TW202016149A - Ox40結合分子 - Google Patents

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Abstract

本申請案係關於結合OX40之特異性結合成員。該等特異性結合成員包含定位於特異性結合成員之恆定域中的OX40抗原結合位點，且應用於例如癌症及感染性疾病之治療。

Description

OX40結合分子
發明領域 本發明係關於結合OX40之特異性結合成員。該等特異性結合成員包含定位於特異性結合成員之恆定域中的OX40抗原結合位點，且應用於例如癌症及感染性疾病之治療。
發明背景 細胞信號傳遞係所有生物體之生命的必需部分，且通常涉及與可溶性配位體或表面表現之配位體相互作用的細胞表面受體。此相互作用引起受體、配位體或二者之變化。舉例而言，配位體結合可誘導受體之構形變化，使其聚集在一起成為二聚體或寡聚體。此聚集效應隨後引起胞內信號傳遞路徑之活化。存在大量以此方式活化之受體，包括腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)之成員，諸如OX40。
OX40 (亦被稱作CD134及TNFRSF4)主要在活化T細胞，包括CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、第1型及第2型T輔助(Th1及Th2)細胞及調節T (Treg)細胞上表現，且亦在活化自然殺手(NK)細胞上表現。OX40與在抗原呈現細胞(APC)上表現之其配位體OX40L的相互作用引起OX40受體之聚集。如同大部分其他腫瘤壞死因子(TNF)受體之配位體，OX40L以三聚體形式在細胞表面處表現。所提出之OX40活化模型為與表面表現之三聚OX40L的相互作用誘導細胞表面處以單體或預先形成之三聚體形式存在之OX40受體的聚集。OX40受體之此聚集效應活化NFkB信號傳遞路徑(Croft, 2010)。NFkB信號傳遞路徑之活化反過來提高T細胞活化、T細胞無性擴增、T細胞分化及存活，且促進記憶T細胞之產生。OX40/OX40L相互作用之主要作用為調節在初級免疫反應後期累積之效應(保護或病原) T細胞的數目，且因此當稍後再次遇到抗原時，在次級免疫反應期間增加可用於反應之記憶T細胞的數目(Croft, 2010)。OX40可如上文所描述直接介導其對T細胞之影響，或經由增強之發炎性細胞介素(諸如IL2及IFNγ)的產生，間接介導其對T細胞之影響。OX40信號傳遞亦可調節Treg細胞之功能以消除其免疫抑制活性(Croft, 2010)。
已在小鼠腫瘤模型中證明OX40促效劑之治療功效。具體而言，已在黑素瘤、膠質瘤、乳房癌及結腸癌、肉瘤、腎癌及前列腺癌之小鼠腫瘤模型中展示OX40促效劑(OX40L-Ig及抗OX40 mAb OX86)治療有效(Weinberg等人, 2000; Morris等人, 2001; Ali等人, 2004; Sadun等人, 2008; Redmond等人, 2009)。OX40促效劑單一療法之有效性似乎與腫瘤免疫原性相關(Kjaergaard等人2000)，表明腫瘤特異性T細胞上之OX40表現需要由腫瘤抗原引起的足夠預致敏(priming)，且免疫原性不良之腫瘤提供的預致敏不足。
亦在臨床試驗中研究呈單一療法形式及與其他單株抗體(mAb)組合之抗OX40促效劑抗體的功效。
呈單一療法形式之抗OX40 mAb的臨床測試包括小鼠單株抗OX40 mAb在患有晚期癌症之患者中的I期研究，該研究展示可接受毒性概況及30名患者中之12名中至少一個轉移性病變的消退(Curti等人, 2013)。來自人類化抗OX40 mAb (MEDI0562；MedImmune)在患有晚期實體腫瘤之患者中之I期研究的結果未展現劑量限制性毒性(DLT)，且32名患者中之一名展示客觀反應(Glisson等人, 2016)。
如上文所提及，亦在癌症治療中研究抗OX40 mAb與其他mAb之組合。舉例而言，在晚期實體腫瘤中測試抗OX40 mAb與抗PD-L1 mAb (德瓦魯單抗(durvalumab))或抗CTLA4 mAb (曲美單抗)之組合(ClinicalTrials.gov識別碼：NCT02705482)。已在臨床前模型中測試此等組合，且此等組合已展示改善之腫瘤消退及存活(Guo等人, 2014; Redmond等人, 2014)。
在局部晚期或轉移性實體腫瘤之治療中臨床上測試呈單一療法形式之抗OX40 mAb (MOXR0916；Genentech) (NCT02219724)及其與抗PD-L1 mAb (阿特珠單抗(atezolizumab))之組合(NCT03029832)。在選定晚期或復發性實體腫瘤之治療中評估人類化抗OX40 mAb (GSK3174998；GlaxoSmithKline)與抗PD-1 mAb (派姆單抗(pembrolizumab))之組合(NCT02528357)。在局部晚期或轉移性癌症之治療中，在臨床試驗中測試人類抗OX40 mAb (PF-04518600；Pfizer)，且展示該mAb耐受良好，且在48名患者中之27名中達成部分反應(2名患者)或穩定疾病(25名患者) (NCT02315066；El-Khoueiry等人, 2017)。亦在局部晚期或轉移性實體腫瘤之治療中測試此mAb與抗4-1BB促效劑mAb (PF-05082566/烏圖木單抗(utomilumab))之組合(NCT02315066)，及與抗PD-L1 mAb (艾維路單抗(avelumab))之組合(NCT02554812)。在晚期或已擴散之實體癌的治療中，在臨床試驗中測試人類IgG1抗OX40 mAb (BMS-986178；Bristol-Myers Squibb)與抗PD-1 mAb (納武單抗(nivolumab))或抗CTLA-4 mAb (伊匹單抗(ipilimumab))或二者之組合(NCT02737475)。
發明概要 諸位發明人進行廣泛選擇及親和性成熟項目群，以分離一組抗體Fc區片段(FcabTM )，該等片段包含經工程改造至其CH3域中之OX40抗原結合位點。
Fcab分子由二個一致多肽鏈組成，多肽鏈各自包含截短鉸鏈區、CH2域及CH3域。二個多肽鏈經鉸鏈區中之多個二硫鍵及CH3域中存在之疏水區結合在一起。如上所解釋，OX40配位體與其受體OX40之初始連接引發一連串事件，其引起OX40受體聚集，之後為NFkB胞內信號傳遞路徑之活化及強效T細胞活性之後續引發。為了使治療劑有效達成活化，數個OX40單體需要以模擬表面表現之三聚配位體之方式橋接在一起。展示藉由諸位發明人基於Fcab結合OX40之能力分離的抗OX40 Fcab之子集能夠驅動T細胞表面上OX40之聚集及活化。考慮到與允許抗OX40抗體分子之Fab臂移動且結合至其目標之抗體分子在鉸鏈區中的已知可撓性相比，Fcab分子之恆定域，尤其二個CH3域之間的剛性結構及小分子距離，此結果係出人意料的。鑒於Fcab分子之恆定域結合位點的緊密幾何構型，未預期此等結合位點將能夠誘導可能最初在T細胞表面上不緊密接近之OX40分子的聚集及促效作用。然而，與期望相反，本文所描述之由諸位發明人獲得的結果清楚地展示抗OX40 Fcab能夠活體外及活體內誘導OX40之聚集及活化。
選擇Fcab以便以高親和性結合二聚OX40，亦即預期Fcab以高親合力(avidity)結合OX40。認為對二聚OX40之高親和性有益於誘導OX40聚集，及活化。
如本文中所提及之『親和性』可以指如藉由KD 所量測，抗體分子與其同源抗原之間結合相互作用的強度。如將對熟習此項技術者顯而易見，在抗體分子能夠與抗原形成多個結合相互作用時(例如在抗體分子能夠二價結合抗原，且任擇地，抗原為二聚時)，如藉由KD 所量測之親和性亦可受親合力影響，其中親合力係指抗體-抗原複合物之總強度。
由諸位發明人鑑別為能夠誘導OX40聚集及活化之Fcab屬於二個組。對於OX40聚集及活化而言，第一組Fcab (FS20-11譜系)依賴於由例如抗CH2域抗體交聯，而第二組(FS20-22及FS20-31譜系)即使在不存在交聯之情況下亦展示低位準OX40聚集及活化。OX40促效劑抗體尚未在臨床上展示任何DLT。因此未預期在不存在交聯之情況下的OX40促效活性代表臨床治療之問題。相反，取決於待治療之病狀，在不存在交聯之情況下由Fcab引起之低位準OX40促效活性可為有利的。在不希望受理論束縛的情況下，認為具有此特性之抗OX40 Fcab藉由在不存在交聯之情況下誘導腫瘤反應性T細胞之有限活化及擴增，產生隨後可由腫瘤微環境中之交聯Fcab分子進一步活化之腫瘤反應性T細胞的較大庫，可適用於例如癌症治療情形。
對TNF受體(諸如OX40)具有特異性之習知抗體典型地不具有內在促效活性或僅極中度活性，且需要使用外部交聯劑(諸如蛋白A或G或二次抗體)進行抗體-TNFRSF成員複合物之二次交聯，或將抗體與定位於質膜之Fcγ受體結合，以便誘導較高位準之TNF受體成員聚集及活化(Wajant, 2015)。在不存在交聯之情況下，TNF受體特異性抗體具有低位準促效活性或不具有促效活性可由以下事實解釋：普通二價抗體可最大限度地交聯二個單體TNF受體，其對於TNF受體活化而言不足。因此，對於活體內功效而言，靶向OX40之單特異性抗體需要表現Fcγ受體之細胞緊密接近於表現OX40之T細胞存在，以達成OX40特異性抗體之交聯及OX40受體之後續聚集及活化。然而，認為Fcγ受體介導之交聯效率低。另外，表現Fcγ受體之細胞在整個身體中存在，且因此抗體交聯及表現OX40之T細胞的活化不限於特定位點，例如腫瘤微環境。此外，需要選擇此類OX40抗體之同型，以介導與Fcγ受體之有效結合以便交聯。然而，此可導致抗體誘發由Fcγ受體介導之效應功能，諸如ADCC，藉此消除意欲由抗體活化之T細胞。
諸位發明人已進行交聯Fcab-OX40複合物(其中Fcab呈mAb2 格式)之質譜分析，其展示17%之複合物包含二個OX40部分，表明本發明之抗OX40 Fcab可二價結合OX40。
諸位發明人認為本發明之抗OX40 Fcab可用於製備多特異性(例如雙特異性)分子，該等分子結合除OX40以外之第二抗原，諸如腫瘤抗原。較佳地，多特異性分子亦二價結合第二抗原，不過預期在第二抗原為細胞結合腫瘤抗原時，抗原之單價結合將足以交聯特異性結合成員/抗體分子且誘導OX40聚集及活化。
諸位發明人已製備包含本發明之抗OX40 Fcab的抗體分子，該等抗體分子可經其Fab區二價結合第二抗原。諸位發明人已展示此類雙特異性抗體分子能夠在存在該第二抗原之情況下有條件地活化OX40，而不需要例如如習知抗體分子所需的Fcγ受體交聯。與第二抗原為細胞表面受體或多聚可溶性因子無關，觀測到相同效果。認為抗體分子與第二抗原之結合造成該抗原位點處抗體分子的交聯，其反過來引起T細胞表面上OX40之聚集及活化。抗體分子之促效活性因此依賴於第二抗原及OX40二者存在，或當二者存在時得到增強。換言之，促效活性有條件。另外，認為在存在第二抗原之情況下的抗體交聯幫助經抗體分子之恆定域抗原結合位點結合之OX40的聚集，因為在抗體分子之二個結合位點結合至其各別目標時，而非在僅一個結合位點結合時，觀測到抗體分子之促效活性的提高。因此預期包含本發明之抗OX40 Fcab之多特異性分子以疾病依賴性方式，例如在腫瘤微環境中有效活化免疫細胞。
諸位發明人已展示，包含本發明之抗OX40 Fcab之雙特異性抗體分子能夠活體內抑制腫瘤生長。此外，相比於二個單特異性抗體分子之組合，其中抗體分子中之一者包含與雙特異性分子相同之恆定域，且另一抗體分子包含與雙特異性分子相同之可變域結合位點，在此等雙特異性抗體分子之情況下觀測到更有效腫瘤生長抑制，表明在二個結合位點存在於相同分子中時，發現增強之OX40聚集及信號傳遞，及因此T細胞活化及對應抗腫瘤效應。
如上所解釋，與習知抗體相比，包含本發明之抗OX40 Fcab之抗體分子不依賴於Fcγ受體交聯以驅動OX40聚集及活化。用於消除Fcγ結合之突變係此項技術中已知的且可包括於本發明之分子中。然而，在一些情形(諸如癌症治療)下，保留Fcγ受體結合可為有益的。舉例而言，若抗體分子經其Fab區結合至腫瘤抗原，且OX40抗原結合位點未接合，則將誘導腫瘤細胞之抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。此ADCC效應將為由抗體分子誘導之T細胞活化及後續T細胞介導之腫瘤細胞殺滅的附加。
包含本發明之抗OX40 Fcab及對第二抗原具有特異性之Fab區的抗體分子，較佳二價結合OX40及第二抗原二者。此係有利的，因為預期二種目標之二價結合使表現OX40之T細胞與第二抗原之間的橋接更穩定，且藉此延長T細胞定位於特定位點(諸如腫瘤微環境)，且可作用於疾病(例如腫瘤)持續的時間。此不同於絕大部分習知雙特異性抗體格式，該等格式為異二聚，且經一個Fab臂單價結合每一目標抗原。預期此類單價相互作用不僅較不穩定，而且首先在許多情況下不足以誘導諸如OX40之TNFRSF受體的聚集。
包含本發明之抗OX40 Fcab之抗體分子的另一特徵為針對OX40及第二抗原之二個抗原結合位點均含於抗體結構自身內。特定而言，抗體分子不需要其他蛋白質經連接子或其他手段與抗體分子融合，以產生二價結合至其目標二者的分子。此具有數個優點。具體而言，可使用類似於針對標準抗體產生所採用之方法產生抗體分子，因為該等抗體分子不包含任何額外融合部分。亦預期該結構引起改良之抗體穩定性，因為連接子可隨時間推移降解，產生抗體分子之異質群體。群體中僅具有一種融合蛋白之彼等抗體將不能夠與具有二種融合蛋白之抗體一樣有效誘導諸如OX40之TNFRSF受體的條件性促效作用。連接子之裂解或降解可在投與之前發生或在治療劑投與至患者之後發生(例如經由酶裂解或患者之活體內pH)，藉此導致在患者體內循環時其有效性的降低。由於本發明之抗體分子中不存在連接子，因此預期該等抗體分子在投與之前及之後均保留相同數目的結合位點。此外，自分子免疫原性之視角來看，本發明之抗體分子的結構亦為較佳的，因為融合蛋白或連接子或二者之引入可在抗體分子向患者投與時誘導免疫原性，導致治療劑之有效性降低。
因此，本發明提供：
[1]    一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之CH3域中的OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、 FS20 - 22 - 41 、 FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或FS20 - 22 - 38 之第一、第二及/或第三序列，較佳第一及第三序列，更佳第一、第二及第三序列，其中特異性結合成員之該第一、第二及第三序列： (i)FS20 -22 -49 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中； (ii)FS20 -22 -41 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 43、54及45中； (iii)FS20 -22 -47 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 43、54及62中； (iv)FS20 -22 -85 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 43、54及80中；且 (v)FS20 -22 -38 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 43、44及45中；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
[2]    一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之CH3域中的OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之第一、第二及/或第三序列，較佳第一及第三序列，更佳第一、第二及第三序列，其中特異性結合成員之該第一、第二及第三序列： (i)FS20 -31 -115 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中； (ii)FS20 -31 -108 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 122、132及133中； (iii)FS20 -31 -58 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 91、92及93中； (iv)FS20 -31 -94 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 111、112及113中； (v)FS20 -31 -102 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 122、123及102中；且 (vi)FS20 -31 -66 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 91、92及102中；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
[3]    一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之CH3域中的OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之第一、第二及/或第三序列，較佳第一及第三序列，更佳第一、第二及第三序列，其中特異性結合成員之該第一、第二及第三序列： (i)FS20 -11 -131 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 12、13及23中； (ii)FS20 -11 -127 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 12、13及14中；且 (iii)FS20 -11 -134 之第一、第二及第三序列分別列舉於SEQ ID NO 12、13及32中；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
[4]    如[1]之特異性結合成員，其中該第三序列定位於該CH3域之位置92與位置102之間，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[5]    如[2]之特異性結合成員，其中該第三序列定位於該CH3域之位置91與位置102之間，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[6]    如[3]之特異性結合成員，其中該第三序列定位於該CH3域之位置96與位置102之間，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[7]    如[3]或[6]之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含該CH3域之位置14、15、16、17或18處的胺基酸缺失，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[8]    如[1]至[7]中任一項之特異性結合成員，其中該第一序列定位於該CH3域之位置13與位置19之間，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[9]    如[1]至[8]中任一項之特異性結合成員，其中該第二序列定位於該CH3域之位置45與位置78之間，其中胺基酸殘基編號係根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案。
[10] 如[1]至[9]中任一項之特異性結合成員，其中該CH3域係人類IgG1 CH3域。
[11] 如[1]、[4]及[8]至[10]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 72、55、63、81及46中之特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 的CH3域序列。
[12] 如[11]之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含SEQ ID NO: 72中所列舉之特異性結合成員FS20 - 22 - 49 的CH3域序列。
[13] 如[2]、[5]及[8]至[10]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 143、134、94、114、124及103中之特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 的CH3域序列。
[14] 如[3]、[6]、[7]及[8]至[10]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 24、15及33中之特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 的CH3域序列。
[15] 如[1]至[14]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員進一步包含CH2域，較佳人類IgG1之CH2域。
[16] 如[15]之特異性結合成員，其中該CH2域具有SEQ ID NO: 5、6或7中所列舉之序列。
[17] 如[15]至[16]中任一項之特異性結合成員，該特異性結合成員在該CH2域之N端進一步包含免疫球蛋白鉸鏈區或其部分。
[18] 如[1]之特異性結合成員，其中該鉸鏈區或其部分係人類IgG1鉸鏈區或其部分。
[19] 如[18]之特異性結合成員，其中該鉸鏈區具有SEQ ID NO: 170中所列舉之序列或其片段。
[20] 如[18]或[19]之特異性結合成員，其中該鉸鏈區具有SEQ ID NO: 171中所列舉之序列。
[21] 如[1]、[4]、[8]至[10]、[11]至[12]及[15]至[20]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 74、57、65、83及48中之FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 76、59、67、85及50中之FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20-22 -85 或FS20 -22 -38 的序列。
[22] 如[21]之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含SEQ ID NO: 74或SEQ ID NO: 76中所列舉之特異性結合成員FS20 - 22 - 49 的序列。
[23] 如[2]、[5]、[8]至[10]、[13]及[15]至[20]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 145、136、96、116、126及105中之FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 147、138、98、118、128及107中之FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的序列。
[24] 如[3]、[6]、[7]至[10]及[14]至[20]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 26、17及35中之FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 28、19及37中之FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的序列。
[25] 如[1]至[24]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員結合人類OX40。
[26] 如[25]之特異性結合成員，其中該人類OX40具有以下、包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 161中所列舉之序列。
[27] 如[1]、[2]、[4]、[5]、[8]至[13]、[15]至[23]及[25]至[26]中任一項之特異性結合成員， 其中該特異性結合成員結合食蟹獼猴OX40。
[28] 如[27]之特異性結合成員或抗體分子，其中該食蟹獼猴OX40具有以下、包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 166中所列舉之序列。
[29]  如[1]至[28]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員係多特異性分子。
[30] 如[29]之特異性結合成員，其中該特異性結合成員係雙特異性、三特異性或四特異性分子。
[31] 如[30]之特異性結合成員，其中該特異性結合成員係雙特異性分子。
[32] 如[1]至[31]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員進一步包含第二抗原結合位點。
[33] 如[32]之特異性結合成員，其中該第二抗原結合位點係基於CDR之抗原結合位點。
[34] 如[33]之特異性結合成員，其中該第二抗原結合位點包含重鏈可變域CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈可變域CDR1、CDR2及CDR3。
[35] 如[33]至[34]之特異性結合成員，其中該第二抗原結合位點包含重鏈可變及輕鏈可變域。
[36] 如[32]至[35]中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員係抗體分子。
[37] 如[36]之抗體分子，其中該抗體分子係人類IgG1分子。
[38] 如[33]至[37]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子之該基於CDR之抗原結合位點結合選自由以下組成之群的第二抗原：免疫細胞抗原及疾病抗原。
[39]  如[38]之抗體分子，其中該疾病抗原係腫瘤抗原或病原抗原。
[40]  如[38]之抗體分子，其中該免疫細胞抗原為腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)之成員。
[41]  如[39]之抗體分子，其中該腫瘤抗原係腫瘤相關抗原(TAA)。
[42]  如[39]之抗體分子，其中該病原抗原係細菌或病毒抗原。
[43] 如[32]至[42]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子能夠在存在該第二抗原之情況下活化存在於T細胞上之OX40。
[44] 如[32]至[43]中任一項之抗體分子，其中該抗體分子與OX40及該第二抗原之結合引起免疫細胞上OX40之聚集。
[45] 如[43]或[44]之抗體分子，其中該免疫細胞係T細胞。
[46] 如[38]、[41]及[43]至[45]中任一項之抗體分子，其中該腫瘤抗原係癌細胞上之細胞表面抗原。
[47] 如[38]、[41]及[43]至[45]中任一項之抗體分子，其中該腫瘤抗原係可溶性多聚體。
[48] 如[47]之抗體分子，其中可溶性多聚體係至少二聚體。
[49] 如[48]之抗體分子，其中可溶性多聚體係至少三聚體。
[50] 如[1]至[49]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其中該特異性結合成員或抗體分子已經修飾，以減少或消除該特異性結合成員或抗體分子之CH2域與一或多種Fcγ受體的結合。
[51] 如[1]至[50]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其中該特異性結合成員或抗體分子不結合至Fcγ受體。
[52]  如[50]或[51]之特異性結合成員或抗體分子，其中該等Fcγ受體係選自由以下組成之群：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIII。
[53] 如[1]至[52]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其中該特異性結合成員或抗體分子與生物活性分子共軛。
[54] 如[1]至[52]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其中該特異性結合成員或抗體分子與可偵測標記共軛。
[55] 一種核酸分子，其編碼如[1]至[52]中任一項之特異性結合成員或抗體分子。
[56] 如[55]之核酸分子，其中該(等)核酸分子包含： (i)分別列舉於SEQ ID NO: 73、56、64、82及47中之特異性結合成員FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的CH3域核酸序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO: 144、135、95、115、125及104中之特異性結合成員FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的CH3域核酸序列；或 (iii)分別列舉於SEQ ID NO: 25、16及34中之特異性結合成員FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的CH3域核酸序列。
[57]  如[55]或[56]之核酸分子，其中該核酸分子包含以下特異性結合成員之核酸序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO: 75、58、66、a84及49中之特異性結合成員FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的核酸序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO: 146、137、97、117、127及106中之特異性結合成員FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的核酸序列；或 (iii)分別列舉於SEQ ID NO: 27、18及36中之特異性結合成員FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的核酸序列。
[58]  如[55]或[56]之核酸分子，其中該核酸分子包含以下特異性結合成員之核酸序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO: 77、60、68、86及51中之FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的核酸序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO: 148、139、99、119、129及108中之FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的核酸序列。 (ii)分別列舉於SEQ ID NO: 29、20及38中之FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的核酸序列。
[59] 一種載體，其包含如[55]至[58]中任一項之核酸。
[60] 一種重組宿主細胞，其包含如[55]至[58]中任一項之核酸，或[59]之載體。
[61] 一種產生如[1]至[52]中任一項之特異性結合成員或抗體分子之方法，該方法包含在用於產生該特異性結合成員或抗體分子之條件下培養如[60]之重組宿主細胞。
[62] 如[61]之方法，其進一步包含分離及/或純化該特異性結合成員或抗體分子。
[63] 一種醫藥組合物，其包含如[1]至[54]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，及醫藥學上可接受之賦形劑。
[64] 如[1]至[54]中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其用於藉由療法治療人體或動物體之方法中。
[65] 一種治療個體之疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如[1]至[54]中任一項之特異性結合成員或抗體分子。
[66] 如[64]所使用之特異性結合成員或抗體分子，或如[65]之方法，其中該治療係個體之癌症或感染性疾病的治療。
[67]  如[64]或[66]所使用之特異性結合成員或抗體分子，或如[65]或[66]之方法，其中治療方法包含向該個體投與該特異性結合成員或抗體分子與第二治療劑之組合。
較佳實施例之詳細說明 本發明係關於結合OX40之特異性結合成員。OX40亦被稱作腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (TNFRSF4)或CD134。具體而言，特異性結合成員包含定位於該特異性結合成員之恆定域中的OX40抗原結合位點。特異性結合成員較佳能夠二價結合OX40。特異性結合成員較佳結合人類OX40，更佳人類及食蟹獼猴OX40。特異性結合成員所結合之OX40的部分較佳為OX40胞外域。人類及食蟹獼猴OX40之胞外域可包含以下或由以下組成：分別列舉於SEQ ID NO 161及162中之序列。特異性結合成員較佳能夠結合至在細胞表面上表現之OX40，該細胞較佳為T細胞，諸如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、第1型T輔助(Th1)細胞、第2型T輔助(Th2)細胞或調節T (Treg)細胞或腫瘤浸潤T細胞，或自然殺手(NK)細胞。腫瘤浸潤T細胞為在許多癌症中發現之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之子集。
特異性結合成員較佳特異性結合OX40。術語「特異性」可以指特異性結合成員將不展示與除其(多種)特異性結合搭配物外之分子之任何顯著結合的情況。術語「特異性」亦可在特異性結合成員對由數種抗原攜載之特定抗原決定基(諸如OX40上之抗原決定基)具有特異性時適用，在此情況下特異性結合成員將能夠結合至攜載抗原決定基之各種抗原。特異性結合成員較佳不與CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR及/或CD137結合，或不展示與其之任何顯著結合。
本發明之特異性結合成員針對其結合二聚OX40之能力經選擇。與結合至單體OX40相比，特異性結合成員可以較高親和性結合至二聚OX40。認為對二聚OX40之高親和性有益於誘導OX40聚集及因此T細胞活化。已展示以高親和性結合至TNF受體Fas之抗體具有降低之促效活性。如OX40，Fas需要三聚合作用以便活化。認為諸如IgG抗體之二價促效劑必須能夠結合Fas且隨後部分解離，以便募集其他Fas單體且形成活性信號傳遞複合物。認為以高親和性結合至Fas單體之抗體變為鎖定在非信號傳遞狀態中(Chodorge等人, 2012)。
特異性結合成員較佳以70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之親和性(KD )或更高親和性結合至二聚人類OX40。較佳地，特異性結合成員以1 nM之親和性(KD )或更高親和性結合至人類OX40。
亦已展示FS20-22及FS20-31譜系之特異性結合成員結合二聚食蟹獼猴OX40。結合至食蟹獼猴OX40以及人類OX40係有益的，因為其准許在向人類投與之前在食蟹獼猴中測試特異性結合成員之功效及毒性。來自FS20-11譜系之特異性結合成員展示與二聚食蟹獼猴OX40之結合，但親和性較低，表明其將較不適於食蟹獼猴中之臨床前測試。
在一較佳實施例中，特異性結合成員可以150 nM、140 nM、120 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM或2 nM之親和性(KD )或更高親和性結合至二聚食蟹獼猴OX40。較佳地，特異性結合成員以2 nM之親和性(KD )或更高親和性結合至食蟹獼猴OX40。
如本發明實例中所描述，認為與人類及食蟹獼猴抗原結合之相似性可為有利的，因為希望食蟹獼猴研究中mAb2 之特性可外推至人類。認為此有益於在食蟹獼猴中利用特異性結合成員進行功效及毒性研究，該等研究可預測特異性結合成員在人類中之功效及毒性。
因此，在一較佳實施例中，與特異性結合成員結合二聚人類OX40之親和性相比，特異性結合成員以不低於或高於該親和性超過10倍、較佳不低於或高於超過5倍的親和性結合至二聚食蟹獼猴OX40。
可藉由表面電漿子共振(SPR)，例如Biacore測定特異性結合成員與同源抗原，諸如人類或食蟹獼猴OX40的結合親和性。
特異性結合成員可能能夠阻斷OX40與其配位體OX40L之間的相互作用，較佳人類OX40與人類OX40L之間的相互作用。可使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定特異性結合成員阻斷OX40L與OX40結合之能力。
術語「特異性結合成員」描述免疫球蛋白或其片段，包含恆定域，該恆定域包含OX40抗原結合位點。如本文所用，術語「特異性結合成員」由此包括抗原結合片段，其限制條件為該抗原結合片段包含定位於特異性結合成員之恆定域中的OX40抗原結合位點。恆定域可為CL、CH1、CH2、CH3或CH4域，較佳恆定域為CH1、CH2或CH3域，更佳CH2或CH3域，最佳CH3域。特異性結合成員可部分或全部合成產生。
較佳地，特異性結合成員包含CH2及CH3域，其中CH2或CH3域，較佳CH3域，包含OX40抗原結合位點。特異性結合成員較佳為各自包含CH2及CH3域之二個(一致)多肽鏈的二聚體。在一較佳實施例中，特異性結合成員在CH2域之N端進一步包含免疫球蛋白鉸鏈區或其部分。此類分子在本文中亦被稱作抗原結合Fc片段，或FcabTM 。鉸鏈區可由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 170中所列舉之序列或其片段。較佳地，片段為SEQ ID NO: 170中所列舉之序列的C端片段。片段長度可為至多20、至多10、至多8或至多6個胺基酸。片段長度可為至少3、至少4、至少5或至少6個胺基酸。在一較佳實施例中，鉸鏈區具有SEQ ID NO: 171中所列舉之序列。
