PT2740798T - Composição de fármaco para o tratamento e/ou a prevenção de cancro - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO DE FÁRMACO PARA O TRATAMENTO E/OU A PREVENÇÃO DE

CANCRO

Campo técnico A presente invenção refere-se a nova utilização de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um fragmento do mesmo num fármaco tal como um agente terapêutico e/ou preventivo para o cancro. Técnica Anterior 0 cancro é a principal causa de morte. Esta doença atualmente é tratada principalmente por terapêutica cirúrgica em combinação com quimioterapia e/ou terapêutica de radiação. Apesar do desenvolvimento recente de novas técnicas cirúrgicas ou a descoberta de novos agentes anticancro, o tratamento de cancro existente tem um resultado melhorado insuficientemente, exceto para alguns tipos de cancro. Com os avanços recentes de biologia molecular ou imunologia do cancro, anticorpos que reagem especif icamente com cancro, antigénios de cancro que são reconhecidos por células T citotõxicas, genes que codificam tais antigénios de cancro, e semelhantes têm sido identificados, elevando as expectativas de terapêutica específica de cancro direcionadas a antigénios de cancro (Literatura não patente 1).

Para reduzir o efeito secundário de terapêutica do cancro, é desejável que péptidos, polipéptidos, ou proteínas reconhecidas como antigénios do cancro raramente existam em células normais e especif icamente existam em células de cancro. Em 1991, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Bélgica) isolou um antigénio de melanoma humano MAGE 1 reconhecido por células T CD8 positivas por um método de clonagem de expressão ADNc utilizando linhas celulares de cancro autólogas e as células T reativas a cancro (Literatura não patente 2) . Posteriormente, um método SEREX (identificação sorológica de antigénios através de clonagem de expressão recombinante) tinha sido relatado, que adota uma abordagem de clonagem de expressão de gene para identificar antigénios de tumor reconhecidos pelos anticorpos produzidos em resposta a cancro autólogo in vivo num paciente de cancro (Literatura não patente 3 e Literatura de patente 1) . De acordo com este método, alguns antigénios de cancro que raramente são expressos em células normais e são expressos especificamente em cancro têm sido isolados por este método (Literaturas não patente 4 a 9) . Além disso, terapêuticas celulares utilizando imunócitos que reagem especificamente com os antigénios de cancro utilizando vacinas ou semelhantes que compreendem antigénios de cancro está em ensaio clínico direcionado a alguns antigénios de cancro isolados.

Em anos recentes, vários fãrmacos de anticorpo para o tratamento do cancro direcionados a proteínas antigénicas em células de cancro têm surgido no mundo. Estes fãrmacos receberam atenção devido a sua certa eficácia como agentes terapêuticos específicos de cancro. A grande maioria de proteínas antigénicas direcionadas pelos fármacos, contudo, também são expressas em células normais. Como um resultado da administração de anticorpos, células normais que expressam os antigénio bem como células de cancro são danificadas, resultando desvantajosamente em efeito secundário. Consequentemente, se antigénios de cancro especificamente expressos na superfície de células de cancro podem ser identificados e anticorpos direcionados aos antigénios podem ser utilizados como fãrmacos, pode ser esperado que estes fármacos de anticorpo consigam um tratamento com menos efeito secundário. A proteína 1 citoplasmãtica e associada à proliferação e ativação (CAPRIN-1) tem sido conhecida como uma proteína celular que é expressa após ativação ou divisão celular de células normais em repouso e e forma grânulos de estresse citoplasmãtico com ARNs intracelulares para participar na regulação de transporte e tradução de AR3SL Encontrou-se que esta proteína é especificamente expressa na superfície de células de cancro e, portanto, está a ser estudada como um alvo de fármacos de anticorpo para o tratamento de cancro (literatura de patente 2).

Lista de citações Literatura de Patente

Literatura de patente 1: Patente U.S. N 0 5Ã9839Ã Literatura de patente 2: W02010/01Ã52Ã Literatura não Patente

Literatura não Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, !! Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 19 9Á, Vol. 24, p. 511-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japão)

Literatura não Patente 2: Bruggen P. et al. , Science, 254: 1A43-1A4Á (1991)

Literatura não Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Literatura não Patente 4: Int. J. Cancer, Á2 : 9Ã5-9Á1 (199Á) Literatura não Patente 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Literatura não Patente Ã: Int. J. Cancer, 29: Ã52-Ã5S (1998) Literatura não Patente Á: Int. J. Oncol., 14: Á03-Á08 (1999) Literatura não Patente 8: Cancer Res., 5Ã: 4ÁÃA-4ÁA2 (199Ã) Literatura não Patente 9: Hum. Mol. Gene Ã: 33-39, 199Á Sumário da Invenção Problema técnico

Um objeto da presente invenção é proporcionar é produzir um anticorpo que tem como alvo CAPRIN-1 especificamente expressa na superfície de células de cancro e tem melhor atividade antitumoral que os anticorpos convencionais, e proporcionar o anticorpo para utilização como um agente terapêutico e/ou preventivo para o cancro.

Solução ao problema A presente invenção possui os seguintes aspetos: A presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, o anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5, Ã, e Á e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 9, 10, e 11, e uma composição farmacêutica e uma combinação farmacêutica que compreende o mesmo como um ingrediente ativo, bem como uma composição farmacêutica e uma combinação farmacêutica para utilização num método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro, todos como são definidos nas reivindicações.

Numa forma de realização da presente invenção, o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovárico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma.

Noutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, Um anticorpo de cadeia simples, ou um anticorpo bi-específico. Efeitos Vantajosos da Invenção 0 anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção danifica células de cancro. Consequentemente, o anticorpo contra CAPRIN-1 é útil no tratamento e/ou na prevenção de cancro.

Descrição de formas de realização 0 anticorpo contra um polipéptido de CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser examinado para sua atividade antitumoral, conforme descrito posteriormente, examinando in vivo a inibição de proliferação tumoral num animal portador de cancro ou examinando ex vivo a presença ou ausência de atividade citotóxica mediada por complemento ou imunócito exibida pelo anticorpo contra células tumorais que expressam o polipéptido. 0 anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção é um anticorpo monoclonal, e pode ser qualquer tipo de anticorpo que pode exercer atividade antitumoral e inclui, por exemplo, anticorpos recombinantes, por exemplo, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos humanos, e seus fragmentos de anticorpo, por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv. Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser preparados por meio de métodos geralmente conhecidos dos peritos 11a especialidade. No caso de um indivíduo humano, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado é desejável para a evitar ou suprimir a rejeição.

Neste contexto, a frase "ligar-se especificamente a uma proteína de CAPRIN-1" significa que o anticorpo se liga especif icamente a uma proteína de CAPRIN-i e não se liga substancialmente a outras proteínas. 0 indivíduo a receber o tratamento e/ou prevenção de cancro de acordo com a presente invenção é um mamífero tal como um ser humano, um animal de estimação, animais de pecuária, ou um animal de desporto, preferentemente um ser humano. A seguir no presente documento, a preparação de antigénio, preparação de anticorpo, e uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção serão descritos. cPreparação de antigénio para a preparação de anticorpos>

As proteínas ou fragmentos das mesmas utilizadas como antigénios de sensibilização para a obtenção do anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção não são limitados pelos tipos de animais que servem como suas origens, incluindo seres humanos, cães, bovinos, cavalos, ratinhos, ratos, e galinhas. As proteínas ou fragmentos das mesmas, contudo, são preferentemente selecionadas em vista da compatibilidade com as células parentais para utilização em fusão celular. Geralmente, são preferidas proteínas derivadas de mamíferos. Particularmente, são preferidas proteínas derivadas de ser humano. Por exemplo, quando a CAPRIN-1 é CAPRIN-1 humana, proteínas de CAPRIN-1 humana, péptidos parciais das mesmas, ou células que expressam CAPRIN-1 humana podem ser utilizados.

As sequências nucleotídicas e as sequências de aminoácidos de CAPRIN-1 humana e homólogos das mesmas podem ser obtidas, por exemplo, fazendo um acesso ao GenBank (NCBI, EUA) e utilizando o algoritmo BLAST ou FASTA (Karlin and Altschul, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 90: 58Á3-58ÁÁ,1993 ; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 199Á).

Na presente invenção, com referência à sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 1 ou 3) ou sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 ou 4) de CAPRIN-l humana, as alvos são ácidos nucleicos ou proteínas que consiste em sequências que têm de Á0 a 100 %, preferentemente de 80 % a 100 %, mais preferentemente de 90 % a 100 %, ainda preferentemente de 95 % a 100 %, por exemplo, de 9Á % a 100 %, de 98 % a 100 %, de 99 % a 100 %, ou de 99,5 % a 100 % de identidade de sequência com a sequência nucleotídica ou a sequência de aminoácidos da ORF ou a porção madura da referência. Neste contexto, o termo " % de identidade de sequência" significa a percentagem ( %) do número de aminoácidos idênticos (ou bases) em relação ao número total de aminoácidos (ou bases) quando duas sequências estão alinhadas de tal modo que o grau máximo de semelhança ou identidade é pode ser conseguido com ou sem introdução de intervalos.

Os fragmentos de cada proteína de CAPRIN-1 têm comprimentos que variam desde o comprimento do aminoácido de um epítopo (ou um determinante antigénico) , que é a unidade mais curta reconhecida pelo anticorpo, até menos do que o comprimento completo da proteína. 0 epítopo refere-se a um fragmento de polipéptido que tem antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferentemente seres humanos. Sua menor unidade consiste em aproximadamente Á a 12 aminoácidos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos.

Polipéptidos que compreendem as proteínas CAPRIN-1 humanas acima e péptidos parciais das mesmas sintetizadas de acordo com métodos de síntese química, por exemplo, os métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) and tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical

Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis , Tokyo Kagaku Do j in Co . , Ltd. (Japão), 1981). Igualmente, estes polipéptidos podem ser sintetizados por meio de métodos de rotina utilizando vários sintetizadores de péptido disponíveis comercialmente. Alternativamente, polinucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser preparados utilizando abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica (Sambrook et al. , Molecular Cloning, a 2a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biology, a 3a edição, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons; etc.) em incorporados em vetores de expressão, que então são introduzidos em células hospedeiras de modo que as células hospedeiras produzem os polipéptidos. Desta maneira, os polipéptidos de interesse podem ser obtidos.

Os polinucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser prontamente preparados por meio de abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica ou métodos de rotina utilizando sintetizadores de ácidos nucleicos disponíveis comercialmente. Por exemplo, 0 ADN que compreende a seuquência nucleotídica do gene de CAPRIN-1 humano pode ser preparado por meio de PCR utilizando uma biblioteca de ADNc ou ADN cromossómico humano como um molde e um par de iniciadores concebidos de forma a ser capazes de amplificar a sequência nucleotídica descrita na SEQ ID NO: 1. As condições de reação por este PCR podem ser determinadas de forma apropriada. Exemplos das condições podem incluir, mas não são limitadas a, 30 ciclos cada envolvendo as etapas de reação que consistem em 94 °C durante 30 segundos (desnaturação) , 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (anelamento), e Á2 °C durante 2 minutos (alongamento) utilizando termotolerância de ADN polimerase (por exemplo, Taq polimerase, Pfu polimerase) e um tampão de PCr contendo Mg2Ç, seguida pela reação a Á2 °C durante Á minutos. A abordagem de PCR, condições, etc. são descritos em, por exemplo, Ausubel et ai. , Short Protocols in Molecular Biology, a 3a edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995) , John Wiley & Sons (particularmente, Capítulo 15) .

Igualmente, as sondas ou iniciadores apropriados podem ser preparados com base nas informações sobre as sequências nucleotídicas do gene de CAPRIN-1 e as sequências de aminoãcidos das proteínas de CAPRIN-1, e utilizadas no rastreio de, por exemplo, uma biblioteca de ADNc humana, para isolar o ADN desejado. Preferentemente, tal biblioteca de ADNc é produzida a partir de células, órgãos, ou tecidos que expressam proteínas de CAPRIN-1. Exemplos de tais células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados de cancros ou tumores tais como cancro de mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovãrico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma. Estas operações, incluindo a preparação de sondas ou iniciadores, a construção de uma biblioteca de ADNc, o rastreio construção da biblioteca de ADNc, e a clonagem do gene de interesse, são conhecidos pelos peritos na especialidade e podem ser realizados de acordo com métodos descritos em, por exemplo, Sambrook et al. ,

Molecular Cloning, a 2a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989) , e Ausubel et al. (ibid.) . Os ADNs que codificam as proteínas de CAPRIN-1 humana e os péptidos parciais das mesmas podem ser obtidos a partir dos ADN assim obtidos.

As células hospedeiras podem ser qualquer célula capaz de expressar os polipéptidos acima. Exemplos de células procarióticas incluem, mas não são limitadas a, E. colí. Exemplos de células eucariõticas incluem, mas não são limitados a: células de mamíferos tais como células de rim de macaco COSI e células de ovário de hamster chinês CHO; uma linha celular de células embriónicas humanas (HEK293), linha de células de pele embriónicas de ratinho (NIH3T3) , células de leveduras tais como células de brotamento de leveduras e leveduras fissiparidade; células de bicho-da-seda; e óvulos de Xenopus.

No caso de utilizar células procarióticas como as células hospedeiras, os vetores de expressão utilizados têm uma origem que permite a replicação nas células procarióticas, um promotor, um local de ligação ao ribossoma, um local de multiclonagem, um terminador, um gene de resistência a fármacos, um gene complementar auxotrófico, etc. Exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir a série plJC, pBluescript II, sistemas de expressão pET, e sistemas de expressão pGEX. Os ADN que codificam o polipéptido acima podem ser incorporados em tal vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras procarióticas são depois transformados, seguido pela cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipéptidos codificados pelos ADNs são expressos nas células hospedeiras procarióticas. A este respeito, os polipéptidos podem ser expressos como proteínas de fusão com outras proteínas.

