JP2016210800A - Wt1抗原性ポリペプチド、及び該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】
由来の異なる多くのT細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供すること。
【解決手段】
WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びWT1タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含むポリペプチド。
【選択図】 なし
由来の異なる多くのT細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供すること。
【解決手段】
WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びWT1タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含むポリペプチド。
【選択図】 なし
Description
本発明は、がん免疫療法に利用可能な、ウィルムス(Wilms)腫瘍遺伝子WT1にコードされるWT1タンパク質由来の抗原性ポリペプチドと、当該ポリペプチドに特異的なT細胞を製造する方法と、当該ポリペプチド等を含む抗腫瘍剤とに関する。
難治性の疾患であるがん(悪性新生物)に対する治療法の一つに、患者個体の持つ免疫系を利用してがん細胞を退縮させる、いわゆるがん免疫療法が挙げられる。この方法における重要な点は、如何にして免疫系にがん細胞を異物として認識させ、がん細胞に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くかである。
抗腫瘍免疫に関与する重要な免疫細胞に、細胞表面蛋白質であるCD8を発現しているT細胞(CD8+T細胞)と、細胞表面蛋白質であるCD4を発現しているT細胞(CD4+T細胞)とがある。CD8+T細胞は、活性化された場合、HLAクラスI分子に結合する抗原を提示している細胞を溶解するT細胞(細胞傷害性T細胞、CTL)である。CD4+T細胞はサイトカインを分泌するTh細胞であって、MHCクラスII分子により抗原を提示するマクロファージ及び/又は樹状細胞等により活性化され、CD8+T細胞の誘導及び維持のためのヘルパー機能を発揮する。また、Th細胞は分泌するサイトカインの種類によってTh1細胞(IFN−γ等を産生する細胞)、Th2細胞(インターロイキン−4等を産生する細胞)及びTh0細胞(サイトカイン産生能は低いか、あるいはIFN−γ、IL−4等を共に産生する細胞)に分類されることが知られており、各細胞の役割も解明されつつある。またCD4+T細胞は、MHCクラスII分子陰性腫瘍(MHCクラスII−腫瘍)に対する間接的な機構によって、例えばマクロファージの活性化やキラーT細胞、NK細胞を介して、またはMHCクラスII陽性腫瘍に対する直接的な機構によって、エフェクター機能を持つこともできる。
これまで、ヒトのがん免疫治療におけるT細胞の研究は、CD8+HLAクラスI拘束性CTL応答の同定及び誘導に焦点が絞られていた(特許文献1)。CD4+T細胞については、がん抗原の一つであるチロシナ一ゼとそのCD4+T細胞に対するエピトープ(ヘルパーエピトープ)の同定が報告されている(特許文献2)。チロシナ一ゼは、メラノサイト系列の正常細胞及び腫瘍細胞の中で発現され、CD4+メラノーマ反応性T細胞の特異的標的として示された、MHCクラスII分子に結合するメラノーマ会合性組織特異的抗原である(非特許文献1)。しかし、チロシナ一ゼは限られた型の腫瘍でのみ発現する抗原であり、がん免疫治療における有望ながん抗原であるとは言い難い。
本発明者らの一部は、MAGEと称される、CD8+T細胞によって認識される腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリーに着目し、その内の一つであるMAGE−A4タンパク質に由来するポリペプチド断片ががんワクチンペプチド(ヘルパーエピトープ)として有用であることを見いだしている(特許文献3)。しかし、MAGE−A4タンパク質が発現しているがんの種類には制限があるため、より多くの種類のがんに対しても免疫応答を誘導し得る新たなポリペプチドの創出に対する期待は、依然として高い。
一方、WT1タンパク質は、白血病や種々の固形がんで高発現しているウィルムス(Wilms)腫瘍遺伝子WT1にコードされているタンパク質である。がんワクチンペプチドの候補として期待され、多くの研究者によってWT1タンパク質に由来する多数のヘルパーエピトープやキラーエピトープが報告されている、がん関連タンパク質の代表例である(特許文献4〜6、非特許文献1〜3)。
また、このようなヘルパーエピトープやキラーエピトープによって誘導される免疫応答は、HLA遺伝子の多型性によって制御(拘束)される(後述の表1〜5「HLA拘束性」 参照)。また、同一のHLAアレルを有する患者に由来するT細胞間でもヘルパーエピトープやキラーエピトープによる免疫応答に関し、その有無や強弱に差異があることも知られている。ゆえに、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、より多くの種類のがんに対して、より強い免疫応答を誘導し得るポリペプチドが求められている。
この点に関し、本発明者らによって、ヘルパーエピトープ1個とキラーエピトープ1個とを結合させた長鎖ポリペプチド(ヘルパー/キラー−ハイブリッドエピトープロングペプチド;H/K−HELP)が開発されており、さらにこのH/K−HELPを用いることによって、該ヘルパーエピトープ及び該キラーエピトープを混合して用いた場合に比べ、抗原特異的な免疫応答(抗原特異的なCTL及びTh細胞の産生)をより効率良く誘導できることも明らかにされている(非特許文献4)。また、かかるH/K−HELPに関しては、MAGEタンパク質由来のヘルパーエピトープ1個とMAGEタンパク質由来のキラーエピトープ1個とを結合させてなるH/K−HELPを大腸がんが肺に転移したヒト患者に投与することによって、MAGEに対して特異的な免疫応答が強く誘導され、当該患者における腫瘍増殖並びにCEA腫瘍マーカーが有意に減少することも、本発明者によって実証されている(非特許文献4及び5)。
Oka Y.ら、Current Medicinal Chemistry、2008年12月、15巻、29号、3052〜3061ページ
Kobayashi H.ら、Cancer Immunol Immunother.、2006年7月、55巻、7号、850〜860ページ
Borbulevych OYら、Mol Immunol.、2010年9月、47巻、15号、2519〜2524ページ
大竹淳矢ら、「ヘルパー/キラーハイブリッドロングペプチド(H/K−HELP)はショートペプチドに比べて優れたがん抗原特異的Th1,Tc1細胞誘導能を示す」、第71回日本癌学会学術総会記事、2012年8月30日発行、101ページ
Takahashi N.ら、Cancer Sci.、2012年1月、103巻、1号、150〜153ページ
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して、免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成すべく、白血病や種々の固形がんで高発現している腫瘍遺伝子WT1にコードされているタンパク質に着目し、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープ1個とWT1タンパク質由来のキラーエピトープ1個とを結合させてなるH/K−HELPを調製してT細胞を刺激し、これらエピトープを混合してT細胞を刺激する場合と比較した。しかしながら、予想に反して、非特許文献4及び5において確認されていた免疫応答の亢進等は確認することができなかった。
一方、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを合わせて3個以上結合してなるH/K−HELPによってT細胞を刺激した場合には、これらエピトープを混合してT細胞を刺激する場合と比較し、由来の異なるより多くのCD4+T細胞及びCD8+T細胞を刺激し、サイトカイン(IFN−γ)を産生するTh1細胞及びCTLをより多く誘導できることを見出した。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合しているH/K−HELPによりT細胞を刺激することによって、ヘルパーエピトープの片方の側にキラーエピトープが2個結合しているH/K−HELPにてT細胞を刺激した場合と比較して、由来の異なるより多くのCD4+T細胞を刺激し、IFN−γを産生するTh1細胞をより多く誘導できることを見出し、下記の各発明を完成させた。