在一較佳實施例中，特異性結合成員為抗體分子，較佳單株抗體，或其片段。抗體分子較佳為人類或人類化的。抗體分子可為免疫球蛋白G分子，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，較佳IgG1、IgG2或IgG4分子，更佳IgG1分子，或其片段。
由於抗體可以數種方法修飾，因此術語「抗體分子」應視為涵蓋抗體片段，抗體之衍生物、功能等效物及同系物，無論為天然抑或完全或部分合成的。包含CH3域之抗體片段之一實例為抗體的Fc域。包含CDR序列及CH3域二者之抗體片段之一實例為微型抗體，其包含接合至CH3域之scFv (Hu等人, 1996)。
特異性結合成員包含OX40抗原結合位點。OX40抗原結合位點定位於特異性結合成員之恆定域，較佳CH3域中。OX40抗原結合位點包含特異性結合成員之恆定域中的一或多種經修飾結構環。對抗體恆定域結構環進行工程改造以建立針對目標抗原之抗原結合位點係此項技術中已知的，且描述於例如Wozniak-Knopp G等人, 2010及專利公開案第WO2006/072620號及第WO2009/132876號中。
較佳地，OX40抗原結合位點包含經修飾AB、CD及/或EF結構環。諸位發明人已認識到，在一些情況下，與CD環序列相比，AB及EF環序列在抗原結合中起較大作用。此由Fcab FS20-22及FS20-11結合OX40但在其CD環序列中不包含任何修飾(參見圖 1 )之事實顯而易見。因此，在一較佳實施例中，OX40抗原結合位點包含經修飾AB及EF結構環。在一替代性較佳實施例中，OX40抗原結合位點包含經修飾AB、CD及EF結構環。
在一較佳實施例中，特異性結合成員之CH3域之位置95及96處的殘基為野生型，亦即較佳分別為精胺酸(R)及色胺酸(W)。此等殘基均定位於EF結構環中。除非另外指示，否則胺基酸殘基位置在本文中根據ImMunoGeneTics (IMGT)編號方案進行編號。IMGT編號方案描述於Lefranc等人, 2005中。
因此，特異性結合成員之OX40抗原結合位點可包含第一、第二及/或第三序列，較佳第一及第三序列，或第一、第二及序列序列，其中第一、第二及第三序列分別定位於特異性結合成員之恆定域，較佳CH3域的AB、CD及EF結構環中。
第一、第二及第三序列可為以下之CH3域的第一、第二及第三序列：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、 FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 ，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 ， 再更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 ，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 。
可替代地，第一、第二及第三序列可為以下之CH3域的第一、第二及第三序列：特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、 FS20 - 31 - 108 、 FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 或 FS20 - 31 - 66 ，更佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、 FS20 - 31 - 108 、 FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或FS20 - 31 - 102 ， 再更佳 特異性結合成員FS20 - 31 - 115 或 FS20 - 31 - 108 ， 甚至更佳 特異性結合成員FS20 - 31 - 115 。
作為另一替代方案，第一、第二及第三序列可為以下之CH3域的第一、第二及第三序列：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或FS20 - 11 - 134 ， 更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 。
特異性結合成員FS20-22-38 、FS20-22-41 、FS20-22-47 、FS20-22-49 、FS20-22-85 、 FS20-31-58 、FS20-31-66 、FS20-31-94 、FS20-31-102 、 FS20-31-108 、FS20-31-115 、 FS20-11-127 、 FS20-11-131 及 FS20-11-134 之CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 46、55、63、72、81、94、103、114、124、134、143、15、24及33中。
特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 及 FS20 - 22 - 38 之第一、第二及第三序列可為以下位置處的序列： 分別FS20-22-49 、FS20-22-41 、FS20-22-47 、FS20-22-85 及 FS20-22-38 之CH3域的 (i) 14至18、45.1至77及97至101；或 (ii) 14至18、45.1至77及93至101。
在結合OX40之FS20-31譜系之親和性成熟後鑑別的所有76種特異性結合成員在CH3域之位置77處包含天冬胺酸(D)殘基，表明在此等分子中，此殘基可能對OX40結合重要。類似地，FS20-31中之所有特異性結合成員保留CH3域之位置45.3處的野生型麩胺酸(E)殘基，表明在此等分子中，此殘基亦可能對OX40結合重要。因此，特異性結合成員可包含特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之第一序列及第三序列，其中第一序列為定位於特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之CH3域之位置14至18處的序列，且第二序列為定位於位置92至101，或97至101處的序列序列，且其中特異性結合成員進一步包含CH3域之位置77處的天冬胺酸(D)殘基，及任擇地CH3域之位置45.3處的麩胺酸(E)殘基。特異性結合成員可任擇地進一步包含CH3域之位置45.1、45.2及/或45.4處的胺基酸取代。
可替代地，特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 及FS20 - 31 - 66 之第一、第二及第三序列可為以下位置處的序列： 分別FS20-31-115 、FS20-31-108 、FS20-31-58 、FS20-31-94 、 FS20-31-102 及FS20-31-66 之CH3域的 (i) 14至18、45.1至77，及97至101；或 (ii) 14至18、45.1至77，及92至101。
特異性結合成員FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 及FS20 - 11 - 134 之第一、第二及第三序列可為在以下位置之間的序列： 分別FS20-11-127 、 FS20-11-131 及FS20-11-134 之CH3域的 (i) 13與19、45.2與78及96與102； (ii) 11與19、45.2與78及96與102； (iii) 13與19、45與78及96與102；或 (iv) 11與19、45與78及96與102。
第一、第二及第三序列可分別為特異性結合成員FS20-22-49 、FS20-22-41 、FS20-22-47 、FS20-22-85 、 FS20-22-38 、FS20-31-115 、 FS20-31-108 、 FS20-31-58 、FS20-31-94 、FS20-31-102 、 FS20-31-66 、 FS20-11-131 、 FS20-11-127 或 FS20-11-134 之完整AB、CD及EF結構環序列。例如根據IMGT、IMGT外顯子、EU或Kabat編號系統確定AB、CD及EF結構環在CH3域序列中之位置在熟習此項技術者能力範圍內且描述於Hasenhindl等人(2013)中。在一較佳實施例中，根據IMGT編號系統之AB、CD及EF結構環分別定位於特異性結合成員之CH3域的位置10與19之間、42與79之間及91與102之間。在一較佳實施例中，第一、第二及第三序列因此分別為特異性結合成員FS20-22-49 、FS20-22-41 、FS20-22-47 、FS20-22-85 、 FS20-22-38 、FS20-31-115 、 FS20-31-108 、 FS20-31-58 、FS20-31-94 、FS20-31-102 、 FS20-31-66 、 FS20-11-131 、 FS20-11-127 或 FS20-11-134 之CH3域之位置10與19之間、42與79之間及91與102之間的序列。
在一較佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中之FS20 -22 -49 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及45中之FS20 -22 -41 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及62中之FS20 -22 -47 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及80中之FS20 -22 -85 的第一、第二及第三序列；或 (v)分別列舉於SEQ ID NO 43、44及45中之FS20 -22 -38 的第一、第二及第三序列； 其中第一、第二及第三序列較佳分別定位於特異性結合成員之CH3域的位置14至18、45.1至77及93至101處。
在一更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中之FS20 -22 -49 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及45中之FS20 -22 -41 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及62中之FS20 -22 -47 的第一、第二及第三序列；或 (iv)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及80中之FS20 -22 -85 的第一、第二及第三序列。
在一甚至更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中之FS20 -22 -49 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及45中之FS20 -22 -41 的第一、第二及第三序列；或 (iii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及62中之FS20 -22 -47 的第一、第二及第三序列。
在一再更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中之特異性結合成員FS20 - 22 - 49 的第一、第二及第三序列。
特異性結合成員可在特異性結合之CH3域的位置91處進一步包含白胺酸(L)。特定而言，含包含特異性結合成員FS20 - 22 - 85 之第一、第二及第三序列之OX40抗原結合位點的特異性結合成員可在特異性結合成員之CH3域的位置91處包含白胺酸。
在一替代性較佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中之FS20 -31 -115 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 122、132及133中之FS20 -31 -108 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 91、92及93中之FS20 -31 -58 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO 111、112及113中之FS20 -31 -94 的第一、第二及第三序列； (v)分別列舉於SEQ ID NO 122、123及102中之FS20 -31 -102 的第一、第二及第三序列；或 (vi)分別列舉於SEQ ID NO 91、92及102中之FS20 -31 -66 的第一、第二及第三序列； 其中第一、第二及第三序列較佳分別定位於特異性結合成員之CH3域的位置14至18、45.1至77及92至101處。
在一更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中之FS20 -31 -115 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 122、132及133中之FS20 -31 -108 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 91、92及93中之FS20 -31 -58 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO 111、112及113中之FS20 -31 -94 的第一、第二及第三序列；或 (v)分別列舉於SEQ ID NO 122、123及102中之FS20 -31 -102 的第一、第二及第三序列。
在一甚至更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中之FS20 -31 -115 的第一、第二及第三序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 122、132及133中之FS20 -31 -108 的第一、第二及第三序列。
在一再更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中之特異性結合成員FS20 - 31 - 115 的第一、第二及第三序列。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及23中之FS20 -11 -131 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及14中之FS20 -11 -127 的第一、第二及第三序列；或 (iii)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及32中之FS20 -11 -134 的第一、第二及第三序列； 其中第一、第二及第三序列較佳定位於特異性結合成員之CH3域的位置13與19之間、45與78之間及96與102之間。
在一更佳實施例中，特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含分別列舉於SEQ ID NO 12、13及23中之特異性結合成員FS20 - 11 - 131 的第一、第二及第三序列。
特異性結合成員可在特異性結合成員之CH3域之位置12處進一步包含麩胺酸(E)、在位置94處進一步包含天冬醯胺酸(N)及/或在位置103處進一步包含白胺酸(L)。特定而言，含包含特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之第一、第二及第三序列之OX40抗原結合位點的特異性結合成員，可在特異性結合成員之CH3域的位置12處進一步包含麩胺酸，且在位置103處進一步包含白胺酸。另外，含包含特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之第一、第二及第三序列之OX40抗原結合位點的特異性結合成員，可在特異性結合成員之CH3域的位置94處包含天冬醯胺酸。
含包含特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之AB、CD及EF結構環序列之OX40抗原結合位點的特異性結合成員，可在特異性結合成員之CH3域的位置103處進一步包含白胺酸。
在特異性結合成員之OX40抗原結合位點包含特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之第一、第二及第三序列，或AB、CD及EF結構環序列時，特異性結合成員可在特異性結合成員之CH3域的位置13與19之間，例如在位置14、15、16、17或18處包含胺基酸缺失。認為此等特異性結合成員中存在之缺失由於引子錯誤而發生，且缺失之精確位置因此未知。在圖 1A 中，在位置18處展示缺失，但缺失可同樣定位於CH3域之位置14、15、16或17處。
作為IMGT編號之替代方案，如本文所描述之胺基酸殘基位置，包括胺基酸序列、取代、缺失及插入之位置，可根據IMGT外顯子編號(亦被稱作連續編號)、EU編號或Kabat編號進行編號。CH3域之殘基位置之IMGT編號、IMGT外顯子編號、EU編號及Kabat編號之間的一致性展示於圖 1 中。因此，舉例而言，在本申請案提及分別定位於特異性結合成員之CH3域之位置14至18、45.1至77及93至101處的第一、第二及第三序列時，其中殘基位置根據IMGT編號方案進行編號，第一、第二及第三序列定位於CH3域之位置18至22、46至50及74至82，其中殘基位置根據IMGT外顯子編號方案進行編號，如圖 1 中所展示。可替代地，如本文所描述，CH3域中之胺基酸殘基的位置，包括CH3域中胺基酸序列、取代、缺失及插入之位置，可參考其列舉於SEQ ID NO : 4 中之野生型CH3域序列中的位置界定。IMGT編號與野生型CH3域序列之間的一致性亦展示於圖 1 中。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含CH3域，其包含以下、具有以下或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、S20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 之CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 之CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 之CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 之CH3域序列， 其中特異性結合成員FS20 - 22 - 38 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 49 及 FS20 - 22 - 85 之CH3域序列分別列舉於SEQ ID NO 46、55、63、72及81中。
在一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含CH3域，其包含以下、具有以下或由以下組成：特異性結合成員FS20-31-115 、FS20-31-108 、FS20-31-58 、FS20-31-94 、 FS20-31-102 或FS20-31-66 之CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20-31-115 、FS20-31-108 、FS20-31-58 、FS20-31-94 或 FS20-31-102 之CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20-31-115 或FS20-31-108 之CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20-31-115 之CH3域序列，其中特異性結合成員FS20-31-58 、FS20-31-66 、FS20-31-94 、FS20-31-102 、 FS20-31-108 及FS20-31-115 之CH3域序列分別列舉於SEQ ID NO 94、103、114、124、134及143中。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含CH3域，其包含以下、具有以下或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之CH3域序列， 其中特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之CH3域序列分別列舉於SEQ ID NO 15、24及33中。
特異性結合成員之CH3域可在CH3域序列之最接近的C端處任擇地包含額外離胺酸殘基(K)。
可獲得單株及其他抗體且使用重組DNA技術之技術以產生保留原始抗體之特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術可涉及將CDR或可變區引入至不同免疫球蛋白中。將一種免疫球蛋白之CDR引入至另一免疫球蛋白中描述於例如EP-A-184187、GB 2188638A及EP-A-239400中。可採用類似技術，以將構成本發明之特異性結合成員之OX40抗原結合位點的恆定域序列引入至另一特異性結合成員之恆定域，例如CH3域中，藉此產生特異性結合成員，該特異性結合成員在其恆定域中包含OX40抗原結合位點。可替代地，可將特異性結合成員之全部恆定域序列用本發明之特異性結合成員之恆定域序列置換，以製備特異性結合成員，該特異性結合成員在其恆定域中包含OX40抗原結合位點。類似地，可將特異性結合成員之恆定域序列的片段用包含OX40抗原結合位點之本發明之特異性結合成員之恆定域序列的對應片段置換。
另外，特異性結合成員可包含免疫球蛋白G分子之CH2域，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子之CH2域。較佳地，特異性結合成員包含IgG1分子之CH2域。CH2域可具有SEQ ID NO: 5中所列舉之序列。已知CH2域結合至Fcγ受體及補體。CH2域與Fcγ受體之結合係抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)所需的，而與補體之結合係補體依賴性細胞毒性(CDC)所需的。在一些實施例中，特異性結合成員誘發ADCC及/或CDC。在特異性結合成員包含針對腫瘤抗原之第二抗原結合位點的情形下，此係較佳的。在不希望受理論束縛的情況下，認為在特異性結合成員未結合至OX40時，特異性結合成員與腫瘤細胞之結合將誘發ADCC或CDC介導之腫瘤細胞殺滅。在特異性結合成員結合至腫瘤抗原及OX40二者，引起T細胞活化時，此效應將為T細胞介導之腫瘤細胞殺滅的附加。
特異性結合成員之CH2域可包含一或多種突變，該一或多種突變減少或消除CH2域與一或多種Fcγ受體(諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII)及/或補體之結合。諸位發明人假定減少或消除與Fcγ受體之結合將減少或消除由特異性結合成員介導之ADCC。類似地，預期減少或消除與補體之結合將減少或消除由特異性結合成員介導之CDC。減少或消除CH2域與一或多種Fcγ受體及/或補體之結合的突變係此項技術中已知的(Wang等人, 2018)。此等突變包括Bruhns等人, 2009及Hezareh等人, 2001中所描述之「LALA突變」，其涉及CH2域之IMGT位置1.3及1.2處的白胺酸殘基經丙胺酸取代(L1.3A及L1.2A)。可替代地，亦已知藉由將CH2域之IMGT位置84.4處的天冬醯胺酸(N)突變成丙胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，經由守恆N鍵聯糖基化位點之突變產生α-糖基抗體，降低IgG1效應功能(Wang等人, 2018)。作為另一替代方案，已知經由CH2域之IMGT位置114處之脯胺酸突變成丙胺酸或甘胺酸(P114A或P114G)，補體活化(C1q結合)及ADCC減少(Idusogie等人, 2000; Klein等人, 2016)。亦可將此等突變組合以便產生具有進一步降低之ADCC或CDC活性或不具有ADCC或CDC活性的特異性結合成員。
因此，特異性結合成員可包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3及1.2處之丙胺酸殘基；及/或 (ii)位置114處之丙胺酸或甘胺酸；及/或 (iii)位置84.4處之丙胺酸、麩醯胺酸或甘胺酸； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含CH2域，其中該CH2域較佳包含： (i)位置1.3及1.2處之丙胺酸殘基；及/或 (ii)位置114處之丙胺酸或甘胺酸； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3處之丙胺酸殘基；及 (ii)位置1.2處之丙胺酸殘基； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
舉例而言，CH2域可具有SEQ ID NO: 6中所列舉之序列。
在一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含CH2域，其中該CH2域包含： (i)位置1.3處之丙胺酸殘基； (ii)位置1.2處之丙胺酸殘基；及 (iii)位置114處之丙胺酸； 其中胺基酸殘基編號係根據IMGT編號方案。
舉例而言，CH2域可具有SEQ ID NO: 7中所列舉之序列。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 之CH2及CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 之CH2及CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 之CH2及CH3域序列，其中特異性結合成員FS20 - 22 - 38 、 FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 49 及 FS20 - 22 - 85 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 48、57、65、74及83中，在胺基酸7處起始向前。
在一個替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 之CH2及CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 之CH2及CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 之CH2及CH3域序列，其中特異性結合成員FS20 - 22 - 38 、 FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 49 及 FS20 - 22 - 85 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 50、59、67、76及85中，在胺基酸7處起始向前。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之CH2及CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 之CH2及CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 之CH2及CH3域序列，其中特異性結合成員FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 96、105、116、126、136及145中，在胺基酸7處起始向前。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之CH2及CH3域序列，較佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 之CH2及CH3域序列，最佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 之CH2及CH3域序列，其中特異性結合成員FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 98、107、118、128、138及147中，在胺基酸7處起始向前。
在再另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之CH2及CH3域序列， 其中特異性結合成員FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 或 FS20 - 11 - 134 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 17、26及35中，在胺基酸7處起始向前。
在再另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之CH2及CH3域序列，更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之CH2及CH3域序列， 其中特異性結合成員FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 或 FS20 - 11 - 134 之CH2及CH3域序列分別展示於SEQ ID NO 19、28及37中，在胺基酸7處起始向前。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 之序列，較佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 之序列，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 22 - 38 、 FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 49 及 FS20 - 22 - 85 之序列分別列舉於SEQ ID NO 48、57、65、74及83中。
在一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 之序列，較佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 之序列，最佳特異性結合成員FS20 - 22 - 49 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 22 - 38 、 FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 49 及 FS20 - 22 - 85 之序列分別列舉於SEQ ID NO 50、59、67、76及85中。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之序列，較佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 之序列，最佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之序列分別列舉於SEQ ID NO 96、105、116、126、136及145中。
在另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 之序列，較佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 之序列，最佳特異性結合成員FS20 - 31 - 115 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之序列分別列舉於SEQ ID NO 98、107、118、128、138及147中。
在再另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 及 FS20 - 11 - 134 之序列分別列舉於SEQ ID NO 17、26及35中。
在再另一替代性較佳實施例中，特異性結合成員包含以下、具有以下、或由以下組成：特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 之序列，更佳特異性結合成員FS20 - 11 - 131 之序列，其中特異性結合成員FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 及 FS20 - 11 - 134 之序列分別列舉於SEQ ID NO 19、28及37中。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含除定位於特異性結合成員之恆定域中的OX40抗原結合位點以外，結合一或多個其他抗原之一或多個其他抗原結合位點。一或多個其他抗原結合位點較佳特異性結合其同源抗原。
一或多個其他抗原結合位點可結合OX40或另一抗原。特異性結合成員可由此為多特異性，例如雙特異性、三特異性或四特異性分子，較佳雙特異性分子。在一較佳實施例中，特異性結合成員能夠同時結合至OX40及一或多個其他抗原。
已知抗體分子具有包含離散域之模組化架構，該等域可以許多不同方式組合以建立多特異性，例如雙特異性、三特異性或四特異性抗體格式。例示性多特異性抗體格式描述於例如Spiess等人(2015)及Kontermann (2012)中。本發明之特異性結合成員可以此類多特異性抗體格式採用。此具有以下之額外優點：經由存在特異性結合成員之抗原結合位點恆定域，例如CH3域，將一其他抗原結合位點引入至此類多特異性抗體格式中。
舉例而言，本發明之特異性結合成員可為異二聚抗體分子，諸如異二聚完整免疫球蛋白分子，或其片段。在此情況下，抗體分子之一部分將具有如本文所描述之序列或多個序列。舉例而言，在本發明之特異性結合成員為雙特異性異二聚抗體分子時，特異性結合成員可包含含如本文所描述之CH3域的重鏈，該重鏈與結合除OX40外之抗原的重鏈配對。用於製備異二聚抗體之技術係此項技術中已知的，且包括臼包杵(KIH)技術，其涉及對抗體分子之CH3域進行工程改造，以建立「杵」或「臼」以促進鏈異二聚。可替代地，可經由將電荷對引入至抗體分子中，以藉由靜電斥力避免CH3域之均二聚且藉由靜電引力引導雜二聚，製備異二聚抗體。異二聚抗體格式之實例包括互換Mab (CrossMab)、mAb-Fv、SEED體及KIH IgG。
可替代地，本發明之多特異性特異性結合成員可包含完整免疫球蛋白分子或其片段，及額外抗原結合部分或多個部分。抗原結合部分可例如為Fv、scFv或單域抗體，且可融合至完整免疫球蛋白分子或其片段。包含融合至完整免疫球蛋白分子之額外抗原結合部分之多特異性抗體分子的實例包括DVD-IgG、DVI-IgG、scFv4-IgG、IgG-scFv及Fv-IgG分子(Spiess等人, 2015；圖1)。包含融合至包含CH3域之免疫球蛋白片段之額外抗原結合部分之多特異性抗體分子的實例包括例如sc雙功能抗體(scDiabody)-CH3、雙功能抗體-CH3及scFv-CH3 KIH (Spiess等人, 2015；圖1)。
其他適合之多特異性格式將對熟習此項技術者顯而易見。
在一較佳實施例中，特異性結合成員包含結合第二抗原之第二抗原結合位點，其中第二抗原結合位點較佳為基於CDR之抗原結合位點。基於CDR之抗原結合位點為抗體可變區中之抗原結合位點。基於CDR之抗原結合位點由六個CDR形成；三個輕鏈可變域(VL) CDR及三個重鏈可變域(VH) CDR。
針對給定抗原之抗體分子的製備及此類抗體分子之CDR序列的測定係明確的，且許多適合技術係此項技術中已知的。CDR序列可例如根據Kabat等人, 1991或國際ImMunoGeneTics資訊系統(international ImMunoGeneTics information system；IMGT) (Lefranc等人, 2015)測定。
舉例而言，特異性結合成員可為mAb2 (™)雙特異性抗體。如本文中所提及，mAb2 雙特異性抗體為IgG免疫球蛋白，其包括在其可變區中之每一者中的基於CDR之抗原結合位點，及恆定域中之至少一個抗原結合位點。在本發明之特異性結合成員呈mAb2 格式時，特異性結合成員由此包含除特異性結合成員之恆定域中之OX40抗原結合位點以外，其可變區中之每一者中的基於CDR之抗原結合位點。
抗原結合位點之三個VH域CDR可定位於免疫球蛋白VH域內，且三個VL域CDR可定位於免疫球蛋白VL域內。舉例而言，基於CDR之抗原結合位點可定位於抗體可變區中。
特異性結合成員可具有一個或較佳多於一個，例如二個針對第二抗原的基於CDR之抗原結合位點。特異性結合成員由此可包含一個VH域及一個VL域，但較佳包含二個VH域及二個VL域，亦即二個VH/VL域對，如天然存在之IgG分子中的情況。
在一些較佳實施例中，特異性結合成員可為包含二個可變區之免疫球蛋白，各可變區包含針對第二抗原的基於CDR之抗原結合位點。
在一較佳實施例中，抗體由此為結合OX40及第二抗原之抗體，該抗體分子包含： (i)定位於該抗體分子之二個CH3域中之二個針對OX40的抗原結合位點；及 (ii)二個針對第二抗原之基於CDR之抗原結合位點，其各自由免疫球蛋白VH域及免疫球蛋白VL域形成。 在一更佳實施例中，抗體為完整免疫球蛋白分子，例如結合OX40及第二抗原之完整IgG1分子，該抗體分子包含： (i)定位於該抗體分子之二個CH3域中之二個針對OX40的抗原結合位點；及 (ii)二個針對第二抗原之基於CDR之抗原結合位點，其各自由免疫球蛋白VH域及免疫球蛋白VL域形成；且 其中免疫球蛋白分子進一步包含CH1、CH2及CL域。
OX40之活化需要T細胞表面上OX40之聚集，其反過來刺激胞內信號傳遞路徑及T細胞活化。在不存在特異性結合成員之交聯之情況下，特異性結合成員與T細胞表面上之OX40的結合可能不會使OX40形成團簇，或可能僅誘導OX40之有限聚集，且因此可能不會引起T細胞活化，或可能僅引起有限T細胞活化。
