방에서 46%의 감소이다. 4주동안 pST IGT 캡슐에 노출된 동물은 그들이 등지방반응이 더 다양하였는데, 이는 많은 이 동물들로부터 모든 캡슐을 회수할 수 없는 것과 관련될 수 있다.

분비캡슐에 노출된 돼지에서 요부근육부위는 pST IGT 캡슐에 6주 노출된 후에만 상당히 증가하였다(즉 22%)(도 13).

넓게 설명된 바와 같은 본 발명의 정신이나 범위로부터 벗어나지 않는 특정 실시형태로 나타낸 바와 같이 본 발명에 대해 많은 변형이 있을 수 있다는 것은 당업자가 잘 알 것이다. 따라서 본 실시형태는 모든 면에서 설명적인 것으로 제한적인 것이 아니라고 간주된다.

참고문헌

Basic et al, (1996) Microencapsulation and transplantation of genetically engineered cells; A new approach to somatic gene therapy. Art. Cells, Blood subs. and Immob. Biotech 24(3): 219-255.

Magari et al, (1997) Pharmacological control of humanised gene therapy system implanted into nude mice. J. Clin. Invest. 100: 2865-2872.

Schrader et al, (1996) Identification of natural monomeric response elements of the nuclear receptor R2R/ROR. They also bind to COUP-TF homodimers. J. Biol. Chem. 271: 19732-19736.

Claims

폴리펩티드를 암호화하는 이종서열에 작동가능하게 결합된 인슐린분비신호를 암호화하는 서열을 포함하는 발현카세트.
제1항에 있어서,

상기 인슐린 분비신호는 SEQ ID NO:1으로 나타낸 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
제1항에 있어서,

상기 인슐린분비신호는 SEQ ID NO:1으로 나타낸 아미노산서열을 가지는 인슐린분비신호와 실질적으로 동일한 총 생물학적 활성을 가지는 변형된 인슐린분비신호인 것을 특징으로 하는 발현카세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 이종서열은 호르몬, 사이토카인, 수용체 작용제, 수용체 길항제, 페로몬 및 효소로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
제4항에 있어서,

상기 폴리펩티드는 성장호르몬인 것을 특징으로 하는 발현카세트
제5항에 있어서,

상기 폴리펩티드는 소마토트로핀인 것을 특징으로 하는 발현카세트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현카세트는,

상기 이종서열의 박동성 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현카세트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 발현카세트를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 발현벡터를 포함하는 재조합세포.
제9항에 있어서,

상기 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 재조합세포.
제10항에 있어서,

상기 세포는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 재조합세포.
제11항에 있어서,

상기 세포는 래트 미오블라스트(L6)세포인 것을 특징으로 하는 재조합세포.
폴리펩티드의 발현과 분비를 가능하게 하고 상기 폴리펩티드를 선택적으로 분리하는 조건 하에서 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합세포를 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생산방법.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 재조합세포를 캡슐형성하는 반투과성 막을 포함하는, 숙주 내에 이식하기 위한 캡슐.
제14항에 있어서,

상기 반투과성 막은 알긴산-폴리-L-리신-알긴산(APA)막인 것을 특징으로 하는 캡슐.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 발현카세트를 숙주에 투여하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 숙주에 투여하는 방법.
제14항 또는 제15항에 따른 캡슐을 숙주 내로 이식하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 숙주에 투여하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서,

상기 숙주는 동물 또는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서,

상기 숙주는 가축인 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,

상기 가축은 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
재조합세포를 캡슐형성하는 반투과성 막을 포함하는 캡슐을 돼지 속에 이식하는 단계를 포함하고,

상기 재조합세포는 소마토트로핀을 암호화하는 이종서열에 작동가능하게 연결된 인슐린분비신호를 암호화하는 서열을 포함하는 발현카세트를 포함하고 발현하며,

상기 막은 발현된 소마토트로핀에 대해 투과성인 것을 특징으로 하는, 돼지에 소마토트로핀을 투여하는 방법.
제21항에 있어서,

상기 인슐린분비신호는 SEQ ID NO:1으로 나타낸 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서,

상기 인슐린분비신호는 SEQ ID NO:1으로 나타낸 아미노산서열을 가지는 인슐린분비신호와 실질적으로 동일한 총 생물학적 활성을 가지는 변형된 인슐린분비신호인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항 내지 제23항에 있어서,

상기 재조합세포는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서,

상기 포유동물세포는 래트 미오블라스트(L6) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 반투과성 막은 알긴산-폴리-L-리신-알긴산(APA)막인 것을 특징으로 하는 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 돼지는 30ng/ml 이상의 소마토트로핀을 분비하기에 충분한 하나 이상의 캡슐로 이식된 것을 특징으로 하는 방법.