JP7220941B1 - プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)クエン酸含有エタノール溶液が、1質量%以上30質量%以下のクエン酸を含む(1)に記載の製造方法。
(3)軟骨成分混合物が、固形分換算で30質量%以上のプロテオグリカンを含有する(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)軟骨成分混合物が、固形分換算で少なくとも20質量%の水溶性コラーゲンを含有する(1)~(3)のいずれか一項に記載の製造方法。
(5)プロテオグリカンの分子量が80万~90万である(1)~(4)のいずれか一項に記載の製造方法。
(6)軟骨を、0.03質量%以上4質量%未満の酢酸水溶液中に浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する工程とを含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
(7)酢酸水溶液の濃度が0.5質量%以上3質量%以下である(6)に記載の製造方法。
(8)軟骨成分混合物が、コラーゲンを含み、コラーゲンの含有率が、固形分換算で少なくとも20質量%である(6)又は(7)に記載の製造方法。
(9)プロテオグリカンの分子量が40万~65万である(6)~(8)のいずれか一項に記載の製造方法。
(10)軟骨を0.01質量%以上0.05質量%未満のクエン酸水溶液中に、30~80℃で浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、この抽出液から軟骨成分を回収する工程と、を含むプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
(11)プロテオグリカンの分子量が50万~90万である(10)に記載の製造方法。
(12)軟骨が、サケ頭部の鼻軟骨である(1)~(11)のいずれか一項に記載の製造方法。
(13)軟骨を、pH2.0~4.0の水又は水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る工程と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する工程とを含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。
本発明の製造方法により得られる生産物は、プロテオグリカンと共に、その他の軟骨成分を含む混合物である。このプロテオグリカン以外の軟骨成分としては、コラーゲン及びヒアルロン酸を含むがこれらに限定されない。軟骨とは、脊椎動物の鼻、肋骨、関節、気管の周囲、耳殻、椎間板などに存在する結合組織の1つであり、細胞外基質と、軟骨細胞との複合体をいう。軟骨における細胞外基質を、軟骨基質という場合もある。軟骨基質の主成分は、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びプロテオグリカンなどを含む。
本発明の第1の実施形態に係るプロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法は、水に溶けにくい成分を効率的に抽出して可溶性成分とすることができる製造方法である。図1は、この製造方法の典型的な実施形態を示す工程図である。第1の実施形態に係る方法は、冷凍軟骨を凍結乾燥及び粉砕する凍結乾燥・粉砕工程(S01)と、得られた粉砕物を洗浄(脱脂、精製なども含む)する洗浄工程(S02)と、洗浄後の粉砕物を乾燥及び粉砕して粉末を得る粉末化工程(S03)とを含む。
本発明の第2の実施形態に係る製造方法は、低濃度の酢酸水溶液を用いて軟骨成分を抽出する方法である。図2は、この製造方法の典型的な実施形態を示す工程図である。第2の実施形態に係る方法は、冷凍軟骨を酢酸水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る抽出工程(S10)と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する回収工程(S20)とを含む。
本発明の第3の実施形態に係る製造方法は、第2の実施形態における酢酸水溶液の代わりに、低濃度のクエン酸水溶液を用いて軟骨成分を抽出する方法である。図2に示した第2の実施形態と同様に、本実施形態においても、冷凍軟骨を低濃度のクエン酸水溶液に浸漬して軟骨成分抽出液を得る浸漬工程(S10)と、得られた抽出液から軟骨成分を回収する回収工程(S20)とを含む。
第2の実施形態及び第3の実施形態で挙げている抽出工程(S10)では、酢酸水溶液及びクエン酸水溶液の代わりに、pH2から4の水又は水溶液を用いることも可能である。プロテオグリカンの抽出効率を上げる観点などから、当該pHは以下の通りである。
・pHの下限は、好ましくは2以上、より好ましくは2.1以上、より好ましくは2.2以上、より好ましくは2.3以上、更に好ましくは2.4以上である。
