CN108753733A - 杂交瘤细胞株及其产生的抗糖基单克隆抗体以及制备方法与制剂 - Google Patents

杂交瘤细胞株及其产生的抗糖基单克隆抗体以及制备方法与制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗糖基单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株具有抑制人胃癌细胞株（MGC‑803）生长的功能。本发明还提供一种含有上述抗糖基单克隆抗体的用于诊断或者治疗肿瘤的制剂。本发明还提供一种杂交瘤细胞株产生的抗糖基单克隆抗体的制备方法。本发明通过免疫MGC‑803细胞膜，研制出了抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞株HS123，可以分泌相应的抗糖基单克隆抗体，具有有效的抑制多种肿瘤细胞生长的活性。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗糖基单克隆抗体以及制备方法与 制剂
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的 抗糖基单克隆抗体，以及抗糖基单克隆抗体的制备方法，以及用于诊断或者治 疗肿瘤的制剂。
背景技术
胃癌在我国发病率和死亡率均很高。据《中国肿瘤登记年报》报道，全国胃 癌发病率为36.21/10万，居恶性肿瘤第二位；其死亡率为25.88/10万，居恶性肿 瘤第三位。晚期胃癌患者五年生存率不到10％，肿瘤的复发和转移是其致死的主 要原因。因此，胃癌的早期诊断及控制转移发生对患者预后至关重要。临床上 一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但多药耐药的存在，使胃癌的 化疗效果受到严重影响，晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低。
基于抗体药物的靶向治疗作为新的治疗手段在肿瘤治疗中的应用越来越广 泛。近两年来，国际上很多课题组都在集中精力研制治疗性单克隆抗体，筛选 能够抑制肿瘤细胞生长或者具有直接杀死肿瘤细胞能力的单克隆抗体。CD20、 HER2、EGRF等都是经临床确证的研制抗体药物的分子靶点。
目前，临床应用的抗肿瘤抗体药物(利妥昔、曲妥珠、吉非替尼、西妥昔和 贝伐珠等等)都是针对单一靶点，但是肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过 程，从单一靶点对肿瘤治疗是远不够的。多靶点治疗策略近年特别受到关注。 多靶点作用在癌症治疗中的应用十分有优势，尤其是对单靶点抑制剂产生耐药 性的癌症患者。
因此，筛选能抑制肿瘤细胞生长或者能应用于肿瘤诊断的单克隆抗体成为 迫切需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种抑制人胃癌细胞株 (MGC-803)生长的抗糖基单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 本发明还提供一种含有上述抗糖基单克隆抗体的用于诊断或者治疗肿瘤的制 剂。本发明还提供一种杂交瘤细胞株产生的抗糖基单克隆抗体的制备方法，该 方法稳定、经济、操作不繁复，所采用的免疫原是MGC-803细胞膜蛋白，相较 于纯蛋白的免疫原来说所获得的抗体位点较为繁多，利于抗体广泛筛选研究。
本发明的杂交瘤细胞株HS123于2018年4月9日保藏在武汉大学中国典型培 养物保藏中心。地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心；保藏编号：CCTCC NO.C201859。
所述杂交瘤细胞株是抗糖基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述糖基为人肿 瘤细胞蛋白上的糖基。
一种抗糖基单克隆抗体，是由上述的杂交瘤细胞分泌所得。
所述抗糖基单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗糖基单克隆抗体具有抑 制人胃癌细胞株MGC-803生长的功能。
一种用于诊断或者治疗肿瘤的制剂，其包含上述的抗糖基单克隆抗体。
一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备：
1)、将对数生长期的MGC-803细胞，用1％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞 于纯化水中，用纯化水清洗细胞至少3次，制成约5×108～1×109个细胞/mL 的细胞悬液；