<1> WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びWT1タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含むポリペプチド。
<2> 前記融合ポリペプチド1分子あたり1個の前記ヘルパーエピトープと2個の前記キラーエピトープとを含む、<1>に記載のポリペプチド。
<3> 前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合している、<2>に記載のポリペプチド。
<4> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号:2〜39に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号:40〜45に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列である、<1>〜<3>のうちのいずれか一に記載のポリペプチド。
<5> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:5に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:40及び/又は44に記載のアミノ酸配列である、<2>に記載のポリペプチド。
<6> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:5に記載のアミノ酸配列であり、前記ヘルパーエピトープのアミノ末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:40に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記ヘルパーエピトープのカルボキシル末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:44に記載のアミノ酸配列である、<3>に記載のポリペプチド。
<7> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
<8> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む、WT1タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するT細胞をインビトロで製造する方法。
<9> <8>に記載の製造方法により製造されたT細胞を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
<10> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドをさらに含む、<9>に記載の抗腫瘍剤。
<11> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
<12> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドによってパルスされた抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
<2> 前記融合ポリペプチド1分子あたり1個の前記ヘルパーエピトープと2個の前記キラーエピトープとを含む、<1>に記載のポリペプチド。
<3> 前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合している、<2>に記載のポリペプチド。
<4> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号:2〜39に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列は、配列番号:40〜45に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも一のアミノ酸配列である、<1>〜<3>のうちのいずれか一に記載のポリペプチド。
<5> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:5に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:40及び/又は44に記載のアミノ酸配列である、<2>に記載のポリペプチド。
<6> 前記ヘルパーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:5に記載のアミノ酸配列であり、前記ヘルパーエピトープのアミノ末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:40に記載のアミノ酸配列であり、かつ前記ヘルパーエピトープのカルボキシル末端側に結合している前記キラーエピトープのアミノ酸配列が、配列番号:44に記載のアミノ酸配列である、<3>に記載のポリペプチド。
<7> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
<8> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む、WT1タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するT細胞をインビトロで製造する方法。
<9> <8>に記載の製造方法により製造されたT細胞を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
<10> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドをさらに含む、<9>に記載の抗腫瘍剤。
<11> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
<12> <1>〜<6>のうちのいずれか一に記載のポリペプチドによってパルスされた抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤。
本発明によれば、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して、IFN−γ等のサイトカインの産生等の免疫応答を強く誘導することを可能とするポリペプチドを提供することが可能となる。
<本発明のWT1タンパク質に由来する抗原性ポリペプチド>
後述の実施例において示す通り、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを合わせて3個以上結合して長鎖ポリペプチドとすることで、これらエピトープを混合してT細胞を刺激する場合と比較し、由来の異なる多くのCD4+T細胞及びCD8+T細胞を刺激し、サイトカインを産生するTh1細胞及びCTLを多く誘導することができる。一方、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを1個ずつ結合して長鎖ポリペプチドとしても、かかるTh1細胞又はCTLの誘導は亢進されなかった。
後述の実施例において示す通り、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを合わせて3個以上結合して長鎖ポリペプチドとすることで、これらエピトープを混合してT細胞を刺激する場合と比較し、由来の異なる多くのCD4+T細胞及びCD8+T細胞を刺激し、サイトカインを産生するTh1細胞及びCTLを多く誘導することができる。一方、WT1タンパク質由来のヘルパーエピトープとキラーエピトープとを1個ずつ結合して長鎖ポリペプチドとしても、かかるTh1細胞又はCTLの誘導は亢進されなかった。
したがって、本発明のWT1タンパク質由来の抗原性ポリペプチドは、WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びWT1タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含むポリペプチドである。