諸位發明人已展示特異性結合成員FS20-11-131、FS20-11-127及FS20-11-134在不存在特異性結合成員之交聯之情況下不進行T細胞活化。對比而言，FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85、FS20-22-38、FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102及FS20-31-66在不存在交聯之情況下誘導有限T細胞活化。此等特異性結合成員之OX40促效作用在特異性結合成員交聯時受誘導或增加(參見實例 5 )。
如上所解釋，抗體分子經由與Fcγ受體結合之交聯低效且無法靶向至特定部位，例如疾病位點，因為表現Fcγ受體之細胞在整個人體中存在。第二抗原結合位點所結合之第二抗原因此較佳不為Fcγ受體。
在一較佳實施例中，本發明之特異性結合成員因此包含結合第二抗原之第二抗原結合位點，其中第二抗原能夠結合至且交聯多個特異性結合成員。
舉例而言，諸位發明人已展示，在第二抗原為可為單體或多聚，且以高濃度存在且/或在表面處(例如細胞表面處)聚集的表面抗原(諸如細胞表面抗原)時，特異性結合成員與第二抗原之結合引起或增強T細胞活化。在不希望受理論束縛的情況下，認為特異性結合成員與充足的細胞表面抗原之結合，例如引起結合至細胞表面之特異性結合成員的高密集度，其將特異性結合成員足夠貼近置放以使得能夠驅動OX40聚集及T細胞活化。在一較佳實施例中，第二抗原因此為以高密集度在表面(例如細胞表面)處表現之表面抗原。
諸位發明人亦已展示，在第二抗原為多聚可溶性分子(例如多聚可溶性因子)時，特異性結合成員與第二抗原之結合引起或增強T細胞活化。在一較佳實施例中，第二抗原在可溶性分子時因此為多聚抗原，諸如二聚體、三聚體或高階多聚體，且因此能夠交聯數個特異性結合成員。
如本文中所描述，包含結合第二抗原之第二抗原結合位點，且僅在結合至第二抗原時活化T細胞，或T細胞活化活性在結合至第二抗原時得到增強的特異性結合成員亦被稱作條件性促效劑。在結合至第二抗原時之此T細胞活化活性不依賴於特異性結合成員與Fcγ受體及/或外部交聯劑(諸如蛋白A或G或二次抗體)之結合，且因此允許特異性結合成員之條件性促效活性靶向至存在第二抗原之位點。舉例而言，在第二抗原為疾病抗原時，特異性結合成員可在個體之疾病位點處且不在別處選擇性活化T細胞，或可在個體之疾病位點處且不在別處選擇性增強T細胞活化。
另外，與依賴於藉由其他機制，諸如外部交聯劑交聯或經由Fcγ受體相互作用交聯之特異性結合成員相比，僅在結合至第二抗原時活化T細胞，或T細胞活化活性在結合至第二抗原時得到增強之特異性結合成員，較佳具有提高的T細胞活化活性。因為OX40之活化更高效，所以相對於其他特異性結合成員，本文所描述之特異性結合成員可在較低濃度下達成T細胞活化。
因此，與在特異性結合成員未交聯時相比，在特異性結合成員例如經由結合至第二抗原交聯時，本發明之特異性結合較佳誘導提高的T細胞活化。
可使用T細胞活化分析來量測抗體分子或特異性結合成員活化T細胞之能力。T細胞在活化時釋放IL-2。T細胞活化分析可因此量測IL-2釋放，以測定由抗體分子或特異性結合成員誘導之T細胞活化的位準。
舉例而言，可藉由在特異性結合成員或抗體分子交聯時，在T細胞活化分析中量測為達成由T細胞半最大釋放IL-2所需之抗體分子或特異性結合成員的濃度，測定抗體分子或特異性結合成員活化T細胞之能力。此在下文被稱為抗體分子或特異性結合成員之EC50 。較低EC50 指示在T細胞活化分析中需要較低濃度之抗體分子或特異性結合成員以達成由T細胞半最大釋放IL-2，且因此抗體分子或特異性結合成員具有較高T細胞活化活性。特異性結合成員或抗體分子可例如使用及抗CH2抗體交聯。
在一較佳實施例中，抗體分子或特異性結合成員在T細胞活化分析中具有FS20-22-49/4420 (包含LALA突變)在相同分析中之EC50 之50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍內的EC50 ，其中FS20-22-49/4420 (LALA)由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 78中所列舉之重鏈及SEQ ID NO: 156中所列舉之輕鏈。
在一較佳實施例中，與在不存在交聯之情況下相比，在存在抗體分子或特異性結合成員之交聯的情況下，T細胞活化分析中抗體分子或特異性結合成員之EC50 低10倍、20倍、30倍或40倍。
舉例而言，抗體分子或特異性結合成員在T細胞活化分析中可具有5 nM或更小、4 nM或更小、3 nM或更小、2 nM或更小、1 nM或更小、0.5 nM或更小、0.3 nM或更小、0.2 nM或更小或0.1 nM或更小，較佳0.1 nM或更小的EC50 。
另外，或可替代地，可藉由在存在抗體分子或特異性結合成員之情況下，在T細胞活化分析中量測由T細胞釋放之IL-2的最大濃度，測定抗體分子或特異性結合成員活化T細胞之能力，其中該抗體分子或特異性結合成員經交聯。
在一較佳實施例中，在存在抗體分子或特異性結合成員，存在交聯之情況下，在T細胞活化分析中由T細胞釋放之IL-2的最大濃度在相同分析中存在FS20-22-49/4420 (包含LALA突變)之情況下由T細胞釋放之IL-2之最大濃度的20%或10%內，其中FS20-22-49/4420 (LALA)由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 78中所列舉之重鏈及SEQ ID NO: 156中所列舉之輕鏈。
T細胞活化分析可為如本文所描述之T細胞分析，諸如如本發明實例中所描述之泛T細胞分析。
舉例而言，T細胞活化分析可為基於自人類周邊血液單核細胞(PBMC)分離之T細胞的IL-2釋放分析。舉例而言，T細胞活化分析可包含自白血球耗乏錐(cone)分離人類PBMC。用於分離PBMC之方法係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。T細胞接著可自PBMC分離。用於自PBMC分離T細胞之方法係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。
T細胞活化分析可包含例如在適合培養基(諸如T細胞培養基)中製備所需數目之T細胞。所需數目之T細胞可以1.0×106 個細胞/毫升之濃度製備。接著可使用提供T細胞活化所需之信號的適合T細胞活化試劑刺激T細胞。舉例而言，T細胞活化試劑可為包含CD3及CD28之試劑，諸如包含CD3及CD28之珠粒。經分離T細胞可用T細胞活化試劑培育隔夜以活化T細胞。在此之後，可洗滌活化T細胞以將T細胞與T細胞活化試劑分離，且以適合濃度(諸如2.0×106 個細胞/毫升)再懸浮於T細胞培養基中。活化T細胞接著可添加至經抗人類CD3抗體塗佈之培養盤中。
可製備各測試抗體分子或特異性結合成員之適合稀釋液且將稀釋液添加至孔中。T細胞接著可在37℃，5% CO2 下與測試抗體培育24小時。可收集上清液且對其進行分析，以測定上清液中IL-2之濃度。用於測定溶液中IL-2之濃度的方法係此項技術中已知的，且描述於本發明實例中。可繪製相對於抗體分子或特異性結合成員之對數濃度，人類IL-2之濃度。可使用log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
特異性結合成員之第二抗原結合位點所結合之第二抗原可為免疫細胞抗原，或疾病抗原。疾病抗原包括病原抗原及腫瘤抗原。
在一較佳實施例中，特異性結合成員之第二抗原結合位點結合免疫細胞抗原。
特異性結合成員所結合之免疫細胞抗原可與OX40存在於相同免疫細胞或不同免疫細胞上。
免疫細胞抗原可為除OX40外之腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)的成員。TNFRSF受體為膜結合細胞介素受體，其包含結合腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)之一或多種配位體的胞外富半胱胺酸域。
TNFRSF受體可定位於免疫細胞表面上。在結合TNFRSF配位體後，TNFRSF受體在免疫細胞表面上形式團簇，其活化免疫細胞。舉例而言，配位體結合TNFRSF受體可形成多聚體(諸如三聚體)，或多聚體之團簇。配位體結合TNFRSF受體之團簇的存在刺激胞內信號傳遞路徑，其活化免疫細胞。
在不希望受理論束縛的情況下，認為藉由接合免疫細胞表面上之OX40及第二TNFRSF受體二者，特異性結合成員將使OX40及第二TNFRSF受體聚集且活化(多個)免疫細胞。換言之，在結合二種目標時，特異性結合成員將充當TNFRSF受體促效劑。
TNFRSF受體包括CD27、CD40、EDA2R、EDAR、FAS、LTBR、RELT、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6B、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A-10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21及TNFRSF25。
在一較佳實施例中，TNFRSF受體為TNFRSF9 (CD137；4-1BB)。
CD27 (TNFRSF7：基因ID 939)具有參考胺基酸序列NP_001233.1且可由參考核苷酸序列NM_001242.4編碼。CD40 (TNFRSF5：基因ID 958)具有參考胺基酸序列NP_001241.1且可由參考核苷酸序列NM_001250.5編碼。EDA2R (TNFRSF27：基因ID 60401)具有參考胺基酸序列NP_001186616.1且可由參考核苷酸序列NM_001199687.2編碼。EDAR (基因ID 10913)具有參考胺基酸序列NP_071731.1且可由參考核苷酸序列NM_022336, 3編碼。FAS (TNFRSF6：基因ID 355)具有參考胺基酸序列NP_000034.1且可由參考核苷酸序列NM_000043.5編碼。LTBR (TNFRSF3：基因ID 4055)具有參考胺基酸序列NP_001257916.1，且可由參考核苷酸序列NM_001270987.1編碼。RELT (TNFRSF19L：基因ID 84957)具有參考胺基酸序列NP_116260.2且可由參考核苷酸序列NM_032871.3編碼。TNFRSF1A (基因ID 7132)具有參考胺基酸序列NP_001056.1且可由參考核苷酸序列NM_001065.3編碼。TNFRSF1B (基因ID 7133)具有參考胺基酸序列NP_001057.1且可由參考核苷酸序列NM_001066.2編碼。
TNFRSF6B (基因ID 8771)具有參考胺基酸序列NP_003814.1且可由參考核苷酸序列NM_003823.3編碼。TNFRSF8 (基因ID 943)具有參考胺基酸序列NP_001234.3且可由參考核苷酸序列NM_001243.4編碼。TNFRSF9 (基因ID 3604)具有參考胺基酸序列NP_001552且可由參考核苷酸序列NM001561編碼)。TNFRSF10A (基因ID 8797)具有參考胺基酸序列NP_003835.3且可由參考核苷酸序列NM_003844.3編碼。TNFRSF10B (基因ID 8795)具有參考胺基酸序列NP_003833.4且可由參考核苷酸序列NM_003842.4編碼。TNFRSF10C (基因ID 8794)具有參考胺基酸序列NP_003832.2且可由參考核苷酸序列NM_003841.4編碼。TNFRSF10D (基因ID 8793)具有參考胺基酸序列NP_003831.2且可由參考核苷酸序列NM_003840.4編碼。TNFRSF11A (基因ID 8792)具有參考胺基酸序列XP_011524547.1且可由參考核苷酸序列XM_11526245.2編碼。TNFRSF11B (基因ID 4982)具有參考胺基酸序列NP_002537.3且可由參考核苷酸序列NM_002546.3編碼。TNFRSF12A (基因ID 51330)具有參考胺基酸序列NP_057723.1且可由參考核苷酸序列NM_016639.2編碼。TNFRSF13B (基因ID 23495)具有參考胺基酸序列NP_0036584.1且可由參考核苷酸序列NM_012452.2編碼。TNFRSF13C (基因ID 115650)具有參考胺基酸序列NP_443177.1且可由參考核苷酸序列NM_052945.3編碼。TNFRSF14 (基因ID 8764)具有參考胺基酸序列NP_001284534.1且可由參考核苷酸序列NM_001297605.1編碼。TNFRSF17 (基因ID 608)具有參考胺基酸序列NP_001183.2且可由參考核苷酸序列NM_001192.2編碼。TNFRSF18 (基因ID 8784)具有參考胺基酸序列NP_004195.2且可由參考核苷酸序列NM_004186.1編碼。TNFRSF19 (基因ID 55504)具有參考胺基酸序列NP_001191387.1且可由參考核苷酸序列NM_001204458.1編碼。NFRSF21 (基因ID 27242)具有參考胺基酸序列NP_055267.1且可由參考核苷酸序列NM_014452.4編碼。TNFRSF25 (DR3：基因ID 8718)結合至配位體TNFSF15 (TL1A)，具有參考胺基酸序列NP_001034753.1且可由參考核苷酸序列NM_001039664.1編碼。
可替代地，第二抗原結合位點所結合之免疫細胞抗原可為除TNFRSF成員外，在免疫系統中具有調節功能之分子，例如免疫共刺激分子或抑制性檢查點分子。此類免疫調節分子之實例包括ICOS (CD278)、LAG3、PD1、PD-L1、PD-L2、B7H3、B7H4、CTLA4、TIGIT、BTLA、HVEM、含T細胞免疫球蛋白黏蛋白域-3 (TIM-3)、CD47、CD73、A2aR、CD200、CD200R、群落刺激因子1受體(CSF-1R)、VISTA CD28、CD80、LLT1、半乳糖凝集素-9、NKG2A、NKG2D及KIR。
上面存在免疫細胞抗原之免疫細胞可屬於任何免疫細胞子集且可為T細胞、腫瘤浸潤白血球(TIL)、骨髓譜系細胞(抗原呈現細胞(APC))、NK細胞及/或B細胞。在免疫細胞抗原為TNFRSF受體時，上面存在TNFRSF受體之免疫細胞較佳為T細胞。
可替代地，第二抗原結合位點可結合至如上文所提及之疾病抗原。在不希望受理論束縛的情況下，認為特異性結合成員與OX40及疾病抗原之結合將引起疾病附近T細胞之活化。活化T細胞接著可引發、促進或參與免疫反應，例如針對病原體或癌細胞之免疫反應。對免疫系統在識別及根除癌細胞中所起到之作用的概覽由Chen及Mellman, 2013提供。
特異性結合成員之第二抗原結合位點可結合腫瘤抗原。腫瘤抗原為主要存在於腫瘤環境中，且不廣泛存在於個體中別處的抗原。舉例而言，腫瘤抗原可存在於腫瘤細胞表面上，或可存在於腫瘤微環境或腫瘤附近生物流體中之其他基質細胞上。腫瘤抗原因此為個體中腫瘤細胞之位置的標記物。
在一些實施例中，腫瘤抗原可為定位於癌細胞表面上之抗原。腫瘤抗原可在腫瘤細胞上上調或過度表現，而在不存在腫瘤之情況下，其可能未由來自相同組織之對應正常體細胞充分表現。
在一些實施例中，與在不存在腫瘤之情況下之對應正常組織的基質細胞相比，腫瘤微環境之基質細胞上腫瘤抗原上調或過度表現。
腫瘤抗原可存在於細胞表面上且可能不快速內化。
可使用此項技術中已知的方法鑑別適於由特異性結合成員靶向之腫瘤抗原。舉例而言，靶向OX40受體及腫瘤抗原之特異性結合成員可用於分析中，在該分析中，表現OX40之細胞與表現腫瘤抗原之細胞共培養，且例如藉由T細胞活化分析、增殖分析或細胞毒性分析量測表現OX40之細胞的活化。
細胞表面腫瘤抗原可為腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)。
由癌細胞表現之腫瘤抗原可包括例如由癌-生殖系基因編碼之癌-睪丸(CT)抗原，諸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE- A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、GAGE-I、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-I、RAGE- 1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE-Xp4 (MAGE-B4)、MAGE- C1/CT7、MAGE-C2、NY-ESO-I、LAGE-I、SSX-I、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-I及XAGE及其免疫原性片段或變異體(Simpson等人, 2005; Gure等人, 2005; Velazquez等人, 2007; Andrade等人, 2008; Tinguely等人, 2008; Napoletano等人, 2008)。
其他細胞表面腫瘤抗原包括例如AFP、αv β3 (玻璃連結蛋白受體)、αv β6 、B細胞成熟劑(BCMA)、CA125 (MUC16)、CD4、CD20、CD22、CD33、CD52、CD56、CD66e、CD80、CD140b、CD227 (MUC1)、EGFR (HER1)、EpCAM、GD3神經節苷脂、HER2、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺特異性抗原(PSA)、CD5、CD19、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、HLA-DR、抗個體基因型、癌胚抗原(CEA) (例如癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5))、TAG-72、葉酸結合蛋白、A33、G250、鐵蛋白、糖脂(諸如神經節苷脂)、碳水化合物(諸如CA-125)、IL-2受體、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、IGF1R、B7H3、B7H4、PDL1、CD200、EphA2及間皮素或其變異體。此等及其他細胞表面腫瘤抗原描述於Carter等人, 2004; Scott及Renner, 2001; Cheever等人, 2009; Tai及Anderson, 2015; 及Podojil及Miller, 2017中。
其他腫瘤抗原包括藉由「受脅迫」癌細胞所採用之非AUG轉譯起始機制產生的框架外(out-of-frame)肽-MHC複合物(Malarkannan等人, 1999)。
其他腫瘤抗原包括腫瘤細胞或腫瘤微環境之細胞表面上的肽-MHC複合物，其中肽-MHC複合物包含突變胞內腫瘤抗原之腫瘤特異性新抗原肽片段，且其中肽新抗原具有一或多種腫瘤特異性突變(Gubin等人, 2015)。其他腫瘤抗原係此項技術中熟知的(參見例如WO00/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Stern, Beverley及Carroll編, Cambridge University Press, Cambridge)。此等腫瘤抗原之序列可自公開資料庫容易地獲得，但亦見於WO1992/020356 A1、WO1994/005304 A1、WO1994/023031 A1、WO1995/020974 A1、WO1995/023874 A1及WO1996/026214 A1中。
例示性腫瘤抗原包括HER2、FAP、EpCAM、CEACAM5、CD20、CD73、PSMA、間皮素、EphA2、IGF1R、CD200、αv β6 、BCMA、PD-L1、B7H3、B7H4及EGFR。
舉例而言，腫瘤抗原可為間皮素(MSLN)。
HER2 (ERBB2；基因ID 2064)可具有參考胺基酸序列NP_001005862.1且可由參考核苷酸序列NM_001005862.2編碼。FAP (基因ID 2191)可具有參考胺基酸序列NP_001278736.1且可由參考核苷酸序列NM_001291807.1編碼。EpCAM (基因ID 4072)可具有參考胺基酸序列NP_002345.2且可由參考核苷酸序列NM_002354.2編碼。
CEACAM5 (基因ID 1048)可具有參考胺基酸序列NP_001278413.1且可由參考核苷酸序列NM_001291484.2編碼。CD20 (MS4A1；基因ID 931)可具有參考胺基酸序列NP_068769.2且可由參考核苷酸序列NM_021950.3編碼。CD73 (NT5E；基因ID 4907)可具有參考胺基酸序列NP_001191742.1且可由參考核苷酸序列NM_001204813.1編碼。PSMA (FOLH1；基因ID 2346)可具有參考胺基酸序列NP_001014986.1且可由參考核苷酸序列NM_001014986.1編碼。間皮素(MSLN；基因ID 10232)可具有參考胺基酸序列NP_001170826.1且可由參考核苷酸序列NM_001177355.2編碼。EphA2 (基因ID 1969)可具有參考胺基酸序列NP_001316019.1且可由參考核苷酸序列NM_001329090.1編碼。IGF1R (基因ID 3480)可具有參考胺基酸序列NP_000866.1且可由參考核苷酸序列NM_000875.4編碼。CD200 (基因ID 4345)可具有參考胺基酸序列NP_001004196.2且可由參考核苷酸序列NM_001004196.3編碼。αv β6 為由整合素次單元αV及整合素次單元β6構成之雜二聚體。整合素次單元αV (ITGAV；基因ID 3685)可具有參考胺基酸序列NP_001138471.1且可由參考核苷酸序列NM_001144999.2編碼。整合素次單元β6 (ITGB6；基因ID 3694)可具有參考胺基酸序列NP_000879.2且可由參考核苷酸序列NM_000888.4編碼。BCMA (TNFRSF17；基因ID 608)可具有參考胺基酸序列NP_001183.2且可由參考核苷酸序列NM_001192.2編碼。PD-L1 (CD274；基因ID 29126)可具有參考胺基酸序列NP_001254635.1且可由參考核苷酸序列NM_001267706.1編碼。B7H3 (CD276；基因ID 80381)可具有參考胺基酸序列NP_001019907.1且可由參考核苷酸序列NM_001024736.1編碼。B7H4 (VTCN1；基因ID 79679)可具有參考胺基酸序列NP_001240778.1且可由參考核苷酸序列NM_001253849.1編碼。EGFR (基因ID 1956)可具有參考胺基酸序列NP_001333826.1且可由參考核苷酸序列NM_001346897.1編碼。
在其他實施例中，腫瘤抗原可為可溶性腫瘤抗原，例如由癌細胞產生或回應於癌細胞產生之生長因子。可溶性因子可在腫瘤附近之生物流體中上調或過度表現。可溶性腫瘤抗原可為多聚的，例如二聚體或三聚體。與個體體內別處相比，可溶性腫瘤抗原可以較高濃度存在於腫瘤位點處或腫瘤微環境中。腫瘤微環境及相關可溶性腫瘤抗原更詳細地描述於Bhome等人(2015)中。
適合之可溶性腫瘤抗原包括VEGF、HGF、SDF1及TGF-β，例如TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3及TGF-β-4。
VEGF (VEGFA；基因ID 7422)具有參考胺基酸序列NP_001020537.2且可由參考核苷酸序列NM_001025366.2編碼。HGF (基因ID 3082)具有參考胺基酸序列NP_000592.3且可由參考核苷酸序列NM_000601.5編碼。SDF1 (CXCL12；基因ID 6387)具有參考胺基酸序列NP_000600.1且可由參考核苷酸序列NM_000609.6編碼。TGF-β-1 (TGFB1；基因ID 7040)可具有參考胺基酸序列NP_000651.3且可由參考核苷酸序列NM_000660.6編碼。TGF-β-2 (TGFB2；基因ID 7042)可具有參考胺基酸序列NP_001129071.1且可由參考核苷酸序列NM_001135599.3編碼。TGF-β-3 (TGFB3；基因ID 7043)可具有參考胺基酸序列NP_001316867.1且可由參考核苷酸序列NM_001329938.1編碼。TGF-β-4 (LEFTY2；基因ID 7044)可具有參考胺基酸序列NP_001165896.1且可由參考核苷酸序列NM_001172425.2編碼。
在一替代性較佳實施例中，疾病抗原為病原抗原。
預期在感染性疾病之位點附近由特異性結合成員活化T細胞適用於治療感染性疾病。感染性疾病可為急性或持續性感染性疾病，但較佳為持續性感染性疾病。
病原抗原較佳為由人類病原體表現之抗原，諸如病毒、細菌、真菌或寄生蟲抗原(例如原蟲抗原)，較佳病毒或細菌抗原。病原抗原為主要存在於病原體上，或感染性疾病之位點附近，且不廣泛存在於個體中別處的抗原。
舉例而言，病原抗原可為存在於病毒、細菌、真菌或寄生蟲表面上之抗原，或由病毒、細菌、真菌或寄生蟲表現之可溶性抗原。病毒、細菌、真菌或寄生蟲可為本文別處所提及之病毒、細菌、真菌或寄生蟲。
在病原抗原為可溶性抗原時，抗原可在感染性疾病之位點附近的生物流體中上調或過度表現。舉例而言，與個體體內別處相比，可溶性病原抗原可以較高濃度存在於感染性疾病之位點處或附近。可溶性病原抗原可為多聚的，例如二聚體或三聚體。
可使用此項技術中已知的方法鑑別適於由特異性結合成員靶向之病原抗原。舉例而言，靶向OX40受體及病原抗原之特異性結合成員可用於分析中，在該分析中，表現OX40之細胞與病原體或病原抗原共培養，且例如藉由T細胞活化分析、增殖分析或細胞毒性分析量測表現OX40之細胞的活化。
適於由特異性結合成員靶向之許多病原抗原在所屬領域中另外更熟知，且可由熟習此項技術者根據待治療之感染性疾病選擇。病毒抗原之實例包括由人類免疫不全病毒(HIV)表現之蛋白p24、gp120及gp41，由B型肝炎病毒(HBV)表現之B型肝炎表面抗原(HBsAg)及由流感病毒表現之血球凝集素及神經胺糖酸酶。細菌抗原之實例包括由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)表現之Rv1733、Rv2389及Rv2435n。
特異性結合成員亦可包含如本文所揭示之第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈及/或重鏈序列之變異體。適合變異體可藉助於序列改變或突變及篩選之方法獲得。在一較佳實施例中，包含一或多種變異序列之特異性結合成員保留親本特異性結合成員之功能特性中之一或多者，諸如針對OX40的結合特異性及/或結合親和性。舉例而言，與(親本)特異性結合成員相比，包含一或多種變異序列之特異性結合成員較佳以相同親和性或較高親和性結合至OX40。親本特異性結合成員為不包含已併入至變異特異性結合成員中之(多個)胺基酸取代、(多個)缺失及/或(多個)插入的特異性結合成員。
舉例而言，特異性結合成員可包含第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈及/或重鏈序列，其與本文所揭示之第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
特異性結合成員FS20-22-49之CH3域序列與特異性結合成員FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47及FS20-22-85之CH3域具有至少95%序列一致性。特異性結合成員FS20-31-115之CH3域序列與特異性結合成員FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102及FS20-31-108之CH3域具有至少92%序列一致性。特異性結合成員FS20-11-131之CH3域序列與特異性結合成員FS20-11-127及FS20-11-134之CH3域具有至少具有至少97%序列一致性。
因此，在一較佳實施例中，特異性結合成員具有或包含CH3域序列，其與SEQ ID NO: 15、24、33、46、55、63、72、81、94、103、114、124、134或143中所列舉之CH3域序列具有至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性，較佳至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
在另一較佳實施例中，特異性結合成員具有或包含CH2域序列，其與SEQ ID NO: 5、6或7中所列舉之CH2域序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。
在另一較佳實施例中，特異性結合成員具有以下、包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 17、19、26、28、35、37、48、50、57、59、65、67、74、76、83、85、96、98、105、107、116、118、126、128、136、138、145或147中所列舉之Fcab序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性的序列。
序列一致性通常參考演算法GAP (Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA)界定。GAP使用尼德曼及翁施演算法(Needleman and Wunsch algorithm)來比對二個完整序列，最大化匹配數目且最小化間隙數目。一般而言，使用預設參數，其中間隙創建罰分等於12且間隙擴展罰分等於4。使用GAP可為較佳的，但可使用其他演算法，例如BLAST (其使用Altschul等人, 1990之方法)、FASTA (其使用Pearson及Lipman, 1988之方法)或史密斯-沃特曼演算法(Smith-Waterman algorithm)(Smith及Waterman, 1981)，或前述Altschul等人, 1990之TBLASTN程式，一般採用預設參數。特定而言，可使用psi-Blast演算法(Altschul等人, 1997)。
特異性結合成員可包含第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列，其與本文所揭示之第一、第二或第三序列、AB、CD或EF結構環序列、CH3域、CH2域、CH2及CH3域、Fcab、CDR、VH域、VL域、輕鏈或重鏈序列相比，具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。
在一較佳實施例中，特異性結合成員可包含CH3域序列，與SEQ ID NO: 15、24、33、46、55、63、72、81、94、103、114、124、134或143中所列舉之CH3域序列相比，其具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代、及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。
在另一較佳實施例中，特異性結合成員包含CH2域序列，與SEQ ID NO: 5、6或7中所列舉之CH2域序列相比，其具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代、及/或插入)，較佳20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改。
在另一較佳實施例中，特異性結合成員包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 17、19、26、28、35、37、48、50、57、59、65、67、74、76、83、85、96、98、105、107、116、118、126、128、136、138、145或147中所列舉之Fcab域序列相比，具有一或多種胺基酸序列更改(胺基酸殘基之添加、缺失、取代、及/或插入)，較佳40處更改或更少、30處更改或更少、20處更改或更少、15處更改或更少、10處更改或更少、5處更改或更少、4處更改或更少、3處更改或更少、2處更改或更少、或1處更改的序列。
在特異性結合成員包含本文所揭示之CH3域、CH2及CH3域、Fcab、輕鏈或重鏈序列的變異體時，變異體較佳不包含定位於特異性結合成員之CH3域之AB、CD及EF結構環中的第一、第二及第三序列的任何胺基酸更改。舉例而言，變異體可不包含特異性結合成員之CH3域之AB、CD及EF結構環的任何胺基酸更改。
在一或多個胺基酸經另一胺基酸取代之較佳實施例中，取代可守恆取代，例如根據下表。在一些實施例中，中間欄中之相同類別中的胺基酸彼此取代，亦即例如非極性胺基酸經另一非極性胺基酸取代。在一些實施例中，最右欄中之相同行中之胺基酸彼此取代。
Figure 108124735-A0304-0001
在一些實施例中，(多個)取代可為功能性守恆的。亦即，在一些實施例中，取代可不影響(或可不實質上影響)相比於等效未經取代特異性結合成員，包含取代之特異性結合成員的一或多種功能特性(例如結合親和性)。
亦設想特異性結合成員，其包含定位於特異性結合成員之恆定域，較佳CH3域中的OX40抗原結合位點，且與本發明之特異性結合成員競爭與OX40之結合，或結合至OX40上與本發明之特異性結合成員所結合的相同抗原決定基。測定由二種特異性結合成員競爭抗原之方法係此項技術中已知的。舉例而言，可使用表面電漿子共振(諸如Biacore)測定由二種特異性結合成員對結合至抗原的競爭。作圖方法
在一些實施例中，特異性結合成員可不包含基於CDR之抗原結合位點。
特定而言，特異性結合成員可不包含結合CD137之基於CDR之抗原結合位點。
另外，或可替代地，特異性結合成員可不包含結合間皮素(MSLN)之基於CDR之抗原結合位點。
舉例而言，特異性結合成員可不包含結合CD137或MSLN之基於CDR之抗原結合位點，其中特異性結合成員包含定位於特異性結合成員FS20-22-49之CH3域之AB、CD及EF結構環中的第一、第二及第三序列，特異性結合成員FS20-22-49之CH3域之AB、CD及EF結構環序列及/或特異性結合成員FS20-22-49之CH3域序列。
舉例而言，特異性結合成員可不包含以下列舉之抗CD137 mAb FS30-10-16之CDR及/或VH及/或VL域。 FS30-10-16 mAb之重鏈CDR CDR1 (IMGT)  GFTFSSYD CDR1 (Kabat)  SYDMS CDR2 (IMGT)  IDPTGSKT CDR2 Kabat)   DIDPTGSKTDYADSVKG CDR3 (IMGT)  ARDLLVYGFDY CDR3 (Kabat)  DLLVYGFDY FS30-10-16 mAb之VH域域 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS FS30-10-16 mAb之輕鏈CDR CDR1 (IMGT)  QSVSSSY CDR1 (Kabat)  RASQSVSSSYLA CDR2 (IMGT)  GAS CDR2 (Kabat)  GASSRAT CDR3 (IMGT)  QQSYSYPVT CDR3 (Kabat)  QQSYSYPVT FS30-10-16 mAb之VL域 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIK
特定而言，特異性結合成員可不包含以下或由以下組成：分別列舉於SEQ ID NO 172及173中之FS20-22-49-AA/FS30-10-16的重鏈及輕鏈序列。
特異性結合成員可與生物活性分子或可偵測標記共軛。在此情況下，特異性結合成員可被稱作共軛物。此類共軛物應用於如本文所描述之疾病治療。
舉例而言，生物活性分子可為免疫系統調節劑，諸如細胞介素，較佳人類細胞介素。舉例而言，細胞介素可為刺激T細胞活化及/或增殖之細胞介素。用於與特異性結合成員共軛之細胞介素的實例包括IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF及IFN-γ。
可替代地，生物活性分子可為配位體捕獲劑(trap)，諸如細胞介素(例如TGF-β或IL-6)之配位體捕獲劑。
可與特異性結合成員共軛之適合可偵測標記係此項技術中已知的，且包括放射性同位素，諸如碘-125、碘-131、釔-90、銦-111及鎝-99；螢光染料，諸如螢光素、若丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、德州紅(Texas Red)及花青染料衍生物，例如Cy7及Alexa750；發色染料，諸如二胺基聯苯胺；膠乳珠粒；酶標記，諸如辣根過氧化酶；具有光譜分離吸收或發射特徵之磷光體或雷射染料；及可經由結合至特異性同源可偵測部分(例如經標記抗生素蛋白)而被偵測到的化學部分，諸如生物素。
特異性結合成員可藉助於任何適合之共價或非共價鍵(諸如二硫鍵或肽鍵)與生物活性分子或可偵測標記共軛。在生物活性分子為細胞介素時，該細胞介素可藉助於肽連接子接合至特異性結合成員。適合肽連接子係此項技術中已知的，且長度可為5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15個胺基酸。
在一些實施例中，生物活性分子可由可裂解連接子與特異性結合成員共軛。連接子可允許生物活性分子在療法位點處自特異性結合成員釋放。連接子可包括醯胺鍵(例如肽連接子)、二硫鍵或腙。肽連接子例如可由位點特異性蛋白酶裂解，二硫鍵可由胞溶質之還原性環境裂解，且腙可由酸介導之水解裂解。
共軛物可為包含特異性結合成員及生物活性分子之融合蛋白。在此情況下，生物活性分子可藉助於肽連接子或肽鍵與特異性結合成員共軛。在特異性結合成員為多鏈分子時，諸如在特異性結合成員為或包含Fcab或為mAb2 時，生物活性分子可與特異性結合成員之一或多條鏈共軛。舉例而言，生物活性分子可與mAb2 分子之重鏈中之一者或二者共軛。融合蛋白具有更易於產生及純化之優點，便於產生臨床級材料。
本發明亦提供編碼本發明之特異性結合成員的一或多種經分離核酸分子。熟習此項技術者使用此項技術中熟知的方法製備此類核酸分子將沒有困難。
在一較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員之CH3域：FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 ，較佳FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 ，更佳FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 ，最佳FS20 - 22 - 49 。