2)、将细胞悬液置于超声波仪中进行超声裂解至少20分钟(超声5秒， 间隔10秒)；
3)、将裂解后的细胞悬液于12000rpm，4℃条件下离心10min，收集沉淀， 用纯化水复溶，获得约5×108～1×109个细胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液，即 为免疫原；
步骤二：制备杂交瘤细胞株：
1)、将步骤一的MGC-803细胞膜进行乳化，皮下多点注射加腹腔注射于 Balb/c小鼠，每只小鼠每次注射5×107～1×108个MGC-803细胞获得的细胞膜， 注射次数为3次，时间间隔为2周，第三次多点注射加腹腔注射完成的7天后， 尾静脉注射5×106～1×107个MGC-803细胞；
2)、取经步骤1)的免疫小鼠脾脏，研磨后获得脾细胞，取脾细胞与Sp2/0 骨髓瘤细胞(4:1)用聚乙二醇4000(PEG-4000)融合，融合完成后用HAT培 养基选择性培养得到杂交瘤细胞；
3)、筛选阳性的杂交瘤细胞株并扩大培养；初筛采用了间接免疫荧光法 (IFA)和流式细胞术法(FACs)进行，对于初筛结果用免疫印迹法 (Western-blot)进行复筛，将筛选出的这株抗糖基单克隆抗体采用有限稀释法 进行亚克隆；
(1)、间接免疫荧光法(IFA)筛选：将MGC-803细胞铺入96孔板中， 待其长满单层后，用PBS洗三次，5min/次，加入-20℃预冷的甲醇4℃下固定 15min，PBS洗三次后，取50μL杂交瘤细胞上清加入孔中，37℃孵育1h，PBS 洗三次，避光加入1:200稀释的荧光二抗，37℃孵育1h，PBS洗三次后晾干， 在荧光显微镜下观察。
(2)、流式细胞术(FACs)的方法筛选：将处于对数生长期的MGC-803 细胞用1％胰酶消化，洗涤，制成5×104个细胞/mL的细胞悬液，吸取200μL /流式细胞管，相当于1×104个细胞/流式细胞管，1000r/min离心5min，弃 上清，加入200μL杂交瘤细胞分泌的上清液，孵育1h后，1000r/min离心5min， 用PBS洗涤后离心，重复2次，加入1:200稀释的荧光二抗，孵育30min，1000 r/min离心5min，用PBS洗涤后离心，重复2次，用200μL PBS重悬细胞， 在流式细胞仪中测定。
(3)、免疫印迹法(Western-blot)法筛选：采用10％分离胶、4％浓缩胶， 对样品(样品包括MGC-803细胞膜悬液、以及其他肿瘤细胞裂解液)进行电 泳蛋白分离(恒压60V电泳20min，100V电泳60min)，电泳完毕后，取出凝 胶，在去离子水中漂洗；随后，采用硝酸纤维素膜(PVDF膜)进行转印，(恒 流，200mA电流转印100min)；转印结束后取出PVDF膜封闭液室温振摇封 闭2h，用TBST洗5次，每次5min，加入用封闭液稀释好的单抗(即初筛的 阳性株抗体)，和膜一起孵育，4℃过夜或者室温1h。用TBST洗5次，每次5 min。加入1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，室温孵育1h。 用TBST洗5次，每次5min。将膜转移至新鲜配制的显影液中避光放置1-3min， 在暗室显影仪中显影。
(4)、有限稀释法进行亚克隆：用HT培养基将阳性杂交瘤细胞吹起，取 100μL进行计数，在第一列中进行倍比稀释，使之每10mL培养基中约含100 个细胞；轻柔吹匀后加入铺有饲养细胞的培养板中，100μL/孔，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。约7天后数出细胞孔里的克隆数，标记并换新的培养基， 待细胞铺满整个孔底的1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔板所有 细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株冻存。
步骤三：抗糖基单克隆抗体的制备：将步骤3)获得的阳性杂交瘤细胞株注 射于Balb/c小鼠腹腔内使所述小鼠产生腹水，收集腹水；
1)、取10周龄经产的Balb/c母鼠，腹腔注射灭菌降植烷(降植烷优于液体石 蜡)，0.3mL/只；
2)、7d后腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，1～2×106个细胞/只；
3)、待小鼠腹部出现明显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16 号针头刺入腹腔，收集腹水；