本発明において「ポリペプチド」とは、アミノ酸が複数連結している化合物を意味する。すなわち、所謂ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質も含まれる。また、ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然型であってもよく、非天然型であってもよく、アナログ(アミノ酸のN−アシル化物、O−アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等)であってもよい。また、アミノ酸の側鎖は、化学的に修飾(糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化等)が施されているものであってもよい。さらに、ポリペプチドのアミノ末端や遊離のアミノ基には、ホルミル基、アセチル基、t−ブトキシカルボニル(t−Boc)基等が結合していてもよく、本発明のペプチドのカルボニル末端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、エチル基、t−ブチル基、ベンジル基等が結合していてもよい。
本発明において「WT1タンパク質」とは、白血病や種々の固形がんで高発現しているウィルムス(Wilms)腫瘍遺伝子WT1にコードされているタンパク質を意味し、ヒト由来のWT1タンパク質であれば典型的には、配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質(RefSeq ID:NM_024426.4で特定される塩基配列がコードするタンパク質)である。
また、WT1タンパク質は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。したがって、例えば、ヒトWT1タンパク質には、配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、一般的には、10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、1アミノ酸)である。
本発明において「ヘルパーエピトープ」とは、「Thエピトープ」又は「CD4+ヘルパーエピトープ」とも称される、CD4+T細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有する抗原決定基、これを構成するアミノ酸配列又は該アミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドのいずれかを意味する。本発明において「ヘルパーエピトープ」の長さとしては特に制限はないが、通常5〜30アミノ酸であり、好ましくは7〜25アミノ酸であり、より好ましくは9〜22アミノ酸であり、特に好ましくは16アミノ酸である。
なお、本発明において「免疫応答」とは、T細胞等の免疫を担う細胞が、外来性の異物(細菌、ウィルス等又はそれらの断片)又は内因性の異物(がん細胞等又はそれらの断片)を抗原として認識し、特異的に応答して行われる反応のことをいい、例えば、かかる抗原を認識することにより行われる、IFN−γ等のサイトカインの産生、ひいてはかかるサイトカイン産生等によって誘導される細菌、ウィルス及びがん細胞等の排除が挙げられる。
本発明において「キラーエピトープ」とは、「CTLエピトープ」又は「細胞傷害性T細胞エピトープ」とも称される、CD8+T細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有する抗原決定基、これを構成するアミノ酸配列又は該アミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドを意味する。本発明において「キラーエピトープ」の長さとしては特に制限はないが、通常5〜30アミノ酸であり、好ましくは6〜25アミノ酸であり、より好ましくは8〜20アミノ酸であり、特に好ましくは9アミノ酸である。
抗原性ポリペプチドは、周知の技術(例えば、Paul WE編集、Fundamental Immunology、第3版、243〜247ページ、Raven出版、1993年)を使用して同定され得る。抗原性ポリペプチドを同定するための技術としては、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する能力を指標とした、ポリペプチドのスクリーニング方法が挙げられる。例えば、ELISA及び/又はT細胞反応性アッセイにおいて、実質的にWT1タンパク質全長の反応性以上であるレベルであることを指標として、WT1タンパク質中のポリペプチドにおいて、抗血清及び/又はT細胞と反応する部分を、WT1タンパク質に由来する抗原性ポリペプチドとして選択することができる。このようなスクリーニングは、Harlow及びLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1998に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して実施され得る。
また、エピトープを構成するアミノ酸配列は、コンピュータープログラムを利用した分析によって推測することもできる。ヘルパーエピトープのアミノ酸配列は、MHC−THREAD(http://www.csd.abdn.ac.uk/〜gjlk/MHC−Thread/)、EpiPredict(http://www.epipredict.de/index.html)、HLA−DR4 binding(http://www−dcs.nci.nih.gov/branches/surgery/sbprog.html)、ProPred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)等のコンピュータープログラムによって推測することができる。キラーエピトープのアミノ酸配列は、BIMAS(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SVMHC(http://www.sbc.su.se/svmhc/)、PREDEP(http://bioinfo.md.huji.ac.il/marg/Teppred/mhc−bind/)、NetMHC(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)、PREDICT(http://sdmc.krdl.org.sg:8080/predict/)、LpPep(http://reiner.bu.edu/zhiping/lppep.html)等のコンピュータープログラムによって推測することができる。また、SYFPEITHI(http://syfpeithi.bmi−heidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/EpiPredict.htm)、RankPep(http://www.mifoundation.org/Tools/rankpep.html)等のコンピュータープログラムによって、キラーエピトープ及びヘルパーエピトープのアミノ酸配列を推測することもできる。
これらコンピュータープログラムによって推測されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、CD4+T細胞又はCD8+T細胞を刺激し、その免疫応答を誘導する活性を有しているかは、後述の実施例において示すような、樹状細胞、末梢血細胞又は線維芽細胞を使用するインビトロ刺激アッセイに、かかるポリペプチドを供することによって、評価することができる。また、HLAを発現するトランスジェニックマウス動物を使用するインビボ刺激アッセイに、かかるポリペプチドを供することによって、評価することもできる。
本発明において「WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ」又は「WT1タンパク質に由来するキラーエピトープ」には、天然WT1タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列からなる抗原性ポリペプチドのみならず、その改変体も含まれる。かかる改変体としては、WT1タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入又は付加は、一般的には、10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内、好ましくは3アミノ酸以内、より好ましくは1アミノ酸)であり、本発明の改変体としては、WT1タンパク質の一部の連続したアミノ酸配列において、1個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるものが特に好ましい。