・pHの上限は、好ましくは4以下、より好ましくは3.9以下、より好ましくは3.8以下、より好ましくは3.7、更に好ましくは3.6以下である。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下(当該鼻軟骨の温度を35℃以下を保つこと)の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%エタノール550Lに、55kgのクエン酸を溶解し、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、50℃で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を550Lの99%エタノールに再度投入して50℃にて30分間攪拌した。これを遠心脱水機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%エタノールに投入して50℃にて30分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
上記製造方法で得られた乾燥品約1gを精密に量り、リン酸緩衝液(pH6.8)を加えて正確に10mLとしたものを試料溶液とした。各試料溶液を、0.45μmメンブレンフィルターを通した後、以下の操作条件でHPLCを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。なお、検量線の作成は、プロテオグリカン標準品(サケ鼻軟骨由来、富士フイルム和光純薬、162-22131)を、室温減圧デシケーター(シリカゲル)で3時間乾燥してから採取したものを精密に量り取り、試料と同じリン酸緩衝液に溶解して検量線作成用標準液を調製した。また、分子量マーカーとして、Shodex STANDARD P-82(昭和電工社製)を用いて作成した検量線からピークトップの分子量を求めた。
分析計:HPLC分析装置
検出器:示差屈折率検出器(RID-10A 島津製作所製)
カラム:ゲルろ過カラム(東ソー株式会社製TSKgel G5000PWXL)
カラム温度:40℃
試料注入量:50μL
移動相:リン酸緩衝液(pH6.8)
流量:0.5mL/min
コラーゲンは、一般的なタンパク質には含まれないヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンを含むという特徴がある。ヒドロキシプロリンはコラーゲン中の全アミノ酸の約10%を占めるといわれ、このヒドロキシプロリンを定量することによってコラーゲン量を推定することが可能である(皮革科学、vol.56、No.2、p71-79、2010「天然素材コラーゲンの機能性」)。上記製造方法で得られた乾燥品試料を、このヒドロキシプロリン量を測定することによりコラーゲン含有率を算出した。
実施例1で製造した可溶性軟骨成分混合物に含まれるプロテオグリカンの分子量は約84万、含有率は約41%であった。また、この混合物中のコラーゲン含有率は35~38%であった。
以下比較例1~4、実施例1の変形例(その1及びその2)の当該比較試験を官能試験により行った。
まず、以下比較例1~4、実施例1の変形例(その1及びその2)のプロテオグリカン含有の軟骨成分混合物(粉砕物)を作製した。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%ヘキサン溶液550Lに、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、25℃(室温)で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてヘキサン溶液を除去した後、残渣を550Lの99%ヘキサン溶液に再度投入して25℃にて30分間攪拌した。これを遠心分離機でヘキサン溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%ヘキサン溶液に投入して25℃にて30分間攪拌洗浄した。ヘキサン溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%アセトン溶液550Lに、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、25℃で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてヘキサン溶液を除去した後、残渣を550Lの99%アセトン溶液に再度投入して25℃にて30分間攪拌した。これを遠心分離機でアセトン溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%アセトン溶液に投入して25℃にて30分間攪拌洗浄した。アセトン溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。59%エタノール溶液550Lに、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、25℃で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を550Lの59%溶液に再度投入して25℃にて30分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度550Lの59%エタノール溶液に投入して25℃にて30分間攪拌洗浄した。エタノール溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%エタノール溶液550Lに、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、25℃で1時間攪拌した。