4)、收集的腹水3000r/min离心10min，取上清，用玻璃棉过滤后，分装， -70℃保存；
5)、待腹水再生积聚后，再次收集。
步骤四：抗糖基单克隆抗体的纯化：用protein-G柱亲和纯化，得到抗糖 基单克隆抗体。
1)、在柱子中预先加入1mL结合缓冲液，转移1mL protein-G树脂至柱子，流 干，用5mL结合缓冲液平衡；
2)、腹水用结合缓冲液作1:1稀释，加样品至柱子可一次加入10mL，作用10min 后开始过柱子(1mL/min流速过柱)；
3)、30mL结合缓冲液冲洗(10mL×3次)；10-15mL洗柱子进行洗脱(为防 因为洗脱缓冲液pH过酸致蛋白变性，需用为pH 8.5的1M Tris-HCl调pH至7.4)；
4)、收集的蛋白装于透析袋中，透析3天，透析结束后检测蛋白浓度，置于 -20℃保存。
一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括上述的步骤一和步骤二。
杂交瘤细胞株是由人胃癌细胞株MGC-803细胞的细胞膜免疫Balb/c小鼠后 的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合后筛选，培养产生。
本发明具体通过下述方案完成本发明的目的：
1、人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备：
人胃癌细胞株MGC-803扩大培养至对数生长期，消化收集细胞于纯化水， 制成高浓度的细胞悬液，约5×108～1×109个细胞/mL的细胞悬液，进行超声 波裂解，高速离心收集MGC-803细胞的细胞膜，制备成约5×108～1×109个细 胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液。
2、利用MGC-803细胞的细胞膜，制备抗糖基单克隆抗体：通过间接免疫荧 光试验(IFA)、流式细胞术(FACs)，对融合成功的杂交瘤细胞株进行初步筛选， 选择针对MGC-803或者其他肿瘤细胞系荧光亮度强，而对人正常细胞系微弱 或无反应性，并且是反应作用于细胞膜蛋白的杂交瘤细胞株；利用免疫印迹法 (Western-blot)对上述筛选到的杂交瘤细胞株进行进一步的筛选，根据免疫印 迹反应条带的特性，确定出抗糖基单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3、利用筛选的杂交瘤细胞株注射于Balb/c小鼠腹腔内，使所述小鼠产生腹 水，收集腹水；用protein-G柱亲和纯化腹水，得到抗糖基单克隆抗体。
4、通过对所筛选的抗体进行细胞毒性试验，进一步验证抗糖基单克隆抗体 抑制肿瘤细胞生长活性或能力，最终选择一株能有效抑制MGC-803生长的单 克隆抗体，并命名为HS123。
本发明中的抗肿瘤特异糖基单克隆抗体，由于是靶向某一个糖基，而不是 靶向某一种生长因子或者某一种类蛋白。由于在很多种蛋白表达过程中，都能 出现这种类型的糖基，所以这些蛋白都能被该糖基抗体识别，特别是与肿瘤细 胞生长相关的功能性蛋白或死亡相关蛋白。因此，该具有多靶点效果的抗糖基 单克隆抗体在肿瘤治疗上具有很强的开发价值。本发明提供的抗糖基单克隆抗 体能显著抑制肿瘤细胞生长，在肿瘤治疗的应用上有重要意义。
本发明通过免疫MGC-803细胞的细胞膜，制备了抗糖基单克隆抗体的杂交 瘤细胞株HS123，可以分泌相应的抗糖基单克隆抗体，该抗糖基单克隆抗体具 有有效的抑制肿瘤细胞生长的活性，可应用于胃癌的诊断和治疗。
附图说明
图1、HS123与不同种类的肿瘤细胞系的反应性(IFA)；
图2、HS123与不同种类的肿瘤细胞系反应的特性(Western-blot)；
图3、HS123抑制肿瘤细胞生长的特性分析。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明的主要操作步骤为：利用MGC-803细胞(本实验室诱导构建并保藏) 制备细胞膜悬液，免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术多次细胞融合，利用IFA和 FACs筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(初筛)；再通过免疫印迹对初筛获 得的杂交瘤细胞株进行进一步的鉴定，选择符合抗糖基单克隆抗体条带免疫印 迹反应特征的杂交瘤细胞株；通过细胞毒性试验，验证抗糖基单克隆抗体是否 具有抑制肿瘤细胞生长的活性或能力。利用抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞制备 的腹水经protein-G纯化，所得的抗糖基单克隆抗体进行效价测定。经筛选与验证， 确定得到的一株能抑制MGC-803生长的抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名 为HS123(亚类IgG1)。