また、本発明にかかる「WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ」の好適な例としては、表1に記載の配列番号:2〜39のいずれか一に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、より好適な例としては、配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明にかかる「WT1タンパク質に由来するキラーエピトープ」の好適な例としては、表5に記載の配列番号:40〜45のいずれか一に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、より好適な例としては、配列番号:40又は44に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
なお、表1〜5に記載のポリペプチドが、CD4+T細胞又はCD8+T細胞に対し、抗原性を有していることは、特許文献4〜6、非特許文献1〜3において実証されている。また、表1〜5に記載の通り、配列番号:9に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(ヘルパーエピトープ8)は、天然のWT1タンパク質における194位アルギニン残基をチロシン残基に置換したものであり、配列番号:42に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(キラーエピトープ3)は、天然のWT1タンパク質における194位アルギニン残基をチロシン残基に置換したものであり、配列番号:44に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド(キラーエピトープ5)は、天然のWT1タンパク質における304位メチオニン残基をチロシン残基に置換したものである。
本発明の「融合ポリペプチド」は、1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個のポリペプチドが人為的に結合してなるものである。前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープの個数が、前記下限未満であると、由来の異なる多くのT細胞を刺激することができなくなり、前記上限を超えると、化学合成等により調製しにくくなる。また、本発明の融合ポリペプチドの鎖長としては特に制限はないが、好ましくは30〜100アミノ酸である。
本発明の融合ポリペプチド1分子あたりに含まれるエピトープ(前記ヘルパーエピトープ又は前記キラーエピトープ)の個数として、1のエピトープに他のエピトープが含まれている場合には、該他のエピトープの個数(1個)は含まれないものとする。例えば、表1に記載のヘルパーエピトープ7(ヒトWT1タンパク質の190〜208番目のアミノ酸からなるポリペプチド)を含む本発明の融合ポリペプチドに関しては、ヒトWT1タンパク質の190〜208番目のアミノ酸には表5に記載の通りキラーエピトープ7(ヒトWT1タンパク質の194〜202番目のアミノ酸からなるポリペプチド)が含まれているが、該融合ポリペプチド1分子あたりに含まれるエピトープの個数に、キラーエピトープ7の個数(1個のキラーエピトープ)は含まれない。また、例えば、表1に記載のヘルパーエピトープ6(ヒトWT1タンパク質の396〜417番目のアミノ酸からなるポリペプチド)を含む本発明の融合ポリペプチドに関しては、ヘルパーエピトープ2〜4(各々、ヒトWT1タンパク質の399〜413番目のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトWT1タンパク質の405〜415番目のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトWT1タンパク質の400〜415番目のアミノ酸からなるポリペプチド)が含まれているが、該融合ポリペプチド1分子あたりに含まれるエピトープの個数に、ヘルパーエピトープ2〜4(3個のヘルパーエピトープ)は含まれない。
本発明の「融合ポリペプチド」において、異なる配列のエピトープを各配列につき1個以上含んでいてもよく、同配列のエピトープを複数個含んでいてもよい。
また、本発明の「融合ポリペプチド」において、前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープの配置については特に制限はなく、前記ヘルパーエピトープ及び前記キラーエピトープは、各々前記キラーエピトープ及び前記ヘルパーエピトープを間に挟むことなく、2個以上連続して配置されていてもよく、また、前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとが交互に配置されていてもよい。
本発明の「融合ポリペプチド」として、好ましくは、1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3個含むものであり、より好ましくは、1個の前記ヘルパーエピトープと2個の前記キラーエピトープとを含むものであり、さらに好ましくは、配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号:40に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号:44に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを含むものである。
また、後述の実施例において示す通り、由来の異なるより多くのCD4+T細胞及びCD8+T細胞を刺激し、抗原特異的にサイトカインを産生するTh1細胞及びCTLをより多く誘導できるという観点から、本発明の「融合ポリペプチド」として、さらに好ましくは、前記ヘルパーエピトープの両側に前記キラーエピトープが結合しているものであり、特に好ましくは、配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端側に配列番号:40に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが結合しており、配列番号:5に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのカルボキシル末端側に配列番号:44に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが結合しているものである。
本発明の「融合ポリペプチド」において、エピトープ間は直接的に結合されていてもよく、間接的に結合されていてもよい。かかる間接的な結合としては、例えば、リンカーポリペプチドを介した結合が挙げられる。かかるリンカーポリペプチドの長さとしては、通常1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、より好ましくは1〜30アミノ酸、さらに好ましくは2〜10アミノ酸(例えば、5アミノ酸)であり、特に好ましくは5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介した結合である。
本発明の融合ポリペプチドは、1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含む限り、タンパク質の分離精製に有用なタグとして汎用されているHisタグや、GFPの様なマーカータンパク質がさらに付加されていたり、またビオチン等の標識化合物が付加されていてもよい。
本発明の融合ポリペプチドは、それらをコードするDNAに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、当該融合ポリペプチドを組み換えタンパク質として製造することが可能である。典型的には、本発明の融合ポリペプチドをコードするDNAを適当なDNA合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばSambrookらのMolecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年等)に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明の融合ポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、先に述べたように、Hisタグの付加等の様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えることができる。