No caso de utilizar células eucarióticas como as células hospedeiras, vetores de expressão para células eucarióticas tendo um promotor, uma região de splicing, um local de adição de poli(A), etc. são utilizados como os vetores de expressão. Exemplos de tais vetores de expressão podem incluir os vetores pKAl, pCDMS, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3, e pYES2. Da mesma forma conforme acima, os ADN que codificam o polipéptido acima podem ser incorporados em tal vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras eucarióticas são depois transformadas, seguido pela cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipéptidos codificados pelos ADNs são expressos nas células hospedeiras eucarióticas. No caso de utilizar vetores de expressão tais como pIND/VS-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, ou pEGFP-Cl, os polipéptidos podem ser expressos como várias proteínas de fusão com marcador His (por exemplo, (Hís)ã- (His)i0), etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA, GFP, ou semelhantes.

Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras utilizando métodos bem conhecidos tais como eletroporação, um método de fosfato de cálcio, um método de lipossomas, um método de DEAE dextrano, microinjeção, infeção virai, lipofeção e ligação com péptidos de penetração em células. 0 polipéptido de interesse pode ser isolado e purificado a partir de células hospedeiras por uma combinação de operações de separação conhecidos na técnica. Exemplos das mesmas incluem, mas não são limitadas a, tratamento com um desnaturante (por exemplo, ureia) ou um detergente, ultrassonicação, digestão enzimática, salificação, fracionamento e precipitação de solvente, diálise centrifugação ultrafiltração, filtração em gel, SDS-PAGE, eletroforese de focagem isoelétrica, cromatografia de permuta iõnica, cromatografia hidrofõbica, cromatografia de afinidade, e cromatografia de fase reversa. <Estrutura do anticorpo>

Os anticorpos são é geralmente glicoproteínas heteromultiméricas compreendendo, pelo menos, duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Os anticorpos, exceto para IgM, são glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa cada compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está conetada a uma cadeia pesada através de uma ligação covalente dissulfureto simples, embora o número de ligações dissulfureto entre as cadeias pesadas varie consoante os diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada uma das cadeias pesadas e leves também tem uma ligação de dissulfureto intracadeia. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) em uma das extremidades, seguido de uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região VL) numa extremidade e tem uma região constante simples na outra extremidade. A região constante de cadeia leve está alinhada com a primeira região constante de cadeia pesada, enquanto o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Regiões particulares denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis do anticorpo exibem variabilidade específica e conferem especificidade de ligação ao anticorpo. Porções relativamente conservadas nas regiões variáveis são denominadas regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e cadeias leves completas compreendem cada um quatro FRs ligadas através de três CDRs. Estas três CDR são denominadas CDRH1, CDRH2, e CDRH3 nesta ordem desde a terminação N da cadeia pesada. Igualmente, CDR são denominadas CDRL1, CDRL2, e CDRL3 na cadeia leve. A CDRH3 é mais importante para a especificidade de ligação do anticorpo para o seu antigénio. Além disso, CDRs em cada cadeia são mantidas próximas entre si pelas regiões FR e contribuem para a formação de uma local de ligação de antigénio no anticorpo, juntamente com as CDRs na outra cadeia. As regiões constantes não contribuem diretamente para a ligação de anticorpo-antigénio, mas exibem várias funções efetoras, por exemplo, envolvimento na citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada pela ligação a um recetor Fcy, taxa de semivida/eliminação mediada por um recetor Fc neonatal (FcRn) , e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um componente Clq na cascata do complemento. <Preparação do anticorpo> 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção significa um anticorpo tendo reatividade imunolõgica com uma proteína de CAPRIN-1 de comprimento completo ou um fragmento da mesma.

Neste contexto, a "reatividade imunológica" significa a propriedade do anticorpo ligar-se ao antigénio de CAPRIN-1 in vivo. Através de tal ligação, o anticorpo exerce a função de danificar (por exemplo, matar, suprimir, ou regredir) tumor. Especificamente, o anticorpo utilizado na presente invenção não é limitado por seu tipo desde que o anticorpo possa danificar tumores tais como cancro de mama, cancro renal, cancro pancreãtico, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovárico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma como um resultado da ligação à proteína de CAPRIN-1.

Na presente invenção, o anticorpo não é limitado pelo seu tipo desde que o anticorpo seja anticorpos monoclonais, e exemplos dos mesmos incluem anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, diacorpo e triacorpo), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, e fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2/ e Fv). Igualmente, o anticorpo é qualquer classe de molécula de imunoglobulina, por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, ou IgY, ou qualquer subclasse, por exemplo, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, ou IgA2. 0 anticorpo pode ainda ser modificado por acetilação, formilação, amidação fosforilação, PEGuilação, ou semelhantes, adicionalmente à glicolisação. A seguir no presente documento, exemplos de preparação de vários anticorpos monoclonais serão mostrados.

Por exemplo, linhas celulares de cancro da mama SK-BR-3 expressando CAPRIN-1 são administradas a cada ratinho para imunização. 0 baço é extraído deste ratinho. Após a separação das células de baço, as células são fundidas com as células de mieloma de ratinho. Os clones que produzem anticorpos tendo efeito antiproliferativo numa célula de cancro são selecionados dentre as células de fusão obtidas (hibridomas). Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais tendo efeito antiproliferativo da célula de cancro são isolados e cultivados. 0 anticorpo de interesse pode ser preparado por meio de purificação do sobrenadante da cultura de acordo com um métodos de purificação por afinidade geral.

Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal podem ser preparados, por exemplo, como se segue: em primeiro lugar, os animais são imunizados com antigénios de sensibilização de acordo com um método conhecido na técnica. Este método de imunização geralmente envolve injetar intraperitonealmente ou subcutaneamente os antigénios de sensibilização aos mamíferos. Especificamente, os antigénios de sensibilização são diluídos com ou suspensos em PBS (solução salina tamponada com fosfato) , solução salina fisiológica, ou semelhante numa quantidade apropriada e depois misturados, se desejado, com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional, por exemplo, um adjuvante completo de Freund. Após emulsificação, a emulsão resultante é administrada a cada mamífero várias vezes a cada 4 a 21 dias. Alternativamente, um veículo apropriado pode ser usado para a imunização com os antigénios de sensibilização.

Após a confirmação de uma elevação no nível do anticorpo desejado no soro do mamífero assim imunizado, os imunócitos são recolhidos do mamífero e submetidos a fusão celular. Exemplos preferidos dos imunócitos incluem particularmente células de baço.

Utilizam-se células de mieloma de mamíferos como células parentais parceiras a ser fusionadas cornos imunócitos. Várias linhas celulares conhecidas na técnica, por exemplo, P3U1 (P3-XÃ3Ag8Ul), P3 (P3xÃ3Ag8.Ã53) (J. Immunol. (19Á9) 123, 1548-1550), P3xÃ3Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (19Á8) 81, 1-Á), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (19ÁÃ) Ã, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (19ÁÃ) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et. al. , Nature (19Á8) 2ÃÃ, 2Ã9-2Á0), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (19Á8) 148, 313-323), e R210 (Galfre, G. et al. , Nature (19Á9) 2ÁÁ, 131-133) , são preferentemente utilizadas como as células de mieloma. A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser basicamente efetuada de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, o método de Kohler e Mil stein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) Á3, 3-4Ã) .

Mais especif icamente, a fusão celular é levada a cabo, por exemplo, na presença de um promotor de fusão celular num meio nutriente convencional. Por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou hemaglutinante do Japão (HVJ)) é utilizado como o promotor de fusão. Se for desejado, um auxiliar tal como o sulfóxido de dimetilo pode ser ainda adicionado com a finalidade de potenciar a eficiência da fusão. A razão entre os imunócitos e as células de mieloma utilizadas pode ser arbitrariamente definida. Por exemplo, a quantidade dos imunócitos é preferentemente ajustado de 1 a 10 vezes a quantidade das células de mieloma. Exemplos do meio que pode ser utilizado na fusão celular incluem os meios RPMI1Ã40 e MEM adequados para o crescimento das linhas celulares de mieloma bem como meios convencionais para utilização neste tipo de cultura celular. Além disso, um suplemento de soro tal como soro fetal de vitelo (FCS) pode ser utilizado em combinação com estas células.

Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturadas numa quantidade predeterminada do meio. Uma solução de PEG (massa molecular média: por exemplo, aproximadamente de 1000 a Ã000) preaquecida até aproximadamente 3Ã °C é normalmente adicionada à mistura a uma concentração de 3 0 a Ã0 % (p/v) e misturada aí para formar os hibridomas de interesse. Subsequentemente, procedimentos de adicionar sequencialmente um meio apropriado e remover o sobrenadante por meio de centrifugação são repetidos para remover agentes de fusão celular ou semelhantes desfavoráveis para o crescimento de hibridomas.

Os hibridomas assim obtidos são cultivados num meio seletivo convencional, por exemplo, um meio de cultura HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina) para seleção. A cultura no meio HAT é continuada durante um período (normalmente, de vários dias a várias semanas) suficiente para a morte das células que não são do hibridoma de interesse (células não fusionadas). Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são rastreados e clonados como clones individuais por meio de uma método de diluição limitativo convencional.

Para além da obtenção dos hibridomas pela imunização de animais não humanos com antigénios, os hibridomas que produzem anticorpos humanos tendo a atividade desejada (por exemplo, atividade antiproliferativa celular) podem ser obtidos pela sensibilização de linfócitos humanos, por exemplo, linfócitos humanos infetados pelo vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas, ou lisados dos mesmos in vitro e fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivados de humano capazes de se dividir permanentemente, por exemplo, U2ÃÃ (n 0 de acesso TIB 19Ã).

Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal assim preparados podem ser subcultivados num meio convencional e também podem ser armazenados durante um longo período em azoto líquido.

Especificamente, os antigénios desejado ou células que expressam os antigénios desejados são utilizados como antigénios de sensibilização na imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos obtidos são fusionados com células parentais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. As células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas) podem ser rastreadas por um método de rastreio convencional para preparar o anticorpo de interesse.

Neste contexto, por exemplo, ratinhos KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) e ratinhos Xeno (Amgen Inc.) são conhecidos como os ratinhos produtores de anticorpo humano (por exemplo, Publicações Internacionais n 0 WO02/434Á8 e W002/092812) . Anticorpos policlonais humanos completos podem ser obtidos a partir do sangue de tais ratinhos imunizados com as proteínas de CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas. Alternativamente, as células de baço podem ser isoladas dos ratinhos imunizados deste modo e fusionadas com células de mieloma. Desta maneira, hibridomas monoclonais humanos podem ser obtidos.

Os antigénios podem ser preparados de acordo com, por exemplo, um método utilizando células animais (Publicação de Patente JP (Kohyo) N 0 200Á-5300Ã8) ou um método utilizando baculovírus (por exemplo, Publicação Internacional N.° 2008/4ÃÁÁÁ). Os antigénios tendo baixa imunogenicidade podem ser ligados a macromoléculas tais como albumina para imunização.

Alternativamente, os anticorpos recombinantes podem ser utilizados, que são produzidos utilizando uma técnica de recombinação génica que envolve: a clonagem de genes de anticorpos de hibridomas; incorporar os genes de anticorpos nos vetores adequados; e introduzir os vetores em hospedeiros (veja-se, por exemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES , Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) . Especificamente, os ADNc da região variável (região V) do anticorpo são sintetizados a partir dos ARNm de hibridomas utilizando transcriptase reversa. Após a obtenção dos ADNs que codificam as regiões V dos anticorpo de interesse, os ADNs são ligados com ADNS que codificam as regiões constantes do anticorpo desejado (regiões C) . Os produtos de ligação resultantes depois são incorporados nos vetores de expressão. Alternativamente, os ADNs que codificam a região V do anticorpo podem ser incorporados nos vetores de expressão contendo os ADNs da região C do anticorpo. Estes ADNs podem ser incorporados no vetores de expressão de modo que sejam expressos sob o controlo de regiões de controlo de expressão, por exemplo, um potenciador e um promotor. A seguir, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e permitidas que expressem anticorpos. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo monoclonal inclui anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonals não humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de ratinho, rato, coelho, e galinha), anticorpos monoclonais quiméricos, e semelhantes. 0 anticorpo monoclonal pode ser preparado pela cultura de hibridomas obtidos a partir da fusão entre células de baço de animais não humanos (por exemplo, ratinhos ou ratinhos produtores de anticorpos humanos, galinhas, e coelhos) imunizados com proteínas de CAPRIN-1 e células de mieloma. 0 anticorpo quimérico é um anticorpo preparado a partir de uma combinação de sequências derivadas a partir de diferentes animais e é, por exemplo, um anticorpo composto de regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpo de ratinho e regiões constante de cadeia pesada e leve de anticorpo humano. 0 anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido na técnica que envolve, por exemplo: ligar os ADNs que codificam as regiões V de anticorpo com ADNs que codificam as regiões C de anticorpo humano; incorporar os produtos de ligação resultantes nos vetores de expressão; e introduzir os vetores em hospedeiros de modo que os anticorpos são produzidos. Em Exemplos descritos posteriormente, o anticorpo monoclonal quimérico humano-ratinho foi preparado e um efeito antitumoral do mesmo foi confirmada. Estes anticorpos monoclonais compreendem uma região variável de cadeia pesada (VH) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve (VL) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, em que a região VH compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: Ã, e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: Á, e a região VL compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID N.°: 9, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11. 0 anticorpo humanizado, também denominado anticorpo humano remodelado, e um anticorpo modificado por engenharia genética. 0 anticorpo humanizado é construído por enxerto de regiões determinantes de complementaridade de anticorpo humano com CDRs de anticorpo derivadas de um animal imunizado. Uma abordagem geral de recombinação génica para tal também é conhecida.