材料和来源
实验动物：Balb/c小鼠和ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心。
细胞：MGC-803细胞由本实验室诱导并保藏。
试剂：羊抗鼠IgG荧光二抗以及抗体亚类鉴定试剂盒，均购于Sigma公司；protein-G购于invitrigen公司。
一、人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备
1)人胃癌细胞株MGC-803细胞培养
用含10-12％小牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养 至对数生长期(细胞一瓶分二瓶时在24小时内可以长满)后，进行扩大培养， 以获得足够数量的MGC-803细胞。
2)MGC-803细胞的细胞膜悬液制备
MGC-803细胞在细胞培养皿中进行扩大培养，用1％胰蛋白酶消化细胞， 收集细胞于纯化水，用纯化水清洗细胞数次，并制成高浓度的MGC-803细胞 悬液，约5×108～1×109个细胞/mL的细胞悬液。将细胞悬液进行超声波裂解(超声5秒，间隔10秒)20分钟，高速离心收集MGC-803细胞的细胞膜，制 备成约5×108～1×109个细胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液；
3)MGC-803细胞的细胞膜悬液作为免疫原
将制备成的MGC-803细胞膜悬液，按照100μL/鼠的量进行小鼠免疫。将细 胞膜悬液与弗氏不完全佐剂(不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成， 组分比为(1～5)：1)进行等比例混合，乳化约1小时，形成水油混合物。所述 混合物为免疫原，用于Balb/c小鼠的免疫。
二、抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞株的研制、筛选与鉴定
1)单克隆抗体的研制
MGC-803细胞膜悬液作为免疫原，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠， 每只小鼠每次注射5×107～1×108个MGC-803细胞获得的细胞膜，注射次数为3 次，时间间隔为2周，第三次多点注射加腹腔注射完成的7天后，尾静脉注射5× 106～1×107个MGC-803细胞；3天后处死取出小鼠脾脏，用聚乙二醇4000 (PEG-4000)将研磨成单个细胞的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行细 胞融合。
饲养细胞可于融合前一天准备，取6-8周龄ICR小鼠1只，颈椎脱位致死，放 于75％酒精中消毒5-6min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌 注射器吸取HAT选择培养液10mL注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培 养基。加入10mL HAT培养液中，铺入到3块96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃， 5％CO2细胞培养箱中培养。
融合前一周复苏Sp2/0细胞，37℃，5％CO2培养箱中传代培养。将处于对数 生长期的细胞收集至离心管中，细胞计数，把细胞稀释为106个/mL备用。
取加强免疫3天的Balb/c小鼠，摘眼球取血制备阳性血清，脱颈椎处死，75％ 酒精消毒5min，在超净工作台无菌取出脾脏，在无菌平皿中冼涤数次，剥离结 缔组织。将脾脏放在微孔铜网上，加入新鲜的PBS，用研磨棒轻轻将脾脏研磨至 成为单细胞。将平皿中脾细胞悬液转移到10mL离心管中，1000r/min离心10 min，收集脾细胞。