また、本発明の融合ポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することもできる。融合ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第5版 実験化学講座16 有機化合物の合成IV」(相本三郎ら著、日本化学会編)等は、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することができる。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。
<本発明の抗腫瘍剤>
後述の実施例において示す通り、前述の融合ポリペプチドによって、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、それらの免疫応答を強く誘導することができる。したがって、本発明の融合ポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することもできる。
後述の実施例において示す通り、前述の融合ポリペプチドによって、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、それらの免疫応答を強く誘導することができる。したがって、本発明の融合ポリペプチドを有効成分として含有する抗腫瘍剤を提供することもできる。
本発明において「抗腫瘍剤」とは、T細胞を刺激し、それらの免疫応答を誘導することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制、及び/又は該腫瘍細胞の死を誘導することのできる薬剤のことを意味する。すなわち、本発明の抗腫瘍剤には、対象に投与することにより、対象内のT細胞を刺激し、免疫応答を活性化することのできる薬剤(能動免疫療法のための薬剤)のみならず、対象外で刺激され、その免疫応答が活性化されたT細胞等を含む薬剤(受動免疫療法のための薬剤)が含まれる。
また、本発明の「抗腫瘍剤」の治療又は予防の対象となる腫瘍としては、WT1タンパク質が発現しているものであればよく、例えば、白血病(急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病等)及び固形がん(腎芽腫(ウィルムス腫瘍)、腎臓がん、乳がん、肺がん、甲状腺がん、胃がん、腸がん、前立腺がん、卵巣がん、黒色腫等)が挙げられる。
また、本発明の抗腫瘍剤の他の態様としては、本発明の融合ポリペプチド及び、該融合ポリペプチドを用いて製造される、WT1タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するT細胞を有効成分として含有する抗腫瘍剤が挙げられる。
かかる「WT1タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するT細胞」は、例えば、以下の方法にて製造することができる。
本発明の融合ポリペプチドと単核球とをインキュベーションする工程、及び
前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む方法。
前記インキュベーションした単核球と抗原提示細胞とをインキュベーションする工程を含む方法。
本発明において「単核球」とはリンパ球及び単球を意味し、例えば、末梢血単核細胞(PBMC、末梢血単核球)、臍帯血単核細胞、腫瘍組織浸潤リンパ球の態様が挙げられる。なお、腫瘍組織浸潤リンパ球とは、がんを罹患している対象から切除した腫瘍組織中又は採取した胸腹水中から分離したリンパ球のことを意味する。
本発明の融合ポリペプチドと単核球との「インキュベーション」は、例えば、単核球を培養している培地中に、本発明の融合ポリぺプチドを添加することにより行うことができる。また、本発明の融合ポリぺプチドを固相化したプレートにて、単核球を培養することによって行ってもよい。かかるインキュベーションの際の条件としては、単核球の維持に好適であればよく、例えば、単核球を維持するために利用される培地(例えば、血清が添加してあるAIM−V培地)にて、37℃、5%CO2、15分〜48時間培養することが挙げられる。
このようにしてインキュベーションした単核球とインキュベーションする抗原提示細胞としては、前記インキュベーションの際に使用された本発明の融合ポリペプチドが結合し得るHLAをその表面上に発現している細胞であればよく、例えば、樹状細胞、B細胞、マクロファージが挙げられる。また、本発明にかかる抗原提示細胞としては、本発明の融合ポリペプチドがパルスされた前記HLAをその表面上に発現している細胞であってもよい。また、かかる抗原提示細胞は、単核球とインキュベーションする前に、X線照射やマイトマイシン処理等により、増殖能を喪失させたものであってもよい。
かかる抗原提示細胞と単核球とのインキュベーションの際の条件としては、単核球及び抗原提示細胞の維持に好適であればよく、例えば、単核球及び抗原提示細胞を維持するために利用される培地(例えば、AIM−V培地)にて、37℃、5%CO2、1〜7日間にて培養することが挙げられる。また当該インキュベーションの際に、培地には、T細胞を刺激するという観点から、IL−2、IL−7、IL−15、PHA、抗CD3抗体、IFN−γ、IL−12、抗IL−4抗体又はこれらの組み合わせを培地に添加してもよい。さらに、種々のサイトカインを産生させることにより免疫応答を増強させるという観点から、ピシバニール(OK−432)、CpG DNA等のToll様受容体(TLR)のアゴニスト等を培地に添加してもよい。また、この抗原提示細胞と単核球とのインキュベーションは、受動免疫療法に必要なT細胞数を確保するため、複数回繰り返してもよい。
後述の実施例に示す通り、このようにして製造されたT細胞には、本発明の融合ポリペプチド特異的にサイトカインを産生するCD4+T細胞(抗原特異的CD4+T細胞)と、本発明の融合ポリペプチド特異的にサイトカインを産生するCD8+T細胞(抗原特異的CD8+T細胞)とが含まれている。かかるT細胞を精製する方法としては、例えば、本発明の融合ポリペプチドを固相化した担体等を用いて分離することができる。さらに、かかるT細胞は、分泌されるサイトカインを指標として精製することもできる。すなわち、抗原特異的CD4+T細胞は、IFN−γ、IL−2、IL−4等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。
一方、抗原特異的CD8+T細胞は、IFN−γ、TNF−α等のサイトカインを産生するので、これらに対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。
また、かかるT細胞は、各T細胞の細胞表面に発現しているタンパク質に対する抗体を用いたフローサイトメトリー、アフィニティクロマトグラフィー、磁気ビーズ精製法により精製することができる。抗原特異的CD4+T細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、CD29、CD45RA、CD45RO等が挙げられ、抗原特異的CD8+T細胞の細胞表面に発現しているタンパク質としては、CD107a、CD107b、CD63、CD69等が挙げられる。
また、前述の通り、単核球を抗原特異的なT細胞に誘導するために、本発明の融合ポリペプチド及び抗原提示細胞は有用である。したがって、受動免疫療法によりがんを治療又は予防するための薬剤として、本発明の融合ポリペプチド及び抗原提示細胞を有効成分とする抗腫瘍剤を提供することもできる。
また、本発明の抗腫瘍剤に含まれるT細胞及び抗原提示細胞、並びに該T細胞の製造に用いられる単核球及び抗原提示細胞は、各々独立して、本発明の抗腫瘍剤が投与される対象に由来するもの(自家)であってもよく、前記対象と同種異系の関係にあってもよく、また前記対象とHLAクラスの型が一致する同種異系の関係であってもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、本発明の融合ポリペプチド、T細胞又は樹状細胞に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよい。特に、本発明の抗腫瘍剤は、本発明の融合ポリペプチド、T細胞及び樹状細胞を安定に保持できる緩衝液又は液体培地の形態にあることが好ましい。