在一替代性較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員之CH3域：FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 ，較佳FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 ，更佳FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 ，最佳FS20 - 31 - 115 。
在另一替代性較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員之CH3域：FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 ，最佳FS20 - 11 - 131 。
此等特異性結合成員之CH3域序列在本文中描述。
舉例而言，一種核酸分子，其編碼以下特異性結合成員之CH3域： (i)FS20 -22 -38 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -49 或FS20 -22 -85 之CH3域分別列舉於SEQ ID NO: 47、56、64、73及82中； (ii)FS20 -31 -58 、FS20 -31 -66 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 、FS20 -31 -108 或FS20 -31 -115 之CH3域分別列舉於SEQ ID NO: 95、104、115、125、135及144中；或 (iii)FS20 -11 -127 、FS20 -11 -131 或FS20 -11 -134 之CH3域分別列舉於SEQ ID NO: 16、25及34中。
在一較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員：FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 ，較佳FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 或FS20 - 22 - 85 ，更佳FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 或FS20 - 22 - 47 ，最佳FS20 - 22 - 49 。
在一替代性較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員：FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 ，較佳FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 或 FS20 - 31 - 102 ，更佳FS20 - 31 - 115 或FS20 - 31 - 108 ，最佳FS20 - 31 - 115 。
在另一替代性較佳實施例中，核酸分子編碼以下特異性結合成員：FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 ，最佳FS20 - 11 - 131 。
舉例而言，一種核酸分子，其編碼以下特異性結合成員之序列： (i)FS20 -22 -38 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -49 及FS20 -22 -85 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 49、58、66、75及84中；及 (ii)FS20 -22 -38 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -49 及FS20 -22 -85 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 51、60、68、77及86中。
一種核酸分子，其編碼以下特異性結合成員之特異性結合成員序列： (i)FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 97、106、117、127、137及146中；及(ii)FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 66 、FS20 - 31 - 94 、FS20 - 31 - 102 、 FS20 - 31 - 108 及FS20 - 31 - 115 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 99、108、119、129、139及148中。
一種核酸分子，其編碼以下特異性結合成員之序列： (i)FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 或 FS20 - 11 - 134 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 18、27及36中；及( ii ) FS20 - 11 - 127 、 FS20 - 11 - 131 或 FS20 - 11 - 134 之序列分別列舉於SEQ ID NO: 20、29及38中。
經分離核酸分子可用於表現本發明之特異性結合成員。核酸將一般以重組載體形式提供以便表現。本發明之另一態樣由此提供包含如上文所描述之核酸的載體。可選擇或構築含有適當調節序列(包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、強化子序列、標記基因及視需要選用之其他序列)之適合載體。較佳地，載體含有適當調節序列以驅動核酸在宿主細胞中之表現。載體可視需要為質體、病毒(例如噬菌體)或噬菌粒。
如本文所描述之核酸分子或載體可引入至宿主細胞中。用於將核酸或載體引入至寄主細胞之技術係此項技術中公認的，且可採用任何適合之技術。適於產生重組特異性結合成員之一系列寄主細胞係此項技術中已知的，且包括細菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。較佳宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0或HEK細胞(例如HEK293細胞)。最佳宿主細胞為CHO細胞。
本發明之另一態樣提供一種產生本發明之特異性結合成員的方法，該方法包含在宿主細胞中表現編碼特異性結合成員之核酸，及任擇地分離及/或純化由此產生之特異性結合成員。用於培養寄主細胞之方法係此項技術中熟知的。方法可進一步包含分離及/或純化特異性結合成員。用於純化重組特異性結合成員之技術係此項技術中熟知的，且包括例如HPLC、FPLC或親和性層析法(例如使用蛋白A或蛋白L)。在一些實施例中，可使用特異性結合成員上之親和標籤進行純化。方法亦可包含將特異性結合成員任擇地與醫藥學上可接受之賦形劑或如下文所描述之其他物質一起調配成醫藥組合物。
如上所解釋，OX40在免疫系統之細胞上表現，該等細胞包括活化T細胞，尤其CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、第1型T輔助(Th1)細胞、第2型T輔助(Th2)細胞及調節T (Treg)細胞及腫瘤浸潤T細胞，以及活化自然殺手(NK)細胞。已展示OX40活化在增強T細胞活化、T細胞無性擴增、T細胞分化及存活及記憶T細胞之產生中起作用。考慮到OX40之增強免疫反應的活性，已在癌症治療之情形下研究OX40促效劑分子。
如本文所描述之特異性結合成員可由此適用於治療應用，尤其用於癌症之治療。另外，預期特異性結合成員適用於治療感染性疾病，諸如持續性感染性疾病。
如本文所描述之特異性結合成員可用於治療人體或動物體之方法。本發明之相關態樣提供； (i)用作藥劑之本文所描述之特異性結合成員， (ii)用於疾病或病症之治療方法的本文所描述之特異性結合成員， (iii)本文所描述之特異性結合成員在用於治療疾病或病症之藥劑之製造中的用途；及 (iv)治療個體之疾病或病症的方法，其中該方法包含向該個體投與治療有效量之如本文所描述之特異性結合成員。
個體可為患者，較佳人類患者。
治療可為其中達成一定所需療效之任何治療或療法，該療效例如抑制病狀或延緩病狀進展，且包括進展速率降低；進展速率停止；病狀改善；病狀之治癒或緩解(無論部分或整體)；預防、改善、延緩、緩和或遏制病狀之一或多個症狀及/或徵象；延長個體或患者之存活期，超過或在不存在治療之情況下所預期之存活期。
亦包括作為預防性措施(亦即預防)之治療。舉例而言，可如本文所描述治療易於發生或復發疾病(諸如癌症)或具有發生或復發疾病之風險的個體。此類治療可預防或延緩個體中疾病之發生或復發。
如所描述之治療方法可包含向個體投與除特異性結合成員以外的至少另一種治療。本文所描述之特異性結合成員可由此單獨或與一或多種其他治療組合投與個體。在特異性結合成員與另一治療組合投與個體時，額外治療可與特異性結合成員之投與同時、依序或分別地投與個體。在額外治療與特異性結合成員同時投與時，特異性結合成員及額外治療可以組合製劑形式投與個體。舉例而言，額外療法可為已知用於待治療之疾病的療法或治療劑。
儘管特異性結合成員可單獨投與，但特異性結合成員將通常以醫藥組合物形式投與，該醫藥組合物可包含除特異性結合成員以外的至少一種組分。本發明之另一態樣因此提供醫藥組合物，其包含如本文所描述之特異性結合成員。亦提供包含將特異性結合成員調配成醫藥組合物之方法。
除特異性結合成員以外，醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係關於在合理醫學判斷之範疇內，適用於接觸個體(例如人類)之組織而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱的化合物、物質、組合物及/或劑型。各載劑、賦形劑等必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。載劑或其他材料之確切性質將取決於投藥途徑，其可為藉由輸注、注射或任何其他適合途徑，如下文所論述。
對於非經腸，例如皮下或靜脈內投與(例如藉由注射)，包含特異性結合成員之醫藥組合物可呈可非經腸接受之水溶液形式，其無熱原且具有適合pH、等滲性及穩定性。具有此項技術之相關技能之彼等者能夠很好地使用例如等滲媒劑(諸如氯化鈉注射劑、林格氏注射劑(Ringer's Injection)或乳酸化林格氏注射劑)來製備適合溶液。可按需要使用之防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)；氯化苯索銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3'-戊醇；及間甲酚)；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉離子；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，特異性結合成員可以在投與之前復水之凍乾形式提供。舉例而言，在投與個體之前，凍乾特異性結合成員可在無菌水中復水且與生理食鹽水混合。
投與可呈「治療有效量」，此足以展示對個體之益處。所投與之實際量，及投與速率及時程將取決於所治療之疾病的性質及嚴重程度、所治療之特定個體、個體之臨床病狀、病症之病因、組合物之遞送位點、特異性結合成員之類型、投與方法、投與排程及醫學從業者已知的其他因素。治療開處，例如對劑量等之決定處於一般從業者及其他醫生之職責內，且可取決於症狀之嚴重程度及/或所治療之疾病的進展。免疫球蛋白之適當劑量係此項技術中熟知的(Ledermann等人(1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; 及Bagshawe等人(1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922)。可使用適於所投與抗體分子之本文所指定，或Physician's Desk Reference (2003)中之特定劑量。至於抗體分子，可藉由在動物模型中比較活體外活性及活體內活性來確定特異性結合成員之治療有效量或適合劑量。已知將小鼠及其他測試動物中之有效劑量外推至人類的方法。精確劑量將取決於數個因素，包括待治療之域之大小及位置，及特異性結合成員之確切性質。
對於全身施加，典型免疫球蛋白劑量在100 µg至1 g範圍內，且對於局部施加，在1 µg至1 mg範圍內。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。此為用於成年個體之單次治療之劑量，其可按比例調節以用於兒童及嬰兒，且亦可針對其他特異性結合成員格式與分子量成比例地調節。
由醫師酌情處理，治療可以每天、每週二次、每週一次或每月一次間隔重複。個體之治療排程可取決於特異性結合成員組合物之藥物動力學及藥力學特性、投藥途徑及所治療之病狀的性質。
治療可為週期性的，且投與之間的時段可為約二週或更多，例如約三週或更多、約四週或更多、約一月一次或更多、約五週或更多或約六週或更多。舉例而言，治療可為每二至四週一次或每四至八週一次。適合調配物及投藥途徑描述於上文。
在一較佳實施例中，如本文所描述之特異性結合成員可用於治療癌症之方法中。
癌症之特徵可為惡性癌細胞之異常增殖。在提及特定類型之癌症(諸如乳房癌)時，此係指相關組織(諸如乳房組織)之惡性細胞的異常增殖。定位於乳房中但為另一組織(諸如卵巢組織)之惡性細胞異常增殖之結果的繼發癌不為如本文中所提及之乳房癌，而為卵巢癌。
癌症可為原發癌或繼發癌。因此，如本文所描述之特異性結合成員可用於治療個體之癌症的方法中，其中癌症為原發性腫瘤及/或腫瘤轉移。
待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之癌症的腫瘤可包含例如在細胞表面上表現OX40之腫瘤浸潤T細胞。在一個實施例中，可能已確定腫瘤包含表現OX40之腫瘤浸潤T細胞。用於確定抗原在細胞表面上之表現的方法係此項技術中已知的，且包括例如流式細胞量測術。
舉例而言，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療的癌症可選自由以下組成之群：白血病，諸如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)及慢性淋巴球性白血病(CLL)；淋巴瘤，諸如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤及多發性骨髓瘤；及實體癌，諸如肉瘤(例如軟組織肉瘤)、皮膚癌(例如梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma))、黑素瘤、膀胱癌(例如尿道上皮癌)、腦癌(例如多形性膠質母細胞瘤)、乳房癌、子宮/子宮內膜癌、卵巢癌(例如卵巢漿液性囊腺瘤)、前列腺癌、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC))、結腸直腸癌(例如結腸直腸腺癌)、子宮頸癌(例如子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌)、肝癌(例如肝細胞癌)、頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌)、食道癌(例如食道癌)、胰臟癌、腎癌(例如腎細胞癌)、腎上腺癌、胃癌、睪丸癌、膽囊及膽道癌(例如膽管癌)、甲狀腺癌、胸腺癌、骨癌及腦癌。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之癌症為實體癌。更佳地，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之癌症為選自由以下組成之群的實體癌：肉瘤、黑素瘤、膀胱癌、腦癌、乳房癌、子宮/子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、胰臟癌、腎癌及胃癌。
在癌症情形下，治療可包括抑制癌症生長，包括完全癌症緩解，及/或抑制癌轉移，以及抑制癌症復發。癌症生長一般係指指示癌症內變化成發展較完善之形式的數種指數中之任一者。因此，用於量測癌症生長之抑制的指數包括癌細胞存活率降低、腫瘤體積或形態減小(例如，如使用電腦斷層攝影(CT)、超音波掃描或其他成像方法測定)、腫瘤生長延緩、腫瘤血管破壞、延遲超敏皮膚測試之改良表現、抗癌免疫細胞或其他抗癌免疫反應之活性提高，及腫瘤特異性抗原之位準降低。活化或增強對個體之癌性腫瘤的免疫反應可改善個體抵抗癌症生長，尤其已存在於個體中之癌症之生長的能力，及/或減少個體中對癌症生長之傾向。
在癌症治療情形下，如本文所描述之特異性結合成員可與另一抗癌療法或治療劑組合投與個體，另一抗癌療法或治療劑諸如已展示為適用於，或預期適用於治療所討論之癌症的抗癌療法或治療劑。舉例而言，特異性結合成員可與以下組合投與個體：化學治療劑、放射療法、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、過繼細胞轉移(ACT)療法(諸如過繼NK細胞療法或利用嵌合抗原受體(CAR)T細胞、自體腫瘤浸潤淋巴球(TIL)或γ/δ T細胞的療法，或供激素療法用之藥劑。
在不希望受理論束縛的情況下，認為本文所描述之特異性結合成員可充當抗癌療法之佐劑。具體而言，認為與在化學療法及/或放射療法之情況下或在單獨的抗腫瘤疫苗情況下所達成之針對癌症的免疫反應相比，將特異性結合成員與化學療法及/或放射療法組合或與抗腫瘤疫苗組合投與個體例如將觸發針對癌症的更大免疫反應。
用於與如本文所描述之特異性結合成員組合投與的一或多種化學治療劑可選自由以下組成之群：紫杉烷、細胞毒性抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、PARP抑制劑、B-Raf酶抑制劑、MEK抑制劑、c-MET抑制劑、VEGFR抑制劑、PDGFR抑制劑、烷基化劑、鉑類似物、核苷類似物、抗葉酸劑、沙立度胺(thalidomide)衍生物、抗腫瘤(antineoplastic)化學治療劑及其他。紫杉烷包括多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel)；細胞毒性抗生素包括放線菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、及蒽環黴素(anthracycline)(諸如小紅莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)及伐柔比星(valrubicin))；酪胺酸激酶抑制劑包括埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊馬替尼(imatinib)、可米替尼(cobemitinib)及曲美替尼(trametinib)；PARP抑制劑包括皮納帕尼(piraparib)；B-Raf酶抑制劑包括維羅非尼(vemurafenib)及達拉非尼(dabrafenib)；烷基化劑包括達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及替莫唑胺(temozolomide)；鉑類似物包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)及奧賽力鉑(oxaliplatin)；核苷類似物包括阿紮胞苷(azacitidine)、卡培他濱(capecitabine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)及吉西他濱(gemcitabine)且；抗葉酸劑包括甲胺喋呤(methotrexate)及培美曲唑(pemetrexed)。適用於本發明之其他化學治療劑包括迪法替尼(defactinib)、恩替諾特(entinostat)、艾瑞布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)及長春鹼(vinblastine)。
用於與如本文所描述之抗體分子一起投與之較佳治療劑為小紅莓、米托蒽醌、環磷醯胺、順鉑及奧賽力鉑。
用於與如本文所描述之特異性結合成員組合投與之放射療法可為體外放射療法(external beam radiotherapy)或近接療法(brachytherapy)。
用於與如本文所描述之特異性結合成員組合投與之免疫治療劑可為治療性抗體分子、核酸細胞介素或基於細胞介素之療法。舉例而言，治療性抗體分子可結合至免疫調節分子(例如抑制性檢查點分子或免疫共刺激分子)或腫瘤抗原(例如細胞表面腫瘤抗原或可溶性腫瘤抗原)。治療性特異性結合成員可結合之免疫調節分子的實例包括CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、PD-L1、PD-1、CD47、CD73、CSF-1R、KIR、CD40、HVEM、IL-10及CSF-1。治療性抗體分子可結合之先天免疫系統之受體的實例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、類RIG-I受體(例如RIG-I及MDA-5)及STING。治療性抗體分子可結合之腫瘤抗原的實例包括HER2、EGFR、CD20及TGF-β。
用於與如本文所描述之特異性結合成員組合投與的核酸可為siRNA。
細胞介素或基於細胞介素之療法可選自由以下組成之群：IL-2、共軛IL2之前藥、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21及第I型干擾素。
用於治療癌症之抗腫瘤疫苗既已在臨床上實施，亦已在科學文獻(諸如Rosenberg，2000)內詳細論述。此主要涉及藉由將自體或同種異體癌細胞以疫苗接種方法之形式使用，伴隨或不伴隨顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，促使免疫系統對由該等自體或同種異體癌細胞表現之各種細胞標記物起反應的策略。GM-CSF引起抗原呈現中之強烈反應，且在與該策略一起採用時尤其良好地起作用。
化學治療劑、放射療法、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT療法或供激素療法用之藥劑較佳為用於所討論之癌症的化學治療劑、放射療法、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT療法或供激素療法用之藥劑，亦即已展示為有效治療所討論之癌症的化學治療劑、放射療法、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT療法或供激素療法用之藥劑。選擇已展示為對所討論之癌症有效的化學治療劑、放射療法、免疫治療劑、抗腫瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT療法或供激素療法用之藥劑很好地在熟練從業者的能力範圍內。
考慮到OX40之增強免疫反應的活性，預期OX40促效劑分子應用於感染性疾病之治療中。因此，在另一較佳實施例中，如本文所描述之特異性結合成員可用於治療感染性疾病(諸如急性或持續性感染性疾病)之方法中。
在不希望受理論束縛的情況下，認為本發明之特異性結合成員將藉由誘導先天性免疫細胞(諸如嗜中性白血球及單核球)之快速浸潤及活化，增強針對由病原體所引起之急性感染性疾病的免疫反應，藉此促進對引起急性感染性疾病之病原體的清除。因此，在另一實施例中，如本文所描述之特異性結合成員可用於治療急性感染性疾病(諸如急性細菌疾病)之方法中。在一較佳實施例中，急性感染性疾病為由革蘭氏陽性細菌(諸如李斯特菌屬(Listeria )細菌、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ))引起之急性細菌疾病。
感染性疾病通常由免疫系統清除，但一些感染持續長時間段，諸如數月或數年，且未受免疫系統有效抗擊。此類感染亦被稱作持續性或慢性感染。
較佳地，如本文所描述之特異性結合成員用於治療持續性感染性疾病，諸如持續性病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染，較佳持續性病毒或細菌感染。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之持續性病毒感染為以下的持續性感染：人類免疫不全病毒(HIV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、巨細胞病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒或水痘帶狀疱疹病毒(Varicella Zoster virus)。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之持續性細菌感染為以下的持續性感染：金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza )、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae )、大腸桿菌(Escherichia coli )、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi )、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori )、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )、梅毒螺旋體(Treponema pallidum )、糞腸球菌(Enterococcus faecalis )或肺炎鏈球菌。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之持續性真菌感染為以下的持續性感染：念珠菌屬(Candida )(例如白色念珠菌(Candida albicans ))、隱球菌屬(Cryptococcus )(例如格特隱球菌(Cryptococcus gattii )及新型隱球菌(Cryptococcus neoformans ))、籃狀菌屬(Talaromyces )(青黴菌屬(Penicillium ))(例如馬爾尼菲籃狀菌(Talaromyces marneffe ))、小芽孢菌屬(Microsporum )(例如奧杜盎小芽孢菌(Microsporum audouinii ))或匐行疹發癬菌(Trichophyton tonsurans )。
在一較佳實施例中，待使用如本文所描述之特異性結合成員治療之持續性寄生蟲感染為以下的持續性感染：瘧原蟲屬(Plasmodium )(諸如惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum ))，或利什曼原蟲屬(Leishmania )(諸如黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani ))。
在治療持續性感染性疾病之情形下，治療可包括消除感染、減少個體之病原負荷及預防感染復發。舉例而言，治療可包含預防、改善、延緩、緩和或遏制持續性感染之一或多個症狀及/或徵象。可替代地，治療可包括預防感染性疾病。
在治療感染性疾病之情形下，如本文所描述之特異性結合成員可與用於治療感染性疾病之另一治療劑組合投與個體，另一治療劑諸如已展示為適合或預期適合用於治療所討論之感染性疾病的治療劑。舉例而言，特異性結合成員可與免疫治療劑組合投與個體。用於與如本文所描述之抗體分子組合投與的免疫治療劑可為治療性抗體分子。舉例而言，治療性抗體分子可結合至先天免疫系統之受體。治療性抗體分子可結合之先天免疫系統之受體的實例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、類RIG-I受體(例如RIG-I及MDA-5)及STING。
在特異性結合成員用於預防感染性疾病時，特異性結合成員可與針對所討論之病原體的疫苗組合投與。在不希望受理論束縛的情況下，認為本文所描述之特異性結合成員可充當疫苗接種中之佐劑。具體而言，認為向個體投與特異性結合成員與疫苗之組合，與在單獨的疫苗情況下所達成之針對病原體的免疫反應相比，將觸發針對病原體的更大免疫反應。
給定本發明，包括以下實驗範例，對熟習此項技術者而言，其他態樣及實施例將顯而易見。
本說明書中所提及之所有文獻均以全文引用之方式併入本文中。
本文所用之「及/或」應視為二種指定特徵或組分中之每一者具有或不具有另一者之特定揭示內容。舉例而言，「A及/或B」應視為特定揭示(i) A、(ii) B及(iii) A及B中之每一者，正如在本文中個別地陳述每一者一般。
除非上下文另外指示，否則上文所陳述之特徵之描述及定義不限於本發明之任何特定態樣或實施例，且同樣應用於本發明所描述的所有態樣及實施例。
除非上下文另外指示，否則本發明之其他態樣及實施例提供上文所描述之態樣及實施例，其中術語「包含」經術語「由...組成」或「基本上由...組成」置換。
現將藉助於實例且參考上文所描述之圖式說明本發明之某些態樣及實施例。實例 實例1-抗原選擇及表徵
用於選擇對人類及小鼠OX40具有特異性之Fcab及用於測試所選Fcab與食蟹獼猴OX40之交叉反應性的OX40抗原自產(in-house)製備，或獲自如下文所描述之商業來源。1.1 自產製備之抗原
重組、可溶性、二聚OX40抗原，以及表現OX40之細胞株自產製備。1.1.1 重組可溶性人類、食蟹獼猴及小鼠 OX40 抗原之製備
為製備重組可溶性二聚OX40抗原，將OX40之胞外域融合至小鼠Fc，其改良抗原之溶解度及穩定性。具體而言，使用EcoRI-HF及BglII限制酶，將相關OX40 (人類、食蟹獼猴或小鼠)之胞外域選殖至pFUSE-mIgG2aFc2載體(Invivogen目錄號pfuse-mg2afc2)中，以產生在C端具有小鼠IgG2a Fc域之抗原。隨後藉由在HEK293-6E細胞(National Research Council of Canada)中短暫表現，產生重組OX40抗原，且使用mAb Select SuRe蛋白A管柱(GE Healthcare，11003494)純化抗原，接著進行尺寸排阻層析法(SEC)以確保所得抗原為單一物種且不含聚集體。
為製備生物素標記形式的重組OX40抗原，使用EZ-Link™ Sulfo-NHS-SS-Biotin套組(Thermo Fisher Scientific，目錄號21331)遵循製造商之方案用生物素標記抗原。經生物素標記之OX40抗原用於下文所描述之選擇實驗，而非用於結合親和性量測。根據製造商說明書，使用PD-10去鹽管柱GE Healthcare，17-0851-01)，接著用Amicon 30k自旋管柱Millipore，UFC903024)，以二個步驟進行經生物素標記之OX40抗原的純化。重組抗原之生理特性藉由SE-HPLC分析表徵，以確保不存在聚集體，且藉由PAGE表徵，以驗證分子之尺寸。藉由PAGE進行之尺寸測定表明，可溶性抗原為二聚的，因為其估計分子量為單體之預測分子量的雙倍。亦藉由凝膠位移分析對重組抗原進行分析，該分析展示生物素標記程度超過90%。使用ELISA及表面電漿子共振(SPR)以證實經生物素標記之重組人類(hOX40-mFc)、小鼠(mOX40-mFc)及食蟹獼猴(cOX40-mFc) OX40抗原可由OX40特異性抗體(針對人類及食蟹獼猴OX40之抗體11D4 [歐洲專利第2242771號]；針對食蟹獼猴OX40之多株綿羊抗人類OX40抗體[R&D Systems目錄號AF3388]；針對人類OX40之抗體ACT35 [Biolegend目錄號35002]及針對小鼠OX40之抗體OX86 [Biolegend目錄號119408])結合。此等抗原列於以下表 2 中。1.1.2 表現人類、食蟹獼猴及小鼠 OX40 之細胞株的製備
使用SpeI-HF及NotI-HF限制酶，將人類、食蟹獼猴及小鼠OX40 (對於序列，參見表 1 )選殖至載體pLVX-EF1a-IRES-puro (Clontech，目錄號631253)中。將載體隨後與Lenti-X HTX包裝混合物(Clontech目錄號631249)一起轉型至Lenti-X 293T細胞株(Clontech，目錄號632180)中，以產生慢病毒。慢病毒隨後用於轉導DO11.10細胞(National Jewish Health)。藉由用5 μg/ml嘌呤黴素(Life Technologies目錄號A11113803)培育細胞持續大約2週，接著藉由連續稀釋進行細胞株選殖，選擇過度表現OX40之細胞。藉由流式細胞量測術，使用螢光標記OX40特異性抗體(OX86；ACT35；及多株綿羊抗人類OX40，如實例 1 . 1 . 1 及表 2 中所描述)測試OX40由細胞株之表現。選擇表現人類(DO11.10-hOX40)、小鼠(DO11.10-mOX40)或食蟹獼猴(DO11.10-cOX40) OX40之細胞株，其中在流式細胞量測術分析中，所有細胞展示比未經轉導之細胞高至少10倍的螢光值。此等細胞株列於以下表 2 中。表 1 ：OX40序列
Figure 108124735-A0304-0002
 1.2 市售OX40 抗原
測試數種市售OX40抗原。
重組加His標籤之人類OX40胞外域獲自SinoBiologicals (目錄號10481-H08H-50)。然而，對此抗原之SE-HPLC分析展示，少於50%之抗原呈單體、非聚集形式。此抗原因此未用於後續分析中。
重組人類OX40/人類Fc (hOX40-hFc)及在C端包含人類IgG1 Fc域之重組小鼠OX40/人類Fc (mOX40-hFc)，獲自R&D Systems (hOX40-hFc：目錄號3388-OX-050；mOX40-hFc：目錄號1256-OX-050)且自行用生物素標記。此等可溶性抗原之生理特性藉由SE-HPLC分析表徵，以確保不存在聚集體，且藉由PAGE表徵，以驗證分子之尺寸。藉由PAGE進行之尺寸測定表明，可溶性抗原為二聚的，因為其估計分子量為針對單體抗原所預期之分子量的二倍。亦藉由凝膠位移分析對可溶性抗原進行分析，該分析展示生物素標記程度超過90%。使用ELISA及SPR以證實經生物素標記之重組人類(hOX40-hFc)及小鼠(mOX40-hFc) OX40抗原可由OX40特異性抗體(如實例 1 . 1 . 1 及以下表 2 中所描述之11D4；ACT35；及OX86結合。表 2 ：OX40抗原
Figure 108124735-A0304-0003
 實例2-抗人類OX40 Fcab之選擇及表徵2.1 抗人類OX40 Fcab 之初始選擇
為了自初始噬菌體庫選擇對人類OX40具有特異性之Fcab，將重組生物素標記可溶性二聚人類OX40 (hOX40-mFc；參見表 2 )及細胞表現之人類OX40 (DO11.10-hOX40)二者用作抗原。在一些選擇方案中，除重組生物素標記可溶性二聚人類OX40外，使用表現人類OX40之細胞，以確保所選Fcab能夠結合至細胞表面上呈天然構形之OX40。
構築呈現CH3域(IMGT編號1.4-130))之六個初始噬菌體庫，其在CH3域中包含部分隨機AB環(根據IMGT編號方案，殘基14至18)及EF環(根據IMGT編號方案，殘基92至101)。六個庫中之一者另外包含在CH3域之EF環中位置101處具有二個或四個胺基酸(由二個或四個NNK密碼子編碼)插入(根據IMGT編號方案，插入殘基編號為101.1至101.4)的純系。
所有六個庫經歷使用重組生物素標記可溶性二聚人類OX40 (hOX40-mFc；參見表 2 )之三輪選擇。具體而言，庫經歷三輪，使用(在第1輪及第3輪中)在經抗生蛋白鏈菌素塗佈(Thermo Fisher Scientific，11206D)或(在第2輪中)在經中性抗生物素蛋白塗佈(Thermo Fisher Scientific，14203及A2666)之戴諾珠粒(Dynabead)上捕獲的hOX40-mFc。
所有六個庫亦經歷在第一輪選擇中使用hOX40-mFc，接著使用細胞表現之人類OX40 (在另外二個選擇輪中，DO11.10-hOX40；參見表 2 )的另一選擇操作。
庫中之二者經歷使用表現DO11.10-hOX40抗原之細胞的三輪選擇。
將在第三輪選擇之後自六個庫中鑑別的2133個純系藉由ELISA針對與人類OX40之結合進行篩選。此產生所鑑別之32個獨特陽性結合子，其經次選殖且以可溶性Fcab (由截短鉸鏈[SEQ ID NO: 171]、CH2及CH3域組成)形式在HEK Expi293細胞中表現(使用ExpiFectamine 293轉染套組[Life Technologies，A14524]將選殖至pTT5載體[National Research Council of Canada]中之Fcab轉染至Expi293F細胞[Life technologies，A14527]中)。
針對32個獨特Fcab結合細胞表現之人類OX40 (DO11.10-hOX40)之能力對該等Fcab進行測試。所篩選之32個Fcab中之15個展示與DO11.10-hOX40之細胞結合，且此等相互作用之EC50 範圍為0.1至62 nM。在人類NF-κB報導體分析(描述於下文實例 4 . 4 中)中測試展示與DO11.10-hOX40之結合的15個Fcab。在人類NF-κB報導體分析中，15個Fcab中之六個在與抗人類Fc抗體交聯時展示活性提高。選擇三種Fcab FS20-11、FS20-22及FS20-31用於親和性成熟，該等Fcab在此分析中展示最高位準活性，且在Fcab與抗人類CH2 mAb (純系MK1A6 (Jefferis等人, 1985及Jefferis等人, 1992)，自製)交聯時，其活性提高。2.2 抗人類 OX40 Fcab 之親和性成熟
基於實例 2 . 1 中所選擇之三個Fcab (FS20-11、FS20-22及FS20-31)，藉由使用來自ELLA Biotech之隨機化引子，使用不包括半胱胺酸之胺基酸的等莫耳分佈，使CH3域之AB環中之五個殘基(殘基14至18)或CD環中之五個殘基(殘基45.1至77)隨機化，或藉由使CH3域之EF環之部分(在FS20-22及FS20-31情況下殘基92至94及97至101，且在FS20-11情況下殘基97至100及101.1至101.4 [參見上文實例 2 . 1 ])隨機化(所有殘基編號根據IMGT編號方案)，構築九個噬菌體呈現親和性成熟庫，每一Fcab三個。亦嘗試第四Fcab純系FS20-10之親和性成熟，但產生與其他三個Fcab譜系相比具有較差結合特性及功能活性之後代，且因此未進一步進行此譜系。