Especificamente, por exemplo, as sequências de ADN concebidas para ligar CDRs de anticorpos de ratinho e galinha e regiões estruturais de anticorpo humano (FRs) são sintetizadas por meio de PCR utilizando oligonucleótidos preparados tendo porções terminais sobrepostas entre si. Os ADNs obtidos são ligados com ADNS que codificam as regiões constantes do anticorpo. Subsequentemente, os produtos de ligação resultantes são incorporados nos vetores de expressão, que depois são introduzidos em hospedeiros para a produção de anticorpos para obter o anticorpo de interesse (veja-se a Publicação de Pedido de Patente Europeia η 0 EP239400 e a Pedido Internacional n 0 WO9Ã/025ÁÃ). As FRs do anticorpo humano ligadas através das CDR são selecionadas de tal modo que as CDRs formam um local de ligação ao antigénio favorável. Se for necessário, os aminoácidos nas regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de tal modo que as CDRs do anticorpo humano remodelado resultante formam um local de ligação ao antigénio apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: S51-85Ã). Além disso, estas regiões estruturais podem ser substituídas com regiões estruturais derivadas de vários anticorpos humanos (veja-se a Publicação Internacional N 0 W099/51Á43).

As regiões estruturais do anticorpo humano ligadas através das CDR são selecionadas de tal modo que as CDRs formam um local de ligação ao antigénio favorável. Se for necessário, os aminoácidos nas regiões estruturais das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de tal modo que as CDRs do anticorpo humano remodelado resultante formam um local de ligação ao antigénio apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-85Ã).

Os aminoãcidos em regiões variáveis (por exemplo, FRs) ou regiões constantes da anticorpo quimérico ou o anticorpo humanizado assim preparado pode ser substituído por outros aminoãcidos. A substituição de aminoãcidos é a substituição de, por exemplo, menos de 15, menos de 10, 8 ou menos, Á ou menos, Ã ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos aminoãcidos, preferentemente de 1 a 5 aminoãcidos, mais preferentemente 1 ou 2 aminoãcidos. 0 anticorpo substituído deveria ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. A substituição é de forma desejável uma substituição de aminoácido conservativa, que é a substituição entre aminoácido semelhantes em propriedades tais como carga, cadeias laterais, polaridade, e aromaticidade. Os aminoãcidos podem ser classificados em termos de propriedades semelhantes em, por exemplo: aminoãcidos básicos (arginina, lisina, e histidina); aminoãcidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoãcidos polares sem carga (glicina, asparagina, glutamine, serina, treonina, cisterna, e tirosina), aminoãcidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoãcidos ramificados (leucina, valina, e isoleucina) °f e aminoãcidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

Exemplos de anticorpos modificados incluem anticorpos ligados a várias moléculas tais como o polietilenoglicol (PEG) . No anticorpo modificado da presente invenção acima mencionado, a substância a ser ligada não é limitada. Com a finalidade de obter tal anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser quimicamente modificado. Já foi estabelecido um método para tal na técnica.

Neste contexto, a frase "funcionalmente equivalente" significa que um anticorpo objeto tenha atividade biológica ou bioquímica semelhante à do anticorpo da presente invenção, especificamente, o anticorpo em questão tem a função de danificar tumor e essencialmente não causa rejeição quando é aplicado a seres humanos, por exemplo. Exemplos de tal atividade podem incluir atividade antiproliferativa e atividade de ligação.

Um método para a preparação de um polipéptido funcionalmente equivalente a um certo polipétido, que envolve introduzir uma mutação num polipéptido, é bem conhecido para os peritos na especialidade. Por exemplo, os peritos na especialidade podem introduzir de forma apropriada uma mutação no anticorpo da presente invenção utilizando mutagénese dirigida ao local (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152: 2Á1-2Á5; Zoller, MJ., e Smith, M. (1983) Methods Enzymol., 100: 4Ã8-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res., 12: 9441-945Ά; Kramer, W. and Fritz, HJ., (198Á) Methods Enzymol., 154: 350-3ÃÁ; Kunkel, TA. , (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 488-492; e Kunkel (1988) Methods Enzymol., 85: 2ÁÃ3-2ÁÃA) ou semelhante, deste modo preparando um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção.

Um anticorpo que reconhece um epítopo de uma proteína de CAPRIN-! reconhecida por cada anticorpo anti-CAPRIN-1 descrito acima pode ser obtido através de um método conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, o anticorpo pode ser obtido através de um método que envolve determinar o epítopo da proteína de CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 por um método convencional (por exemplo, mapeamento de epítopos) e preparar um anticorpo utilizando um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como um imunógeno, ou um método que envolve determinar um epítopo para um anticorpo preparado através d eum método convencional e selecionar um anticorpo que reconhece o mesmo epítopo como aquele para o anticorpo anti-CAPRIN-1. Neste contexto, o epítopo refere-se a um fragmento de polipéptido que tem antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferentemente seres humanos. Sua menor unidade consiste em aproximadamente Á a 12 aminoácidos, preferentemente de 8 a 11 aminoácidos. 0 anticorpo da presente invenção tem uma constante de afinidade Ka(k0n/k0ff) de preferentemente pelo menos 10a M”1, pelo menos 10® pelo menos 5 x 108 M'1, pelo menos 109 M'1, pelo menos 5 x 109 M"1, pelo menos 10i0 M"1, pelo menos 5 x 10lú M"1 pelo menos 1011 M"1 pelo menos 5 x 1011 M"1 pelo menos 1012 M"1, ou pelo menos 1013 M"1. O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente anti-tumoral. A conjugação do anticorpo com o agente antitumoral pode ser realizada através de um espaçador tendo um grupo (por exemplo, um grupo succinimidilo, um grupo formilo, um grupo 2-piridilditio, um grupo maleimidilo, um grupo alcoxicarbonilo, ou um grupo hidroxi) reativo com um grupo amino, um grupo carboxilo, um grupo hidroxi, um grupo tiol, ou semelhantes.

Exemplos do agente antitumoral incluem os seguintes agentes antitumorais publicamente conhecidos na literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bussulfano, improsulfano, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, callistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosmfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, Ã-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina; epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcellomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, A-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, A-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, androgénios (por exemplo, calusterona, propionato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostano, e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolinico, aceglatona, aldofosfamida glicósido, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglticido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, acido podofilinico, 2~etilidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gencitabina, Ã-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipõsido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinóico, capecitabina, e sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos .

Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumoral para produzir um efeito terapêutico maior. Esta abordagem é adaptável a um paciente com cancro que expressa CAPRIN-l antes ou após operação cirúrgica. Esta abordagem pode ser aplicada, particularmente após cirurgia, a cancro que expressa CAPRIN-1, que tenham sido tratados com um agente anti-tumoral individualmente, para produzir maior prevenção de recorrência de cancro ou prolongação do tempo de sobrevivência.

Exemplos do agente antitumoral utilizado na administração combinada com o anticorpo da presente invenção incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos publicamente nas literaturas, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bussulfano, improsulfano, pipossulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucil, clornafazina, colofosmfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, Ã-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina; epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, Ã-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, Ã-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolinico, aceglatona, glicosideo de aldofosfamida, ácido aminolevulinico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilinico, 2-etilidrazida, procarbazina, razoxano; rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gencitabina, Ã-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinbiastina etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinóico, capecitabina, e solvatos e hidratos farmaceuticamente aceitáveis (conhecidos na técnica) e derivados (conhecidos na técnica) dos mesmos. Destes agentes antitumorais, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, ou vinorelbina é particularmente utilizado.

Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ser ligado a um radioisótopo publicamente conhecido nas literaturas, etc. tal como 211At, 131I 125I 90Y, i8ARe, 188Re, 15jSm, 212Bi, 32p, 1A5Lu, ou iaALu. De forma desejável, um radioisótopo eficaz para o tratamento ou diagnóstico do tumor é utilizado. 0 anticorpo da presente invenção é um anticorpo tendo reatividade imunológica com a CAPRIN-1, um anticorpo que reconhece especif icamente CAPRIN-1, ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1 e exibe atividade citotõxica ou efeito antiproliferativo em cancro. 0 anticorpo preferentemente deve ter uma estrutura que cause pouca ou nenhuma rejeição nos animais recetores. Exemplos de tais anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos quiméricos ratinho-humano), anticorpos de cadeia simples, e anticorpos biespecíficos quando os animais recetores são seres humanos. Estes anticorpos (1) têm regiões variáveis de cadeias leves e pesadas derivadas de um anticorpo humano, (2) têm regiões variáveis com CDRs (CDR1, CDR2, eCDR3) de cadeias leves e pesadas derivadas de um anticorpo de um animal não humano e regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano, ou (3) estes anticorpos são anticorpos recombinantes tendo regiões variáveis de cadeias leve e pesada derivadas de um anticorpo de animal não humanos e regiões constantes de cadeia leve e pesada derivadas de um anticorpo humano. 0 anticorpo da presente invenção é preferentemente os dois anticorpos anteriores.

Tais anticorpos recombinantes podem ser preparados como se segue: ADNs que codificam anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais ser humano, ratinho, rato, coelho, e galinha) contra CAPRIN-1 humana são clonados a partir de células que produzem anticorpos tais como hibridomas e utilizados como moldes em RT-PCR ou semelhantes para preparar ADNs que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas nos anticorpos. As respetivas sequências das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas e as respetivas sequências de CDR1, CDR2 , e CDR3 em cada região são determinadas com base no sistema de numeração de Kabat EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Tal ADN que codifica cada região variável ou ADN que codifica cada CDR é preparado utilizando técnicas de recomfoinação genética (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de ADN. Neste contexto, os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados imunizando animais produtores de anticorpos humanos (por exemplo, ratinhos) com CAPRIN-1 humana e fusionando posteriormente células de baço excisadas do animal imunizado com células de mieloma. Além disto, são preparados ADNs que codificam as regiões constantes e variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpo humano, se for necessário, utilizando uma técnica de recombinação génica ou um sintetizador de ADN.

Para o anticorpo humanizado, ADNs em que as sequências que codificam CDR em ADNs que codificam uma região variável de cadeia pesada ou leve de anticorpo humano sao substituídos pelas sequências que codificam a CDR correspondente de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho, ou galinha) podem ser preparados e ligados com os ADNs que codificam as regiões constantes de cadeia pesada ou leve derivada de anticorpo humano para preparar um ADN que codifica o anticorpo humanizado.

Para o anticorpo quimérico, ADNs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve ou pesada de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho, ou galinha) podem ser ligados com ADNs que codificam as regiões constantes de cadeia pesada ou leve derivada de anticorpo humano para preparar um ADN que codifica o anticorpo quimérico. 0 anticorpo de cadeia simples refere-se a um anticorpo que compreende regiões variáveis de cadeias leves e pesadas ligadas linearmente entre si através de um ligante. Um ADN que codifica o anticorpo de cadeia simples pode ser preparado ligando um ADN que codifica a região variável da cadeia pesada, um ADN que codifica o ligante, e um ADN que codifica variável de cadeia leve. Neste contexto, as regiões variáveis de cadeias leves e pesadas são ambas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano tendo sço CDRs substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho, ou galinha). 0 ligante consiste em 12 a 19 aminoãcidos, Exemplos do mesmo incluem (G4S)3 que consistem em 15 aminoãcidos (G.B. Kim et al. , Protein Engineering Design and Selection 200Á, 20 (9) : 425-432) . 0 anticorpo biespecífico (diacorpo) refere-se a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes. Um ADN que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado ligando, por exemplo, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada A, um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B, e um ADN que codifica um região variável de cadeia leve A nesta ordem (desde que o ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B e o ADN que codifica um região variável de cadeia pesada B e ligado via um ADN que codifica um ligante conforme descrito acima). Neste contexto, as regiões variáveis de cadeias leves e pesadas são todas derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano tendo são CDRs substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho, ou galinha).

Os ADNs recombinantes assim preparados podem ser incorporados em um ou mais vetores adequados, que depois são introduzidos em células hospedeiras (por exemplo, células de mamífero, células de leveduras, e células de insetos) de modo que os ADNs são (co)expressos para produzir anticorpos recombinantes (P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 199Á WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies: 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; e J.W. Coding., Monoclonal Antibodies: principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS) .

Exemplos do anticorpo da presente invenção preparados por qualquer dos métodos descritos acima incluem o seguinte anticorpo (a) obtido nos Exemplos descritos posteriormente: (a) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5, Ã, e Á e uma região variável de cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 (por exemplo, um anticorpo composto por uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: Se uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12).

Neste contexto, as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 5, Ã, e Á correspondem a CDR1, CDR2 , e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia pesada de anticorpo de ratinho. As sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 9, 10, e 12 correspondem a CDR1, CDR2 , e CDR3, respetivamente, de uma região variável de cadeia leve de anticorpo de ratinho.

Exemplos do anticorpo humanizado, o anticorpo quimérico, o anticorpo de cadeia simples, ou o anticorpo biespecífico da presente invenção incluem os seguintes anticorpos: (i) um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: Ã, A, e 8 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10, e 11 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano; (ii) um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5, Ã, e Á e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano, uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 9, 10, e 11 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano, e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoãcidos derivada de anticorpo humano; e (iii) um anticorpo ou fragmento do mesmo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID MO: 8, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de um anticorpo humano, uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoãcidos derivada de anticorpo humano.

As sequências das regiões constantes e variáveis de cadeias pesadas e leves de anticorpos humanos estão disponíveis de, por exemplo, NCBI (USA; GenBank, UniGene, etc.). Por exemplo, as seguintes sequências podem ser consultadas em: Número de acesso J00228 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgGl humana; Número de acesso J00230 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG2 humana; Número de acesso X03Ã04 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG3 humana; Número de acesso K0131Ã para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG4 humana; Números de Acesso V0055Ã, XÃ4135, e XÃ4133 para uma região constante de uma cadeia leve humana k; e Números de Acesso XÃ4132 e XÃ4134 para uma região constante de uma cadeia leve humana X.

Preferentemente, estes anticorpos têm atividade citotóxica e podem deste modo exercer um efeito antitumoral.