緩衝液の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水等を挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤(例えば、EDTA又はグルタチオン)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、KLH、QS21、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、BCG、ミョウバン、CpG DNA等のTLRのアゴニスト)、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤及び/又は保存剤等をさらに含んでいてもよい。
また本発明の抗腫瘍剤において、本発明の融合ポリペプチド及びT細胞、並びに、本発明の融合ポリペプチド及び樹状細胞とは各々混合されている形態にあることが好ましいが、本発明の融合ポリペプチドとT細胞又は樹状細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与することのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、がんの治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。また、本発明の抗腫瘍剤は、ヒトを含む動物を対象として使用することができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。また、本発明の抗腫瘍剤を投与される対象としては特に制限されることなく、WT1タンパク質が発現している腫瘍を罹患しているもののみならず、罹患していないものであってもよい。例えば、がんの再発予防という観点から、外科的手術、化学療法、放射線療法等によってがんを治療したものであってもよい。
本発明の抗腫瘍剤の投与形態としては特に制限はなく、例えば皮下注射、静脈注射、皮内注射、筋肉内注射、腫瘍組織部位への局所注射が挙げられる。本発明の抗腫瘍剤を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜選択されるが、例えば、本発明の抗腫瘍剤の投与量(有効成分換算量)は、有効成分の種類に応じて異なるが、例えば、有効成分がポリペプチドである場合には、通常、0.01〜10mgであり、有効成分が細胞である場合には、通常、106〜1012細胞である。
本発明は、このように、本発明の抗腫瘍剤を対象に投与させることを特徴とする、対象におけるがんの治療又は予防するための方法をも提供する。
本発明の抗腫瘍剤の製品又はその説明書は、がんの治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。がんの治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明の融合ポリペプチド、該融合ポリペプチド及び、該融合ポリペプチドを用いて製造される、WT1タンパク質を発現している腫瘍細胞に対してサイトカインを産生するT細胞又は該融合ポリペプチド及び樹状細胞を投与することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制、及び/又は該腫瘍細胞の死が誘導される機序についての情報を含むことができる。
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
<樹状細胞の調製>
健常人ボランティア6名より供与された血液から、Ficoll−Paque(Amersham Bioscience社製)を用い、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。分離したPBMCを、無血清のAIM−Vを用い、細胞培養フラスコ(BD Biosciences社製)にて37℃、CO2インキュベータ内で1時間培養した後、非付着性細胞を除去した。そして、フラスコ上に残った付着性細胞を、リコンビナントGM−CSF(10ng/ml、Wako社製)及びリコンビナントIL−4(10ng/ml、Wako社製)存在下、AIM−V培地にて培養を開始した。培養を開始してから3日後、GM−CSFとIL−4とを添加したAIM−V培地に交換し、培養を開始してから7日後トリプシンを用いて樹状細胞(DC)を回収した。このDCを抗原特異的T細胞の誘導、又はT細胞からの抗原特異的サイトカイン(IFN−γ)産生解析の際の抗原提示細胞(APC:antigen−presenting cells)として用いた。
健常人ボランティア6名より供与された血液から、Ficoll−Paque(Amersham Bioscience社製)を用い、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。分離したPBMCを、無血清のAIM−Vを用い、細胞培養フラスコ(BD Biosciences社製)にて37℃、CO2インキュベータ内で1時間培養した後、非付着性細胞を除去した。そして、フラスコ上に残った付着性細胞を、リコンビナントGM−CSF(10ng/ml、Wako社製)及びリコンビナントIL−4(10ng/ml、Wako社製)存在下、AIM−V培地にて培養を開始した。培養を開始してから3日後、GM−CSFとIL−4とを添加したAIM−V培地に交換し、培養を開始してから7日後トリプシンを用いて樹状細胞(DC)を回収した。このDCを抗原特異的T細胞の誘導、又はT細胞からの抗原特異的サイトカイン(IFN−γ)産生解析の際の抗原提示細胞(APC:antigen−presenting cells)として用いた。
<WT1タンパク質に由来するポリペプチド>
表6に示す6種類のWT1タンパク質に由来するポリペプチドを設計し、株式会社ペプチド研究所にて化学合成し、95%以上の純度にてポリペプチドを得た。
表6に示す6種類のWT1タンパク質に由来するポリペプチドを設計し、株式会社ペプチド研究所にて化学合成し、95%以上の純度にてポリペプチドを得た。
なお、ヘルパー/キラー−ハイブリッドエピトープロングペプチド(H/K−HELP)1は、N末端側よりヘルパーエピトープ(HE)4とキラーエピトープ(KE)1とが5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。H/K−HELP2は、N末端側よりHE4とKE1とKE5とが5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。H/K−HELP3は、N末端側よりKE1とHE4とKE5とが5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドを介して結合している融合ポリペプチドである。
また、後述のPBMCの培養培地への添加は、下記4態様にて行った。
ミックス(比較例1):HE4、KE1及びKE5を各5μM混合したものを培地に添加
H/K−HELP1(比較例2):5μMのH/K−HELP1を培地に添加
H/K−HELP2(実施例1):5μMのH/K−HELP2を培地に添加
H/K−HELP3(実施例2):5μMのH/K−HELP3を培地に添加。
ミックス(比較例1):HE4、KE1及びKE5を各5μM混合したものを培地に添加
H/K−HELP1(比較例2):5μMのH/K−HELP1を培地に添加
H/K−HELP2(実施例1):5μMのH/K−HELP2を培地に添加
H/K−HELP3(実施例2):5μMのH/K−HELP3を培地に添加。
<抗原特異的Th細胞(CD4陽性T細胞)及びCTL(CD8陽性T細胞)の誘導>
健常人ボランティアから分離した前述のPBMCを、24穴プレート(BD Biosciences社製)に2×106細胞/穴になるよう播種した。そして、前述のWT1タンパク質に由来する、抗原特異的T細胞を誘導するための各ポリペプチド(5μM)及び血清を添加したAIM−V培地1ml/穴にて、37℃、CO2インキュベータ内で培養を開始した。
健常人ボランティアから分離した前述のPBMCを、24穴プレート(BD Biosciences社製)に2×106細胞/穴になるよう播種した。そして、前述のWT1タンパク質に由来する、抗原特異的T細胞を誘導するための各ポリペプチド(5μM)及び血清を添加したAIM−V培地1ml/穴にて、37℃、CO2インキュベータ内で培養を開始した。
