JP2006042684A - 神経突起伸長促進ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】次のアミノ酸配列を少なくとも保持し12〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド;Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp(XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。)、次のアミノ酸配列を少なくとも保持し39〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド;Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys、これらのポリペプチドに他のポリペプチドが結合した融合ポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、及びこれらのポリペプチドを有効成分とする神経突起伸展促進剤。
【選択図】 なし
Description
CS:コンドロイチン硫酸(chondroitin sulfate)
EGF:上皮成長因子(epidermal growth factor)
GABA:γ−アミノ酪酸(γ-aminobutyric acid)
GST:グルタチオン S−トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase)
IPTG:イソプロピルチオガラクトシド(isopropylthiogalactoside)
LB培地:ルリア-ベルターニ培地 (Luria-Bertani's medium)
MAP2:微小管関連タンパク質2(microtubule-associated protein 2)
NGC:ニューログリカンC(neuroglycan C)
PBS:リン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline)
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction)
tau:τタンパク質(tau protein)
TM:膜貫通
ラットNGC:ラット由来のNGC
ヒトNGC:ヒト由来のNGC
NGCは、脳に特異的なCSプロテオグリカンである。既にラット、ヒト及びマウスにおいてそのクローニングがなされており、「AAドメイン」、「EGF様ドメイン」、「膜貫通ドメイン(TMドメイン)」等のドメイン構造が見出されている(非特許文献1、2、3)。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。)
本発明ポリペプチド1は、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。また本発明ポリペプチド1は、配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるものも好ましい。また本発明ポリペプチドは、配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるものも好ましい。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
本発明ポリペプチド2は、配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
以下、本発明ポリペプチド1及び2を併せて「本発明ポリペプチド」という。
<1>本発明ポリペプチド
(1)本発明ポリペプチド1
本発明ポリペプチド1は、下記のアミノ酸配列(配列番号1)を少なくとも保持し、かつ、12〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチドである。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。)
上記のアミノ酸配列(配列番号1)は、NGCの「AAドメイン」に相当する部分のアミノ酸配列である。そして本発明ポリペプチドは、このアミノ酸配列を少なくとも保持しており、かつ、12〜400アミノ酸残基から構成されている限りにおいて、他のアミノ酸配列を保持していてもよい。
(2)本発明ポリペプチド2
本発明ポリペプチド2は、下記のアミノ酸配列(配列番号5)を少なくとも保持し、かつ、39〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチドである。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
上記のアミノ酸配列(配列番号5)は、NGCの「EGFドメイン」に相当する部分のアミノ酸配列である。そして本発明ポリペプチドは、このアミノ酸配列を少なくとも保持しており、かつ、39〜400アミノ酸残基から構成されている限りにおいて、他のアミノ酸配列を保持していてもよい。
<2>本発明融合ポリペプチド
本発明融合ポリペプチドは、本発明ポリペプチドに、他のポリペプチドが結合していることを特徴とする融合ポリペプチドである。
<3>本発明核酸
本発明核酸は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドをコードする核酸である。本発明核酸の種類は、DNAであってもRNAであっても良いが、その安定性の観点からはDNAであることが好ましい。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。)
そして、これをコードする核酸(DNA)としては、例えば、配列番号8における塩基番号847〜882で示される塩基配列からなるDNA及び配列番号10における塩基番号823〜858で示される塩基配列からなるDNAが例示される。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys
そして、これをコードする核酸(DNA)としては、例えば、配列番号8における塩基番号1147〜1263で示される塩基配列からなるDNAが例示される。
・配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド:配列番号8における塩基番号103〜1290で示される塩基配列からなるDNA。
・配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド:配列番号8における塩基番号784〜1020で示される塩基配列からなるDNA。
・配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド:配列番号8における塩基番号784〜1290で示される塩基配列からなるDNA。
・配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド:配列番号8における塩基番号1030〜1290で示される塩基配列からなるDNA。
<4>本発明促進剤
本発明促進剤は、本発明ポリペプチド又は本発明融合ポリペプチドを有効成分とする神経突起伸展促進剤である。本発明ポリペプチドや本発明融合ポリペプチドは神経突起伸展促進作用を有することから、これを本発明促進剤として応用したものである。
<実施例1> 本発明ポリペプチドの製造
ラットNGCのコアタンパク質のアミノ酸配列をベースとして、以下のポリペプチドを製造した。NGCコアタンパク質のドメイン構造と、それぞれのポリペプチドとの位置的な対応関係を図1に示す。
(1)AAドメイン部分を保持するポリペプチド(本発明ポリペプチド)
・NGCect(配列番号2)(配列番号9におけるアミノ酸番号31〜426に相当;EGFドメインも保持している)
・NGCAA(配列番号3)(配列番号9におけるアミノ酸番号258〜336に相当)