使用在(第1輪及第3輪中)經抗生蛋白鏈菌素塗佈(ThermoFisher Scientific，11206D)及(在第2輪中)經中性抗生物素蛋白塗佈(ThermoFisher Scientific，14203及A2666)戴諾珠粒上交替捕獲之重組人類生物素標記hOX40-mFc，對親和性成熟庫進行三輪選擇。使用自50 nM (第1輪)至10 nM (第2輪)至1 nM (第3輪) (對於FS20-11及FS20-22譜系)，或自100 nM (第1輪)至50 nM (第2輪)至10 nM或1 nM (第3輪) (對於FS20-31譜系)之降低抗原濃度，以鑑別高親和性結合子。僅對第三輪輸出中之二者，亦即來自在AB環中具有隨機化殘基14至18之FS20-11庫及在CD環中具有隨機化殘基45.1至77之FS20-22庫的輸出，進行使用1 nM濃度相同抗原及經抗生蛋白鏈菌素塗佈之戴諾珠粒的第四輪選擇。針對與人類OX40之結合，藉由ELISA篩選來自第三及第四輪選擇之輸出的1410個Fcab，且如上文實例 2 . 1 中所描述，將204個獨特陽性結合子鑑別、次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。
在不存在及存在抗CH2交聯之情況下，使用抗人類CH2 mAb純系MK1A6 (參見實例 2 . 1 )用Biacore 3000 (GE Healthcare)來量測在結合至hOX40-mFc時可溶性Fcab的解離速率。針對與細胞表現之人類OX40的結合及針對人類T細胞活化分析(參見下文實例 5 . 1 )中之活性，進一步篩選相比於相關親本Fcab，具有改良解離速率之Fcab。所有Fcab結合細胞表現之人類OX40。選擇在人類T細胞活化分析具有最高活性的來自FS20-11譜系之20個Fcab、來自FS20-22譜系之10個Fcab及來自FS20-31譜系之18個Fcab，以用於如下文所描述之環改組(shuffling)。
對於FS20-11譜系，產生二個環改組庫，一個藉由將九個AB環用十個EF環及WT CD環改組產生，且另一個藉由將AB及EF環用親和性成熟CD環改組產生。對於FS20-22譜系，藉由將三個CD環、六個EF環及親本AB環或親和性成熟AB環改組，產生二個環改組庫。對於FS20-31譜系，產生含有四個AB環、七個CD環及七個EF環之一個環改組庫。
如上文實例 2 . 1 中所描述，將改組序列以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現，且針對與經生物素標記之hOX40-mFc抗原的結合，在Octet QKe System (Pall FortéBio)上使用Dip and ReadTM 抗生蛋白鏈菌素生物感測器(Pall FortéBio，18-5050)進行篩選。對在結合至hOX40-mFc時相比於親本Fcab具有改良解離速率之Fcab進行定序，得到來自FS20-11譜系之66個獨特Fcab、來自FS20-22譜系之35個獨特Fcab序列及來自FS20-31譜系之62個獨特Fcab。針對與hOX40-mFc抗原之結合，在存在及不存在CH2交聯之情況下，使用抗人類CH2 mAb純系MK1A6用Biacore 3000儀器(GE Healthcare)對所鑑別之獨特Fcab進行測試。
對於FS20-11譜系，選擇具有與hOX40-mFc之最強結合(如藉由對於固定濃度，在Biacore儀器上給出最高反應所確定)的18個Fcab，以用於如下文所描述以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現且進一步表徵。對於FS20-22譜系，選擇18個Fcab用於以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現，及基於以下的進一步表徵：當結合至hOX40-mFc時在CH2交聯之情況下的最慢解離速率，當結合至hOX40-mFc時非交聯及CH2交聯解離速率之間的解離速率最大差值及與如上hOX40-mFc之結合強度。對於FS20-31譜系，選擇在CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時具有最慢解離速率的九個Fcab，及在無CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時具有最慢解離速率的九個Fcab，以用於以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現及進一步表徵。由於數個Fcab為此等九Fcab組二者所共有，因此自FS20-31譜系選擇在不存在CH2交聯之情況下在結合至hOX40-mFc時展示緩慢解離速率之額外Fcab，以使用於以假擬mAb2 格式表現及進一步表徵之來自此譜系之Fcab的總數目達18。使用來自T細胞活化分析之資料，鑑別出來自FS20-22譜系之另外六個Fcab及來自FS20-31譜系之八個Fcab，該等Fcab在此分析中展示高活性，且因此將其亦以假擬(4420 LALA) mAb2 格式表現且進一步表徵。 實例3-抗小鼠OX40 Fcab之選擇及表徵3.1. 抗小鼠 OX40 Fcab 之初始選擇
對於選擇，使用呈現人類IgG1之CH1至CH3域的初始酵母菌庫，該等域含有CH3域之AB環(根據IMGT編號方案，殘基11-18)及EF環(根據IMGT編號方案，殘基92-101)中之隨機化，且包括AB環之殘基16與17 (根據IMGT編號方案)之間的五殘基隨機插入。將酵母菌與融合至人類IgG Fc域之經生物素標記之重組鼠類OX40 (mOX40-hFc；表 2 )一起培育，且使用抗生蛋白鏈菌素塗佈之珠粒藉由MACS分選。隨後在存在五倍莫耳過量hFc之情況下，使用降低濃度之經生物素標記mOX40-hFc進行三輪FACS選擇。將細胞用抗生蛋白鏈菌素-別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC) (BD Bioscience，349024)或抗生物素-APC (Miltenyi Biotec，130-090-856)染色，且使用FACSAria (BD Bioscience)細胞分選儀進行分選。針對抗原結合，篩選來自富集群之182個個別Fcab，且如先前在實例 2 . 1 中所描述，將二個獨特陽性結合子次選殖且以可溶性Fcab形式表現。針對與mOX40-hFc之結合，藉由ELISA表徵Fcab，且在小鼠NF-κB報導體分析1 (參見下文實例 4 . 5 )中針對活性表徵Fcab。僅一個Fcab，FS20m-232，在NF-κB報導體分析1中具有活性且展示與表現小鼠OX40之細胞的結合，因此選擇此Fcab用於親和性成熟。3.2 mOX40 Fcab 之親和性成熟
藉由使用來自ELLA Biotech之隨機化引子，使用不包括半胱胺酸之胺基酸的等莫耳分佈，使FS20m-232 Fcab之AB環中之七個殘基(根據IMGT編號方案，殘基15 - 16.5) (庫1)、CD環中之六個殘基(根據IMGT編號方案，殘基45.1-78) (庫2)，或EF環中之五個殘基(根據IMGT編號方案，殘基92-94及97-98) (庫3)隨機化，構築三個噬菌體呈現親和性成熟庫。
使用在經抗生蛋白鏈菌素塗佈(ThermoFisher Scientific，11205D)及經中性抗生物素蛋白塗佈(ThermoFisher Scientific，14203及A2666)戴諾珠粒(Dynabead)上交替捕獲之重組生物素標記mOX40-mFc，對親和性成熟庫進行三輪選擇。使用自50 nM (第1輪)至10 nM (第2輪)，至1 nM (第3輪)之降低抗原濃度以鑑別高親和性結合子。針對與mOX40-mFc之結合，藉由噬菌體ELISA篩選來自第三輪選擇的1655個個別噬菌體，且如實例 2 . 1 中所描述，將98個獨特陽性結合子鑑別、次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。針對細胞結合及小鼠NF-κB報導體分析2 (詳見下文實例 4 . 6 )中之活性，進一步篩選Fcab。選擇活性最強的Fcab用於環改組。
產生環改組庫，該庫含有27個CD環(自親和性成熟鑑別之所有26個獨特序列及WT序列)，其經37個EF環(在噬菌體ELISA中具有與小鼠OX40之最佳結合的彼等序列及WT序列)改組，其中所有改組純系含有FS20m-232 Fcab之AB環。如上文所描述，將750個改組序列以可溶性Fcab (含有截短鉸鏈)形式在HEK Expi293細胞中表現。針對改良解離速率，藉由在Octet QKe System (Pall FortéBio)上使用Dip and ReadTM 抗生蛋白鏈菌素生物感測器(Pall FortéBio，18-5050)，量測Fcab與經生物素標記之mOX40-mFc (表 2 )之結合，篩選含有Fcab之HEK上清液。如上文所描述，將11個獨特AB環隨機化Fcab及60個獨特EF環隨機化Fcab次選殖且以可溶性Fcab形式在HEK Expi293細胞中表現。將此等Fcab與具有最慢解離速率之43個改組Fcab一起針對細胞結合及小鼠T細胞活化分析(參見下文實例 5 . 2 )中之活性進一步篩選。在由抗人類CH2 mAb純系MK1A6交聯時，FS20m-232-91 Fcab在結合至經生物素標記之mOX40-mFc時具有最慢解離速率，且在小鼠T細胞活化分析中具有最高活性，且因此選為小鼠(替代)Fcab以用於後續實驗。 實例4-假擬mAb2 之構築、表現及表徵4.1 假擬mAb2 之構築及表現
製備包含上述經鑑別之抗人類OX40及抗小鼠OX40 Fcab的「假擬」mAb2 ，以便允許對呈mAb2 格式之此等Fcab進行表徵。此等假擬mAb2 由抗OX40 Fcab及人類IgG1主鏈中之抗FITC抗體4420 (Bedzyk等人, 1989及Bedzyk等人, 1990)的可變區(詳見SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168及SEQ ID NO: 156)，或人類IgG1主鏈中之抗雞蛋白溶菌酶(HEL)抗體D1.3 (Braden等人, 1996)的可變區(詳見SEQ ID NO: 169及157)，藉由在人類IgG1之未經修飾CH3域之序列中存在的XhoI及BamHI位點內，將抗FITC及抗HEL抗體之CH3域用抗OX40 Fcab之CH3域置換來製備。假擬mAb2 分別包含抗FITC mAb 4420之輕鏈(SEQ ID NO: 156)或抗HEL mAb D1.3之輕鏈(SEQ ID NO: 157)，且亦含有重鏈之CH2域中的LALA突變(Hezareh等人, 2001及Bruhns等人, 2009)，以減少Fc-γ受體相互作用及潛在的Fc-γ受體誘導之交聯。此等實例中所提及之假擬mAb2 及mAb2 中LALA突變的存在由其純系名稱之Fcab部分末尾處的後綴『AA』表示。
假擬mAb2 藉由在HEK293-6E細胞中短暫表現產生，且使用mAb Select SuRe蛋白A管柱純化。4.2 呈假擬mAb2 格式之抗人類 OX40 Fcab 對細胞表現之人類及食蟹獼猴 OX40 的結合親和性
使用流式細胞量測術來量測假擬呈(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab對細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40 (表現人類OX40 [DO11.10-hOX40]或食蟹獼猴OX40[DO11.10-cOX40]之DO11.10細胞；參見表 2 )的親和性。亦藉由流式細胞量測術，由測試與不表現OX40之HEK細胞的結合評定非特異性結合。
將假擬(4420 LALA) mAb2 及對照mAb稀釋液(2×最終濃度)在1×DPBS (Gibco，14190-094)中一式三份地製備。將DO11.10-hOX40或DO11.10-cOX40或HEK細胞懸浮液在PBS+2% BSA (Sigma，A7906)中製備，且以4×106 個細胞/毫升，以50微升/孔接種於V型底96孔培養盤(Costar，3897)中。將50 µl假擬(4420 LALA) mAb2 或對照mAb (抗人類OX40 mAb，11D4)稀釋液添加至含有細胞之孔中(最終體積100 µl)，且在4℃下培育1小時。洗滌培養盤，且隨後添加100微升/孔1:1000稀釋於PBS外加2% BSA中之二次抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，且在4℃下在暗處培育30分鐘。洗滌培養盤，且再懸浮於100 µl含1 μg/ml DAPI (Biotium，目錄號40043)之PBS中。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)讀取培養盤。排除死細胞，且量測FITC通道中之螢光(488nm/530/30)。使用GraphPad Prism軟體中之log(促效劑)對反應擬合資料。
Fcab (均以假擬[4420 LALA] mAb2 格式測試)及陽性對照，在人類IgG1主鏈中且在重鏈之CH2域中含有LALA突變之抗人類OX40 mAb，11D4，以一系列親和性結合至人類OX40。在實例 2 . 2 中所描述之針對以假擬mAb2 格式進一步表徵所選的純系中，相比於其他Fcab，14個Fcab (來自FS20-11譜系之三個、來自FS20-22譜系之五個及來自FS20-31譜系之六個)展示針對人類OX40之顯著較高親和性。此等14個Fcab純系針對細胞表現之人類及食蟹獼猴OX40的結合親和性列舉於表 3 中。
來自FS20-22及FS20-31譜系之Fcab以與人類OX40之相當親和性結合食蟹獼猴OX40。此係潛在有利的，因為在展示適合之活體外食蟹獼猴OX40活化之條件下，此等Fcab可能能夠用於食蟹獼猴中之毒理學研究，其結果可預測人類中的毒理學效應。來自FS20-11之Fcab亦結合至食蟹獼猴OX40，但親和性較低，使其較不適於在食蟹獼猴中測試。所測試之Fcab及陽性對照mAb不展示與HEK細胞之任何非特異性結合。表 3 ： 呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗OX40 Fcab對細胞表現之人類或食蟹獼猴OX40的結合親和性
Figure 108124735-A0304-0004
 4.3 呈假擬mAb2 格式之抗小鼠 OX40 Fcab 對細胞表現之小鼠 OX40 的結合親和性
使用流式細胞量測術來量測呈假擬mAb2 格式(4420 LALA)之抗小鼠OX40 Fcab對細胞表現之小鼠OX40 (DO11.10-mOX40；參見表 2 )的親和性。亦藉由流式細胞量測術，由測試與不表現OX40之HEK細胞的結合評定非特異性結合。
將假擬(4420 LALA) mAb2 及對照mAb稀釋液(2×最終濃度)在1×DPBS (Gibco，14190-094)中製備。將DO11.10 mOX40或HEK細胞懸浮液在PBS+2% BSA (Sigma，A7906)中製備，且以4×106 個細胞/毫升，以50微升/孔接種於V型底96孔培養盤(Costar，3897)中。將50 µl假擬(4420 LALA) mAb2 或對照mAb (抗小鼠OX40 mAb，OX86稀釋液添加至含有細胞之孔中(最終體積100 µl)且在4℃下培育1小時。洗滌培養盤，且隨後添加100微升/孔1:1000稀釋於PBS+2% BSA中之二次抗體(抗人類Fc-488抗體，Jackson ImmunoResearch，109-546-098)，且在4℃下在暗處培育30分鐘。洗滌培養盤，且再懸浮於100 µl含1 μg/ml DAPI (Biotium，40043)之PBS中。使用Canto II流式細胞儀(BD Bioscience)讀取培養盤。排除死細胞，且量測FITC通道中之螢光(488nm/530/30)。使用GraphPad Prism軟體中之log(促效劑)對反應擬合資料。
以假擬(4420 LALA) mAb2 格式測試之Fcab，及陽性對照，在人類IgG1主鏈中，具有LALA突變之抗小鼠OX40 mAb OX86 (SEQ ID NO 175及176)，以表 4 中所列舉之親和性特異性結合至小鼠OX40。抗小鼠OX40 Fcab對細胞表現之小鼠OX40之親和性與抗小鼠OX40陽性對照mAb的親和性相當。所測試之Fcab及陽性對照mAb不展示與HEK細胞之任何非特異性結合。表 4 ： 呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab對細胞表現之小鼠OX40的結合親和性
Figure 108124735-A0304-0005
 4.4 人類 NF - κB 報導體分析
需要分析以簡單且快速地測試在初始選擇期間所分離之Fcab的OX40促效活性，使得可快速決定繼續追求哪些Fcab。如下文所描述，此類分析之開發在技術上具有挑戰性。
OX40與其配位體之結合引起OX40聚集及NF-κB信號傳遞路徑之活化(Arch及Thompson, 1998)。具有促效活性之抗OX40 Fcab藉由誘導OX40聚集及信號傳遞模擬OX40配位體。因此設計可偵測在OX40聚集後NF-κB信號傳遞路徑之活化的分析，以測試抗OX40 Fcab之活性。
將Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies, R780-07)用含有控制螢光素酶表現之NF-κB敏感型啟動子的Qiagen Cignal Lenti NFkB Reporter (luc) (Qiagen目錄號336851)慢病毒轉導。隨後藉由在存在5 μg/ml嘌呤黴素(Life technologies目錄號A11113803)之情況下培養細胞大約2週，接著經由連續稀釋進行細胞株選殖，選擇此等細胞。藉由在培養基中用10 ng/ml TNFa (R&D Systems目錄號210-TA-005)培育細胞24小時，且在處理後15分鐘用Promega Bio-Glo螢光素酶分析系統(Promega目錄號G7941)根據製造商說明書量測螢光，測試螢光素酶報導體構築體之存在。在盤讀取器中用Gen5軟體，BioTek量測螢光(0.5秒積分時間)。
使用EcoRI-HF及NotI-HF限制酶，將人類OX40次選殖至載體pcDNA5FRT (Life Technologies目錄號V6010-20)中。隨後使用脂染胺2000 (Life Technologies，11668-019)將載體轉型至Flp-In T-REx 293 HEK細胞株(Life Technologies，R780-07)中。在含10% FBS (Life Technologies，10270-1-6)、100 µg/ml濕黴素B (Melford Laboratories Ltd，Z2475)、15 µg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin) (Melford Laboratories Ltd, B1105)之DMEM (Life Technologies，61965-026)中生長轉型Flp-In T-REx 293細胞(被稱作HEK.FRT.luc細胞株) 3至4週，直至穩定轉型細胞之集落明顯。此等集落在存在1 µg/ml多喜黴素(Doxycyclin) (Sigma, D9891)之情況下擴增，且針對人類OX40表現藉由流式細胞量測術使用抗OX40 mAb ACT35 (Thermo Fisher Scientific，目錄號17-1347-42)進行測試。
新產生之HEK.FRT.luc細胞株中人類OX40的表現出乎意料地引起NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化及螢光素酶之高位準表現。因此，不可能偵測到由OX40促效劑抗體引起之此信號傳遞路徑的差異性活化。為了降低NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化，藉由用其他啟動子(來自Invivogen PromTest質體)取代高表現CMV啟動子，嘗試降低OX40之表現位準。然而，與期望相反，在此策略之情況下，OX40表現位準未改變，且NF-κB信號傳遞路徑仍具有組成性活性。
藉由將人類OX40胞外域與其他TNFR家族成員(CD40、GITR、TNFRII、CD27、CD30、CD137及HVEM)中之一者的胞內結構域融合(Song等人, 2014)，且在如上文所詳述之HEK.FRT.luc細胞株中表現所得嵌合蛋白，進行降低NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化的另一嘗試。使用OX40特異性抗體藉由流式細胞量測術測定OX40表面表現。出人意料地，表現嵌合hOX40-hCD137受體之HEK.FRT.luc細胞展示降低之NF-κB信號傳遞路徑之背景活化，及對OX40促效劑抗體之濃度依賴性反應。所測試之其他嵌合受體中無一者引起NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化降低。僅表現hOX40-hCD137嵌合體之細胞株(HEK.FRT.luc.hOX40hCD137)可因此用於在就抗人類OX40 Fcab之促效活性而言初始選擇之後鑑別的Fcab進行測試及分級，且用於此作用。
如實例 2 . 1 中所描述，將抗OX40 Fcab以可溶蛋白形式表現，且如下針對OX40促效活性進行測試。在37℃，5% CO2 下，將HEK.FRT.luc.hOX40hCD137細胞以1×105 個細胞/孔之濃度接種於96孔白色透明平底培養盤中隔夜。第二天，在DPBS (Gibco)中製備待測試之各Fcab或對照mAb (呈人類IgG1格式之11D4)的2 µM稀釋液，且進一步1:10稀釋於報導體細胞培養基(DMEM (Gibco目錄號61965-026)；10% FCS (Gibco目錄號10270-106)；1×青黴素鏈黴素(PennStrep) (Gibco目錄號15140-122)；濕黴素B 100 μg/ml (Melford Laboratories Ltd. Z2475)；殺稻瘟菌素15 μg/ml (Melford Laboratories Ltd. B1105)；嘌呤黴素5μg/ml (Life technologies目錄號A11113803)；及多喜黴素1 μg/ml (Sigma目錄號D9891))中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6)以與測試Fcab或對照mAb 1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，在存在或不存在交聯劑之情況下製備Fcab或對照mAb的連續稀釋液，且將100 µl稀釋液添加至培養盤上之細胞中。
在37℃，5% CO2 下培育細胞24小時，且在處理後15分鐘用Promega Bio-Glo螢光素酶分析系統(Promega目錄號G7941)根據製造商說明書量測螢光。在盤讀取器中用Gen5軟體, BioTek量測螢光(0.5秒積分時間)，作為回應於經由由交聯促效性Fcab或陽性對照mAb與OX40之結合誘導之人類OX40聚集的NF-κB信號傳遞路徑活化，產生之螢光素酶的量度。相對於Fcab/mAb之對數濃度，繪製螢光值，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。4.5 小鼠 NF - κB 報導體分析 1
為允許亦快速且簡單地測試所分離之抗小鼠OX40 Fcab的OX40促效活性，開發小鼠NF-κB報導體分析。
最初遵循如實例 4 . 4 中所描述用於產生人類NF-κB報導體分析之類似方法，使用小鼠OX40序列進行。然而，遇到類似問題，導致NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化。
為降低NF-κB信號傳遞路徑之組成性活化，將小鼠OX40胞外域與人類CD40受體之胞內域融合(Song等人, 2014)，且在如上文所詳述之HEK.FRT.luc細胞株中表現。使用OX40特異性抗體藉由流式細胞量測術進行之OX40表面表現測定用於測試嵌合受體之存在。表現嵌合mOX40-hCD40受體之HEK.FRT.luc細胞(HEK.FRT.luc.mOX40hCD40細胞)展示相比於表現全長小鼠OX40之細胞，降低之NF-κB信號傳遞路徑之背景活化，且展示對OX40促效性抗體之濃度依賴性反應。因此選擇此細胞株以用於測試在初始選擇之後所鑑別之抗小鼠OX40 Fcab的OX40促效活性。分析方案基本上如實例 4 . 4 中所描述，但用此等HEK.FRT.luc.mOX40hCD40細胞測試結合小鼠OX40之Fcab，且使用呈人類IgG1格式之OX86作為陽性對照。4.6 小鼠 NF - κB 報導體分析 2
為了開發改良之小鼠OX40 NF-κB報導體分析，採用用於人類OX40 NF-κB報導體分析之策略。如實例 4 . 4 中所描述，將小鼠OX40胞外域融合至人類CD137受體之胞內域，且在HEK.FRT.luc細胞株中表現。使用OX40特異性抗體藉由流式細胞量測術測定OX40表面表現，以偵測嵌合受體之存在。表現嵌合mOX40-hCD137受體之HEK.FRT.luc細胞(HEK.FRT.luc.mOX40hCD137細胞)展示與小鼠NF-κB報導體分析1中所觀測到之背景活化相比，降低之NF-κB信號傳遞路徑之背景活化，且展示對抗小鼠OX40促效性抗體的濃度依賴性反應。此細胞株因此允許對抗小鼠OX40 Fcab進行改良之測試及分級，且用於對在針對小鼠OX40促效活性之親和性成熟之後所鑑別的抗小鼠OX40 Fcab進行測試及分級。使用此等細胞之分析方案基本上如實例 4 . 5 中所描述。4.7 抗人類 OX40 Fcab 針對人類及食蟹獼猴 OX40 之結合親和性
藉由SPR量測抗人類OX40 Fcab (呈OX40/EGFR mAb2 格式)針對人類及食蟹獼猴OX40的親和性。由於在抗原通過流槽上方時，mAb或mAb2 分子之定向可影響結合動力學，因此試圖藉由在量測Fcab之親和性時，將mAb2 之Fcab部分遠離Biacore晶片之結合表面定位，且在量測Fab之親和性時，將mAb2 之Fab部分遠離Biacore晶片之結合表面定位，減少此影響。為達成此，使用目標捕獲方法以將mAb2 分子根據需要進行定向。EGFR用作捕獲OX40/EGFR mAb2 之抗原(參見表 5 )，其使用抗人類OX40 Fcab及抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab) (美國專利第6217866號；在表5中由『Cx』指示)之可變區，與實例 4 . 1 中所描述之假擬mAb2 以相同方式構築。為了將抗OX40 Fcab之親和性與抗OX40 mAb之親和性進行比較，將結合EGFR之Fcab (專利公開案第WO 2018/015448 A1號)與抗OX40 mAb 11D4 (EP 2 242 771 B1)之Fab配對，且將EGFR用作捕獲所得EGFR/OX40 mAb2 的抗原。此允許Fcab及陽性對照mAb二者遠離Biacore晶片表面，且朝向在Biacore晶片上方流動之OX40抗原定向。
藉由遵循BIAcore T200儀器之製造商說明書，藉由胺偶合(GE Healthcare，BR-1000-50)至5000 RU之表面密度，將EGFR (R&D Systems目錄號344-ER)固定於Series S CM5晶片(GE Healthcare，BR-1005-30)上。藉由以10微升/分鐘注入稀釋於HBS-EP+緩衝液(GE目錄號BR100669)中之mAb2 的1 μg/ml溶液持續40秒，將mAb2 樣品捕獲至大約150 RU。隨後使於HBS-EP+緩衝液(GE目錄號BR100669)中之不同濃度之OX40抗原(自製未經生物素標記之hOX40-mFc或未經生物素標記之cOX40-mFc；參見表 2 )以70微升/分鐘在晶片上方流動3分鐘，且隨後使其解離6分鐘。在各抗原濃度之後，藉由以30微升/分鐘之流動速率注入30 mM氫氧化鈉(NaOH)持續10秒，更新晶片。出於參考減除目的，在最高濃度之抗原之前及最低濃度之抗原之後注入緩衝液HBS-EP+。
用1:1朗繆爾(Langmuir)模型擬合結合動力學，以產生各樣品之平衡結合常數(KD )。用BiaEvaluation軟體版本3.2進行資料分析。結果展示於表 5 中。表 5 ： 如藉由SPR所測定之針對人類及食蟹獼猴OX40的結合親和性
Figure 108124735-A0304-0006
觀測到OX40 Fcab具有針對人類OX40之一系列親和性(參見表 5 )。來自FS20-11譜系之Fcab與食蟹獼猴OX40的結合在偵測臨限以下，表明此等Fcab針對食蟹獼猴OX40具有低親和性，如亦在上文實例 4 . 2 中所描述之細胞結合實驗中觀測到。來自FS20-22及FS20-31譜系之抗人類OX40 Fcab以與結合至人類OX40相當的親和性結合至食蟹獼猴OX40。4.8 抗小鼠 OX40 Fcab 針對小鼠 OX40 之結合親和性
使用與實例 4 . 7 中所描述之相同目標捕獲及EGFR固定方法，但差別為藉由以10微升/分鐘注入稀釋於HBS-EP+緩衝液(GE目錄號BR100669)中之mAb2 的5 nM溶液持續1分鐘，將mAb2 樣品捕獲至大約200 RU，藉由SPR量測FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab針對小鼠OX40之親和性。使用FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab (具有LALA突變)及抗EGFR抗體西妥昔單抗(專利US 6,217,866 B1；在以下表 6 中由Cx指示)之可變區構築OX40/EGFR mAb2 。隨後使於HBS-EP+緩衝液(GE目錄號BR100669)中之不同濃度之OX40抗原(自製mOX40-mFc；詳見表 2 )以70微升/分鐘在晶片上方流動5分鐘，且隨後使其解離10分鐘。在各抗原濃度之後，藉由以30微升/分鐘之流動速率注入30 mM氫氧化鈉(NaOH)持續10秒，更新晶片。出於參考減除目的，在最高濃度之抗原之前及最低濃度之抗原之後注入緩衝液HBS-EP+。
用1:1朗繆爾模型擬合結合動力學，以產生各樣品之平衡結合常數(KD )。用BiaEvaluation軟體版本3.2進行資料分析。表 6 展示抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91之親和性為大約0.7 nM。表 6 ： 如藉由SPR所測定之mAb2 對小鼠OX40的結合親和性
Figure 108124735-A0304-0007
 4.9 抗人類 OX40 Fcab 之特異性
抗人類OX40 Fcab針對人類OX40之特異性以假擬mAb2 格式測試，且藉由測試Fcab與其他人類TNFR家族受體(CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR及CD137)之結合，在Biacore T200中藉由SPR進行量測。使用胺偶合(胺偶合套組，GE Healthcare，BR-1000-50)以將人類CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR、CD137受體(均獲自R&D Systems)在Biacore CM5晶片(GE Healthcare，目錄號29149603)中塗佈至大約1000 RU。在HBS-EP+緩衝液(BR100669)中製備以1 μM起始之呈假擬mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab (參見表 7 )的稀釋液，且以30微升/分鐘注入，持續3分鐘，且隨後使其在緩衝液中解離4分鐘。藉由以30微升/分鐘注入pH 2.5之10 mM甘胺酸，持續12 s，更新晶片。將對不同TNFR家族成員具特異性之抗體用作陽性對照，以驗證Biacore晶片塗佈。將資料進行二重參考減除且使用BIAevaluation 3.2軟體分析。表 7 中所列之Fcab不結合至所測試之TNFR家族受體中之任一者，表明其針對人類OX40的特異性。
表 7 ：針對特異性藉由SPR測試之呈假擬mAb2 格式的抗人類OX40 Fcab。
Figure 108124735-A0304-0008
 4.10 抗小鼠OX40 Fcab之特異性
藉由測試與其他小鼠TNFR家族受體(小鼠CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR及CD137受體)之結合，在Biacore T200儀器中藉由SPR量測呈假擬(HEL D1.3 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab (FS20m-232-91)的特異性。使用胺偶合(胺偶合套組，GE Healthcare，BR-1000-50)以將小鼠CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR、CD137受體(均獲自R&D Systems)在Biacore CM5晶片(GE Healthcare，目錄號29149603)中塗佈至大約1000 RU。在HBS-EP+緩衝液(BR100669)中製備以1 μM起始之假擬mAb2 (FS20m-232-91AA/HEL D1.3)的稀釋液，且以30微升/分鐘注入，持續3分鐘，且隨後使其在緩衝液中解離6分鐘。藉由以30微升/分鐘注入pH 2.5之10 mM甘胺酸，持續20 s，更新晶片。將對不同TNFR家族成員具特異性之抗體用作陽性對照，以驗證Biacore晶片塗佈。
將資料進行二重參考減除且使用BIAevaluation 3.2軟體分析。呈假擬(HEL D1.3 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91不結合至所測試之相關TNFR家族成員中之任一者，表明此Fcab針對小鼠OX40的特異性。 實例5至8-Fcab藉由不同交聯手段活體外及活體內誘導OX40活性的功能活性
在先前實例中，鑑別可結合至人類OX40或小鼠OX40之Fcab。隨後在NF-κB分析中測試呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之此等Fcab活化OX40聚集及信號傳遞的能力。以下實例展現在Fcab由其Fc區或由Fab結合至另一目標交聯時，呈假擬mAb2 及mAb2 格式之Fcab活體外及活體內活化OX40的能力。由於Fcab能夠以含有多種Fab之mAb2 格式引起OX40之聚集及活化，因此預期其具有治療數種不同疾病之效用。 實例5-由呈假擬mAb2 格式之抗OX40 Fcab引起之活體外及活體內OX40活化
活化T細胞在其細胞表面上表現OX40。三聚OX40配位體與OX40之結合引起受體之三聚合作用。由於OX40配位體在抗原呈現細胞之細胞表面上以團簇形式表現，因此OX40配位體與OX40與之間的相互作用引起OX40聚集，已知該聚集為OX40信號傳遞及進一步T細胞活化所必需的。對OX40產生促效作用之抗體必須模擬OX40配位體之此聚集活性。在單特異性抗OX40抗體情況下，Fcγ受體結合至抗體之Fc域，且與其交聯，引起OX40聚集。
針對在存在交聯劑之情況下交聯Fcab後，活化T細胞上表現之OX40的能力，在T細胞活化分析中測試實例 4 中所描述之呈假擬(4420) LALA格式之抗人類OX40及抗小鼠OX40 Fcab。針對經由活化表現OX40之腫瘤浸潤淋巴球，在CT26同基因型小鼠腫瘤生長模型中活體內抑制腫瘤生長的能力，亦測試呈假擬(HEL D1.3) mAb2 格式(參見實例 4 . 1 )之FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab。5.1 使用呈假擬 mAb2 格式之抗人類 OX40 Fcab 的人類 T 細胞活化分析
活化人類T細胞在其細胞表面上表現人類OX40。已知OX40之聚集為誘導受體信號傳遞及進一步T細胞活化所必需的。使用T細胞活化分析以評定在存在以下表 8 中所詳述之假擬(4420 LALA) mAb2 及mAb分子之情況下OX40的聚集及信號傳遞。藉由量測IL-2之釋放偵測T細胞活化。5.1.1 分離及活化人類 T 細胞
為分離T細胞，將周邊血液單核細胞(PBMC)自血小板捐獻副產物白血球耗乏錐(NHS Blood and Transplant服務)分離。簡言之，將白血球錐內含物用PBS沖洗且上覆於聚蔗糖梯度(GE Lifesciences目錄號17144002)上。藉由對未穿過聚蔗糖梯度之細胞進行離心及回收，分離PBMC。進一步用PBS洗滌PBMC，且根據製造商說明書，經由添加10 ml紅細胞溶解緩衝液(eBioscience)溶解剩餘的紅細胞。使用泛T細胞分離套組II (Miltenyi Biotec Ltd)，根據製造商說明書，自存在於溶析液中之PBMC分離T細胞。
藉由渦流再懸浮人類T活化子CD3/CD28戴諾珠粒(Life technologies 11452D)。將珠粒用T細胞培養基(含10% FBS (Life Technologies)、1×青黴素鏈黴素(Life Technologies)、丙酮酸鈉(Gibco)、10 mM Hepes (Gibco)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)及50 µM 2-巰基乙醇(Gibco)之RPMI培養基(Life Technologies))洗滌二次。
在T-25燒瓶(Sigma)中以2:1細胞比珠粒比率用經洗滌人類T活化子CD3/CD28戴諾珠粒刺激T細胞培養基中濃度為1.0×106 個細胞/毫升之所需量的T細胞，且將T細胞在37℃，5% CO2 下培育隔夜以活化T細胞。將活化T細胞自戴諾珠粒洗滌且以2.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於T細胞培養基中。經由與稀釋於PBS中之2.5 µg/ml抗人類CD3抗體(R&D Systems純系UHCT1)在37℃，5% CO2 下一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗人類CD3抗體塗佈。將活化T細胞以2×105 個細胞/孔添加至培養盤中。在DPBS (Gibco)中製備假擬(4420 LALA) mAb2 分子、陽性對照11D4 mAb (在人類IgG1主鏈中且包含LALA突變)及陰性對照4420 mAb (在人類IgG1主鏈中且包含LALA突變)之2 µM稀釋液，且將稀釋液進一步1:10稀釋於T細胞培養基中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。將用於經Fc交聯陽性對照mAb之抗人類CH2 mAb純系MK1A6，或用於經由Fab結合交聯呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式(參見表 8 )之Fcab的FITC-葡聚糖(Sigma)以與假擬mAb2 或陽性對照mAb 1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備(1)陽性對照或假擬mAb2 或(2)各自具有相關交聯劑之陽性對照或假擬mAb2 的連續稀釋液。將100 µl稀釋假擬mAb2 /陽性對照mAb，或稀釋假擬mAb2 或陽性對照mAb及交聯劑添加至培養盤上之活化T細胞中。