培養を開始してから7日後、前述のDC(自己DC)を、由来を同一とするPBMCに加えた。また培地を、OK−432(0.1KE/ml、商品名:ピシバニール、中外製薬株式会社製)を添加した無血清のAIM−V培地(Life Technologies社製)に交換し、2時間培養した。なお、ピシバニール(OK−432)は、A群溶血性連鎖球菌の弱毒の自然変異株(Su株)をペニシリンで処理して得られた製剤であり、種々のサイトカイン(免疫因子)を産生させることにより免疫増強作用を惹起することが知られている。
そして、前記2時間の培養後、マイトマイシンC(MMC、協和発酵キリン株式会社製)を加えて50分間処理した。さらに、前述の抗原特異的T細胞を誘導するための各ポリペプチド(5μM)存在下、自己DCとT細胞を非動化した5%ヒトAB血清(北海道赤十字センター)とを含有したAIM−V培地中で共培養し、T細胞の再刺激を行った。その2日後、リコンビナントIL−2(Shionogi Pharmaceutical Institute Co.Ltd製)を最終濃度10U/mlになるように添加した。共培養開始より14日後、自己DCに前述の抗原特異的T細胞を誘導するための各ポリペプチド(5μM)を2時間パルスし、MMC処理したものをAPCとして、T細胞の再刺激を行った。また、共培養開始より14日後以降は、リコンビナントIL−2の添加濃度を20U/mlとして培養を行った。その後、共培養21日目のT細胞を遠心分離等で回収し、次に示す抗原特異的な反応性の解析に供した。
<細胞内染色法(ICS)によるT細胞の抗原特異的サイトカイン産生の解析>
前述の通り誘導したT細胞(前記共培養21日目のT細胞)を5×104細胞/穴になるよう、また自己DCを5×103細胞/穴となるように、96穴プレート(BD Biosciences社製)の同一の穴に播種した。そして、抗原特異的な反応性を解析するための各ポリペプチド(HE4、KE1、KE5、H/K−HELP1、H/K−HELP2又はH/K−HELP3)5μMの存在下、培養を行った。また、対照群としてポリペプチドを加えない群を用意した。
前述の通り誘導したT細胞(前記共培養21日目のT細胞)を5×104細胞/穴になるよう、また自己DCを5×103細胞/穴となるように、96穴プレート(BD Biosciences社製)の同一の穴に播種した。そして、抗原特異的な反応性を解析するための各ポリペプチド(HE4、KE1、KE5、H/K−HELP1、H/K−HELP2又はH/K−HELP3)5μMの存在下、培養を行った。また、対照群としてポリペプチドを加えない群を用意した。
細胞内サイトカイン染色法は、定法に従い、先ず培養開始時にブレフェルディンA(Sigma社製)を加えて細胞内タンパク質輸送を阻害し、サイトカインを細胞内に蓄積させた。そして、15〜20時間培養した細胞に対し、CD4陽性T細胞を検出するために、抗CD4抗体と抗サイトカイン抗体とで染色し、またCD8陽性T細胞を検出するために、抗CD8抗体と抗サイトカイン抗体とで染色し、フローサイトメトリーによる解析を行った。なお、抗CD4抗体としてFITC標識マウス抗ヒトCD4 mAbを、抗サイトカイン抗体としてPerCP−Cy7標識マウス抗ヒトIFN−γ mAbを、抗CD8抗体としてAPC標識マウス抗ヒトCD8 mAbを用いた。また、測定にはFACSCantoTMIIを、解析にはFACSDivaTM6.1(共にBD Biosciences社製)を使用した。
そして、CD4陽性T細胞(Th細胞)における抗原特異的IFN−γ産生細胞の比率を測定し、抗原特異的な反応性を解析するための各ポリペプチド存在下における測定値において最も高い比率を選択した。次いで、この比率が対照群(ポリペプチド非添加群)における比率の2.5倍以上あり、かつその差が2%以上ある場合を、前述の抗原特異的T細胞を誘導するためのポリペプチドによってサイトカイン産生が誘導されるT細胞(抗原特異的T細胞)が誘導されたと評価した。また、CD8陽性T細胞(CTL)における抗原特異的IFN−γ産生細胞の比率も測定し、前述のCD4陽性T細胞同様に、抗原特異的T細胞の誘導を評価した。得られた結果を表7に示す。表7中、「+」は抗原特異的T細胞の誘導が認められたことを示し、「−」は抗原特異的T細胞の誘導が認められなかったことを示す。「誘導効率(%)」は供したドナーの異なる6種のPBMCから抗原特異的T細胞に誘導することのできた割合を示す。また、「最良ペプチド」とは、各PBMCにおいて、抗原特異的IFN−γ産生細胞の比率が最も高くなった(ポリペプチド添加群とポリペプチド非添加群との抗原特異的IFN−γ産生細胞の比率の差が最も大きくなった)、抗原特異的T細胞を誘導するためのポリペプチドを示す。さらに、「最良ペプチド(%)」は6種のPBMCにおいて、前記最良ペプチドとして評価された割合を示す。
表7に示した結果から明らかなように、本発明の融合ポリペプチドを用いた場合(実施例1〜2)においては、本発明の融合ポリペプチドを構成するエピトープを混合して用いた場合(比較例1)よりも、由来の異なるより多くのCD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞を刺激し、サイトカイン(IFN−γ)を産生するTh1細胞及びCTLを誘導することができた(表7「誘導効率(%)」の「CD4」及び「CD8」 参照)。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合している本発明の融合ポリペプチドを用いた場合(実施例2)においては、実施例1と比較しても、由来の異なるより多くのCD4陽性T細胞を刺激し、サイトカイン(IFN−γ)を産生するTh1細胞を誘導できることが明らかになった(表7「誘導効率(%)」の「CD4」参照)。一方、キラーペプチドとヘルパーエピトープとが1個ずつ結合している融合ポリペプチドを用いた場合(比較例2)において、CD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞における抗原特異的T細胞を誘導する活性は比較例1のそれと変わらないものであった(表7「誘導効率(%)」の「CD4」及び「CD8」 参照)。
また、表7に示す通り、本発明の融合ポリペプチドを用いた場合(実施例1〜2)においては、比較例1及び2と比較して、サイトカインを産生するTh1細胞及びCTLの誘導効率が高い、すなわち免疫応答が強く誘導されていることが明らかになった(表7「最良ペプチド」 参照)。さらに、ヘルパーエピトープの両側にキラーエピトープが結合している本発明の融合ポリペプチドを用いた場合(実施例2)においては、実施例1と比較しても、由来の異なるより多くのCD4陽性T細胞及びCD8陽性T細胞を刺激し、サイトカイン(IFN−γ)を産生するTh1細胞及びCTLを誘導できることが明らかになった(表7「最良ペプチド(%)」参照)。
以上説明したように、本発明によれば、由来の異なる多くのT細胞を刺激し、多くの種類のがんに対して免疫応答を強く誘導することが可能となる。
したがって、本発明の融合ポリペプチド、並びに該融合ポリペプチド及び樹状細胞は、対象に投与することにより、対象内のT細胞を刺激し、免疫応答を強く活性化することができるので、がんに対する能動免疫療法のための薬剤として有用である。また、該融合ポリペプチドによって誘導される抗原特異的T細胞、及び該融合ポリペプチドによってパルスされた抗原提示細胞は、受動免疫療法のための薬剤又は抗腫瘍剤として有用である。これらの細胞は該融合ポリペプチドとともに使用されることが好ましい。
配列番号:1
<223> ヒトWT1タンパク質
配列番号:2
<223> ヘルパーエピトープ1(HE1)
配列番号:3
<223> ヘルパーエピトープ2(HE2)
配列番号:4
<223> ヘルパーエピトープ3(HE3)
配列番号:5
<223> ヘルパーエピトープ4(HE4)
配列番号:6
<223> ヘルパーエピトープ5(HE5)
配列番号:7
<223> ヘルパーエピトープ6(HE6)
配列番号:8
<223> ヘルパーエピトープ7(HE7)
配列番号:9
<223> WT1タンパク質の180〜208位において194位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、ヘルパーエピトープ8(HE8)
配列番号:10
<223> ヘルパーエピトープ9(HE9)
配列番号:11
<223> ヘルパーエピトープ10(HE10)
配列番号:12
<223> ヘルパーエピトープ11(HE11)
配列番号:13
<223> ヘルパーエピトープ12(HE12)