・NGCAE(配列番号4)(配列番号9におけるアミノ酸番号258〜426に相当;EGFドメインも保持している)
(2)EGFドメイン部分を保持するポリペプチド(本発明ポリペプチド)
・NGCEGF(配列番号6)(配列番号9におけるアミノ酸番号340〜426に相当)
(3)AA及びEGFドメイン部分のいずれをも保持しないペプチド
・NGCCS(配列番号7)(配列番号9におけるアミノ酸番号33〜259に相当)
これらのポリペプチドをコードする以下の塩基配列を保持するcDNA断片を、各々ベクター(pGEX-4T1;アマシャムバイオサイエンス社製)に組み込んだ。このベクターにはGSTをコードする配列が保持されており、GSTが前記ポリペプチドのN末端側に結合した形でポリペプチド(前記ポリペプチドとGSTとの融合ポリペプチド)が発現されるよう、cDNAの組込みを行った。
・NGCect:配列番号8における塩基番号103〜1290で示される塩基配列
・NGCAA:配列番号8における塩基番号784〜1020で示される塩基配列
・NGCAE:配列番号8における塩基番号784〜1290で示される塩基配列
・NGCEGF:配列番号8における塩基番号1030〜1290で示される塩基配列
・NGCCS:配列番号8における塩基番号109〜789で示される塩基配列
cDNAが組み込まれたベクターを大腸菌(BL21)に導入し、その大腸菌を、アンピシリン存在下でLB培地を用いて、600 nm の吸光度が 0.6 以上になるまで37℃で培養した。その後、IPTGを終濃度 1 mM になるように加え、30℃でさらに4時間培養することによってポリペプチドを発現させた。菌体を回収してBugBuster protein Extraction Reagent(Novagen社製)で可溶化した後、グルタチオン−セファロース4B(glutathione-Sepharose 4B;アマシャムバイオサイエンス株式会社製)カラムを用いて精製し、前記の各ポリペプチドを得た。
<実施例2> 神経突起伸長促進活性の測定
(1)NGCectを用いた試験
胎生16日目のWistarラット大脳皮質からニューロン(E16)を採取し、これをポリ−L−リジンでコートした24ウエルのプレートに播接した(1 x 104個/ウエル、1ウエル=500μl)。播種の1時間後にPBS(25μl)、GST(20μg/ml;NGCectと等モル量)又はNGCect (50μg/ml)を添加して37℃で24時間インキュベートした。その後、ショ糖を含有する3%パラホルムアルデヒド溶液を用いて一晩固定した。
(2)各種ポリペプチドを用いた試験
上記(1)のサンプルに加え、NGCEGF(27μg/ml)、NGCCS(38μg/ml)、NGCAA(26μg/ml)及びNGCAE(33μg/ml)を用いて、上記(1)と同様に試験した。上記(a)についての結果を図5に、上記(b)についての結果を図6にそれぞれ示す。なお図中の「G」、「ect」、「EGF」、「cs」、「AA」及び「AE」は、それぞれGST、NGCect、NGCEGF、NGCCS、NGCAA及びNGCAEを用いた結果を示す。また「**」はp<0.01で、「***」はp<0.001でそれぞれ有意差があることを示す。また「n.s.」は有意差がないことを示す。
図5及び図6から、NGCectのみならず、NGCEGF、NGCAA及びNGCAEにも神経突起伸長促進活性が認められた。しかし、AA及びEGFドメイン部分のいずれをも保持しない
NGCCSにおいては、この活性は認められなかった。
(3)伸長した神経突起の数の解析
上記(2)において、最も長い神経突起の長さがニューロンの細胞体の直径の3倍以上であるとされた細胞について、一つの細胞体から出ている神経突起の数を測定した。測定は、1ウエルあたり任意の10視野を選択し、4ウエル分(計40視野)について行った。ヒストグラムとして表した結果を図7に示す。
(4)ポリペプチドの濃度による影響
サンプルとしてNGCEGFのみを用い、その濃度を変えて前記(2)と同様に試験した。前記(a)及び(b)についての結果をまとめて図8に示す。図8中の白丸は前記(a)についての結果を(単位:%)、黒丸は前記(b)についての結果を(単位:μm)それぞれ示す。
(5)GABA陽性ニューロンに対する活性
24ウエルプレートのウエルにポリ−L−リジンでコートした直径13mmのカバーガラスを沈める点以外は、前記(2)と同様に試験した。ただしサンプルはGST、NGCect、NGCEGF、NGCCS、NGCAA及びPBSとした。また、インキュベート後の細胞は3%パラホルムアルデヒド、0.1%グルタールアルデヒド及び1%ショ糖を含有するPBS溶液を用いて1時間固定し、固定後にモノクローナル抗MAP2抗体(BDバイオサイエンスファーミンジェン社製)及びポリクローナル抗GABA抗体(シグマ社製)で細胞を処理した(MAP2は樹状突起の分子マーカーであり、抗MAP2抗体によってニューロン全体が染色される)。モノクローナル抗体は、ビオチン化抗マウスIgG抗体(ベクター社製)を反応させた後、アレキサフルオル488で標識したストレプトアビジン(モレキュラープローブス社製)を用いて、またポリクローナル抗体は Cy3 で標識した抗ウサギIgG (H + L) 抗体(ジャクソンイムノリサーチラボ製)を用いて検出した。
(6)伸長した神経突起の性質
サンプルとしてNGCectを用い、抗GABA抗体に代えてポリクローナル抗tau抗体(シグマ社製)を用いた以外は、上記(5)と同様に試験した。tauは軸索の分子マーカーである。
Claims (10)
- 下記のアミノ酸配列(配列番号1)を少なくとも保持し、かつ、12〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド。
Asp Asp Leu Xaa Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp
(XaaはGlu残基又はAsp残基を示す。) - 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号3に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号4に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
- 下記のアミノ酸配列(配列番号5)を少なくとも保持し、かつ、39〜400アミノ酸残基からなることを特徴とするポリペプチド。
Cys Asp Leu Phe Pro Ser Tyr Cys His Asn Gly Gly Gln Cys Tyr Leu Val Glu Asn Ile Gly Ala Phe Cys Arg Cys Asn Thr Gln Asp Tyr Ile Trp His Lys Gly Met Arg Cys - 配列番号6に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項5に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドに、他のポリペプチドが結合していることを特徴とする、融合ポリペプチド。
- 他のポリペプチドが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼである、請求項7に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分とする、神経突起伸展促進剤。
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JPN6010019106, Neuroscience Research, 1998, Vol.32, p.313−322 * |
JPN6010019109, 生化学, 2002, Vol.74, No.11, p.1380 * |
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