在37℃，5% CO2 下培育T細胞72小時。收集上清液，且使用人類IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D systems)遵循製造商說明書量測IL-2釋放。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於假擬mAb2 陽性對照mAb之對數濃度，繪製人類IL-2 (hIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。表 8 展示在存在或不存在交聯之情況下測試之假擬mAb2 及陽性對照mAb存在下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 2 展示對於來自譜系(譜系FS20-11、FS20-22及FS20-31)中之每一者的代表性純系，T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。表 8 ： 使用呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab進行的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0009
 * 在不存在交聯之情況下，此等假擬mAb2 /對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
如表 8 中所示，在由Fab目標(FITC-葡聚糖)交聯時，呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗人類OX40 Fcab在T細胞活化分析中展示一系列活性。所有Fcab能夠在存在抗CD3抗體之情況下共刺激T細胞，且誘導人類IL2之產生。
FS20-11譜系Fcab僅能夠在交聯時共刺激T細胞，且在不存在交聯之情況下不具有活性。僅在交聯時存在之此活性意謂當向患者投與時，預期此等Fcab僅在存在Fab目標或其他交聯手段之情況下活化T細胞。與此譜系中之其他純系相比，FS20-11-131具有較低EC50 。然而，由於存在FS20-11譜系之純系對食蟹獼猴OX40之低交叉反應性，因此將需要對與食蟹獼猴OX40之親和性的進一步改良，以便在此物種中進行毒理學研究。
在存在及不存在交聯之情況下，來自FS20-22及FS20-31譜系之Fcab均展示活性。具體而言，在不存在交聯劑之情況下，來自此等譜系之Fcab具有活性，該活性在交聯後得到提高。由於此等Fcab具有與食蟹獼猴OX40之高交叉反應性(與結合人類OX40相當)，因此在此物種中，毒理學研究將為可能的。在FS20-22譜系中之純系中，純系FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49及FS20-22-85在交聯時對其促效活性具有最低EC50 值，且因此為來自此譜系之較佳純系。此等中，純系FS20-22-49展示在交聯後促效活性的最高提高，且在存在交聯之情況下對其促效活性亦具有最低EC50 ，且因此為較佳純系。在FS20-31譜系中之純系中，純系FS20-31-108、FS20-31-108及FS20-31-115展示最大的最大反應，同時亦展示低EC50 值及因此良好效力。
未預期FS20-22及FS20-31譜系中之純系在不存在交聯之情況下展示一定的有限T細胞活化的事實帶來安全性風險，因為靶向OX40之分子在臨床上未展示不良影響。相反，認為此等純系在不存在交聯之情況下的有限T細胞活化活性可為有益的，因為此等純系可能能夠在不存在交聯之情況下活化表現OX40之記憶T細胞，藉此誘導記憶T細胞增殖且由此產生較大T細胞群，該細胞群接著可經由由交聯抗OX40 Fcab之結合驅動的OX40聚集進一步活化。5.2 使用呈假擬 mAb2 格式之抗小鼠 OX40 Fcab 進行的小鼠 T 細胞活化分析
為了評定結合小鼠OX40之Fcab的活性，使用T細胞活化分析以評定在存在以下表 9 中所詳述之假擬(4420 LALA) mAb2 及mAb分子之情況下，小鼠OX40之聚集及信號傳遞。如在人類分析中，藉由量測IL-2之釋放偵測T細胞活化。5.2.1 分離及活化小鼠 T 細胞
為分離T細胞，自4至8週齡雌性Balb/C小鼠(Charles River)收集脾臟。將小鼠人道地安樂死且藉由剝離分離脾臟。藉由使用5 ml塑膠注射器之內部將脾臟推動通過70 µm細胞過濾器(Corning)分離脾細胞。將細胞過濾器用1 ml杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate-buffered saline；DPBS) (Gibco)洗滌10次，且在50 ml管中收集溶析液。經由添加10 ml紅細胞溶解緩衝液(eBioscience)，根據製造商說明書，溶解溶析液中存在的紅細胞。使用泛T細胞分離套組II (Miltenyi Biotec Ltd)，根據製造商說明書，自存在於溶析液中之脾細胞分離T細胞。
藉由渦流再懸浮小鼠T活化子CD3/CD28戴諾珠粒(Life technologies, 11452D)。將珠粒用T細胞培養基(含10% FBS (Life Technologies)、1×青黴素鏈黴素(Life Technologies)、丙酮酸鈉(Gibco)、10 mM Hepes (Gibco)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)及50 µM 2-巰基乙醇(Gibco)之RPMI培養基(Life Technologies))洗滌二次。
在T-25燒瓶(Sigma)中以2:1細胞比珠粒比率用經洗滌小鼠T活化子CD3/CD28戴諾珠粒刺激T細胞培養基中濃度為1.0×106 個細胞/毫升之所需量的T細胞，且將T細胞在37℃，5% CO2 下培育隔夜以活化T細胞。
在隔夜培育後，將活化T細胞自戴諾珠粒洗滌且以2.0×106 個細胞/毫升之濃度再懸浮於T細胞培養基中。經由與稀釋於PBS中之2.5 µg/ml抗小鼠CD3抗體(Biolegend純系145-2C11)在37℃，5% CO2 下一起培育2小時，且隨後用PBS洗滌二次，將96孔平底培養盤用抗小鼠CD3抗體塗佈。將活化T細胞以2×105 個細胞/孔添加至培養盤中。在DPBS (Gibco)中製備假擬(4420 LALA) mAb2 及陽性對照抗小鼠OX40 OX86 mAb (在人類IgG1主鏈中，具有LALA突變；SEQ ID NO 175及176) (詳見表 9 )之2 µM稀釋液，且將稀釋液進一步1:10稀釋於T細胞培養基中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。將用於經OX86陽性對照mAb之Fc交聯的抗人類CH2 mAb純系MK1A6，或用於經由呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之Fcab之Fab結合交聯的FITC-葡聚糖(Sigma)以與假擬mAb2 或陽性對照mAb 1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備(1)陽性對照或假擬mAb2 或(2)各自具有相關交聯劑之陽性對照或假擬mAb2 的連續稀釋液。將100 µl稀釋假擬(4420 LALA) mAb2 /對照mAb，或假擬(4420 LALA) mAb2 或陽性對照mAb及交聯抗體之混合物添加至培養盤上之活化T細胞中。
在37℃，5% CO2 下培育T細胞72小時。收集上清液，且使用小鼠IL-2 ELISA套組(eBioscience或R&D systems)遵循製造商說明書量測IL-2釋放。使用盤讀取器用Gen5軟體，BioTek在450 nm下讀取培養盤。自450 nm之吸光值減去630 nm之吸光值(校正)。細胞介素濃度計算之標準曲線基於四參數邏輯曲線擬合(Gen5軟體，BioTek)。相對於假擬mAb2 或陽性對照mAb之對數濃度，繪製小鼠IL-2 (mIL-2)之濃度，且使用GraphPad Prism中之log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。表 9 展示在存在所測試之假擬mAb2 及陽性對照mAb之情況下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。表 9 ： 使用呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab進行的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0010
 * 在不存在交聯之情況下，假擬mAb2 /對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
如表 9 中所示，在T細胞活化分析中，在由Fab目標(FITC-葡聚糖)交聯時之呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab的活性與在人類IgG1主鏈中且由抗人類CH2 mAb純系MK1A6交聯時之陽性對照抗小鼠OX40 mAb OX86的活性相當。在不存在交聯之情況下，針對呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab或抗小鼠OX40 mAb陽性對照抗體未觀測到T細胞活化。此等結果展示抗小鼠OX40 Fcab具有與陽性對照抗小鼠OX40 mAb類似之促效活性，且展現Fcab格式在交聯時可介導OX40之聚集及活化。抗小鼠OX40 Fcab之活性類似於抗人類OX40 Fcab之FS20-11譜系的活性，亦觀測到該譜系僅在交聯時具有活性。展示Fcab之FS20-22及FS20-31譜系在不存在交聯之情況下具有促效活性，該促效活性在存在交聯之情況下進一步增強。如上所解釋，預期此等Fcab在不存在交聯之情況下的背景促效活性使得此等Fcab與不展示此類背景促效活性之Fcab相比，在臨床上更強效。來自FS20-22及FS20-31譜系之抗人類OX40 Fcab的臨床活性可因此大於在抗小鼠OX40 Fcab之情況下所觀測到的活體內活性。5.3 呈假擬 mAb2 格式之抗小鼠 OX40 Fcab 的活體內抗腫瘤功效
使用CT26同基因型腫瘤模型以測試呈假擬mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91之活體內抗腫瘤活性。先前已展示CT26同基因型腫瘤模型對OX40促效劑抗體敏感(Sadun等人, 2008)，且預期自CT26腫瘤分離之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)表現OX40。
如使用T細胞活化分析所示，抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91及抗人類OX40 Fcab為T細胞活化之強效促效劑。在不存在交聯之情況下，針對呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab未觀測到T細胞活化(參見實例 5 . 2 )。由於FS20-11譜系僅在交聯時具有T細胞活性，如FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab，因此預期來自用FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab進行之活體內研究之結果預測來自此FS20-11譜系之抗人類OX40 Fcab在人類患者中的臨床功效(參見實例 5 . 1 )。來自FS20-22及FS20-31譜系之抗人類OX40 Fcab在不存在交聯之情況下展示OX40促效活性(參見實例 5 . 1 )。如實例 5 . 2 . 1 中所解釋，預期來自FS20-22及FS20-31譜系之Fcab與在不存在交聯之情況下不具有OX40促效活性之Fcab相比，將展示較高臨床功效。來自FS20-22及FS20-31譜系之抗人類OX40 Fcab的臨床功效可因此大於在FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab之情況下所觀測到的活體內結果。
將呈假擬(HEL D1.3) mAb2 格式，具有或不具有LALA突變之FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab抑制腫瘤生長的能力與陽性對照抗小鼠OX40 mAb (人類IgG1主鏈中之OX86)及陰性對照抗FITC抗體(人類IgG1主鏈中之4420)進行比較。
在研究起始之前，使各8至10週齡且重量大約20 g之BALB/c雌性小鼠(Charles River)休息一週。將所有動物植入微晶片且給定唯一識別符。各群組具有12隻小鼠。CT26結腸癌細胞株(ATCC，CRL-2638)經初始擴增、儲存，且隨後針對病原體由IDEXX Bioresearch使用IMPACT I方案預篩選且展示為不含病原體。將CT26細胞(大約3-5×106 )自-150℃解凍，且添加至T175組織培養燒瓶中含10% FCS (Gibco，10270-106)之20 ml DMEM (Gibco，61965-026)中。使用異氟醚(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，且各動物在左側腹接受1×106 個細胞皮下注射。在腫瘤細胞接種之後第10天，監測小鼠之健康及腫瘤生長，且將小鼠分選且隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
在注射之前24小時內，將假擬(HEL D1.3) mAb2 分子及對照mAb藉由SEC-HPLC譜分析且檢查雜質。將假擬(HEL D1.3) mAb2 及mAb在PBS中製備成0.1 mg/ml之最終濃度，且在腫瘤接種之後第10、12及14天每小鼠腹膜內(IP)注射200 μl之體積，對20 g小鼠給予1 mg/kg之最終劑量。動物在麻醉下一週三次以不知情方式進行健康篩選，在該時間中，取得腫瘤之準確量測值。用卡尺取得腫瘤體積量測值，以確定腫瘤之最長軸及最短軸。使用下式計算腫瘤體積： L × (S2 ) / 2 (其中L=最長軸；S=最短軸)
當腫瘤負擔視為接近限制時，在第22天停止試驗，且將所有小鼠人道地處死。結果展示於圖 3 中。使用GraphPad Prism套裝軟體內之雙尾史都登氏t檢定(Student's t-test)進行終點腫瘤體積的統計分析。
在抑制腫瘤生長方面，陽性對照抗小鼠OX40 mAb (G1/OX86)與陰性對照抗FITC對照抗體(正常生長)之間存在證明的統計顯著差異。在抑制腫瘤生長方面，假擬(HEL D1.3) mAb2 與具有LALA突變之假擬(HEL D1.3) mAb2 之間亦存在證明的統計顯著差異。
CT26腫瘤模型為侵襲性、快速生長腫瘤模型，其固有地傾於使小鼠罹患腸癌轉移，且因此具有極有限治療窗。引起腫瘤生長之抑制的此腫瘤模型中之腫瘤浸潤T細胞上表現之OX40的聚集及活化由呈假擬mAb2 格式之FS20m-232-91 Fcab及G1/OX86陽性對照的Fcγ介導之交聯驅動，該等抗體均不含有LALA突變。然而，如在含LALA突變之呈假擬mAb2 格式之FS20m-232-91AA的情況下所見，在存在很少或不存在Fcab之Fcγ介導之交聯且因此不存在OX40之聚集及活化時，未觀測到對腫瘤生長之抑制。可因此由此推斷出抗小鼠OX40 Fcab僅在交聯時具有引起腫瘤生長減少的活性。
基於此等結果，預期抗人類OX40 Fcab在交聯時將類似地能夠在人類患者中抑制包含表現OX40之腫瘤浸潤T細胞之腫瘤的生長。 實例6-經由細胞表面受體結合引起之mAb2 交聯
活化T細胞在其細胞表面上表現OX40。三聚OX40配位體與OX40之結合引起受體之三聚合作用。由於OX40配位體在抗原呈現細胞之細胞表面上以團簇形式表現，因此OX40配位體與OX40與之間的相互作用引起OX40聚集，已知該聚集為OX40信號傳遞及進一步T細胞活化所必需的。對OX40產生促效作用之抗體必須模擬OX40配位體之此聚集活性。在單特異性抗OX40抗體情況下，Fcγ受體結合至抗體之Fc域，且與其交聯，引起OX40聚集。雙特異性抗體可經其第二抗原結合位點結合至第二細胞表面表現之受體，引起抗體交聯及OX40聚集。雙特異性抗體所結合之第二細胞表面表現之受體可為腫瘤相關抗原(TAA)。此具有以下優點：雙特異性抗體在腫瘤位點處交聯，引起腫瘤位點處之OX40聚集及T細胞活化。使用雙特異性抗體由此具有引起免疫系統之腫瘤局部化活化及隨之而來的消除或控制腫瘤之潛力。
由此在如下文所描述之T細胞活化分析中使用在表面處表現TAA之腫瘤細胞，以評定由包含本發明之抗OX40 Fcab及可變區中之TAA抗原結合位點的mAb2 結合TAA是否可引起mAb2 交聯且因此誘導OX40之聚集及信號傳遞。6.1 使用包含與抗 EGFR 、抗 EphA2 、抗 CEACAM5 或抗 EpCAM Fab 配對之抗人類 OX40 Fcab 之 mAb2 進行的人類 T 細胞活化分析
如實例 4 . 1 中所描述，製備具有LALA突變之以下表 10 及表 11 中所列舉之抗體分子，以便在T細胞活化分析中進行測試。使用抗FITC抗體4420 (SEQ ID NO 167、168及156)、抗EGFR抗體西妥昔單抗(美國專利第6217866號；由『Cx』指示)、EphA2抗體E2A (WO 2004/014292 A2)、EpCAM抗體MOC31 (美國專利第8637017號)、OX40抗體11D4 (EP 2 242 771 B1)或抗CEACAM5抗體CEA (US 8,771,690 B2，純系hMN15)之可變區，以與實例 4 . 1 中所描述之假擬mAb2 的相同方式構築抗體分子。在此等分析中，經由可變區結合位點與TAA之結合，腫瘤細胞充當mAb2 之交聯劑，mAb2 包含抗人類OX40 Fcab及對TAA具有特異性之可變區(在表 10 中之抗人類OX40 Fcab FS20-22-49AA情況下，EGFR、EphA2、CEACAM5或EpCAM，且在表 11 中之抗人類OX40 Fcab FS20-11-131AA情況下，EphA2或CEACAM5)。藉由IL-2之釋放測定T細胞活化。表 10 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0011
 表 11 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0012
如上文實例 5 . 1 . 1 中所描述分離且活化T細胞。
在含10% FBS (Life Technologies)之DMEM培養基(Life Technologies)中維持HPAC細胞(ATCC，CRL-2119)，其在其細胞表面上表現EGFR、EpCAM、EphrinA2及CEACAM5。將HPAC細胞在T細胞培養基中洗滌一次，且在需要時以2.5×104 個細胞/孔添加至培養盤中。
在DPBS (Gibco)中製備各測試mAb/mAb2 (詳見表 10 及表 11 )之2 µM稀釋液，且將稀釋液進一步1:10稀釋於T細胞培養基中(30 µl + 270 µl)，獲得200 nM稀釋液。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITC-葡聚糖(Sigma)；參見表 10 及表 11 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備測試mAb/mAb2 之連續稀釋液，且將100 µl稀釋mAb/mAb2 混合物添加至培養盤上之活化T細胞及HPAC細胞中。
如實例 5 . 1 . 1 中所描述培育T細胞且收集上清液。如實例 5 . 1 . 1 中所描述，讀取培養盤，相對於測試mAb/mAb2 之對數濃度，繪製人類IL-2 (hIL-2)之濃度，且使用log (促效劑)對反應方程擬合所得曲線。
表 12 展示在存在或不存在由交聯劑或HPAC細胞交聯之情況下，由表 10 中所列舉之mAb/mAb2 引起之T細胞活化(EC50 值及最大IL-2釋放)。圖 4 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。表 12 ： 在存在HPAC腫瘤細胞之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0013
 * 在不存在交聯之情況下，此對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
圖4 展示在OX40由交聯抗OX40 mAb/mAb2 結合時，存在T細胞活化之提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1AA/4420之情況下未觀測到T細胞活化，該抗體充當陰性對照。在存在HPAC細胞之情況下，靶向OX40之mAb G1/11D4在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。如之前所見，呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在不存在交聯之情況下具有促效活性，且此活性在存在結合至假擬mAb2 之Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖的情況下增強。在靶向OX40之Fcab與抗TAA Fab (對於EGFR，西妥昔單抗；對於EphrinA2，E2A；對於EpCAM，MOC31；及對於CEACAM5，CEA)配對時，與呈假擬mAb2 格式之Fcab相比，所得mAb2 之促效活性提高，表明TAA Fab與HPAC細胞上細胞表面表現之TAA的結合引起mAb2 之交聯及因此OX40聚集及活化。
表 13 展示在存在或不存在由交聯劑或HPAC細胞交聯之情況下，由表 11 中所列舉之mAb/mAb2 引起之T細胞活化(EC50 值及最大IL-2釋放)。圖 5 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。表 13 ： 在存在HPAC腫瘤細胞之情況下的T細胞活化分析
Figure 108124735-A0304-0014
 * 在不存在交聯之情況下，此對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
圖5 所繪製之資料展示在OX40由交聯抗OX40 mAb/mAb2 結合時，存在T細胞活化之提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下未觀測到T細胞活化，該抗體充當陰性對照。在存在HPAC細胞之情況下，靶向OX40之mAb抗體G1/11D4在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。如之前所見，呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-11-131AA/4420在不存在交聯之情況下不具有促效活性，且僅在存在結合至假擬mAb2 之Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖的情況下顯示促效活性。在存在表現TAA之HPAC細胞之情況下，在靶向OX40之Fcab與抗TAA Fab (對於EphrinA2，E2A，或對於CEACAM5，CEA)配對時，與呈假擬mAb2 格式之Fcab相比，所得mAb2 之促效活性提高，表明TAA Fab與HPAC細胞上細胞表面表現之TAA的結合引起mAb2 之交聯及因此OX40聚集及活化。
在抗OX40/抗EGFR、抗OX40/抗CEACAM5、抗OX40/抗EphA2或抗OX40/抗EpCAM mAb2 抗體之情況下所觀測到的T細胞活化證明多於一種類型之細胞表面受體可與抗OX40 Fcab配對。6.2 使用包含與抗 EphA2 Fab 配對之抗小鼠 OX40 Fcab 之 mAb2 進行的小鼠 T 細胞活化分析
使用此T細胞活化分析以評定在存在以下表 14 中所列舉之測試mAb/mAb2 之情況下的OX40之聚集及信號傳遞。如實例 4 . 1 中所描述，製備具有LALA突變之mAb2 。經由Fab結合至EphA2，分析中所使用之腫瘤細胞充當靶向TAA EphA2之陽性對照mAb及mAb2 的交聯劑。表 14 ： 所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0015
如實例 5 . 2 . 1 中所描述分離且活化小鼠T細胞，且在基本上相同於實例 6 .1 中所描述之使用HPAC細胞之人類T細胞活化分析中使用，但該方案利用如上文及下文所描述之不同交聯劑及對照抗體，且評定IL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類Fc (a-hFc)，Jackson Immunoresearch；或FITC-葡聚糖，Sigma)與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。在96孔培養盤中，製備mAb/mAb2 或mAb/mAb2 及交聯抗體混合物之六個五倍連續稀釋液(60 μl + 240 μl T細胞培養基)。將100 µl稀釋mAb/mAb2 或mAb/mAb2 及交聯抗體混合物添加至培養盤上之活化T細胞中。
表 15 展示在存在或不存在由交聯劑或HPAC細胞交聯之情況下，由表 14 中所列舉之mAb/mAb2 引起之T細胞活化(EC50 值及最大IL-2釋放)。圖 6 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。表 15 ： 在存在HPAC腫瘤細胞之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0016
 * 此等mAb/mAb2 在T細胞活化分析中不展示任何活性。
圖6 展示在存在各種mAb/mAb2 之情況下，含有表現EphA2之HPAC細胞之T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，六種不同mAb/mAb2 或其組合以逐漸提高之濃度測試，視需要根據其人類IgG同型/Fab純系或Fcab/Fab純系名稱(G1/4420、G1/E2A、G1/OX86、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420 + G1/E2A及FS20m-232-91AA/E2A)標記。展示於圖 6A 中結果證明在存在表現EphA2之HPAC細胞之情況下，存在由FS20m-232-91AA/E2A mAb2 抗體引起之T細胞活化的提高。此證明交聯為靶向OX40之抗體提高T細胞活化所需的，且FS20m-232-91AA/E2A mAb2 抗體為可僅藉由HPAC (EphA2+)細胞之存在交聯且不需要任何額外非生理交聯劑的唯一分子。圖 6B 展示在靶向OX40且抗OX40 mAb/mAb2 交聯時，存在T細胞活化之提高。此等結果證明交聯為靶向OX40之mAb/mAb2 提高T細胞活化所需的。
在存在表現EphA2之HPAC細胞之情況下，在抗小鼠OX40/抗EphA2 mAb2 (FS20m-232-91AA/E2A)之情況下所觀測到之T細胞活化證明在由具有針對EphA2及OX40二者之結合位點的mAb2 靶向時，此受體亦可介導OX40之交聯。6.3 抗 mOX40 / 抗 EphA2 mAb2 活體內抑制腫瘤生長
在此實驗中使用CT26同基因型腫瘤模型，因為CT26細胞表現EphA2，且自CT26腫瘤分離之TIL包括表現OX40之T細胞。在CT26同基因型小鼠腫瘤生長模型測試實例 6 . 2 中所描述之抗mOX40/抗EphA2 mAb2 抗體(FS20m-232-91AA/E2A)之活體內活性。
將抗mOX40/抗EphA2 mAb2 抑制腫瘤生長之能力與作為對照之呈假擬mAb2 格式之抗OX40 Fcab (FS20m-232-91AA/4420)、呈假擬mAb2 格式之抗OX40 Fcab (FS20m-232-91AA/4420)與抗EphA2 mAb (G1/E2A)之組合，及抗FITC mAb (G1/4420)的能力進行比較。
如實例 5 中所描述，將BALB/c雌性小鼠用CT26細胞注射，監測健康及腫瘤生長，分選且隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
如實例 5 中所描述，將mAb2 /mAb進行譜分析，檢查雜質，製備且投與小鼠。如實例 5 中所描述，將動物進行健康篩選，取得腫瘤量測值且計算腫瘤體積。
當腫瘤負擔視為接近限制時，在第20天停止試驗，且將所有小鼠人道地處死。結果展示於圖 7 中。使用GraphPad Prism套裝軟體內之雙尾史都登氏t檢定進行終點腫瘤體積的統計分析。
在抑制腫瘤生長方面，抗OX40/抗EphA2 mAb2 (FS20m-232-91AA/E2A)與抗FITC mAb (G1/4420)對照(正常生長)之間存在證明的統計顯著差異。在FS20m-232-91AA/4420與G1/E2A之組合或FS20m-232-91AA/4420及G1/4420對照組之情況下，未觀測到此類統計顯著差異。
出人意料地，與IgG1對照(G1/4420)群組相比，靶向OX40及EphA2之抗體的組合不顯著抑制腫瘤生長。然而，與IgG1對照相比，經抗mOX40/抗EphA2 mAb2 (FS20m-232-91AA/E2A)處理之群組確實顯示對生長的顯著抑制。此試驗展示，類似於所觀測到的活體外結果，由靶向腫瘤細胞上表現之EphA2及腫瘤浸潤T細胞上表現之OX40的mAb2 交聯OX40引起T細胞活化及後續腫瘤生長控制，超過在對照之情況下所觀測到的T細胞活化及後續腫瘤生長控制。
圖 7 展示在經G1/4420、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420 + G1/E2A及FS20m-232-91AA/E2A處理之Balb/c小鼠群組中，CT26同基因型模型的腫瘤生長曲線。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值，且使用雙尾t檢定在不同組中比較最後一天時之腫瘤體積。相比於經對照抗體(G1/4420)處理之組，經抗mOX40/抗EphA2 mAb2 抗體(FS20m-232-91AA/E2A)處理之組展示統計顯著腫瘤體積減少。此結果證明與FS20m-232-91AA/4420及G1/E2A之組合相比，抗mOX40/抗EphA2 mAb2 抗體具有針對表現EphA2之腫瘤的較好活體內抗腫瘤功效，表明由抗mOX40/抗EphA2 mAb2 介導之OX40及EphA2之雙特異性接合引起的OX40活體內交聯有效控制腫瘤生長。 實例7-經由結合至可溶因子引起之mAb2 交聯
血管內皮生長因子(VEGF)為可溶性均二聚分子，其回應於低氧症表現且結合至內皮細胞上之受體，引起新血管形成(一種被稱為血管生成之過程)。腫瘤微環境(TME)低氧，且具有提高的VEGF位準，使得腫瘤細胞供應有對其生長而言足夠的營養素。使用單株抗體靶向VEGF為一種已確立之形式的抗腫瘤療法。由於細胞表面表現之TAA能夠介導靶向OX40之mAb2 的交聯，因此亦測試使用可溶性VEGF交聯靶向OX40及VEGF之mAb2 。7.1 使用包含抗人類 OX40 Fcab 及抗 VEGF Fab 之 mAb2 進行的人類 T 細胞活化分析
在存在或不存在額外VEGF之情況下，使用T細胞活化分析以評定在存在以下表 16 中所列之抗體之情況下的OX40之聚集及信號傳遞。如實例 4 . 1 中所描述，製備具有LALA突變之OX40/VEGF mAb2 及OX40/FITC假擬mAb2 。在此分析中，VEGF作為OX40/VEGF mAb2 之交聯劑起作用，該mAb2 使用靶向OX40之Fcab FS20-22-49AA及抗VEGF抗體貝伐單抗(bevacizumab) (EP1325932B9純系A4.6.1；在表 16 及表 17 中由『Bev』指示)之可變區構築。表 16 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0017
如上文實例 5 . 1 . 1 中所描述分離且活化T細胞，且使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2 及以下交聯劑(例如可溶性VEGF替代HPAC細胞)，在基本上相同於實例 6 .1 中所描述之人類T細胞活化分析之方案中使用該等T細胞。如先前所描述測定hIL-2產生。在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6，FITCdex (Sigma)或VEGF (Peprotech，目錄號100-20)；參見表 16 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。
表 17 展示存在或不存在利用交聯劑之交聯的情況下，由表 16 中所列舉之mAb/mAb2 引起的T細胞活化(EC50 值及最大IL-2釋放)。圖8展示T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。表 17 ： 在存在VEGF之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0018
 * 在不存在交聯之情況下，此對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
圖8 展示在OX40被靶向且抗OX40 mAb/mAb2 交聯時，存在T細胞活化的提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下未觀測到T細胞活化。在由抗人類CH2抗體交聯時，靶向OX40之mAb G1/11D4誘導T細胞活化。呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在存在結合至假擬mAb2 之Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖之情況下，具有促效活性。在靶向OX40之Fcab與抗VEGF Fab貝伐單抗配對時，mAb2 抗體在不存在交聯之情況下具有一定的促效活性，該活性可能為在抗OX40 Fcab FS20-22-49之情況下所觀測到之在不存在交聯之情況下之促效活性的產物。在VEGF添加至OX40/貝伐單抗mAb2 抗體時，如藉由EC50 之大約100倍降低所證明，促效活性提高，表明抗VEGF Fab能夠在存在VEGF之情況下交聯mAb2 。
在抗hOX40/抗VEGF mAb2 之情況下所觀測到之T細胞活化證明可溶因子可用作交聯劑。7.2 使用包含抗小鼠 OX40 Fcab 及抗 VEGF Fab 之 mAb2 進行的小鼠 T 細胞活化分析
使用T細胞活化分析以評定在存在以下表 18 中所列之mAb/mAb2 之情況下的OX40之聚集及信號傳遞。將抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91與抗VEGF mAb R84 (專利公開案第US 2009/0175791 A1號)之Fab區配對，且所有mAb2 如實例 4 . 1 中所描述製備，其具有LALA突變。在此分析中，VEGF作為用於結合至小鼠OX40及VEGF之mAb2 的交聯劑起作用。表 18 ： 所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0019
如實例 5 . 2 . 1 中所描述分離且活化小鼠T細胞，且在基本上相同於實例 7 .1 中之方案中使用，但該方案使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2及如下文所描述之交聯劑。如先前所描述測定mIL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6，FITCdex，(Sigma)或VEGF (Peprotech，目錄號100-20)；參見表 18 )以與測試抗體1:1莫耳比添加至孔中。
表 19 展示在存在所測試之mAb2 及mAb之情況下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 9 展示T細胞活化分析之IL2的代表性曲線。
表 19 ： 在存在VEGF之情況下的T細胞活化。
Figure 108124735-A0304-0020
 * 在不存在交聯之情況下，此對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性。
圖9 展示，在存在靶向OX40及VEGF可溶性因子之mAb2 時，而非在存在靶向OX40之其他mAb2 但不交聯時，在存在VEGF之情況下存在T細胞活化的提高。此表明mAb2 藉由結合至OX40及VEGF交聯。圖 9 展示，在存在非生理交聯劑(抗Fc抗體或FITC-葡聚糖)之情況下，靶向OX40之mAb/mAb2 活化T細胞。如所預期，在存在交聯劑之情況下，抗VEGF及抗FITC對照抗體不誘導T細胞活化。在由抗Fc抗體交聯時，抗小鼠OX40抗體(G1/OX86交聯)誘導一定的T細胞活化(參見表 19 )。在由FITC-葡聚糖交聯時，在與mAb2 中之抗FITC Fab配對時的抗OX40 Fcab (FS20m-232-91AA/4420交聯)活化T細胞，與OX40抗體G1/OX86相比，其具有較低EC50 及較高最大反應。在不存在額外交聯劑之情況下，在與mAb2 中之抗VEGF Fab配對時的相同抗OX40 Fcab (FS20m-232-91AA/R84)活化T細胞，其可能歸因於由活化T細胞產生VEGF。如藉由與在不存在額外VEGF之情況下抗OX40/抗VEGF mAb2 抗體相比，較低EC50 及相當的最大反應，觀測到添加VEGF提高由抗OX40/抗VEGF mAb2 (FS20m-232-91AA/R84)引起的T細胞活化。
在存在VEGF之情況下，在抗mOX40/抗VEGF mAb2 之情況下所觀測到的T細胞活化證明可溶因子亦可介導OX40之交聯，諸如在可溶因子由結合至VEGF及OX40的mAb2 靶向時。7.3 抗 mOX40 / 抗 VEGF mAb2 活體內抑制腫瘤生長
在CT26同基因型小鼠腫瘤生長模型中，測試實例 7 . 2 中所描述之抗mOX40/抗VEGF mAb2 抗體(FS20m-232-91AA/R84)之活體內活性。