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を550Lの99%溶液に再度投入して25℃にて30分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%エタノール溶液に投入して25℃にて30分間攪拌洗浄した。エタノール溶液洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%エタノール550Lに、55kgのクエン酸を溶解し、先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、60℃で30分間攪拌した。当該攪拌は、ホモミキサーにより湿式粉砕を行いながら行った。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心脱水機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を550Lの99%エタノールに再度投入して60℃にて30分間攪拌した。これを遠心脱水機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%エタノールに投入して60℃にて30分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を、品温35℃以下の条件で凍結乾燥を行い、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、14メッシュパス相当の粉砕物を得た。99%エタノール550Lに先に得られた軟骨粉砕物55kgを投入し、60℃で1時間攪拌した。当該攪拌は、精密乳化分散機クレアミックス(エム・テクニック株式会社)により湿式粉砕を行いながら行った。このように攪拌により洗浄した軟骨粉砕物を、遠心分離機を用いてエタノール溶液を除去した後、残渣を550Lの99%エタノールに再度投入して60℃にて30分間攪拌した。これを遠心分離機でエタノール溶液を除去した後、残渣を再度550Lの99%エタノールに投入して60℃にて30分間攪拌洗浄した。エタノール洗浄後の粉砕物を遠心分離機でろ取し、加熱温度35℃以下にて減圧乾燥し、得られた乾燥物を粉砕機で粉砕して、約40kgの粉砕物を得た。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を400g用意し、出発原料とした。これに種々の濃度の酢酸水溶液2000mLを投入し、抽出温度30℃~40℃で48~72時間抽出した。種々の濃度(%)、抽出温度(℃)及び抽出時間(hr、時間)は、表2に示す通りである。
・PG収率(%):「((得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量)/(当該鼻軟骨の重量400(g)))×100」にて算出された値(%)
・PG分子量(×104):プロテオグリカン分子量。例えば表2の実施例2の「56」の記載は分子量が560,000(56万)を示す。
・PG含有比率:比較例5の凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量を100として、各実施例の凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量の相対値(比較例5と比較して示す相対値)。
・コラーゲン含有率(%):凍結乾燥物中のコラーゲン含有率
・「―」:測定していないことを示す。
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を400g用意し、出発原料とした。種々の濃度のクエン酸水溶液2000mLを加え、ゆっくり攪拌しながら種々の抽出温度で24~48時間抽出した。種々の濃度(%)、抽出温度(℃)及び抽出時間(hr、時間)は、表3に示す通りである。
・PG収率(%):「((得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量)/(当該鼻軟骨の重量400(g)))×100」にて算出された値(%)。
・PG分子量(×104):プロテオグリカン分子量。例えば表2の実施例10の「72」の記載は分子量が720,000(72万)を示す。
・PG/コラーゲンの比率:「当該比率=(凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有率/凍結乾燥物中のコラーゲンの含有率)」。
・コラーゲン含有率(%):凍結乾燥物中のコラーゲン含有率。
・「―」:測定していないことを示す。
・腐敗の有無:「×」は凍結乾燥物の製造工程中での腐敗が確認された群、「○」は当該製造工程中での腐敗が確認されなかった群(正常な群)、を示す。なお、比較例6は、当該腐敗が確認されたため、PG収率、コラーゲン含有率など測定できなかった。
実施例1で得られた可溶性軟骨成分混合物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。