将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞按细胞数量4:1混合，加入50mL的融合管内，1000r/min离心10min，弃上清，在手心轻轻摩擦使两种细胞充分混匀；然后在 37℃水浴下，将预热好的1mL PEG 4000(PEG 4000相比PEG1500具有更高的融 合效率)在45s内加入融合管内，先慢后快，边加边轻轻搅动。然后立即先慢后 快地在90s内加入无抗无血DMEM 30mL，终止反应。37℃水浴10min，后1000 r/min离心10min，弃上清，将沉淀以HAT悬起，混匀到30mL含37℃预热的20％ 小牛血清的HAT选择培养液中，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，100μ L/孔，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱培养。5d后将用新鲜的HAT培养基对 细胞板半换液，10天后用HT培养基全换液。
2)单克隆抗体的筛选
对融合后的杂交瘤细胞分泌的上清进行初筛和复筛。初筛采用间接免疫荧 光法(IFA)和流式细胞术(FACs)的方法进行。间接免疫荧光筛选，共获得100 个杂交瘤上清与MGC-803细胞反应，进一步用流式细胞术进行筛选，获得了11 个杂交瘤能与MGC-803细胞的细胞膜反应。复筛是对初筛出的11个杂交瘤细胞进 行进一步的筛选。将11株杂交瘤分别制备腹水，通过免疫印迹法(Western-blot) 考察腹水与肿瘤细胞裂解液的反应特性，筛选出与肿瘤细胞裂解液反应，且反 应条带具有抗糖基单克隆抗体特征的杂交瘤细胞株，最终筛选出1株抗糖基单克 隆抗体的杂交瘤细胞株。
将筛选出的这株抗糖基单克隆抗体采用有限稀释法进行亚克隆：先按所述 方法进行饲养细胞的制备，滴入96孔板中，空出第一列。用HT培养基将阳性杂 交瘤细胞吹起，取100μL进行计数，在第一列中进行倍比稀释，使之每10mL培 养基中约含100个细胞；轻柔吹匀后加入铺有饲养细胞的培养板中，100μL/孔， 37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。约7天后数出细胞孔里的克隆数，标记并换新 的培养基，待细胞铺满整个孔底的1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔 板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株冻存，命名为HS123。
将检测阳性确定定株的杂交瘤细胞扩大培养，建立细胞系，冻存。具体过 程如下：将生长旺盛、状态良好的杂交瘤细胞用无抗无血DMEM轻轻从细胞瓶 上吹下，1000r/min离心5min，弃去上清。用含10％DMSO的细胞冻存液将细胞 吹匀，分装到细胞冻存管中。将冻存管放入冻存盒置于-70℃冰箱中，一天后将 冻存管转移入液氮中，做好记录。
间接免疫荧光法(IFA)初筛：将MGC-803细胞铺入96孔板中，待其长满单 层后，用PBS洗三次，5min/次，加入-20℃预冷的甲醇4℃下固定15min，PBS洗 三次后，取50μL杂交瘤细胞上清加入孔中，37℃孵育1h，PBS洗三次，避光加入 1:200稀释的荧光二抗，37℃孵育1h，PBS洗三次后晾干，在荧光显微镜下观察。
流式细胞术(FACs)初筛：将处于对数生长期的MGC-803细胞用1％胰酶消 化，洗涤，制成5×104个细胞/mL的细胞悬液，吸取200μL/流式细胞管，相当 于1×104个细胞/流式细胞管，1000r/min离心5min，弃上清，加入200μL杂交瘤 细胞分泌的上清液，孵育1h后，1000r/min离心5min，用PBS洗涤后离心，重复2 次，加入1:200稀释的荧光二抗，孵育30min，1000r/min离心5min，用PBS洗涤后 离心，重复2次，用200μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪中测定。
免疫印迹(Western-blot)复筛：
按照表1配方配制分离胶。(单位：mL，总量：7.5mL/胶)
表1分离胶配方(15mL)
在分离胶上缓慢加入一层蒸馏水(约1mL)，压平分离胶，放于30℃使其凝 固。待分离胶凝集后，配制浓缩胶，见表2。(单位：mL，总量：2.5mL/胶)
表2浓缩胶配方(5mL)