As sequências particulares acima das regiões variáveis e CDRs de cadeias leves e pesadas em cada anticorpo são proporcionadas meramente para fins ilustrativos. É óbvio que o anticorpo da presente invenção não está limitado pelas sequências particulares. Os hibridomas capazes de produzir os anticorpos de animal não humano ou anticorpos humanos anti-CAPRIN-1 (por exemplo, anticorpos de ratinho) diferentes daqueles descritos acima são preparados, e anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas são recuperados e avaliados como sendo (ou não sendo) os anticorpos de interesse com atividade de ligação imunolõgica contra CAPRIN-1 humana e atividade citotõxica como índices. Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal de interesse sâo identificados desse modo. Posteriormente, os ADNs que codificam as regiões variáveis de cadeias leves e pesadas dos anticorpos de interesses são produzidos a partir dos hibridomas e sequenciados, conforme descrito acima. Os ADNs são utilizados para a preparação dos diferentes anticorpos. 0 anticorpo da presente invenção pode ser o anticorpo (a) tendo a substituição, eliminação, ou adição de um ou vários aminoácidos, particularmente numa sequência de uma região estrutural e/ou uma região constante, desde que o anticorpo tenha tal especificidade que pode especificamente reconhece CAPRIN-1. Neste contexto, o termo ’’vários" significa preferentemente de 2 a 5, mais preferentemente 2 ou 3. A presente invenção proporciona adicionalmente um ADN que codifica o anticorpo da presente invenção, um ADN que codifica a cadeia leve ou pesada do anticorpo, ou um ADN que codifica a região variável de cadeia pesada ou leve no anticorpo. Tal ADN inclui, por exemplo, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências nucleotídicas que codificam as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 5, Ã, e Á, e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências nucleotídicas que codificam as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 9, 10, e 11, no caso do anticorpo (a).

As CDRs codificadas pelo ADN tendo estas sequências servem como regiões que determinam a especificidade do anticorpo. As sequências que codificam as outras regiões (isto é, regiões constantes e regiões estruturais) do anticorpo, portanto, podem ser sequências derivadas de outros anticorpos. Neste contexto, "outros anticorpos" também incluem anticorpos derivados de organismos não humanos e sâo preferentemente aqueles derivados de seres humanos desde o ponto de vista de redução dos efeitos secundários. Especificamente, o ADN da presente invenção preferentemente compreende sequências nucleotídicas que codificam as sequências de aminoácidos derivadas de anticorpo humano correspondente de regiões que codificam cada região estrutural e cada região constante nas cadeias leves e pesadas.

Exemplos adicionais do ADN que codifica o anticorpo da presente invenção incluem ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12. Neste contexto, a sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 é, por exemplo, a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 13. A sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 é, por exemplo, a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 14. Para estes ADNs, é preferido que a região que codifica cada região constante nas cadeias pesadas e leves compreendem uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos correspondente a partir de um anticorpo humano.

Estes ADNs de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, pelos métodos descritos acima ou o seguinte método: em primeiro lugar, os ARNs totais são preparados a partir de hibridomas relacionados com o anticorpo da presente invenção utilizando um kit de extração de ARN disponível comercialmente, e os ADNcs são sintetizados utilizando transcriptase reversa e iniciadores aleatórios ou semelhantes. Subsequentemente, os ADNc que codificam anticorpo são amplificados por meio de PCR utilizando iniciadores de oligonucleótidos para sequências conservadas de cada região variável em genes conhecidos de cadeia leve e pesada de anticorpo de ratinho. As sequências que codificam regiões constantes podem ser obtidas através de amplificação por PCR de sequências conhecidas. A sequência nucleotídica do ADN pode ser incorporada num plasmídeo ou um fago para sequenciamento, por exemplo, e determinada de acordo com um método de rotina. 0 efeito anti-tumoral do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção contra as células cancerosas que expressam CAPRIN-1 parece ser ocasionado pelo seguinte mecanismo: A citotoxicidade celular dependente de anticorpo mediada por célula efetora (ADCC) e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra as células que expressam CAPRIN-1 parece ser ocasionada. 0 efeito antitumoral com base no mecanismo é conhecido por se correlacionar com o número de moléculas alvo que se ligam ao anticorpo expressas na superfície de células de cancro (Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 Mar 15; 11 (Ã) : 232Á-233Ã) . 0 número de moléculas alvo expressas na superfície de células de cancro pode ser examinado utilizando um kit de ensaio existente capaz de medir o número de moléculas na superfície celular. Especificamente, o número de moléculas alvo que se ligam a anticorpo pode ser determinado: fazendo reagir células de cancro com, por exemplo, anticorpos contra as moléculas alvo como anticorpos primários; fazendo reagir com os mesmos anticorpos marcados com fluorescência com os anticorpos primários, juntamente com a curva de calibração com o número de moléculas conhecido preliminarmente; medindo a intensidade de fluorescência média das amostras; e determinando o número de moléculas alvo com base na curva de calibração obtida.

Consequentemente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção pode ser avaliado para sua atividade pela determinação ex vivo da atividade de ADCC ou a atividade de CDC contra células de cancro expressando CAPRIN-1 ou examinando o número de moléculas de CAPRIN-1 expressas na superfície de células de cancro no caso de utilizar o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção como um anticorpo primário conforme especificamente mostrado abaixo nos Exemplos. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção liga-se a proteínas de CAPRIN-1 em células de cancro e exibe um efeito anti-tumoral devido através da atividade. Consequentemente, 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é presumivelmente útil no tratamento ou prevenção do cancro. Especificamente, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de cancro, que compreende um anticorpo anti-CAPRIN-1 como um ingrediente ativo. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado para o propósito de administração aos organismos humanos (terapêutica de anticorpo) é preferentemente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado para reduzir a imunogenicidade. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 com maior afinidade de ligação para uma proteína CAPRIN-1 na superfície de célulasde cancro exerce atividade antitumoral mais forte. Consequentemente, um efeito antitumoral mais forte pode ser esperado se o anticorpo anti-CAPRIN-1 tendo alta afinidade de ligação para a proteína de CAPRIN-1 puder ser obtido. Tal anticorpo é adaptável a uma composição farmacêutica destinada ao tratamento e/ou a prevenção de cancro. De forma desejável, tal alta afinidade de ligação é preferentemente pelo menos 10aM"1, pelo menos IQ8 M”1, pelo menos 5 x 108 M”1, pelo menos 109 M"1, pelo menos 5 x 109 M"1, pelo menos 10*° M"1, pelo menos 5 x IO10 M'1, pelo menos 1011 M"1, pelo menos 5 x 1011 MT1, pelo menos 10i2 M'1, ou pelo menos 1013 M"1, em termos de uma constante de associação (constante de afinidade) Ka (kon/'koff) , conforme descrito acima. A ligação de anticorpos anti-CAPRIN-1 a um maior número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície de células de cancro produz atividade antitumoral mais forte. De forma desejável, o número de moléculas de CAPRIN-i às quais os anticorpos se ligam para o efeito antitumoral esperado é de 104 ou mais, preferentemente 1Q5 ou mais moléculas de CAPRIN-1 por célula de cancro medida utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção. cLigação a células que expressam o antigénio A capacidade do anticorpo de se ligar à CAPRIN-1 pode ser determinada pela utilização de ensaio de ligaçao utilizando, por exemplo, ELISA, Western blot, imunofluorescência, e análise de citometria de fluxo, conforme descrito nos Exemplos. cColoração imunohistoquímica> 0 anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado para sua reatividade com CAPRIN-1 através de um método de imunohistoquímica conhecido pelos peritos na especialidade utilizando seções congeladas fixadas em paraformaldeído ou em acetona ou seções teciduais fixadas em paraformaldeído e envolvidas em parafina de um tecido obtido de um paciente durante a operação cirúgica ou a partir de um animal que porta um tecido de xenoenxerto inoculado com uma linha celular que expressa CARIN-1 espontaneamente ou após transfeção.

Para a coloração imunohistoquímica, o anticorpo reativo com CAPRIN-1 pode ser tingido através de vários métodos. Por exemplo, o anticorpo pode ser visualizado através de reação com anticorpo anti-ratinho de cabra conjugado com peroxidase de rábano, anticorpo anti-coelho de cabra ou anticorpo anti-galinha de cabra. cComposição farmacêutica>

Um alvo da composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de cancro da presente invenção não é particularmente limitado desde que o alvo seja cancro (células) que expressam o gene de CAPRIN-1,

Os termos "tumor" e "cancro" utilizados no presente documento significam neoplasmas malignos e são utilizados indistintamente entre si. 0 cancro alvo na presente invenção é cancro que expressa um gene que codifica proteína CAPRIN-1 e é preferentemente cancro de mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovárico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma.

Exemplos específicos destes cancros incluem, mas não são limitados a, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama de tipo complexo, tumor da glândula mamária misto maligno, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma pulmonar, cancro de células escamosas, cancro de células pequenas, cancro de células grandes, glioma que é um tumor de tecido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionário, neurilenoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma de células de tipo peuqenas a médias, cancro cecal, cancro do cólon ascendente, cancro do cólon descendente, cancro do cólon transversal, cancro do cólon sigmoide, cancro retal, cancro ovárico epithelial, tumor de células germinais, tumor de células do estroma, carcinoma ductal pancreático, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma das células acinares, carcinoma adenosquamouso, tumor de células gigantes, neoplasma mucino papilar intraductal, neoplasmas cístico mucino, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor pseudopapilar sólido, gastrinoma, glueagonoma, insulinoma, neoplasia endócrinas múltipla de tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor de células de ilhotas não funcionais, somatostatinoma, e VIPoma. 0 indivíduo de teste como o recipiente são preferentemente mamíferos, por exemplo, mamíferos incluindo primatas, animais de estimação, animais de pecuária, e animais de desporto e são particularmente preferentemente seres humanos, cães, e gatos.

No caso de utilizar o anticorpo da presente invenção como a composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada por meio de um método geralmente conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser utilizada na forma de uma injeção parentérica de uma suspensão ou solução asséptica com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada com o anticorpo misturado numa farmacêutica unitária unitária necessária para a prática farmacêutica geralmente aceite, em combinação apropriada com meios ou veículos aceitáveis farmacologicamente, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, um emulsificante, um agente de suspensão, um detergente, um estabilizante, um agente aromatizante, um excipiente, um veículo, um conservante, um aglutinante, etc, A quantidade do ingrediente ativo em tal preparação é determinada de modo que se possa conseguir uma dosagem adequada dentro do intervalo prescrito.

Uma composição asséptica para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo tal como água destilada para a injeção.

Exemplos de soluções aquosas para injeção incluem solução salina fisiológica, soluções isotónicas contendo glicose e outros adjuvantes, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante adequado, por exemplo, um álcool (especificamente, etanol) ou um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol e polietilenoglicol), ou um detergente não iõnico, por exemplo, polissorbato 80 (TM) ou HCO-ÃO.

Exemplos de soluções oleosas incluem óleo de sésamo e óleo de soja. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante tal como benzoato de benzilo ou álcool benzilico. As soluções podem ainda ser misturadas com um tampão (por exemplo, uma solução de tampão de fosfato e uma solução de tampão de acetato de sódio) , um agente calmante (por exemplo, cloridrato de procaína), um estabilizante (por exemplo, álcool benzilico e fenol), e um antioxidante. As soluções de injeção assim preparadas são normalmente carregadas em ampolas apropriadas. A composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via oral ou parentérica, preferentemente por via parentérica. Exemplos específicos destas formas farmacêuticas incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de administração transpulmonar, e agentes de administração percutânea. Exemplos das injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, e injeção subcutânea, através da qual a composição farmacêutica pode ser administrada sistemicamente ou localmente.

Igualmente, o método de administração pode ser selecionado apropriadamente dependendo da idade, peso, sexo, sintomas, etc. de um paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou um polinucleótido que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de um intervalo de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dose. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro de um intervalo de, por exemplo, 0,001 a 100000 mg/corpo de um paciente, embora a dose não necessariamente esteja limitada a estes valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, idade, sexo, sintomas, etc. de um paciente, os peritos na especialidade podem apropriadamente selecionar a dose e o método. A composição farmacêutica incluindo o anticorpo ou fragmentos do mesmo da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo para tratar e/ou prevenir cancro, preferentemente cancro de mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovárico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma. A presente invenção abrange ainda um método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro, pela administração da composição farmacêutica da presente invenção em combinação com o agente anti-tumoral conforme exemplificado acima ou uma composição farmacêutica que compreende o agente anti-tumoral a um indivíduo. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção pode ser administrado simultaneamente com ou separadamente do agente antitumoral ao indivíduo. No caso de administração separadamente destas composições farmacêuticas, um pode ser administrado antes ou depois. Seus intervalos de dosagem, doses, vias de administração, e o número de doses podem ser adequadamente selecionados por um especialista. As formas farmacêuticas de fãrmacos separados a ser administrados simultaneamente também incluem, por exemplo, composições farmacêuticas cada uma formulada misturando o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e o agente antitumoral num veículo farmacologicamente aceitável (ou meio). As descrições acima sobre a prescrição, formulação, vias de administração, doses, cancro, etc. como para as composições farmacêuticas e formas farmacêuticas contendo o anticorpo da presente invenção também são aplicáveis a quaisquer das composições farmacêuticas e formas farmacêuticas contendo o agente antitumoral.

Consequentemente, a presente invenção proporciona também uma combinação farmacêutica conforme definida nas reivindicações, que compreende a composição farmacêutica da presente invenção e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral conforme exemplificado acima. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção de cancro, que compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e o agente antitumoral juntamente com um veículo farmacologicamente aceitável. <Polipéptido e ADN> A presente invenção proporciona ainda os seguintes polipéptidos e ADNs com relação ao anticorpo (a): (i) um polipéptido compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 8 e 12, e um ADN que codifica o polipéptido, por exemplo, um ADN que compreende as sequências nucleotídicas das SEQ ID NOs: 13 e 14; (ii) um polipéptido de CDR de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos dasSEQIDNQS: 5,Ã, e Á, e um ADN que codifica o polipéptido; e (iii) um polipéptido de CDR de cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 9, 10, e 11, e um ADN que codifica o polipéptido.