まず、DMEM培地(富士フイルム和光純薬、D-MEM(低グルコース)(L-グルタミン、フェノールレッド含有)、041-29775)を準備した。96well plateに、0.1%FBS含有のDMEM培地細胞浮遊液200μlで4×103個の細胞を播種した。この播種後、37℃、5%CO2の環境下で、72時間培養した。当該培養後、0.1%FBS含有のDMEM200μlに培地を交換した。当該交換後、37℃、5%CO2の環境下で、24時間培養した。当該24時間後、試料入り培地(0.1%FBS含有のDMEM培地200μl)に交換した。このとき、所定の試料を入れずに0.1%FBS含有のDMEM培地のみで培養したコントロール群を設けた。その後、37℃、5%CO2の環境下で、72時間培養した。当該培養後、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay (Promega)を用いて、添加した試料(試料1から試料3の群)の細胞増殖効果を評価した。得られた試験結果に関し、統計学的有意性はDunnett’s testを用いて評価した。表4において、有意差がある場合は、「**」(p<0.05)と標記する。各群の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定することで、当該細胞増殖効果を評価した。当該測定は、コントロール群の細胞数の測定結果を100として、各群(試料1から試料3の群)において測定した細胞数の相対値を算出した。以下表4では、各群において3サンプルの平均値を算出した結果を用いての相対値を示す。
・試料1の群:従来品としてプロテオグリカンF(一丸ファルコス株式会社製)に含有されるプロテオグリカン5倍濃縮したもの
・試料2の群:実施例1で製造した可溶性軟骨成分混合物
・試料3の群:実施例5で製造した可溶性軟骨成分混合物
・試料4の群:市販品のプロテオグリカン
実施例10及び実施例11で得られたプロテオグリカンについて、試験例1と同様の方法にて、ヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。用いた試料は以下のとおりである。得られた試験結果に関し、統計学的有意性はDunnett’s testを用いて評価した。測定結果を表5に示す。表5において、有意差がある場合は、「**」(p<0.05)と標記する。各群の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定することで、当該細胞増殖効果を評価した。当該測定は、コントロール群の細胞数の測定結果を100として、各群(試料1の群、試料5の群、試料6の群)において測定した細胞数の相対値を算出した。以下表5では、各群において3サンプルの平均値を算出した結果を用いての相対値を示す。
・試料1の群:従来品としてプロテオグリカンF(一丸ファルコス株式会社製)に含有されるプロテオグリカン5倍濃縮したもの
・試料5の群:実施例10で製造したプロテオグリカン
・試料6の群:実施例11で製造したプロテオグリカン
-30℃~-20℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を400g用意し、出発原料とした。これにpH2~4の水又は水溶液2000mLを投入し、抽出温度37℃で72時間抽出した。種々の濃度(%)、抽出温度(℃)及び抽出時間(hr、時間)は、表6に示す通りである。
・PG収率(%):「((得られた凍結乾燥物中のプロテオグリカンの含有量)/(当該鼻軟骨の重量400(g)))×100」にて算出された値(%)
・PG分子量(×104):プロテオグリカン分子量。例えば表6の実施例13の「50」の記載は分子量が500,000(50万)を示す。
・コラーゲン含有率(%):凍結乾燥物中のコラーゲン含有率
・「―」:測定していないことを示す。
比較例5及び実施例2から9で用いた溶媒(表2、所定濃度の酢酸水溶液2000mL)、比較例6及び実施例10から12で用いた溶媒(表3、所定濃度のクエン酸水溶液2000mL)のpHを測定した。測定結果を以下表7に示す。
Claims (7)
- 凍結乾燥された軟骨を粉砕して粉砕物を得る工程と、
前記粉砕物をクエン酸含有エタノール溶液にて洗浄する工程と、
前記クエン酸含有エタノール溶液で洗浄した粉砕物を、さらにエタノールにて洗浄する工程と、
前記エタノール洗浄後の粉砕物を乾燥及び粉砕して粉末を得る工程と、
前記粉末に水を加えて湿式粉砕する工程と、
を含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。 - 凍結乾燥された軟骨を粉砕して粉砕物を得る工程と、
前記粉砕物をクエン酸含有エタノール溶液にて洗浄する工程と、
前記クエン酸含有エタノール溶液で洗浄した粉砕物を、さらにエタノールにて洗浄する工程と、
前記エタノール洗浄後の粉砕物を乾燥及び粉砕して粉末を得る工程と、
を含む、プロテオグリカンを含む軟骨成分混合物の製造方法。 - 前記クエン酸含有エタノール溶液が、1質量%以上30質量%以下のクエン酸を含む請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記軟骨成分混合物が、固形分換算で30質量%以上のプロテオグリカンを含有する請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記軟骨成分混合物が、固形分換算で少なくとも20質量%の水溶性コラーゲンを含有する請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記プロテオグリカンの分子量が80万~90万である請求項1又は2に記載の製造方法。
- 当該軟骨が、サケ頭部の鼻軟骨である請求項1又は2に記載の製造方法。
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