浓缩胶加完后迅速插入预先准备好的梳子，30℃待其凝固。5倍上样缓冲液 与样品混合，100℃金属浴或水浴10min，12000r/min离心5min。待胶凝固后， 放入电泳槽中，加入电泳缓冲液没过凝胶，垂直拔去梳子，上样，电泳。样品 在浓缩胶中使用60V电压，至样品电泳至交界面，调电压至100V，继续电泳至 溴酚蓝将要涌出胶面。电泳完毕后，取出凝胶，在去离子水中漂洗，除去浓缩 胶；按照胶的大小剪取同等面积的硝酸纤维素膜以及滤纸6层，在预冷的转印缓 冲液中彻底浸泡30min；按照(负极)海绵-3层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-3层滤纸- 海绵(正极)的顺序安装转印装置，做好标记，各层中不能有气泡；加入转印缓冲 液，将电泳槽置于冰浴中以200mA电流转印100min。转印结束后，拆下转印装 置，用去离子水漂洗PVDF膜，加入封闭液室温振摇封闭2h；用TBST洗5次， 每次5min，加入用封闭液稀释好的单抗，和膜一起孵育，4℃过夜或者室温1h。 用TBST洗5次，每次5min。加入1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 二抗，室温孵育1h。用TBST洗5次，每次5min。将膜转移至新鲜配制的显影液 中避光放置1-3min，在暗室显影仪中显影。
电泳缓冲液配方为：3.03gTris base，14.4g甘氨酸，1gSDS，ddH2O定容至 1L，室温保存。
转印缓冲液配方为：3.03gTris base，14.4g甘氨酸，ddH2O定容至800ml，溶 解后加入200ml甲醇至1L，室温保存。
封闭液配方为：5g脱脂奶粉溶于100mL的TBS中。
TBS配方为：1M Tris-HCL(PH7.5)20ml，NaCL 8.8g，ddH2O定容至1L，室 温保存。
TBST配方为：ml吐温-20加入到1L TBS缓冲液中，混匀，室温保存。
肿瘤细胞裂解液的准备：肿瘤细胞适当长满，密度可大些，10cm的平皿 约1-2×107个细胞；PBS润洗平皿2-3次；1-1.5mL1％胰酶消化；消化完成后， 用PBS吹细胞；转到15mL离心管，管中液体可多些达到13-14mL；500-1000 转离心10min；弃上清，10mL PBS重悬，再次500-1000转离心10min；弃上清， 1mLPBS重悬；-80和37度冻融3次，即可。冻融顺序：-80度冻12小时；37 度水浴融化；即刻放-80度1小时以上；37度水浴融化；即刻放-80度，完成。 裂解液蛋白使用时，即进行第三次融化。
单克隆抗体的大量制备(体内诱生腹水法)：取10周龄经产的Balb/c母鼠， 腹腔注射灭菌降植烷(降植烷优于液体石蜡)，0.3mL/只；7d后腹腔注射培养至 对数期的杂交瘤细胞，1～2×106个细胞/只。每天注意观察，待小鼠腹部出现明 显隆起后，用75％酒精棉球消毒下腹部皮肤，用16号针头刺入腹腔，收集腹水。 待腹水再生积聚后，再次收集。将收集的腹水3000r/min离心10min，取上清， 用玻璃棉过滤后，分装，-70℃保存。
单克隆抗体的纯化：所述结合缓冲液配方：NaCl 0.15M+Na2HPO4 20mM (pH7.8-8.2)；洗脱缓冲液配方：Citric acid 0.1M(pH2.5-3.0)。将腹水用结合缓 冲液作1:1稀释；在柱子中预先加入1mL结合缓冲液，转移1mL protein-G树脂至 柱子，流干，用5mL结合缓冲液平衡；加样品至柱子可一次加入10mL，作用10min 后开始过柱子(1mL/min流速过柱)；30mL结合缓冲液冲洗(10mL×3次)； 10-15mL洗柱子进行洗脱(为防因为洗脱缓冲液pH过酸致蛋白变性，需用为pH 8.5的1M Tris-HCl调pH至7.4)；protein-G树脂的再生，用10mL结合缓冲液润洗； 最后用5mL结合缓冲液平衡2次。
3)单克隆抗体HS123亚类的鉴定
按照SIGMA试剂盒说明书，以捕获ELISA的方法进行单抗的亚类鉴定，具体 如下：将单抗亚类鉴定试剂1:1000稀释后，加入酶标孔中，100μL/孔，2孔/样， 37℃孵育1h；PBST洗三次，拍干；将腹水适当稀释后加入孔中，100μL/孔，； PBST洗三次，拍干；HRP酶标羊抗鼠IgG二抗以1:600稀释后加入，100μL/孔， 室温孵育30min；显色10～20min。以OD450读值明显高于其他孔所加亚类试剂为 单抗所属亚类类型。
抗糖基单克隆抗体的特性
1HS123与不同种类的肿瘤细胞系的反应性(IFA)
用间接免疫荧光法测定抗糖基单克隆抗体HS123与人肿瘤细胞系MGC-803、 MCF-7和人正常细胞系人肾上皮细胞293T细胞的反应性。抗糖基单克隆抗体与人 肿瘤细胞系MGC-803、MCF-7有很强的反应性，而不与人正常细胞系293T有反应 性。结果见图1。
2HS123与不同种类的肿瘤细胞系反应的特性(Western-blot)
用免疫印迹法测定抗糖基单克隆抗体HS123与人肿瘤细胞系MGC-803、 HS7456T、NC-N87、KATOⅢ、SNU-1、H1650、H3122细胞的反应性。抗糖基 单克隆抗体HS123与人肿瘤细胞系MGC-803、NC-N87和H1650有很强的反应性， 该反应性具有抗糖基反应的特异性，与常见的免疫印迹蛋白条带状的反应性并 不相同，此为抗糖基单克隆抗体与蛋白上糖基反应的特殊特征。结果见图2。