Estes polipéptidos e ADNs podem ser preparados utilizando técnicas de recombinação genética conforme descritas acima, A seguir no presente documento, a presente invenção será descrita especificamente em referência aos Exemplos. Contudo, o âmbito da presente invenção não pretende ser limitado por estes exemplos específicos. <Exemplo 1> Análise de expressão génica de CAPRIN-1 em cada tecido A expressão génica de CAPRIN-1 em tecidos normais humanos e caninos e várias linhas celulares foi examinada por meio de RT-PCR de acordo com o Exemplo 1(4) descrito no documento W02010/01Ã52Ã. Como um resultado, observou-se forte expressão em testículos entre os tecidos saudáveis de cão, ao passo que se observou expressão em tecidos de cancro da mama e de adenocarcinoma de cão. Como um resultado de também confirmar a expressão em tecidos humanos, a expressão foi confirmada apenas nos testículos entre os tecidos normais, como com o gene de CAPRIN-1 canino. Em contraste, detetou-se a expressão em vários tipos de linhas celulares de cancro, incluindo 8 linhas de células de cancro da mama humano (ZRÁ5-1, MCFÁ, T4ÁD, SK-BR-3, MDA-MB-15Á, BT-20, MDA-MB-231V, e MRK-nu-1) e 4 linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Pane-1, e BxPc- 3), entre as células de cancro. Estes resultados demonstraram que a CAPRIN-la é expressa em várias células de cancro, embora sua expressão não seja vista em tecidos normais diferentes de testículos. <Exemplo 2> Preparação de anticorpos monoclonais de galinha e ratinho contra CAPRIN-1 100 pg de proteínas de CAPRIN-1 humanas tendo a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 2, que foram preparadas no Exemplo 3 descrito no documento W02010/01Ã52Ã, foram misturadas em quantidade igual de adjuvante MPLÇTDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mistura foi utilizada como uma solução de antigénio por ratinho. A solução de antigénio foi administrada intraperitonealmente a cada ratinho Balb/c de à semanas de idade (Japan SLC, Inc.). Posteriormente, foram realizados Á reforços a cada semana para completar a imunização. Três dias após a dose final, o baço de cada ratinho foi excisado e triturado entre duas lâminas de vidro esterilizadas. Os procedimentos de lavagem com PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co. , Ltd.) e remoção do sobrenadante por meio de centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos foram repetidos três vezes para obter as células de baço. As células de baço obtidas foram misturadas com células de mieloma de ratinho SP2/0 (adquiridas de ATCC) a uma razão de 10:1.200 μΐ de um meio RPMI1Ã40 contendo 10 % de FBS foram aquecidas até 3Á°C e misturadas com 800 μΐ de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), e a solução de PEG preparada deste modo foi adicionadas à mistura de células, que depois deixou-se repousar durante 5 minutos para fusão celular. Após a remoção do sobrenadante por meio de centrifugação a 1Á00 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 150 ml de um meio RPM11Ã40 contendo 15 % de FBS suplementado com 2 % equivalente de uma solução de HAT (Life Technologies, Inc./Gibco) (meio seletivo HAT) . Esta suspensão foi inoculada a quinze placa de 9à poços (Thermo Fisher Scientific Inc. /Nunc) a uma concentração de 100 μΐ/poço. As células de baço e a células de mieloma foram fusionadas por cultura a 3Á°C durante Á dias sob condições de 5 % de C02 para obter hibridomas.

Os hibridomas preparados foram rastreados com a afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteínas CAPRIN-1 como um índice. Um ug/rnl de solução das proteínas de CAPRIN-1 preparadas no Exemplo 3 descrito no W02010/01Ã52Ã foi adicionado a uma placa de 9Ã poços a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar a 4°C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, uma solução a 0,5 % de albumina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionada aí a uma concentração de 400 μΐ/poço e deixou-se a repousas à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi descartada, e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Depois, o sobrenadantes de cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aí a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousas à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, anticorpos anti-IgG de ratinho marcados com HRP (HÇL) (Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram adicionados a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, uma solução de substrato TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aí a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Após o desenvolvimento da cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a uma concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrómetro de absorção. Como um resultado, vários hibridomas produzindo anticorpos tendo absorvância elevada foram selecionados.

Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 9à poços a uma densidade de 0,5 células/poço e foram cultivados na placa. Uma semana mais tarde, os hibridomas que formam colónias únicas nos poços foram observados. As células nestes poços foram adicionalmente cultivadas, e os hibridomas clonados foram rastreados com a afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteínas CAPRIN-1 como um índice. Um pg/ml de solução das proteínas de CAPRIN-1 preparadas no Exemplo 3 descrito no W02010/01Ã52à foi adicionado a uma placa de 9à poços a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar a 4°C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, uma solução a 0,5 % de BSA (Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionada aí a uma concentração de 400 μΐ/poço e deixou-se a repousas à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi descartada, e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Depois, o sobrenadantes de cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aí a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, anticorpos anti-IgG de ratinho marcados com HRP (HÇL) (Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram adicionados a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Depois, uma solução de substrato TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aí a uma concentração de 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Após o desenvolvimento da cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a uma concentração de 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espetrõmetro de absorção. Como um resultado, obtiveram-se 112 linhas de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais reativos com proteínas de CAPRIN-1. A seguir, os anticorpos monoclonais foram rastreados para os anticorpos reativos com a superfície de células de cancro de mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 10a células de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V foram centrifugadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 100 pL do sobrenadantes de cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionado aí e deixado a repousas durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-IgG de ratinho de cabra marcados com FITC (Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo 0,1 % de FBS foram adicionados e deixados a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, mediu-se a intensidade de fluorescência utilizando um FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi realizada utilizando o soro de cada ratinho Balb/c de à semanas de idade não tratado diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridoma, em vez dos anticorpos, para preparar o controlo. Como um resultado, um anticorpo monoclonal (n 0 1) tendo intensidade de fluorescência mais forte do que o controlo; isto é, reativo com a superfície de células de cancro de mama, foi selecionado. <Exemplo 3> Caracterização do anticorpo monoclonal selecionado

Os anticorpos monoclonais obtidos no Exemplo 2 foram analisados de acordo com um método descrito no Exemplo 5 do documento W02010/01Ã52Ã para suas sequências nucleotídicas e os aminoácidos codificados por estas. 0 anticorpo monoclonal resultante n 0 1 é composto por uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12 . A sequência nucleotídica resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal n.0 1 é mostrada na SEQ ID NO: 13, e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 8. A sequência nucleotídica que codifica a região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 14, e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 12 .

Especificamente, o anticorpo monoclonal n.° 1 foi confirmado que é composto pela região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 , e CDRL3 que consiste nas sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 5, Ã, e Á, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2, e CDRL3 que consiste nas sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 9, 10, e 11, respetivamente. <Exemplo 4> Preparação de anticorpo monoclonal quimérico humano-ratinho

Ambas as extremidades do fragmento de amplificação do gene que compreende o nucleótido que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de ratinho n 0 1 obtido no Exemplo 3, que é representada pela SEQ ID NO: 13, foram tratadas com enzimas de restrição, depois purificadas, e inseridas de acordo com um método de rotina num vetor pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.) já tendo insertos de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante de cadeia H de IgGi H humana que compreende a SEQ ID MO: 3Á. Igualmente, o fragmento de amplificação do gene que compreende o gene da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal de ratinho n. 0 1 representada pela SEQ ID NO: 14) foi tratado em ambas as extremidades com enzimas de restrição, depois purificado, e inserido de acordo com um método de rotina num vetor pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen Corp.) já tendo insertos de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante de cadeia L de IgGi H humana que compreende a SEQ ID NO: 38. A seguir, o vetor recombinante tendo o inserto da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) do anticorpo monoclonal de ratinho n 0. 1 e o vetor recombinante tendo o inserto da região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 14) do anticorpo monoclonal de ratinho n 0. 1 foram introduzidos em células CH0-K1 (obtidas do RIKEN Cell Bank). Especificamente, 2 x 1Q5 células CH0-K1 foram cultivadas em meio F12 de Ham (Invitrogen) contendo 1 ml de FBS a 10 % por poço de uma placa de cultura de 12 poços, e foram lavadas com PBS (-) . Posteriormente, um meio F12 de Ham fresco contendo 1 ml de FBS a 10 % por poço foi adicionado aí. 250 ng de cada um do vetores lisados em 30 pL de OptiMEM (Invitrogen Corp.) foi misturado com 30 pL de reagente de transfeçâo Polyfect (Qiagen N.V.), e esta mistura foi adicionada a cada poço. As células CH0-K1 cotransfetadas com os vetores recombinantes foram cultivadas num meio F12 de Ham contendo FBS a 10 % suplementado com 200 pg/mL de Zeocina (Invitrogen Corp.) e 200 pg/mL de Geneticina (Roche Diagnostics K.K.) e depois inoculadas a uma placa de 9Ã poços a uma densidade de 0,5 células/poço para preparar uma linha celular que produz de forma estável um anticorpo monoclonal quimérico humano-ratinho n.° 1 (n.° 1) tendo as regiões variáveis de anticorpo monoclonal de ratinho n.° 1.

Cada linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num balão de 150 cm2 a uma densidade de 5 x 105 células/mL utilizando 30 mL de um meio OptiCHO isento de soro (Invitrogen Corp.) para obter os sobrenadantes de cultura contendo anticorpo monoclonal quimérico de humano-ratinho n,0 1,

Igualmente, as linhas celulares que produzem de forma estável os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos humano-ratinho 1 a 11 foram preparadas da mesma maneira como acima utilizando os seguintes anticorpos monoclonais derivados de ratinho anti-CAPRIN-1 descritos no documento W02010/01Ã52à como anticorpos comparativos 1 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1Ã; um anticorpo comparativo 2 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 1Á e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 18; um anticorpo comparativo 3 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 20; um anticorpo comparativo 4 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22; um anticorpo comparativo 5 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 24; um anticorpo comparativo à que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 2Ã; um anticorpo comparativo Á que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2Á e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 28; um anticorpo comparativo 8 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 30; um anticorpo comparativo 9 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 31 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 32; um anticorpo comparativo 10 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 33 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 34; e um anticorpo comparativo 11 que consiste na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 35 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 3Ã. Cada linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num balão de 150 cm2 a uma densidade de 5 x 105 células/mL utilizando 30 mL de um meio OptiCHO isento de soro (Invitrogen Corp.) para obter os sobrenadantes de cultura contendo quaiquer dos anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho 1 a 11. <Exemplo 5 >Expressão de CAPRIN-1 na superfície de várias células de cancro utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 n.° 1 A seguir, as linhas celulares de cancro da mama humano (ZRÁ5-1, MCFÁ, T4ÁD, SK-BR-3, MDA-MB-15Á, BT-2Q, MDA-MB- 231V, e MRK-nu-1) , linhas de células de cancro renal (Caki-1, Caki-2, A498, e ACHN), a linha de células de cancro da bexiga (T24), a linha de células de cancro de ovário (SKOV3), a linhas de células de cancro pulmonar (QG5à e A549), as linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2 e MIAPaCa-2), a linha celular de cancro de próstata (PC3) , a linha celular de cancro da cérvix uterina (SWÁ5Ã) , a linha celular de fibrossarcoma (HT1080) , as linhas celulares de tumor cerebral (T98G, U8ÁMG, U251, SNB19, e U3Á3) , as linhas celulares de cancro gástrico (MNK28 e MNK45) , as linhas celulares de cancro de intestino grosso (HT29, Lovo, CaCo2, SW480, e HCT11Ã), a linha celular de leucemia (AML5), e a linha celular de linfoma (Ramos) confirmadas que têm expressão do gene CAPRIN-1 foram examinadas para sua expressão de proteínas de CAPRIN-1 na superfície celular utilizando os sobrenadantes de cultura contendo n.° 1 obtidos no Exemplo 4. 5x10a células de cada linha celular foram centrifugadas cada uma num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultura (100 pL) contendo o anticorpo n.° 1 foi adicionado ao tubo e deixado a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-IgG de ratinho (HÇL) de cabra marcado com FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluídos com PBS contendo FBS a 0,1 % adicionado aí e deixado a repousar a 4 °C durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, mediu-se a intensidade de fluorescência utilizando um FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company) . 0 controlo negativo utilizado foi células que reagiam apenas com anticorpos secundários. Como um resultado, as células suplementadas com o anticorpo n.° 1 tinham intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte que o controlo negativo. Isto demonstrou que as proteínas de CAPRIN-1 são expressas na superfície de membrana celular das linhas celulares de cancro humano. A taxa acima de acentuação na intensidade de fluorescência foi indicada pela taxa de aumento da intensidade de fluorescência média (MFI) em cada linha celular e calculada de acordo com a seguinte expressão: Taxa de aumento da intensidade de fluorescência média (taxa de acentuação da intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI de células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) (Controlo de MFI)) / (Controlo de MFI) x 100. <ExemploÃ: efeito antitumoral (atividade de ADCC) do anticorpo anti-CAPRIN-1 contra células de cancro> 0 anticorpo monoclonal quimérico humano-ratinho anti-CAPRIN-1 obtido no Exemplo 4 foi estudado para sua capacidade de danificar células de cancro que expressam CAPRIN-1 por meio de ensaio de atividade de ADCC. 0 sobrenadante de cultura das células que produzem n.° 1 foi purificado utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) . Após substituição com PBS (-) , a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (Millipore Corp.) . 0 anticorpo resultante foi utilizado para ensaio de atividade. 10a células cada da linha celular de cancro da mama humano MCFÁ, a linha celular de cancro de intestino grosso HCT-11Ã, a linha de células de cancro pancreático humano MIAPaCa-2, a linha de células de cancro renal humano Caki-2, e a linha celular de cancro pulmonar humano QG5à que confirmaram ter expressão de CAPRIN-1 foram recolhidas num tubo de centrífuga de 50 ml, ao qual 100 pCi de crómio 51 foi depois adicionado, seguido por incubação a 3Á °C durante 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI 1Ã40 contendo FBS a 10 % e adicionadas a uma densidade de 2 x 103 células/poço a cada placa de 9à poços d efundo em V para preparar as células alvo. 0 anticorpo purificado n.° 1 e os anticorpos quiméricos humano-ratinho quiméricos 1 a 11 obtidos no Exemplo 4 foram cada um adicionado aí a uma concentração de 1 pg/poço. Uma população de células contendo células NK humanas separadas utilizando um método de rotina de linfócitos separadas de sangue periférico humano foi adicionada à placa a uma densidade de 2 x 105 células/poço e cultivada a 3Á°C durante 4 horas sob condições de 5 % de C02. Após a cultura, a quantidade de crómio 51 libertada de células de tumor danificadas foi medida no sobrenadante da cultura para calcular a atividade citotõxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células de cancro. 0 controlo negativo utilizado foi células que suplementadas com anticorpos de controlo de isotipo. A população de células contendo células NK que foi utilizada nesta avaliação foi preparada como se segue: células mononucleares de sangue periférico humano separadas de sangue periférico humano de acordo com um método de rotina utilizando solução de separação de gravidade específica Histopaque para separação de célula mononuclear de sangue periférico humano (Sigma-Aldrich Corp.) foram feitas reagir com vários anticorpos marcados com FITC (anticorpo anti-CD3 humano, anticorpo anti-CD20 humano, anticorpo anti-CD19 humano, anticorpo anti-CDllc humano, e anticorpo anti-HLA-DR (Becton, and Dickinson and Company)), e uma população de células não corada com os anticorpos foi separada utilizando um classificador de células (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company) ) ou um kit de separação de células NK humanas (Miltenyi Biotec K.K.) . Como um resultado da avaliação da atividade citotóxica contra as células de cancro, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados e os anticopos comparativos 1 a 11 utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 5 % contra cada linha celular. Em contraste, o anticorpo n 0 1 exibiu atividade citotóxica de 20 %, 1Á %; 2Á %; e 10 % contra a linha celular de cancro da mama humano MCFÁ, a linha celular de cancro de intestino grosso HCT-11Ã, a linha de células de cancro pancreãtico humano MIAPaCa-2, a linha de células de cancro renal humano Caki-2, e a linha de células de cancro pulmonar humano QG5Ã, respetivamente. Igualmente, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados e os anticorpos comparativos 1 a 11 utilizados tinham atividade citotóxica inferior a 4 % contra todas as outras células de cancro, as linhas celulares de cancro da mama ZRÁ5-1, T4ÁD, Hs5ÁST, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V, e MRK-nu-1, linhas celulares de glioma T98G e U3Á3, uma linha de células de cancro pulmonar A549, linhas celulares de cancro renal Caki-1 e ACHN, uma linha celular de cancro da cérvix uterina SWÁ5Ã, uma linha de células de cancro da bexiga T24, linhas de células de cancro gástrico MKN28 e MKN45, uma linha celular de cancro de intestino grosso SW480, uma linha de células de leucemia AML5, e uma linha de células de linfoma Ramos. Em contraste, 0 anticorpo n.° 1 foi confirmado ter 10 % ou mais de atividade citotóxica contra estas linhas celulares. Estes resultados mostraram que o anticorpo monoclonal n.° 1 obtido contra CAPRIN-1 danifica células de cancro que expressam CAPRIN-1 através de sua atividade de ADCC, e demonstraram que o anticorpo n.0 1 exibe atividade citotóxica mais forte contra células de cancro humanas que aquela dos anticorpos comparativos 1 a 11.