在此實驗中使用CT26同基因型腫瘤模型，因為已描述CT26腫瘤具有提高濃度之VEGF (Voron等人, 2015)，且自CT26腫瘤分離之TIL包括表現OX40之T細胞。
將抗mOX40/抗VEGF mAb2 抑制腫瘤生長之能力與作為對照之mAb G1/4420、FS20m-232-91AA/4420與mAb G1/R84之組合及mAb G1/R84的能力進行比較。
如實例 5 中所描述，將BALB/c雌性小鼠用CT26細胞注射，監測健康及腫瘤生長，分選且隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
如實例 5 中所描述，將mAb2 /mAb進行譜分析，檢查雜質，製備且投與小鼠。如實例 5 中所描述，將動物進行健康篩選，取得腫瘤量測值且計算腫瘤體積。當腫瘤負擔視為接近限制時，在第24天停止試驗，且將所有小鼠人道地處死。結果展示於圖 10 中。使用GraphPad Prism套裝軟體內之雙尾史都登氏t檢定進行終點腫瘤體積的統計分析。
在抑制腫瘤生長方面，抗OX40/抗VEGF mAb2 (FS20m-232-91AA/R84)與抗FITC mAb G1/4420對照(正常生長)之間存在證明的統計顯著差異。在FS20m-232-91AA/4420及無FS20m-232-91AA/R84對照之組合或抗VEGF mAb G1/R84對照之情況下，相對於G1/4420對照未觀測到此類統計顯著差異。
CT26腫瘤模型為侵襲性、快速生長腫瘤模型。出人意料地，與IgG1對照(G1/4420)群組相比，靶向OX40及VEGF之抗體之組合不顯著抑制腫瘤生長。然而，與IgG1對照相比，經抗mOX40/VEGF mAb2 (FS20m-232-91AA/R84)處理之群組確實顯示對生長之顯著抑制。此試驗展示，類似於所觀測到的活體外結果，藉由靶向由腫瘤細胞過度表現或在腫瘤微環境內或腫瘤微環境處的VEGF，及腫瘤浸潤T細胞上表現之OX40的mAb2 交聯OX40引起T細胞活化及後續腫瘤生長控制，超過在對照之情況下所觀測到的T細胞活化及後續腫瘤生長控制。 實例8-經由結合至共表現受體引起之mAb2 交聯
腫瘤浸潤T細胞上之OX40表現可能伴有其他受體，共刺激受體及免疫檢查點受體二者之表現。使用此等共表現受體作為含OX40-Fcab之mAb2 中的Fab目標亦可用於交聯mAb2，引起OX40之聚集，以及Fab目標，引起二種受體之活化。為了測試此概念，進行以下T細胞活化分析。8.1 使用包含與抗 ICOS 、抗 CD27 或抗 GITR Fab 配對之抗人類 OX40 Fcab 之 mAb2 進行的人類 T 細胞活化分析
在此分析中，利用人類OX40及共刺激分子ICOS、CD27及GITR之共表現，以確定以下表 20 中所列舉之mAb/mAb2 的交聯。使用抗FITC抗體4420 (SEQ ID NO 167、168及156)、抗OX40抗體11D4 (EP 2 242 771 B1)、抗ICOS抗體ICOSj (US 2016/0304610 A1)、抗CD27抗體695 (US 2013/0243795 A1)或抗GITR抗體6C8 (US 7,812,135 B2)之可變區，以與實例 4 . 1 中所描述之相同方式製備具有LALA突變的mAb2 。表 20 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0021
如上文實例 5 . 1 . 1 中所描述分離且活化T細胞，且在基本上相同於實例 6 .1 中所描述之人類T細胞活化分析的方案中使用，該方案使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2及以下交聯劑。如先前所描述測定人類IL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITC-葡聚糖(Sigma)；參見表 20 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。
表 21 展示在存在或不存在利用交聯劑之交聯之情況下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 11 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。表 21 ： 在存在共表現受體之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0022
 * 在不存在交聯之情況下，此等對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性
圖11 展示在OX40被靶向且抗OX40抗體交聯時，存在T細胞活化的提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在交聯抗ICOS、抗CD27或抗GITR抗體(分別G1AA/ICOSj、G1AA/695或G1AA/6C8)之情況下，未觀測到T細胞活化。如之前所見，靶向OX40之mAb G1/11D4在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。如之前所見，呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在不存在交聯之情況下具有促效活性，且此活性在添加結合至Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖的情況下增強。在靶向OX40之Fcab與抗ICOS、抗CD27或抗GITR Fab (分別ICOSj、695或6C8)配對時，Fcab之促效活性得到提高，表明mAb2 藉由結合至T細胞表面上之共表現受體而交聯。
在抗OX40/抗ICOS、抗OX40/抗CD27及抗OX40/抗GITR mAb2 抗體之情況下所觀測到之T細胞活化證明與人類OX40在T細胞表面上共表現之受體可用作交聯劑。8.2 使用包含抗人類 OX40 Fcab 及抗 PD1 Fab 之 mAb2 進行的人類 T 細胞活化分析
在此分析中，利用人類OX40及PD1之共表現，以確定以下表 22 中所列舉之mAb/mAb2 的交聯。使用抗FITC抗體4420(SEQ ID NO 167及156)、抗PD1抗體5C4 (US 8,008,449 B2或抗OX40抗體11D4 (EP 2 242 771B1)之可變區，以與實例 4 . 1 中所描述之相同方式製備具有LALA突變的mAb2 。表 22 ： 所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0023
如上文實例 5 . 1 . 1 中所描述分離且活化T細胞，且在基本上相同於實例 8 .1 中之方案中使用，但該方案使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2及如下文所描述之交聯劑。如先前所描述測定hIL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITCdex (Sigma)；參見表 22 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。
表 23 展示在存在或不存在利用交聯劑之交聯之情況下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 12 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的曲線。表 23 ： 利用靶向共表現受體之mAb2 進行的T細胞活化分析
Figure 108124735-A0304-0024
 * 在不存在交聯之情況下，此等對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性
圖12 展示在OX40被靶向且抗OX40抗體交聯時，存在T細胞活化的提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在交聯抗PD1抗體G1AA/5C4之情況下，未觀測到T細胞活化。如之前所見，靶向OX40之mAb G1/11D4在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。如之前所見，呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在不存在交聯之情況下具有促效活性，且此活性在添加結合至mAb2 之Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖的情況下增強。在靶向OX40之Fcab與抗PD1 Fab (5C4)配對時，Fcab之促效活性得到提高，表明mAb2 藉由結合至T細胞表面上之共表現受體PD1而交聯。
在抗OX40/抗PD1 mAb2 抗體之情況下所觀測到之T細胞活化證明對與人類OX40在T細胞表面上共表現之受體具有特異性的Fab結合位點可用作交聯劑。8.3 使用包含抗人類 OX40 Fcab 及抗 LAG3 Fab 之 mAb2 進行的人類 T 細胞活化分析
在此分析中，利用人類OX40及LAG-3之共表現，以確定以下表 24 中所列舉之mAb/mAb2 的交聯。如實例 4 . 1 中所描述，製備具有LALA突變之mAb2 。表 24 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0025
如上文實例 5 . 1 . 1 中所描述分離且活化T細胞，且在基本上相同於實例 8 .1 中之方案中使用，但該方案使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2及如下文所描述之交聯劑。如先前所描述測定hIL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITC-葡聚糖(Sigma)；參見表 24 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。表 25 ：在存在共表現受體LAG3之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0026
 * 在不存在交聯之情況下，此等對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性
圖13 展示在OX40被靶向且抗OX40抗體交聯時，存在T細胞活化的提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在交聯抗LAG3抗體G1/25F7之情況下，未觀測到T細胞活化。如之前所見，靶向OX40之mAb G1/11D4在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。如之前所見，呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20-22-41AA/4420在不存在交聯之情況下具有促效活性，且此活性在添加結合至mAb2 之Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖的情況下增強。在靶向OX40之Fcab與抗LAG3 Fab (25F7)配對時，Fcab之促效活性得到提高，表明mAb2 藉由結合至T細胞表面上之共表現受體而交聯。
在抗OX40/抗LAG3 mAb2 抗體之情況下所觀測到之T細胞活化證明對與人類OX40在T細胞表面上共表現之受體具有特異性的Fab結合位點可用作交聯劑。8.4 使用包含抗小鼠 OX40 Fcab 及抗 LAG3 Fab 之 mAb2 進行的小鼠 T 細胞活化分析
在此分析中，利用小鼠OX40及LAG3受體之共表現，以確定以下表 26 中所列舉之雙特異性抗體的交聯。如實例 4 . 1 中所描述，製備具有LALA突變之mAb2 。表 26 .所測試之mAb及mAb2
Figure 108124735-A0304-0027
如實例 5 . 2 . 1 中所描述分離且活化小鼠T細胞，且在基本上相同於實例 8 .3 中之方案中使用，但該方案使用上文所描述之陽性對照抗體及mAb2及如下文所描述之交聯劑。如先前所描述測定mIL-2產生。
在需要時，將交聯劑(抗人類CH2 mAb純系MK1A6或FITC-葡聚糖(Sigma)；參見表 26 )與測試mAb/mAb2 以1:1莫耳比添加至孔中。
表 27 展示在存在所測試之mAb2 及mAb之情況下，在T細胞活化分析中所觀測到之IL-2釋放的EC50 值及最大反應。圖 14 展示T細胞活化分析之IL2釋放的代表性曲線。表 27 ：在存在LAG3之情況下的T細胞活化
Figure 108124735-A0304-0028
 * 在不存在交聯之情況下，此對照mAb在T細胞活化分析中不展示任何活性
圖14 展示在OX40被靶向且抗OX40抗體交聯時，存在T細胞活化的提高。如所預期，在交聯抗FITC抗體G1/4420之情況下，或在交聯抗LAG3抗體G1/C9B7W之情況下，未觀測到T細胞活化。如之前所見，靶向OX40之mAb G1/OX86在由抗人類CH2抗體交聯時誘導T細胞活化。呈假擬mAb2 (4420 LALA)格式之靶向OX40的Fcab FS20m-232-91AA/4420在不存在交聯之情況下不具有促效活性，且在利用添加結合至Fab臂之交聯劑FITC-葡聚糖而交聯時，其展示強效T細胞活化。在靶向OX40之Fcab與抗LAG3 Fab (C9B7W)配對時，所得mAb2 在不存在任何額外交聯劑之情況下展示T細胞活性。此表明mAb2 藉由結合至LAG3而交聯。
在抗OX40/抗LAG3 mAb2 抗體之情況下所觀測到之T細胞活化證明與小鼠OX40在T細胞表面上共表現之受體可用作交聯劑。8.5 能夠活體外產生 OX40 促效作用之抗 mOX40 / 抗 LAG3 mAb2 活體內抑制腫瘤生長
此實驗中使用CT26同基因型腫瘤模型，因為自CT26腫瘤分離之TIL包括表現OX40及LAG3受體之T細胞。
在CT26同基因型小鼠腫瘤生長模型中，測試實例 8 . 4 之抗mOX40/抗LAG3 mAb2 抗體(FS20m-232-91AA/C9B7W)之活體內活性。將抗mOX40/抗LAG3 mAb2 抑制腫瘤生長之能力與PBS對照進行比較。
如實例 5 中所描述，將BALB/c雌性小鼠用CT26細胞注射，監測健康及腫瘤生長，分選且隨機分入研究群組。將此時不具有腫瘤之任何小鼠自研究移除。
如實例 5 中所描述，將mAb2 /mAb進行譜分析，檢查雜質，製備且投與小鼠。如實例 5 中所描述，將動物進行健康篩選，取得腫瘤量測值且計算腫瘤體積。
當腫瘤負擔視為接近限制時，在第24天停止試驗，且將所有小鼠人道地處死。結果展示於圖 15 中。使用GraphPad Prism套裝軟體內之雙尾史都登氏t檢定進行終點腫瘤體積的統計分析。
在抑制腫瘤生長方面，抗OX40/抗LAG3 mAb2 與PBS對照對照(正常生長)之間存在證明的統計顯著差異。
出人意料地，與PBS對照相比，經抗mOX40/抗LAG3 mAb2 處理之群組展現顯著生長抑制。此試驗展示，類似於所觀測到的活體外結果，由靶向與在腫瘤浸潤T細胞中表現之OX40共表現之LAG3的mAb2 交聯OX40引起T細胞活化及後續腫瘤生長控制。 序列表 WT Fcab CH3域結構環之胺基酸序列 WT Fcab AB環 - RDELTKNQ (SEQ ID NO: 1) WT Fcab CD環 - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 2) WT Fcab EF環 - DKSRWQQGNV (SEQ ID NO: 3) WT Fcab CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 4) AB、CD及EF環加底線
Figure 02_image001
Fcab CH2域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 5)
Figure 02_image003
具有LALA突變之Fcab CH2域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 6) LALA突變加底線
Figure 02_image005
具有LALA-PA突變之Fcab CH2域的胺基酸序列(SEQ ID NO: 7) LALA-PA突變加底線
Figure 02_image007
具有LALA突變之WT Fcab的胺基酸序列(SEQ ID NO: 8) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image009
不具有LALA突變之WT Fcab的胺基酸序列(SEQ ID NO: 9) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image011
具有LALA突變之Fcab FS20-11的胺基酸序列(SEQ ID NO: 10) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image013
不具有LALA突變之Fcab FS20-11的胺基酸序列(SEQ ID NO: 11) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image015
Fcab FS20-11-127 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-11-127第一序列 - DDND (SEQ ID NO: 12) FS20-11-127第二序列 - IPIGP (SEQ ID NO: 13) FS20-11-127第三序列 - WRHYVEEHP (SEQ ID NO: 14) Fcab FS20-11-127 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 15) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image017
Fcab FS20-11-127 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 16)
Figure 02_image019
具有LALA突變之Fcab FS20-11-127的胺基酸序列(SEQ ID NO: 17) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image021
具有LALA突變之Fcab FS20-11-127的核酸序列(SEQ ID NO: 18)
Figure 02_image023
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-127的胺基酸序列(SEQ ID NO: 19) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image025
Figure 02_image027
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-127的核酸序列(SEQ ID NO: 20)
Figure 02_image029
具有LALA突變之FS20-11-127/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 21) VH域(加底線)
Figure 02_image031
不具有LALA突變之FS20-11-127/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 22) VH域(加底線)
Figure 02_image033
Fcab FS20-11-131 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-11-131第一序列 - DDND (SEQ ID NO: 12) FS20-11-131第二序列 - IPIGP (SEQ ID NO: 13) FS20-11-131第三序列 - WKHYVDEHP (SEQ ID NO: 23) Fcab FS20-11-131 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 24) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image035
Fcab FS20-11-131 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 25)
Figure 02_image037
具有LALA突變之Fcab FS20-11-131的胺基酸序列(SEQ ID NO: 26) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image039
具有LALA突變之Fcab FS20-11-131的核酸序列(SEQ ID NO: 27)
Figure 02_image041
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-131的胺基酸序列(SEQ ID NO: 28) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image043
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-131的核酸序列(SEQ ID NO: 29)
Figure 02_image045
具有LALA突變之FS20-11-131/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 30) VH域(加底線)
Figure 02_image047
不具有LALA突變之FS20-11-131/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 31) VH域(加底線)
Figure 02_image049
Fcab FS20-11-134 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-11-134第一序列 - DDND (SEQ ID NO: 12) FS20-11-134第二序列 - IPIGP (SEQ ID NO: 13) FS20-11-134第三序列 - WKHYVEEHP (SEQ ID NO: 32) Fcab FS20-11-134 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 33) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image051
Fcab FS20-11-134 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 34)
Figure 02_image053
具有LALA突變之Fcab FS20-11-134的胺基酸序列(SEQ ID NO: 35) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image055
具有LALA突變之Fcab FS20-11-134的核酸序列(SEQ ID NO: 36)
Figure 02_image057
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-134的胺基酸序列(SEQ ID NO: 37) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image059
不具有LALA突變之Fcab FS20-11-134的核酸序列(SEQ ID NO: 38)
Figure 02_image061
具有LALA突變之FS20-11-134/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 39) VH域(加底線)
Figure 02_image063
不具有LALA突變之FS20-11-134/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 40) VH域(加底線)
Figure 02_image065
Figure 02_image067
具有LALA突變之Fcab FS20-22的胺基酸序列(SEQ ID NO: 41) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image069
不具有LALA突變之Fcab FS20-22的胺基酸序列(SEQ ID NO: 42) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image071
Fcab FS20-22-38 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-38第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 43) FS20-22-38第二序列 - AEKYQ (SEQ ID NO: 44) FS20-22-38第三序列 - QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 45) Fcab FS20-22-38 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 46) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image073
Fcab FS20-22-38 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 47)
Figure 02_image075
具有LALA突變之Fcab FS20-22-38的胺基酸序列(SEQ ID NO: 48) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)及LALA突變(加粗且斜體)
Figure 02_image077
具有LALA突變之Fcab FS20-22-38的核酸序列(SEQ ID NO: 49)
Figure 02_image079
Figure 02_image081
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-38的胺基酸序列(SEQ ID NO: 50) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image083
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-38的核酸序列(SEQ ID NO: 51)
Figure 02_image085
具有LALA突變之FS20-22-38/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 52) VH域(加底線)
Figure 02_image087
不具有LALA突變之FS20-22-38/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 53) VH域(加底線)
Figure 02_image089
Fcab FS20-22-41 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-41第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 43) FS20-22-41第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 54) FS20-22-41第三序列 - QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 45) Fcab FS20-22-41 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 55) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image091
Fcab FS20-22-41 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 56)
Figure 02_image093
具有LALA突變之Fcab FS20-22-41的胺基酸序列(SEQ ID NO: 57) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image095
具有LALA突變之Fcab FS20-22-41的核酸序列(SEQ ID NO: 58)
Figure 02_image097
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-41的胺基酸序列(SEQ ID NO: 59) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image099
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-41的核酸序列(SEQ ID NO: 60)
Figure 02_image101
Figure 02_image103
具有LALA突變之FS20-22-41/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 61) VH域(加底線)
Figure 02_image105
不具有LALA突變之FS20-22-41/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 174) VH域(加底線)
Figure 02_image107
Fcab FS20-22-47 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-47第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 43) FS20-22-47第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 54) FS20-22-47第三序列 - QYRWSPGDY (SEQ ID NO: 62) Fcab FS20-22-47 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 63) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image109
Fcab FS20-22-47 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 64)
Figure 02_image111
具有LALA突變之Fcab FS20-22-47的胺基酸序列(SEQ ID NO: 65) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image113
具有LALA突變之Fcab FS20-22-47的核酸序列(SEQ ID NO: 66)
Figure 02_image115
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-47的胺基酸序列(SEQ ID NO: 67) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image117
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-47的核酸序列(SEQ ID NO: 68)
Figure 02_image119
具有LALA突變之FS20-22-47/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 69) VH域(加底線)
Figure 02_image121
不具有LALA突變之FS20-22-47/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 70) VH域(加底線)
Figure 02_image123
Fcab FS20-22-49 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-49第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 43) FS20-22-49第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 54) FS20-22-49第三序列 - QYRWNPADY (SEQ ID NO: 71) Fcab FS20-22-49 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 72) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image125
Fcab FS20-22-49 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 73)
Figure 02_image127
具有LALA突變之Fcab FS20-22-49的胺基酸序列(SEQ ID NO: 74) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image129
具有LALA突變之Fcab FS20-22-49的核酸序列(SEQ ID NO: 75)
Figure 02_image131
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-49的胺基酸序列(SEQ ID NO: 76) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image133
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-49的核酸序列(SEQ ID NO: 77)
Figure 02_image135
具有LALA突變之FS20-22-49/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 78) VH域(加底線)
Figure 02_image137
不具有LALA突變之FS20-22-49/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 79) VH域(加底線)
Figure 02_image139
Fcab FS20-22-85 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-22-85第一序列 - YWDQE (SEQ ID NO: 43) FS20-22-85第二序列 - DEQFA (SEQ ID NO: 54) FS20-22-85第三序列 - QYRWNPFDD (SEQ ID NO: 80) Fcab FS20-22-85 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 81) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image141
Fcab FS20-22-85 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 82)
Figure 02_image143
具有LALA突變之Fcab FS20-22-85的胺基酸序列(SEQ ID NO: 83) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image145
具有LALA突變之Fcab FS20-22-85的核酸序列(SEQ ID NO: 84)
Figure 02_image147
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-85的胺基酸序列(SEQ ID NO: 85) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image149
不具有LALA突變之Fcab FS20-22-85的核酸序列(SEQ ID NO: 86)
Figure 02_image151
具有LALA突變之FS20-22-85/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 87) VH域(加底線)
Figure 02_image153
不具有LALA突變之FS20-22-85/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 88) VH域(加底線)
Figure 02_image155
具有LALA突變之Fcab FS20-31的胺基酸序列(SEQ ID NO: 89) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image157
不具有LALA突變之Fcab FS20-31的胺基酸序列(SEQ ID NO: 90) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image159
Fcab FS20-31-58 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-58第一序列 - YYSGE (SEQ ID NO: 91) FS20-31-58第二序列 - QPEND (SEQ ID NO: 92) FS20-31-58第三序列 - PYWRWGSPRT (SEQ ID NO: 93) Fcab FS20-31-58 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 94) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image161