3HS123抑制肿瘤细胞生长的特性分析
用细胞毒性试验CCK-8法测定抗糖基单克隆抗体HS123对人肿瘤细胞系 MGC-803、MCF-7、NCI-N87和人正常细胞系人肾上皮细胞293T细胞生长的影响。 步骤如下：1)向96孔细胞板各孔中加入50μL细胞悬液，细胞数量约为3～5×103个细胞；2)在二氧化碳箱中37℃下孵育10h；3)向各孔中加入不同浓度的倍比稀 释过的抗糖基单克隆抗体50μL；4)在二氧化碳箱中37℃下孵育72h；5)向各 孔中加入10μL的CCK-8溶液；6)在二氧化碳箱中37℃下孵育1-4h，根据颜色反 应情况测定450nm处的OD值，根据活细胞数量计算抑制率。抗糖基单克隆抗体 可以显著抑制人肿瘤细胞系MGC-803、MCF-7、NCI-N87的生长，而对人正常细 胞系293T的生长不产生任何影响。因此，抗糖基单克隆抗体HS123可以抑制肿瘤 细胞的生长，具有较强的抗肿瘤活性。结果见图3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞株，其在武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO.C201859。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是能分泌抗糖基单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述糖基为人肿瘤细胞蛋白上的糖基。
3.一种抗糖基单克隆抗体，其特征在于：是由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌所得。
4.根据权利要求3所述的抗糖基单克隆抗体，其特征在于：所述抗糖基单克隆抗体的亚类属于IgG1，所述抗糖基单克隆抗体具有抑制MGC-803生长的功能。
5.一种用于诊断或者治疗肿瘤的制剂，其特征在于：其包含权利要求3所述的抗糖基单克隆抗体。
6.一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一：人胃癌细胞株MGC-803细胞膜悬液作为免疫原的制备；
1)、将对数生长期的MGC-803细胞，用1％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞于纯化水中，用纯化水清洗细胞至少3次，制成5×108～1×109个细胞/mL的细胞悬液；
2)、将细胞悬液置于超声波仪中进行超声裂解至少20分钟，每超声5秒间隔10秒；
3)、将裂解后的细胞悬液离心，收集沉淀，用纯化水复溶，获得5×108～1×109个细胞的细胞膜/mL的细胞膜悬液，即为免疫原；
步骤二：进行细胞融合，研制杂交瘤细胞株：
4)、将步骤一的MGC-803细胞膜悬液进行乳化，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，每只小鼠每次注射5×107～1×108个MGC-803细胞获得的细胞膜，注射次数为3次，时间间隔为2周，第三次多点注射加腹腔注射完成的7天后，尾静脉注射5×106～1×107个MGC-803细胞；
5)、取经步骤4)的免疫小鼠脾脏，研磨后获得脾细胞，取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞用聚乙二醇4000融合，融合完成后用HAT培养基选择性培养得到杂交瘤细胞；
6)、筛选阳性的杂交瘤细胞株并扩大培养，初筛采用间接免疫荧光法IFA和流式细胞术法FACs进行，对于初筛结果用免疫印迹法Western-blot进行复筛，将筛选出的抗糖基单克隆抗体采用有限稀释法进行亚克隆；
步骤三：抗糖基单克隆抗体的制备：将步骤6)获得的抗糖基单克隆抗体杂交瘤细胞注射于Balb/c小鼠腹腔内，使所述小鼠产生腹水，收集腹水；抗糖基单克隆抗体的纯化：用protein-G柱亲和纯化，得到抗糖基单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤3)中的离心参数为：12000rpm，4℃条件下离心至少10min。
8.根据权利要求6所述的一种抗糖基单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤5)中脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的重量比为4:1。
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