配列番号:14
<223> ヘルパーエピトープ13(HE13)
配列番号:15
<223> ヘルパーエピトープ14(HE14)
配列番号:16
<223> ヘルパーエピトープ15(HE15)
配列番号:17
<223> ヘルパーエピトープ16(HE16)
配列番号:18
<223> ヘルパーエピトープ17(HE17)
配列番号:19
<223> ヘルパーエピトープ18(HE18)
配列番号:20
<223> ヘルパーエピトープ19(HE19)
配列番号:21
<223> ヘルパーエピトープ20(HE20)
配列番号:22
<223> ヘルパーエピトープ21(HE21)
配列番号:23
<223> ヘルパーエピトープ22(HE22)
配列番号:24
<223> ヘルパーエピトープ23(HE23)
配列番号:25
<223> ヘルパーエピトープ24(HE24)
配列番号:26
<223> ヘルパーエピトープ25(HE25)
配列番号:27
<223> ヘルパーエピトープ26(HE26)
配列番号:28
<223> ヘルパーエピトープ27(HE27)
配列番号:29
<223> ヘルパーエピトープ28(HE28)
配列番号:30
<223> ヘルパーエピトープ29(HE29)
配列番号:31
<223> ヘルパーエピトープ30(HE30)
配列番号:32
<223> ヘルパーエピトープ31(HE31)
配列番号:33
<223> ヘルパーエピトープ32(HE32)
配列番号:34
<223> ヘルパーエピトープ33(HE33)
配列番号:35
<223> ヘルパーエピトープ34(HE34)
配列番号:36
<223> ヘルパーエピトープ35(HE35)
配列番号:37
<223> ヘルパーエピトープ36(HE36)
配列番号:38
<223> ヘルパーエピトープ37(HE37)
配列番号:39
<223> ヘルパーエピトープ38(HE38)
配列番号:40
<223> キラーエピトープ1(KE1)
配列番号:41
<223> キラーエピトープ2(KE2)
配列番号:42
<223> WT1タンパク質の194〜202位において194位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ3(KE3)
配列番号:43
<223> キラーエピトープ4(KE4)
配列番号:44
<223> WT1タンパク質の303〜311位において304位のメチオニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ5(KE5)
配列番号:45
<223> キラーエピトープ6(KE6)
配列番号:46
<223> N末端から順に、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーと、KE1とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号:47
<223> N末端から順に、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーと、KE1と、5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、KE5とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号:48
<223> N末端から順に、KE1と、5つのグリシンからなるリンカーと、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、KE5とが結合している、融合ポリペプチド
<223> ヒトWT1タンパク質
配列番号:2
<223> ヘルパーエピトープ1(HE1)
配列番号:3
<223> ヘルパーエピトープ2(HE2)
配列番号:4
<223> ヘルパーエピトープ3(HE3)
配列番号:5
<223> ヘルパーエピトープ4(HE4)
配列番号:6
<223> ヘルパーエピトープ5(HE5)
配列番号:7
<223> ヘルパーエピトープ6(HE6)
配列番号:8
<223> ヘルパーエピトープ7(HE7)
配列番号:9
<223> WT1タンパク質の180〜208位において194位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、ヘルパーエピトープ8(HE8)
配列番号:10
<223> ヘルパーエピトープ9(HE9)
配列番号:11
<223> ヘルパーエピトープ10(HE10)
配列番号:12
<223> ヘルパーエピトープ11(HE11)
配列番号:13
<223> ヘルパーエピトープ12(HE12)
配列番号:14
<223> ヘルパーエピトープ13(HE13)
配列番号:15
<223> ヘルパーエピトープ14(HE14)
配列番号:16
<223> ヘルパーエピトープ15(HE15)
配列番号:17
<223> ヘルパーエピトープ16(HE16)
配列番号:18
<223> ヘルパーエピトープ17(HE17)
配列番号:19
<223> ヘルパーエピトープ18(HE18)
配列番号:20
<223> ヘルパーエピトープ19(HE19)
配列番号:21
<223> ヘルパーエピトープ20(HE20)
配列番号:22
<223> ヘルパーエピトープ21(HE21)
配列番号:23
<223> ヘルパーエピトープ22(HE22)
配列番号:24
<223> ヘルパーエピトープ23(HE23)
配列番号:25
<223> ヘルパーエピトープ24(HE24)
配列番号:26
<223> ヘルパーエピトープ25(HE25)
配列番号:27
<223> ヘルパーエピトープ26(HE26)
配列番号:28
<223> ヘルパーエピトープ27(HE27)
配列番号:29
<223> ヘルパーエピトープ28(HE28)
配列番号:30
<223> ヘルパーエピトープ29(HE29)
配列番号:31
<223> ヘルパーエピトープ30(HE30)
配列番号:32
<223> ヘルパーエピトープ31(HE31)
配列番号:33
<223> ヘルパーエピトープ32(HE32)
配列番号:34
<223> ヘルパーエピトープ33(HE33)
配列番号:35
<223> ヘルパーエピトープ34(HE34)
配列番号:36
<223> ヘルパーエピトープ35(HE35)
配列番号:37
<223> ヘルパーエピトープ36(HE36)
配列番号:38
<223> ヘルパーエピトープ37(HE37)
配列番号:39
<223> ヘルパーエピトープ38(HE38)
配列番号:40
<223> キラーエピトープ1(KE1)
配列番号:41
<223> キラーエピトープ2(KE2)
配列番号:42
<223> WT1タンパク質の194〜202位において194位のアルギニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ3(KE3)
配列番号:43
<223> キラーエピトープ4(KE4)
配列番号:44
<223> WT1タンパク質の303〜311位において304位のメチオニンがチロシンに置換されているアミノ酸配列からなる、キラーエピトープ5(KE5)
配列番号:45
<223> キラーエピトープ6(KE6)
配列番号:46
<223> N末端から順に、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーと、KE1とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号:47
<223> N末端から順に、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーと、KE1と、5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、KE5とが結合している、融合ポリペプチド
配列番号:48
<223> N末端から順に、KE1と、5つのグリシンからなるリンカーと、HE4と、5つのグリシンからなるリンカーポリペプチドと、KE5とが結合している、融合ポリペプチド
Claims (1)
- WT1タンパク質に由来するヘルパーエピトープ及びWT1タンパク質に由来するキラーエピトープを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチド1分子あたり前記ヘルパーエピトープと前記キラーエピトープとを合わせて3〜6個含むポリペプチド。
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