Estes resultados sobre a atividade citotóxica foram obtidos misturando o anticorpo contra CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, células de linfócitos (população contendo células NK) , e 2 x 1Q3 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado, conforme descrito anteriormente, seguido da cultura das células durante 4 horas, após a cultura, medindo a quantidade de crómio 51 libertado no meio, e calculando a atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte expressão.

Expressão: Atividade citotóxica ( %) = Quantidade de crómio 51 libertado das células alvo suplementadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e células de linfócitos (população contendo células NK) / Quantidade de crómio 51 libertado das células alvo suplementadas com ácido clorídrico a 1 N x 100, <Exemplo Á> Efeito antitumoral de anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 em ratinho in vivo A seguir, o anticorpo monoclonal quimérico humano-ratinho n.° 1 obtido no Exemplo 4 foi avaliado para seu efeito antitumoral em ratinhos portadores de cancro in vivo. 0 anticorpo utilizado foi purificado em coluna a partir do sobrenadantes de cultura de cada linha celular que produz o anticorpo n. 0 1. De forma semelhante, os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho comparativos de anticorpo anti-CAPRIN-1 1 a 11 preparados no Exemplo 4 também foram avaliados para seus efeitos antitumorais em ratinhos portadores de cancro in vivo. 0 anticorpo n. 0 0 foi estudado para seu efeito antitumoral utilizando ratinhos portadores de cancro em que foi transplantada uma linha celular de cancro derivada de humano que expressam CAPRIN-1. 2 x 10a células da linha celular de cancro pancreãtico humano Capan-2 (adquirida de ATCC) por ratinho foram transplantadas subcutaneamente nas costas de ratinhos nus Ã5 Balb/c (Japan SLC, Inc.) e deixadas a crescer até que o tamanho do tumor era de aproximadamente 5 mm de diâmetro. O anticorpo n.° l e os anticorpos quiméricos comparativos humano-ratinho 1 a 11 foram cada um administrados intraperitonealmente a uma dose de 200 pg (200 μΐ)/ratinho a 5 (por anticorpo) destes ratinhos portadores de cancro. Posteriormente, cada anticorpo foi administrado por via intraperitoneal aos ratinhos portadores de cancro na mesma dose que acima um total de três vezes durante 2 dias. 0 tamanho do tumor foi medido todos os dias, e o efeito antitumoral foi observado. Por outro lado, administrou-se PBS (-) em vez dos anticorpos aos restantes 5 ratinhos portadores de tumor, que, por sua vez, foram utilizados como um grupo de controlo. 0 tamanho do tumor foi calculado em termos de volume de acordo com a expressão 0,5 x (eixo principal x eixo menor x eixo menor) .

Como um resultado da observação do efeito anti-tumoral, no grupo de teste que recebeu o anticorpo n 0 1 contra CAPRIN-1, a proliferação do tumor foi reduzida até ÁO % no dia 29 após a administração do anticorpo (com o tamanho do tumor no grupo de controlo na mesma data definido como 100 %) . Em contraste, nos ratinhos que receberam os anticorpos comparativos quiméricos humano-ratinho 1 a 11, a proliferação de tumor foi reduzida a aproximadamente 85 %. Estes resultados demonstraram que os anticorpos obtidos contra CAPRIN-1 exercem um efeito antitumoral in vivo em células de cancro expressando CAPRIN-1. Estes resultados demonstraram que o anticorpo n.° 1 exerce um efeito antitumoral in vivo mais forte que os dos anticorpos comparativos 1 a 11. <Exemplo 8>0 número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície de várias células de cancro reconhecidas pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 n.° 1

As linhas celulares de cancro da mama (ZRÁ5-1, MCFÁ, T4ÁD, SK-BR-3, MDA-MB-15Á, BT-20, MDA-MB-231V, e MRK-nu-1), linhas celular de cancro renal (Caki-1, Caki-2, A498, e ACHN), uma linha celular de cancro da bexiga (T24), uma linha celular de cancro de ovário (SK0V3), a linhas celular de cancro pulmonar (QG5Ã e A549), linhas celulares de cancro pancreático (MIAPaCa-2 e Capan- 2) , uma linha celular de cancro de próstata (PC3), uma linha celular de cancro da cérvix uterina (SWÁ5Ã), uma linha celular de fibrossarcoma (HT10S0), linhas celulares de tumor cerebral (T98G, U8ÁMG, U251, SNB19, e U3Á3), linhas celulares de cancro gástrico (MNK28 e MNK45), linhas celulares de cancro de intestino grosso (HT29, Lovo, CaCo2, SW480, e HCT11Ã) , uma linha de células de leucemia (AML5), e uma linha celular de linfoma (Ramos) foram examinadas utilizando um kit de ensaio QIFIKIT para o número de moléculas (Dako Japan Inc.) para o número de moléculas de CAPRIN-1 na sua superfície celular reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 n. 0 1. De forma semelhante, o número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície destas várias células de cancro também foi examinado utilizando os anticorpos comparativos 1 a 11, que são os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 preparados no Exemplo 4.

De acordo com o protocolo anexo ao kit, o anticorpo n.° 1 e os anticorpos comparativos 1 a 11 foram diluídos em 5 pg/mL (em termos de concentração final ) com PBS, e esta diluição foi adicionada a cada linha celular e feita reagir durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, os anticorpos anti-IgG de ratinho marcados com fluorescência anexos ao kit foram adicionados como anticorpos secundários, juntamente com esferas de calibração anexas ao kit, a cada linha celular e deixada a repousar durante 45 minutos em gelo. Cada linha celular e as esferas de calibração foram lavadas com PBS. Posteriormente, mediu-se a intensidade de fluorescência utilizando um FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company) para obter o valor de iç (média). Além disso, anticorpos comparativos foram medidos de forma semelhante como acima para obter uma média. 0 controlo negativo utilizado foi células feitas reagir com anticorpos de controlo de isotipo. e uma média também foi obtida. Cada valor de intensidade de fluorescência média (média) foi utilizado para calcular o número de moléculas de acordo com o protocolo anexo ao kit. Como um resultado, o número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície de várias células de cancro reconhecidas pelo anticorpo n. 0 1 foi de 105 ou mais por célula para todas as linhas celulares humanas examinadas. Por outro lado, o número de moléculas reconhecidas pelos anticorpos monoclonais comparativos 1 a 11 foi inferior a 10b por célula.

Aplicabilidade Industrial 0 anticorpo da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção do cancro.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Toray Industries, Inc.

< 12 0 > COMPOSIÇÃO DE FÁRMACO PARA 0 TRATAMENTO E/OU A

PREVENÇÃO DE CANCRO

<13Ο> PH-5303 -PCT <150> JP 2011-1Á1303 <151> 04-08-2011 <1Ã0> 38 <1Á0> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 55Ã2 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (190) . . (2319) <223 > < 4 0 0 > 1 cagagggctg etggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgc.gcc.ca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc teg gee acc age cac age ggg age ggc age aag teg 231

Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 15 10 tee gga ecg cca ecg ecg tc.*g ggt tee tee yy^ agt yc(g yee ycy 2f3

Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gee ggg gee gee geg ccg get tet cag cac ccc gca acc ggc acc 327

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc get gtc cag acc gag gee atg aag cag att ate ggg gtg ate gac 375

Gly Ala Val Gin Thr Gin Ala Met lys Gin He Leu Gly Val He Asp

50 55 SO aag aaa ett egg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ett gat gat tac 423

Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa ega atg aac aaa ggg gaa agg ett aat caa gat cag ctg gat 471

Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp SO 85 90 gee gtt tot aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519

Ala Val Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Aen Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca eta agt caa gat att cag aaa aca 567

Glu Leu Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca cca cgt egg gag cag ctt atg aga gaa gaa get gaa 615 lie Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663

Gin Lys Arg Leu Lys Thr Vai Leu Glu Leu Gin Tyr Vai Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711

Leu Gly Asp Asp Glu Vai Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tea ttg ttg gat gaa ttc tat 759

Vai Pro lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag cta gta gac act gaa egg gac atg age ttg agg ttg aat gaa cag 807

Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Glu 195 200 205 tat gaa cat gee tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855

Tyr Glu His Ala Ser He His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903

Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tea aac tac ttt gac age acc cac aac cac cag aat 951

Arg Val Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr eis Asn His Gin Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gea gee tea gea cct gea gtt gaa gac 999

Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa get gaa cct gag cca gea gaa gag tac act gag caa 1047

Gin Val Pro Glu Ãla Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin 275 280 285 agt gaa gtt gaa tea aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gea gaa 1095

Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Aen Arg Gin Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143

Thr Gin Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tea etc cag cag caa cct c.ag get gea 1191

Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala 320 325 330 tee cct tea gta cca gag ccc cac tet ttg act cca gtg get cag gea 1239

Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gea caa atg 1287

Asp Pro Leu val Arq Arg Gin Arg val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tea atg ctg gat ttt gaa aat 1335

Gin Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ctt gat cet gee att gta tet gca cag cct atg aat cca aca 1383

Gin Thr Leu Asp Pro Ala lie val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gae atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tet gaa 1431

Gin Asn Met Asp Met Pro Gin leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 405 410 tet aga ctt get cag cct aat caa gtt cct gta caa cca gaa geg aca 1479

Ser Arg Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tea tee aca agt gag ggg tac aca gca tet caa 1527

Gin val Pro Leu val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tet cat get aca gag caa ega cca cag aag gaa 1575

Pro Leu Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gca aca ate tet tta aat aca gac cag act 1623

Pro lie Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr 465 470 475 aca gca tea tea tcc ctt cct get gcq tet cag cct caa gta ttt cag 1671

Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin 480 485 490 get ggg aca age aaa cct tta cat age agt gga ate aat gta aat gca 1719

Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 get cca ttc caa tec atg caa aeg gtg ttc aat atg aat gee cca gtt 1767

Ala Pro Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815

Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin 530 535 540 gee agt tat aac cag age ttt tet agt cag cct caa caa gta gaa caa 1863

Ala Ser Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911

Thr Glu Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tec cca gac cag tec cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959

Gly Ser Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt age aat cag ccc tat tac aat 2007

Pro Gin Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tet cgt gga ggc tec cgt ggt get aga ggc ttg atg 2055

Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly leu Met 610 615 620 aat gga tac egg ggc cct gee aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103

Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tea ttc tet aac act cca aac agt ggt tat aea cag tet 2151

Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser 640 645 650 cag ttc. agt get ccc egg gat tac tet ggc. tat caa cgg gat gga tat 2199

Gin Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag ega ggc tet ggg cag agt gga cca egg gga gee 2247

Gin Gin Asn Phe lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca ega ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa 2295

Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin 690 695 700 atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt ttaatcgcca 2349 Met Asn Thr Gin Gin Vai Asn 705 aaaacacact ggccagtgta ccataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct 2409 ccctttcagg aaacttattg taaagggaet gttttcatcc cataaagaca ggactacaat 2469 tgtcagcttt etattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca tgttctgt.cc 2529 taagcgtcat cttgagcctt gcacatgata ctcagattcc tcacecttge ttaggagtaa 2539 aacaatatac tttaeagggt gataataatc tccatagtta tttgaagtgg cttgaaaaag 2649 gcaagattga cttttatgac attggataaa atctacaaat cagccctcga gttattcaat 2709 gataachgac aaactaaatt. atttccctag aaaggaagafc gaaaggagtg gagtgtggtt 2769 tggcagaaca actgcatttc acagcttttc cagttaaatt ggagcactga acgttcagat 2829 goataccaaa ttatgcatgg gtcctaatca cacatataag gctggctacc agatttgaca 2839 cagcactgtt catctggcca aacaactgtg gttaaaaaca catgtaaaat gctttttaac 2949 agctgatact gtataagaca aagceaagat gcaaaattag gctttgattg gcactttttg 3009 aaaaatatgc aacaaatatg ggatgtaatc cggatggccg cttctgtact taatgtgaaa 3069 tatttagata cctttttgaa cacttaacag tttctttgag aoaatgactt ttgtaaggat 3129 tggtactatc tateattect tatgaeatgt acattgtctg tcactaatcc ttggattttg 3189 ctgtattgtc acctaaattg gtacaggtac tgatgaaaat ctctagtgga taatcataac 3249 actctcggtc acatgttttt cettcagctt gaaagctttt ttttaaaagg aaaagataec 3309 aaatgcctgc tgctaccacc ctttteaatt gctatctttt gaaaggcacc agtatgtgtt 3369 ttagattgat ttccctgttt cagggaaatc acggacagta gtttcagttc tgatggtata 3429 agcaaaacaa ataaaacgtt tataaaagtt gtatcttgaa acactggtgt tcaacagcta 3439 gcagcttatg tgattcaccc catgccacgt tagtgtcaca aattttatgg tttatctcca 3549 gcaacatttc tctagrtactt gcacttatta tcttttgtct aatttaaccjt taactgaatt 3609 ctocgtttot cctggaggca tttatattca gtgataattc ottcccttag atgcataggg 3669 agagtctct» aatttgatgg aaatggacac ttgagtagtg acttagcctt atgtactctg 3729 ttggaatttg tgctagcagt ttgagcacta gttctgtgtg cctaggaagt taatgctgct 3789 tattgtctca ttctgacttc atggagaatt aatcccacct ttaagcaaag getactaagt 3849 taatggtatt ttctgtgcag aaattaaatt ttattttcag catttagccc açgaattctt 3909 ccagtaggtg ctoagctatt taaaaacaaa actattctea aacattcatc attagaeaac 3969 tggagttttt gctggttttg taacctacca aaatggatag gctgttgaac attccacatt 4029 caaaagtttt gtagggtggt gggaaatggg ggatcttcaa tgtttatttt aaaataaaat 4089 aaaataagtt cttgactttt etcatgtgtg gttgtggtao atcatattgg aagggttaac 4149 ctgttacttt ggcaaatgag tatttttttg ctagcaoctc cccttgcgtg ctttaaatga 4209 catctgcctg ggatgtacca caaccatatg ttacctgtat cttaggggaa tggataaaat 4269 atttgtggtt tactgggtaa tccctagatg atgtatgctt gcagtcctat ataaaactaa 4329 atttgctatc tgtgtagaaa ataatttcat gacatttaca atcaggactg aagtaagttc 4389 ttcacacagt gacctctgaa tcagtttcag agaagggatg ggggagaaaa tgccttctag 4449 gttttgaact tctatgcatt agtgcagatg ttgtgaatgt gtaaaggtgt tcatagtttg 4509 actgtttcta tqrtatgtttt ttcaaagaat tgttcctttt tttgaactat aatttttctt 4569 tttttggtta ttttaccatc acagtttaaa tgtatatctt ttatgtctot actcagacca 4629 tatttttaaa ggggtgcctc attatggggc agagaacttt tcaataagtc tcattaagat 4689 ctgaatcttg gttctaagca ttctgtataa tatgtgattg cttgtcctag ctgcagaagg 4749 ccttttgttt ggtcaaatgc atattttagc agagtttcaa ggaaatgatt gtcacaeatg 4809 tcactgtagc ctcttçrgtgt agcaagctca catacaaaat acttttgtat atgcataata 4869 taaatcatct catgtggata tgaaacttct tttttaaaac ttaaaaaggt agaatgttat 4929 fcgattacctt gattagggca gttttatttc cagatcctaa taattcctaa aaaatatgga 4989 aaagtttttt ttcaatcatt gtaccttgat attaaaacaa atatccttta agtatttcta 5049 atcagttagc ttctacagtt cttttgtctc cttttatatg cagctcttac gtgggagact 5109 tttccactta aaggagacat agaatgtgtg cttattctca gaaggttcat taactgaggt 5169 gatgagttaa caactagttg agcagtcagc ttcctaagtg ttttaggaca tttgttcatt 5229 atattttccg tcatataact agaggaagtg gaatgcagat aagtgccgaa ttcaaaccct 5289 tcattttatg tttaagctcc tgaatctgca ttccacttgg gttgttttta agcattctaa 5349 attttagttg attataagtt agatttcaca gaatcagtat tgcccttgat cttgtccttt 5409 ttatggagtt aacggggagg aagacccctc aggaaaacga aagtaaattg ttaaggctca 5469 tcttcatacc tttttccatt tfcgaatccta caaaaatact gcaaaagact agtgaatgtt 5529 taaaattaca ctagattaaa taatatgaaa gtc 5562

< 210 > 2 <211> Á09 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30

Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45

Val Gin Thr Gin Ala Met Lys Gin He Leu Gly Val lie Asp Lys lys 50 55 60

Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gin Glu 65 70 75 80

Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp Ala Val 85 90 95

Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110

Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr He Lys 115 120 125

Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lys 130 135 140

Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175

He Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu 180 185 190

Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205

His Ala Ser lie His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lye Pro 210 215 220

Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu lie Val Glu Arg Val 225 230 235 240

Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Sar Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255

Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gin Val 260 265 270

Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin Ser Glu 275 280 285

Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu Thr Gin 290 295 300

Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320 val Glu val val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335

Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350

Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met Gin Gly 355 360 365

Pro Tyr Asn Phe He Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gin Thr 370 375 3B0

Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr Gin Asn 385 390 395 400

Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415

Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430

Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445

Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu Pro He 450 455 460

Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 465 490 495

Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly He Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510

Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525

Val Asn. Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin Ala Ser 530 535 ~ 540

Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin Thr Glu 545 550 555 560

Leu Gin Gin Glu Gin leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575

Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590

Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg 595 600 605

Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 620

Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640

Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Gin Phe 645 650 655

Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr Gin Gin 660 665 670

Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 680 685

Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin Met Asn 690 695 700

Thr Gin Gin Val Asn 705 <210> 3 <211> 3553

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <220>

< 2 21> CDS <222 > (190) . . (22Á4) <223 > <400> 3

cagagggctg ctggctggct aagtacctcc cgctcacggc tctcgcctca ctaggagcgg SO ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctocgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc age cac age ggg age ggc age aag teg 231

Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 15 10 tee gga ccg cca ccg ccg teg ggt tee tea ggg agt gag gag gcc gcg 279

Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gee ggg gee gee gcg ccg get tet cag cac ccc gea acc ggc acc 327

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc get gtc cag acc gag gee atg aag cag att etc ggg gtg ate gac 375

Gly Ala Vai Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Vai lie Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423

Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa ega atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471

Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tet aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gea aaa 513

Ala Vai Ser Lys Tyr Gin Glu Vai Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag Agg agt ttc atg gea eta agt caa gat att cag aaa aca 567

Glu Leu Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp Ile Gin Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gea cgt egg gag cag ctt atg aga gaa gaa get gaa 615 lie Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663

Gin Lys Arg Leu Lys Thr Vai Leu Glu Leu Gin Tyr Vai Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gae ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711

Leu Gly Asp Asp Glu Vai Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tea ttg ttg gat gaa ttc tat 753 val P r. o He Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr

3.75 180 185 ISO aag eta gta gae cct gaa egg gae atg age ttg agg ttg aat gaa cag 807

Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin. 195 200 205 tat gaa cat gcc tee att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855 ryr Glu His Ala Ser lie His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt eta aag gaa att gtt gag 903

Lys Pro val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys val Leu Lys Glu lie val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tea aac tac ttt gac age acc cac aac cac cag aat 951

Arg Val Fhe Gin Ser Asn Tyr Fhe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gcc tea gca cct gca gtt gaa gac 939

Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Fro Ala val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa get gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047

Gin Val Fro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin 275 280 285 agt gaa gtt gaa tea aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1035

Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143

Thr Gin Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin val Asp Glu Trp Thr val 305 310 315 gaa aeg gtt gag gtg gta aat tea etc cag cag caa cct cag get gca 1131

Glu Thr val Glu val val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala 320 325 330 tcc cct tea gta cca gag ccc cac tet ttg act cca gtg get cag gca 1239

Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala 335 340 345 350 gat ccc ett gtg aga aga cag ega gta caa gac ett atg gca caa atg 1287

Asp Pro Leu val Arg Arg Gin Arg val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tea atg ctg gat ttt gaa aat 1335

Gin Gly Pro Tyr Asn Phe lie Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ett gat cct gcc att gta tet gca cag cct atg aat cca aca 1383

Gin Thr Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr 385 390 335 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tet gaa 1431

Gin Asn Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 405 410 tet aga ett get cag cat aat caa gtt cct gta caa cca gaa geg aca 1479

Ser Arg Leu Ala Gin Pro Asn Gin vai Pro vai Gin Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tea tcc aca agt gag ggg tac aca gea tet caa 1527

Gin Vai Pro Leu Vai Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tet cat get aca gag caa cga cca cag aag gaa 1575

Pro Leu Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lya Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gea aca ate tet tta aat aca gae cag act 1623

Pro He Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr 465 470 475 aca gca tea tea tec ett cct get geg tet cag cct caa gta ttt cag 1671

Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin 480 485 490 get ggg aca age aaa cct tta cat age agt gga ate aat gta aat gca 1719

Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 get cca ttc caa tec atg caa aeg gtg ttc aat atg aat gee cca gtt 1767

Ala Pro Phe Gin Ser Met Gin The Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815

Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin 530 535 540 gee agt tat aac cag age ttt tet agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863

Ala Ser Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin 545 550 555 aca gag ett cag caa gaa cag ett caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911

Thr Glu Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tec cca gae cag tec cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959

Gly Ser Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro 575 5BQ 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt age aat cag ccc tat tac aat 2007

Pro Gin Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tet cgt gga ggc tec cgt ggt get aga ggc ttg atg 2055

Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac egg ggc cct gee aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103

Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Aan Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac ege cct tea ttc tet aac act cca aac agt ggt tat aca cag tet 2151

Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser 640 645 650 cag ttc agt get ccc egg gat tac tet ggc tat caa egg gat gga tat 2199

Gin Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr 655 660 * 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tat ggg sag agt gga cca egg gga gcc 2247

Gin Gin Asn Phe lys Arg Gly Ser Gly Gin Sen Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt aat att ttg tgg tgg tga tcctagctcc taagtggagc 2294

Pro Arg Gly Aan lie leu Trp Trp 690 ttctgttctg gcettggaag agctgttaat agtctgcatg ttaggaatac atttatcctt 2354 tccagacttg ttgctaggga ttaaatgaaa tgctctgttt ctaaaactta atcttggacc 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ecctgttact atataaactg tettgaaaae 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtce 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gacatttttg 2594 gaatgagatfc gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggccggata agccatagtt aacatttaga 2714 gaaccatfcta gaagtgatag aactaatgga atfctgcaatg ccfctttggac ctctattagt 2774 gatataaata tcaagttatt tctgactttt aaaeaaaact eccaaattec taacttattg 2834 agctatactt aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagagct agcatttcat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattggc cataacatgt ataaaatgtg tgttaaggag gaattacaac gtactttgat 3074 ttgaafcacta gtagaaacfcg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgeatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaaetgata gctaaaaate 3254 tgttttaaca gcatgtaaaa agttatttta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagfc ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gttttcattc tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact actgaaatgt aagctagagt gtacactaga 3434 atgtaagctc cafcgagagca ggtaecttgt ctgtcttctc tgctgtatct attcecaacg 3494 cttgatgatg gtgcctggca catagtaggc acteaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553

< 210 > 4 <211> Ã94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 15 10 15

Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30

Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45

Val Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val He Asp Lys Lys 50 55 eo

Leu Arg Asn Leu Glu Lya Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gin Glu 65 70 75 80

Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp Ala Val 85 90 95

Ser Lys Tyr Gin Glu val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110

Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr He Lys 115 120 125

Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lys 130 135 140

Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175

He Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Fhe Tyr Lys Leu 180 185 190

Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205

His Ala Ser He His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro 210 215 220

Val Cya Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu lie Val Glu Arg Val 225 230 235 240

Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255

Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp Gin Val 260 265 270

Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin Ser Glu 275 260 285

Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu Thr Gin 290 295 300

Phe Thr Ser Gly Glu Lye Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320

Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335

Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350

Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met Gin Gly 355 360 365

Pro Tyr Asn Phe lie Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gin Thr 370 375 380

Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr Gin Asn 385 330 335 400

Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415

Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430

Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445

Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu Pro lie 450 455 ' 460

Asp Gin He Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 485 490 495

Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510

Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525

Vai Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin Ala Ser 530 535 540

Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Vai Glu Gin Thr Glu 545 550 555 560

Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Vai Vai Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575

Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590

Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg 595 600 * €05

Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 * 620

Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640

Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Gin Phe 645 650 655

Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr Gin Gin 660 665 670

Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 680 685

Gly Asn lie Leu Trp Trp 690

<210> 5 < 211 > 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5

Asp lie Tyr Met 1 < 210 > Ã

< 211> ΙΑ <212> PRT <213> Mus musculus <400> Ã

Lys 11« Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lye Tyr Asp Pro Lys Ph« Gin 1 5 10 15

Gly

<210> Á <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus

< 4 0 0 > A

Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 15 10 <210> 8 <211> 10Ã

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr 15 10 15

Ala Ser Gly Leu Asn lie Arg Asp lie Tyr Met His Trp Val Lys Gin 20 25 30

Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Lys lie Asp Pro Ala Asn 35 40 45

Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr 50 55 60

Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Val Gin Leu Ser Ser Leu Thr 65 70 75 80

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Gly Asp Tyr Trp 85 90 95

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105

<210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9

Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr 1 5 10 15 <210> 10 <211> Á

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5

<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Arg Gin Ser Tyr Asn. Leu Val Thr Phe 1 5

<210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Gly Thr Cys Gly Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala 15 10 15

Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser 20 25 30

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Val Gin His 35 40 45

Lys Pro Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Arg Gin Ser Tyr Asn Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Pro Ser 100 105 110 <210> 13 < 211> 318

< 212 > ADN <213> Mus musculus <400> 13

ggggcagagc tfcgtgaagcc aggggcctca gtcaagttgt cctgcacagc ttctggcctc SO aacattagag acatttatat gcactgggtg aagcagaggc ctgaacaggg ccfcggagtgg 120 attggaaaga ttgatcctgc gaatggtaat actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag 180 gccactataa cagcagacac atcctccaac actgcctatg tgcagctcag cagcctgaca 240 tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct gggactggtg actactgggg ccaagggacc 300 aeggfccacicg tGticGt-ca 318

< 210 > 14 <211> 33Ã <212> ADN <213> Mus musculus <400> 14

ggtacctgtg gggacattgt gatgtcacag tctccatcct ccctggctgt gtcagcagga SO gagaaggtca ctatgagctg caaatccagt cagagtctgc tcaacagtag aacccgaaag 120 aactacttgg cttgggtcca gcscaaacca gggcagtctc ctagactact aatctactgg 180 gcatccacta gggaatctgg ggtcectgat cgcttaaeag gcagtggatc tgggaeagat 240 tteactatca caatcagaag tgtgaaggct gaggaactgg cagttfcatta atgcaggcaa 300 tcttataatc tggtcacgtt cggtgctgga ccaagc 336

<210> 15 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser val Tyr 145 <210 > 1Ã

<211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1Ã

Met Ser Vai Leu Thr Gin Vai Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 15 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45

Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro 50 55 60

Gin Leu Leu Vai Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp 100 105 110

Ser Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Vai Ser Asn Pro Tyr Asp 130 135 <210 > 1Á

<211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1Á

Met Glia Trp Sec Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Sec Gly The Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Sec Val Lys lie Sec Cys Lye Ala Sec Gly Tyr The Phe 35 40 45

The Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Sec His Gly Lys Sec Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser The Sec Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala The Leu The Val Asp Lys Sec Sec Sec 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Sec Leu Thr Sec Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Sec Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18

Ala Val Leu Arg Cys Ser Arg Gly Leu Leu Val lie Trp lie Ser Asp 1 5 10 15 lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu 20 25 30

Lvs Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Trp Ser Val 35 40 45

Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Arg Gin Pro 50 55 60

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser lie Arg Glu Ser Trp Val Pro

65 70 75 SO

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 85 90 95

Ser Asn Val His Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Asn 100 105 110

His Gly Ser Phe Leu Pro Ser Arg Ser Glu Gin Val Pro Ser Trp Arg 115 120 125

Ser Asn Asn Arg 130

<210> 19 <211> 148 <212> PRT <213> Mus muscuius <40G> 19

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 * 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 20 <211> 11A <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Arg Thr Thr Ser His Met Asp Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro 15 10 15

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg 20 25 30

Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin 35 40 45

Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 50 55 €0

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser €5 70 75 80

Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 85 90 95

Gin His Phe Trp Ser Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 lie Lys Gin Ser Asp 115

<210> 21 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <40G> 21

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Set Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp He Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 22 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Ser Gly Asp Arg vai Ser Lew Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser 15 10 15

Asn Tyr Leu Ris Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Ris Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30

Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Xle Ser Gly He Pro Ser Arg Phe 35 40 45

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Vai 50 55 60

Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp 65 70 75 80

Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gin 85 90

<210> 23 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp He Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 24 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24

Gly Leu Phe Cys Ser Val Glu Arg Cys His Tyr Gin Leu Gin Ser Ser 15 10 15

Gin Asn Leu Leu Ser lie Val Asn Arg Tyr His Tyr Met Ser Gly Asn 20 25 30

Pro Pro Lye Leu Leu Val Tyr Pro Ala Leu Leu lie Tyr Glu Ala Ser 35 40 45 lie Thr Lys Ser Cys Val Pro Asp Arg Phe Thr Arg Ser Gly Ser Gly 50 55 eo

Thr Asn Phe Thr Leu Thr He Asn Phe val His Ala Asp Asp Leu He 65 70 75 80

Phe Tyr Tyr Cys Gin His Asn Arg Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ser Ser 85 90 95

Val Gin Val Pro Arg Arg Arg Ser Asn 100 105

<210> 25 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25

Asp lie Leu Gin Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 15 10 15

Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp He Gly Leu He 20 25 30

Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys 35 40 45

Ala Thr Leu Thr val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 50 55 60

Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp 65 70 75 80

Gly Val Trp Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 85 90 95 val Ser Ser Lys loo <210> 2Ã

<211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2Ã

Asp Arq Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Arq Thr Ala 15 10 15 val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Arg Gin Ser Pro Lys Ala Leu He 20 25 30

Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Asp Thr Gly Leu Pro Asp Arg Phe Pro Gly 35 40 45

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn He Thr Asn Val Gin Ser 50 55 60

Glu Asp Leu Glu Asp Tyr Phe Cys Leu Gin His Cys Asn Tyr Pro Asn 65 70 75 80

Glu Phe Arg Gly Cys Thr Lys Val Pro lie 85 90 < 210 > 2Á

< 211> 1ΙΑ <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2Á

Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Vai Lys 1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gin 20 25 30

Trp Vai Lye Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Ala Ile 35 40 45

Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu 65 70 75 80

Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 85 90 95

Glu Tyr Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 100 105 110 val Ser Ser Asn 115

<210> 28 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28

Thr Ser Asp Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala 15 10 15

Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr Leu S«r Trp Phe Gin Gin lys Pro Gly 20 25 30

Lys Ser Pro Lys Thr Leu lie Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly 35 40 45

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu 50 55 «0

Thr He Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly He Tyr Tyr Cys Leu

65 70 75 SO

Gin Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 85 90 95 lie Lys Gin Lys 100

<210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 9

Ala Trp Leu Ser Gin Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn He Lys 1 5 10 15

Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu 20 25 30

Trp Tie Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro 35 40 45

Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 50 55 60

Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75 80

Tyr Cys Ala Arg Pro He His Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ala Tyr 85 90 95

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105

< 210 > 3 0 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Glu Phe His Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg 15 10 15

Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lyg Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser 35 40 45

Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg 50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Gly Arg Ser Glu Val 85 90 95

Val Pro Ser Trp Arg Ser Asn Lys 100

< 210 > 31 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31

Pro Arg Ala Ser Leu Gly Val Ser Glu Thr Leu Leu Cys Thr Ser Gly 15 10 15

Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp val Arg Gin Pro Pro Gly 20 25 30

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe lie Arg Asn Lys Ala Asti Gly Tyr 35 40 45

Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg 50 55 60

Asp Asn Ser Gin Ser lie Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala 65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp Ala Phe Asp 85 90 95

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105

<210> 32 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Ser Gly Asp Arg val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser 15 10 15

Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30

Leu He Lys Tyr Ala Ser Gin Ser He Ser Gly He Pro Ser Arg Phe 35 40 45

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val 50 55 60

Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp 65 70 75 80

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Gin 85 90

< 210 > 3 3 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33

Pro Ala Cys Leu Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser 15 10 15

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro 20 25 30

Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly 35 40 45

Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 50 55 60

Arg Asp Asn Ser Gin Ser lie Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Leu Tyr 85 90 95

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 100 105 110

<210> 34 <211> 102 <212> PRT <213> Mus muscuius <400> 34

Arg Leu Pro Phe Tyr Str Leu Glu Gin Arg Ala Thr lie Ser Tyr Arg 15 10 15

Ala Ser Lys Asn Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser 35 40 45

Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin His He Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Leu Val 85 90 95

Pro Ser Trp Lys Ser Asn 100

<210> 35 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 15 10 15

Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Lwu Glu Trp lie Gly Met lie 20 25 30

Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys 35 40 45

Ala Thr Leu Asn Vai Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu 50 55 60

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 65 70 75 80

Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 85 90 95

Thr Vai Ser Ser Lys 100

<210> 3Ã <211> 99 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3Ã

Thr He Leu Trp Arg Glu Gly Pro Phe Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser 15 10 15

Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro 20 25 30

Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60

Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gin His He Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95

Ser Asn Lys

<210> 3Á <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3Á

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lya Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 val val Val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 38 <211> 10Ã

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5Ã9839Ã A [0006] • WO 201001Ã52Ã A [0006] [0117] [0118] [0119] [0120] [0122] [0127] • WO 02434Á8 A [0050] • WO 02092812 A [0050] • JP 200Á5300Ã8 A [0051] • WO 984ÃÁÁÁ A [0051] • EP 239400 A [0055] • WO 9Ã025ÁÃ A [0055] • WO 9951Á43 A [0055] • PH 5303 W [0137] • JP 20111Á1303 A [0137]

Documentos de não patente citados na descrição • BOON et al. Ludwig Institute for Cancer Research, 1991 [0003] • TSUYOSHI AKIYOSHI. Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy. Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc, 19 9Á, vol. 24, 511-519 [0007] • BRUGGEN P. et al. Science, 1991, vol. 254, 1Ã4 3-1Ã4Á [0007] ® Proc, Natl, Acad, Sci. USA, 1995, vol. 92, 11810-11813 [0007] • Int. J. Cancer, 199Á, vol. Á2, 9Ã5-9Á1 [0007] • Cancer Res., 1998, vol. 58, 1034-1041 [0007] • Int. J, Cancer, 1998, vol. 29, Ã52-Ã58 [0007] • Int. J. Oncol., 1999, vol. 14, Ã03-Ã08 [0007] • Cancer Res., 199Ã, vol. 5Ã, 4ÁÃÃ-4ÁÁ2 [0007] • Hum. Mol. Gene, 199Á, vol. Ã, 33-39 [0007] • KARLIN ; ALTSCHUL. Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 1993, vol. 90, 58Á3-58ÁÁ [0020] • ALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res. , 199Á, vol. 25, 3389-3402 [0020] ® Seikagaku Jikken Koza. Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide

Synthesis. Tokyo Kagaku Doj in Co., Ltd, 1981 [0023] • Molecular Cloning. SAMBROOK et al. Current Protocols in Molecular Biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0023] ® A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. AUSUBEL et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley &amp; Sons, 1995 [0023] ® A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. AUSUBEL et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley &amp; Sons, 1995 [0024] • Molecular Cloning. SAMBROOK et al. Current Protocols in Molecular Biology. 1989 [0025] • J. Immunol., 19Á9, vol. 123, 1548-1550 [0041] • Current Topics in Microbiology and Immunology, 19Á8 , vol. 81, 1-Á [0041] • KOHLER. G. ; MILSTEIN, C. Eur. J. Immunol., 19ÁÃ, vol. Ã, 511-519 [0041] • MARGULIES. D.H. et al. Cell, 19ÁÃ, vol. 8, 405-415 [0041] • SHULMAN, M. et al. Nature, 19Á8, vol. 2ÁÃ, 2Ã9-2Á0 [0041] • GROTH, S.F. et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 35, 1-21 [0041] • TROWBRIDGE, I.S. J. Exp. Med. , 19Á8, vol . 148, 313-323 [0041] • GALFRE, G. et al. Nature, 19Á9, vol. 2ÁÁ, 131-133 [0041] • KOHLER, G. ; MILSTEIN, C. Methods Enzymol. , 1981, vol. Á3, 3-4Ã [0042] • CARL, A.K. BORREBAECK ; JAMES, W. LARRICK. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES. MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 [0052] • SATO K. etal. Cancer Research, 1993, vol. 53, 851 -85Ã [00553 [0056] • HASHIMOTO-GOTOH, T. et al. Gene, 1995, vol. 152, 2Á1-2Á5 [0061] • ZOLLER, MJ. ; SMITH, M. Methods Enzymol. , 1983, vol . 100, 4Ã8-500 [0061] • KRAMER, W. et al. Nucleic Acids Res. , 1984 , vol. 12 , 9441 - 945Ã [0061] • KRAMER, W. ; FRITZ, HJ. Methods Enzymol., 198Á, vol. 154, 350-3ÃÁ [0061] • KUNKEL, TA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 1985, vol. 82, 488-492 [0061] • KUNKEL. Methods Enzymol. , 1988, vol . 85, 2ÁÃ3-2ÁÃÃ [0061] • RABAT et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Public Health Service, National Institute of Health, 1991 [0070] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0071] · G.B. KIM et al.

Protein Engineering Design and Selection, 200Á, vol. 20 (9), 425-432 [0074] • P.J. DELVES . ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES ., 199Á WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies. OXFORD UNIVERSITY PRESS, 2000 [0076] • J.W. GODING. Monoclonal Antibodies : principles and practice . ACADEMIC PRESS, 1993 [0076] • NIWA R. Clinical Cancer Research, 15 March 2005, vol. 11 (Ã) , 232Á-233Ã [0091]

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 5, Ã, e Á e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOS: 9, 10, e 11.
2. 2. O anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples, ou um anticorpo multiespecífico. 3. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo é conjugado com um agente anti-tumoral. 4 . 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer reivindicação anterior, para utilização num método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro. 5. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovãrico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma. Ã. Uma composição farmacêutica, que compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 como um ingrediente ativo. Á. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação Ã, para utilização num método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro.
3. 8. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação Á, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovãrico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma.
4. 9. Uma composição farmacêutica, que compreende uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação à e uma composição farmacêutica que compreende um agente anti-tumoral.
5. 10. A combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, para utilização num método para o tratamento e/ou a prevenção de cancro.
6. 11. A combinação farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro do intestino grasso, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro da cérvix uterina, cancro ovárico, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma, ou melanoma.
7. 12 . Um ADN que codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2.