Fcab FS20-31-58 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 95)
Figure 02_image163
Figure 02_image165
具有LALA突變之Fcab FS20-31-58的胺基酸序列(SEQ ID NO: 96) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image167
具有LALA突變之Fcab FS20-31-58的核酸序列(SEQ ID NO: 97)
Figure 02_image169
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-58的胺基酸序列(SEQ ID NO: 98) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image171
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-58的核酸序列(SEQ ID NO: 99)
Figure 02_image173
具有LALA突變之FS20-31-58/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 100) VH域(加底線)
Figure 02_image175
Figure 02_image177
不具有LALA突變之FS20-31-58/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 101) VH域(加底線)
Figure 02_image179
Fcab FS20-31-66 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-66第一序列 - YYSGE (SEQ ID NO: 91) FS20-31-66第二序列 - QPEND (SEQ ID NO: 92) FS20-31-66第三序列 - PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 102) Fcab FS20-31-66 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 103) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image181
Fcab FS20-31-66 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 104)
Figure 02_image183
具有LALA突變之Fcab FS20-31-66的胺基酸序列(SEQ ID NO: 105) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image185
具有LALA突變之Fcab FS20-31-66的核酸序列(SEQ ID NO: 106)
Figure 02_image187
Figure 02_image189
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-66的胺基酸序列(SEQ ID NO: 107) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image191
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-66的核酸序列(SEQ ID NO: 108)
Figure 02_image193
具有LALA突變之FS20-31-66/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 109) VH域(加底線)
Figure 02_image195
不具有LALA突變之FS20-31-66/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 110) VH域(加底線)
Figure 02_image197
Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-94第一序列 - WEHGE (SEQ ID NO: 111) FS20-31-94第二序列 - IREHD (SEQ ID NO: 112) FS20-31-94第三序列 - PYWRWGGPGT (SEQ ID NO: 113) Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 114) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image199
Fcab FS20-31-94 Fcab CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 115)
Figure 02_image201
具有LALA突變之Fcab FS20-31-94 Fcab的胺基酸序列(SEQ ID NO: 116) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image203
具有LALA突變之Fcab FS20-31-94 Fcab的核酸序列(SEQ ID NO: 117)
Figure 02_image205
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-94 Fcab的胺基酸序列(SEQ ID NO: 118) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image207
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-94 Fcab的核酸序列(SEQ ID NO: 119)
Figure 02_image209
Figure 02_image211
具有LALA突變之FS20-31-94/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 120) VH域(加底線)
Figure 02_image213
不具有LALA突變之FS20-31-94/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 121) VH域(加底線)
Figure 02_image215
Fcab FS20-31-102 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-102第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 122) FS20-31-102第二序列 - QPEVD (SEQ ID NO: 123) FS20-31-102第三序列 - PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 102) Fcab FS20-31-102 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 124) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image217
Fcab FS20-31-102 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 125)
Figure 02_image219
具有LALA突變之Fcab FS20-31-102的胺基酸序列(SEQ ID NO: 126) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image221
Figure 02_image223
具有LALA突變之Fcab FS20-31-102的核酸序列(SEQ ID NO: 127)
Figure 02_image225
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-102的胺基酸序列(SEQ ID NO: 128) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image227
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-102的核酸序列(SEQ ID NO: 129)
Figure 02_image229
具有LALA突變之FS20-31-102/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 130) VH域(加底線)
Figure 02_image231
不具有LALA突變之FS20-31-102/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 131) VH域(加底線)
Figure 02_image233
Fcab FS20-31-108 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-108第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 122) FS20-31-108第二序列 - EKEID (SEQ ID NO: 132) FS20-31-108第三序列 - PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 133) Fcab FS20-31-108 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 134) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image235
FS20-31-108 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 135)
Figure 02_image237
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-108的胺基酸序列(SEQ ID NO: 136) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image239
具有LALA突變之Fcab FS20-31-108的核酸序列(SEQ ID NO: 137)
Figure 02_image241
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-108的胺基酸序列(SEQ ID NO: 138) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image243
Figure 02_image245
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-108的核酸序列(SEQ ID NO: 139)
Figure 02_image247
具有LALA突變之FS20-31-108/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 140) VH域(加底線)
Figure 02_image249
不具有LALA突變之FS20-31-108/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 141) VH域(加底線)
Figure 02_image251
Fcab FS20-31-115 CH3域結構環序列之胺基酸序列 FS20-31-115第一序列 - WASGE (SEQ ID NO: 122) FS20-31-115第二序列 - EQEFD (SEQ ID NO: 142) FS20-31-115第三序列 - PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 133) Fcab FS20-31-115 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 143) 第一、第二及第三序列加底線
Figure 02_image253
Fcab FS20-31-115 CH3域之核酸序列(SEQ ID NO: 144)
Figure 02_image255
具有LALA突變之Fcab FS20-31-115的胺基酸序列(SEQ ID NO: 145) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)，CH3域(斜體)，LALA突變(加粗且加底線)
Figure 02_image257
具有LALA突變之Fcab FS20-31-115的核酸序列(SEQ ID NO: 146)
Figure 02_image259
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-115的胺基酸序列(SEQ ID NO: 147) 鉸鏈區(加底線)，CH2域(加粗)及CH3域(斜體)
Figure 02_image261
不具有LALA突變之Fcab FS20-31-115的核酸序列(SEQ ID NO: 148)
Figure 02_image263
具有LALA突變之FS20-31-115/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 149) VH域(加底線)
Figure 02_image265
不具有LALA突變之FS20-31-115/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 150) VH域(加底線)
Figure 02_image267
Fcab FS20m-232-91 CH3域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 151) AB、CD及EF環加底線
Figure 02_image269
具有LALA突變之FS20m-232-91/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 152) VH域(加底線)
Figure 02_image271
不具有LALA突變之FS20m-232-91/4420假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 153) VH域(加底線)
Figure 02_image273
具有LALA突變之FS20m-232-91/HelD1.3假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 154) VH域(加底線)
Figure 02_image275
不具有LALA突變之FS20m-232-91/HelD1.3假擬mAb2 之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 155) VH域(加底線)
Figure 02_image277
4420 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 156) VL域(加底線)
Figure 02_image279
HelD1.3假擬mAb2 之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 157) VL域(加底線)
Figure 02_image281
人類OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 158) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體)
Figure 02_image283
小鼠OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 159) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體)
Figure 02_image285
食蟹獼猴OX40-mFc之胺基酸序列(SEQ ID NO: 160) IL-2前導序列(加底線)，OX40胞外域(斜體)，小鼠IgG2a Fc域(粗體)
Figure 02_image287
人類OX40胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 161)
Figure 02_image289
食蟹獼猴OX40胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 162)
Figure 02_image291
小鼠OX40胞外域之胺基酸序列(SEQ ID NO: 163)
Figure 02_image293
DO11.10-hOX40及人類OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 164)
Figure 02_image295
DO11.10-mOX40及小鼠OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 165)
Figure 02_image297
DO11.10-cOX40及食蟹獼猴OX40受體之胺基酸序列(SEQ ID NO: 166)
Figure 02_image299
Figure 02_image301
包含LALA突變之抗FITC mAb G1AA/4420之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 167)
CDR之位置加底線。LALA突變之位置加粗。
Figure 02_image303
不具有LALA突變之抗FITC mAb G1/4420之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 168)
CDR之位置加底線。
Figure 02_image305
具有LALA突變之G1/HelD1.3抗體之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 169)
Figure 02_image307
全長IgG1鉸鏈區之胺基酸(SEQ ID NO: 170)
Figure 02_image309
截短Fcab鉸鏈區之胺基酸序列(SEQ ID NO: 171)
Figure 02_image311
FS20-22-49-AA/FS30-10-16之胺基酸重鏈序列(SEQ ID NO: 172)
Figure 02_image313
FS20-22-49-AA/FS30-10-16之胺基酸輕鏈序列(SEQ ID NO: 173)
Figure 02_image315
包含LALA突變之G1/OX86 mAb (G1AA/OX86)之重鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 175)
Figure 02_image317
G1AA/OX86 mAb之輕鏈的胺基酸序列(SEQ ID NO: 176)
Figure 02_image319
參考文獻
本說明書中提及之所有文獻均以全文引用的方式併入本文中。
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圖1A 至圖1C 展示Fcab FS20-11、FS20-11-127、FS20-11-131、FS20-11-134、FS20-22、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108及FS20-31-115以及野生型(WT) Fcab之CH3域之序列的比對。指示AB、CD及EF結構環，以及與WT序列相比，Fcab之CH3域中所存在之任何胺基酸取代、缺失(由波浪符「~」表示)或插入之位置。展示根據IMGT、IMGT外顯子(連續編號)、EU及Kabat編號系統之殘基編號。圖2 展示在存在抗人類OX40 Fcab之情況下，T細胞活化分析中之IL-2釋放。各譜系(FS20-11、FS20-22及FS20-31)中之一種抗人類OX40 Fcab的代表性曲線分別展示於圖 2A 、圖 2B 及圖 2C 中。抗人類OX40 Fcab以假擬(4420 LALA) mAb2 格式測試。在存在及不存在交聯劑(交聯)之情況下測試IL-2釋放。包括各自在人類IgG1主鏈中之抗FITC抗體4420及抗OX40抗體11D4 (G1/4420及G1/11D4)作為陰性及陽性對照。在逐漸提高之濃度下測試抗人類OX40 Fcab及對照抗體對IL-2釋放的影響。觀測到T細胞活化之濃度依賴性增加，如由交聯陽性對照mAb (G1/11D4)及抗人類OX40 Fcab，而非由非交聯陽性對照mAb或由陰性對照mAb (G1/4420)引起之IL-2釋放的增加所證明。在不存在交聯之情況下，呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之FS20-11-131 Fcab未展示活性。在不存在交聯之情況下，呈假擬(4420 LALA) mAb2 格式之FS20-22-49及FS20-31-115 Fcab展示一些活性，且此活性在交聯之情況下提高。圖3 展示在CT26腫瘤模型中，呈假擬(HEL D1.3 LALA) mAb2 格式之抗小鼠OX40 Fcab的活體內抗腫瘤活性。展示Balb/c小鼠群組中CT26同基因型模型之腫瘤生長曲線。將呈假擬(HEL D1.3) mAb2 格式，具有(OX40/假擬mAb2 LALA)及不具有(OX40/假擬mAb2 ) LALA突變之抗小鼠OX40 Fcab的活體內抗腫瘤活性與陽性對照抗小鼠OX40 mAb (人類IgG1主鏈中之OX86；無/OX40mAb)及陰性對照抗體(人類IgG1主鏈中之4420抗體；無/FITC)進行比較。在腫瘤接種之後第10、12及14天，不同分子以1 mg/kg給藥。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值。圖4A 至圖4D 展示在存在HPAC細胞之情況下，T細胞活化分析中IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，mAb/mAb2 以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在由交聯劑(抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖)交聯或由TAA+ HPAC細胞交聯時，存在由靶向OX40之mAb/mAb2 引起之T細胞活化的濃度依賴性增加。圖5A 及圖 5B 展示在存在HPAC細胞之情況下，T細胞活化分析中IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，mAb/mAb2 以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在由交聯劑(抗人類CH2抗體或FITC-葡聚糖)交聯或由TAA+ HPAC細胞交聯時，存在由靶向OX40之mAb/mAb2 引起之T細胞活化的濃度依賴性增加。圖6A 展示在存在表現EphA2之細胞(HPAC)之情況下，在靶向OX40及EphA2之mAb2 存在時，而非在靶向OX40之其他抗體存在但未交聯時，存在T細胞活化之增加。此表明mAb2 藉由結合至二種目標OX40及EphA2而交聯。圖 6B 展示在存在非生理性交聯劑(抗Fc抗體或FITC-葡聚糖)之情況下，靶向OX40活化T細胞之抗體。如所預期，在存在交聯劑之情況下，抗EphA2及抗FITC抗體不誘導T細胞活化。在由抗Fc抗體交聯時，抗小鼠OX40抗體(G1/OX86)誘導一定的T細胞活化。與抗OX40抗體G1/OX86相比，抗小鼠OX40 Fcab在與抗FITC Fab在假擬mAb2 (FS20m-232-91AA/4420)中配對時，在由FITC-葡聚糖交聯時以較低EC50 及較高最大反應活化T細胞。相比於抗OX40/抗FITC mAb2 ，相同抗小鼠OX40 Fcab在與抗EphA2 Fab在mAb2 (FS20m-232-91AA/E2A)中配對時，在存在HPAC細胞之情況下以較低EC50 及相當的最大反應活化T細胞。圖7 展示在經G1/4420、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420 + G1/E2A及FS20m-232-91AA/E2A處理之Balb/c小鼠群組中，CT26同基因型模型的腫瘤生長曲線。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值。使用雙尾t檢定，在不同組中比較最後一天時之腫瘤體積。相比於經對照抗體(G1/4420)處理之組，經抗mOX40/抗EphA2 mAb2 (FS20m-232-91AA/E2A)處理之組展示統計顯著腫瘤體積減小。圖8 展示在存在可溶性VEGF之情況下，T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，mAb/mAb2 以逐漸提高之濃度測試，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在mAb/mAb2 由其交聯劑(抗hCH2、FITC-葡聚糖或VEGF)交聯時，存在由靶向OX40之mAb/mAb2 引起之T細胞活化的濃度依賴性增加。圖9 展示在存在各種mAb/mAb2 之情況下，T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，五種不同mAb/mAb2 以逐漸提高之濃度測試，根據其Fcab/Fab純系名稱(G1/4420、G1/R84、G1/OX86、FS20m-232-91AA/4420及FS20m-232-91AA/R84)標記。結果展示，在存在VEGF之情況下，存在由抗小鼠OX40/抗VEGF mAb2 (FS20m-232-91AA/R84)引起之T細胞活化的增加。此結果證明交聯對於靶向OX40之抗體增加T細胞活化而言係必需的，且抗OX40/抗VEGF mAb2 可由Fab目標VEGF交聯。圖10 展示在經G1/4420、G1/R84、FS20m-232-91AA/4420 + G1/R84及FS20m-232-91AA/R84處理之Balb/c小鼠群組中，CT26同基因型模型的腫瘤生長曲線。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值，且使用雙尾t檢定在不同組中比較最後一天時之腫瘤體積。相比於對照抗體無/FITC處理組，抗mOX40/抗VEGF mAb2 抗體處理組展示統計顯著腫瘤體積減小。此結果證明，與呈假擬mAb2 格式之OX40 Fcab與VEGF抗體之組合相比，抗mOX40/抗VEGF mAb2 抗體針對描述為在微環境中具有提高之VEGF濃度的腫瘤具有較好活體內抗腫瘤功效，表明藉由抗mOX40/抗VEGF mAb2 介導之OX40及VEGF之雙特異性接合引起的OX40活體內交聯有效控制腫瘤生長。圖11A 至圖11C 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，抗體以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在抗體由其交聯劑(抗hCH2；FITC-葡聚糖)交聯時，存在由靶向OX40之抗體引起之T細胞活化的濃度依賴性增加，且在不存在額外交聯劑之情況下，抗OX40/抗ICOS mAb2 (FS20-22-49AA/ICOSj)、抗OX40/抗CD27 mAb2 (FS20-22-49AA/695)及抗OX40/抗GITR mAb2 (FS20-22-49AA/6C8)均具有促效活性，該活性大於呈假擬mAb2 格式之非交聯抗OX40 Fcab (FS20-22-49AA/4420)的活性。圖12 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，抗體以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在抗體由其交聯劑(抗hCH2；FITC-葡聚糖)交聯時，存在由靶向OX40之抗體引起之T細胞活化的濃度依賴性增加，且在不具有額外交聯劑之情況下，抗OX40/抗PD1 mAb2 (FS20-22-49AA/5C4)具有與交聯抗OX40 Fcab (FS20-22-49AA/4420交聯)相當的促效活性。圖13 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，抗體以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在抗體由其交聯劑(抗hCH2；FITC-葡聚糖)交聯時，存在由靶向OX40之抗體引起之T細胞活化的濃度依賴性增加，且在不具有額外交聯劑之情況下，抗OX40/抗LAG3 mAb2 (FS20-22-41AA/25F7)具有與交聯抗OX40 Fcab (FS20-22-41AA/4420交聯)相當的促效活性。圖14 展示T細胞活化分析之IL-2釋放的代表性曲線。在此分析中，抗體以逐漸提高之濃度使用，根據其Fcab/Fab純系名稱標記。結果展示，在抗體由其交聯劑(抗hCH2；FITC-葡聚糖)交聯時，存在由靶向OX40之抗體引起之T細胞活化的濃度依賴性增加，且在不具有額外交聯劑之情況下，抗OX40/抗LAG3 mAb2 (FS20m-232-91AA/C9B7W)具有高於非交聯抗OX40 Fcab (FS20m-232-91AA/4420)的促效活性。此表明結合LAG3之Fab交聯抗OX40 Fcab，且活化T細胞。圖15 展示經抗mOX40/抗LAG3 mAb2 處理之Balb/c小鼠群組中CT26同基因型模型的腫瘤生長曲線。繪製平均腫瘤體積加或減標準誤差均值，且使用雙尾t檢定在不同組中比較最後一天時之腫瘤體積。相比於經PBS處理之對照組，經抗OX40/抗LAG3 mAb2 處理之組展示統計顯著腫瘤體積減小。此結果證明，抗mOX40/抗LAG3 mAb2 抗體針對描述為包含包括表現OX40及LAG3之T細胞之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的腫瘤具有活體內抗腫瘤功效，表明藉由抗mOX40/抗LAG3 mAb2 介導之OX40及LAG3之雙特異性接合引起的OX40活體內聚集有效控制腫瘤生長。
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(無)

Claims (19)

  1. 一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之一CH3域中的一OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及71中之FS20 -22 -49 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及45中之FS20 -22 -41 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及62中之FS20 -22 -47 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO 43、54及80中之FS20 -22 -85 的第一、第二及第三序列；或 (v)分別列舉於SEQ ID NO 43、44及45中之FS20 -22 -38 的第一、第二及第三序列；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
  2. 如請求項1之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 72、55、63、81及46中之特異性結合成員FS20 - 22 - 49 、FS20 - 22 - 41 、FS20 - 22 - 47 、FS20 - 22 - 85 或 FS20 - 22 - 38 的CH3域序列。
  3. 如請求項1或2之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 74、57、65、83及48中之FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 76、59、67、85及50中之FS20 -22 -49 、FS20 -22 -41 、FS20 -22 -47 、FS20 -22 -85 或FS20 -22 -38 的序列。
  4. 一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之一CH3域中的一OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 122、142及133中之FS20 -31 -115 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 122、132及133中之FS20 -31 -108 的第一、第二及第三序列； (iii)分別列舉於SEQ ID NO 91、92及93中之FS20 -31 -58 的第一、第二及第三序列； (iv)分別列舉於SEQ ID NO 111、112及113中之FS20 -31 -94 的第一、第二及第三序列； (v)分別列舉於SEQ ID NO 122、123及102中之FS20 -31 -102 的第一、第二及第三序列；或 (vi)分別列舉於SEQ ID NO 91、92及102中之FS20 -31 -66 的第一、第二及第三序列；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
  5. 如請求項2或4之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 143、134、94、114、124及103中之特異性結合成員FS20 - 31 - 115 、FS20 - 31 - 108 、FS20 - 31 - 58 、FS20 - 31 - 94 、 FS20 - 31 - 102 或FS20 - 31 - 66 的CH3域序列。
  6. 如請求項4或5中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 145、136、96、116、126及105中之FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 147、138、98、118、128及107中之FS20 -31 -115 、FS20 -31 -108 、FS20 -31 -58 、FS20 -31 -94 、FS20 -31 -102 或FS20 -31 -66 的序列。
  7. 一種特異性結合成員，其結合OX40且包含定位於該特異性結合成員之一CH3域中的一OX40抗原結合位點，其中該OX40抗原結合位點包含以下特異性結合成員之第一、第二及第三序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及23中之FS20 -11 -131 的第一、第二及第三序列； (ii)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及14中之FS20 -11 -127 的第一、第二及第三序列；或 (iii)分別列舉於SEQ ID NO 12、13及32中之FS20 -11 -134 的第一、第二及第三序列；且 其中該第一、第二及第三序列分別定位於該特異性結合成員之該CH3域的AB、CD及EF結構環中。
  8. 如請求項7之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含分別列舉於SEQ ID NO 24、15及33中之特異性結合成員FS20 - 11 - 131 、 FS20 - 11 - 127 或 FS20 - 11 - 134 的CH3域序列。
  9. 如請求項7或8之特異性結合成員，其中該特異性結合成員包含以下特異性結合成員之序列： (i)分別列舉於SEQ ID NO 26、17及35中之FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的序列；或 (ii)分別列舉於SEQ ID NO 28、19及37中之FS20 -11 -131 、FS20 -11 -127 或FS20 -11 -134 的序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之特異性結合成員，其中該特異性結合成員進一步包含一基於CDR之抗原結合位點。
  11. 如請求項10之特異性結合成員，其中該特異性結合成員係一抗體分子。
  12. 如請求項10或11之抗體分子，其中該基於CDR之抗原結合位點結合一第二抗原，該第二抗原選自由以下組成之群：一免疫細胞抗原、一腫瘤抗原及一病原抗原。
  13. 如請求項1至12中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其中該特異性結合成員或抗體分子不結合至Fcγ受體。
  14. 一種核酸，其編碼如請求項1至13中任一項之特異性結合成員或抗體分子。
  15. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項14之核酸。
  16. 一種產生如請求項1至13中任一項之特異性結合成員或抗體分子之方法，該方法包含在用於產生該特異性結合成員或抗體分子之條件下培養如請求項15之重組宿主細胞。
  17. 如請求項1至13中任一項之特異性結合成員或抗體分子，其用於一種藉由療法治療人體或動物體之方法中。
  18. 一種治療一患者之一疾病或病症之方法，該方法包含向該患者投與一治療有效量之如請求項1至13中任一項之特異性結合成員或抗體分子。
  19. 如請求項17所使用之特異性結合成員或抗體分子，或如請求項18之方法，其中該治療係一個體中之癌症或一感染性疾病的治療。
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