CN113330310A

CN113330310A - 用于测定肿瘤微环境组成的方法和组合物

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Publication number: CN113330310A
Application number: CN201980088416.4A
Authority: CN
Inventors: N·珀维斯; M·韦斯特福尔
Original assignee: Diatech Oncology LLC
Current assignee: Diatech Oncology LLC
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-08-31
Also published as: EP3876955A1; CA3119311A1; EP3876955A4; JP2022512973A; KR20210119380A; AU2019377546A1; WO2020097495A1; US20210405057A1

Abstract

本公开涉及免疫肿瘤学领域。更具体地，本公开涉及用于进行肿瘤微环境内存在的免疫细胞和癌细胞的单细胞表型和功能分析的方法和组合物。所述方法和组合物允许确定患有实体瘤的受试者是否可能响应特定的免疫调节剂，并且还允许通过帮助选择适用于治疗受试者中的实体瘤的免疫调节剂来治疗受试者中的实体瘤。

Description

用于测定肿瘤微环境组成的方法和组合物

相关申请的交叉参考

本申请要求于2018年11月9日提交的美国临时专利申请No.62/758,393的权益和优先权，将其全部公开内容通过引用并入本文中。

发明领域

本公开涉及免疫肿瘤学领域。更具体地，本公开涉及用于分离和分析肿瘤样品以确定肿瘤微环境的表型组成、评估浸润免疫细胞的功能状态、量化免疫调节受体和配体的表达以及预测对免疫疗法的反应的方法和组合物。

背景

癌症治疗中检查点抑制剂的发现提供了针对治疗癌症的新疗法，在该发现之前，这些癌症已经逃避成功的治疗，因为这些癌症已经进化出逃避受试者免疫系统的机制。然而，尽管迄今为止在使用检查点抑制剂治疗各种癌症方面取得了重大进展，但目前可用的生物标志物和诊断方法对响应的预测很差，并且因此大量患者仍然对免疫疗法治疗无响应。此外，鉴于实体瘤的肿瘤微环境(TME)(其含有上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、基质细胞、癌细胞和免疫细胞)的复杂性，可能更难评估潜在的实体瘤治疗方案。在某些实体瘤中，癌细胞影响TME中的免疫细胞的活性或无活性。

因此，尽管迄今为止取得了进展，但仍然需要方法和组合物能够测定实体瘤的TME组成，随后可以将其用于确定哪些免疫调节剂，单独或与其他癌症药物组合，可能在治疗给定受试者的肿瘤中是有效的。

发明概述

本发明部分基于以下发现：测定实体瘤微环境TME的组成并对位于TME内的免疫细胞和癌细胞进行单细胞表型和功能分析是可能的。更具体地，本文所述的方法和组合物有助于免疫抑制表型以及可靶向的免疫调节(例如，检查点)受体及其配体在TME内的细胞表达的定量表征。该方法和组合物可用于确定患有实体瘤的受试者是否可能响应特定的免疫调节剂。该方法和组合物还通过帮助选择适用于治疗受试者实体瘤的免疫调节剂来促进给定受试者中实体瘤的治疗。

此外，本发明的方法和组合物提供了药物发现/评估工具，用于(a)早期免疫治疗探索性研究；(b)在临床前研究中提供基于机制的原理证明，(c)在临床试验中对患者进行分层；(d)选择在治疗受试者癌症中最有可能有效的免疫调节剂。

本文所述的方法还有助于肿瘤浸润白细胞(TIL)的表型分析，由此在经验证的条件下提供准确且高度可再现的数据集。因此，根据本文所述方法收集的数据的广度和质量提供优于常规细胞评估方法(例如常规免疫组织化学方法)的优势。

在一个方面中，本公开涉及测定实体瘤微环境组成的方法。该方法包括将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，其中细胞表面标志物包括细胞类型标记、免疫调节受体(IMR)和IMR配体标志物(IMR-L)，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞。该方法进一步包括通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而(i)确定实体瘤微环境中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量和(ii)确定癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L，从而确定实体瘤微环境。

在另一个方面中，本公开涉及一种确定患有实体瘤的受试者是否可能响应免疫调节剂的方法。该方法包括将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，其中细胞表面标志物包括细胞类型标记、免疫调节受体(IMR)和IMR-配体(IMR-L)，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞。该方法进一步包括将细胞的单细胞悬液的至少一部分与免疫调节剂组合并确定(i)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，以及癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L和(ii)免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用，从而确定受试者是否可能响应免疫调节剂。

在另一个方面中，本公开涉及治疗需要的受试者中的实体瘤的方法。该方法包括将有效量的免疫调节剂给药于受试者，由此来治疗实体瘤。通过一种方法来选择免疫调节剂，所述方法包括将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，其中细胞表面标志物包括细胞类型标记、免疫调节受体(IMR)和IMR-配体(IMR-L)，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞。该方法进一步包括将细胞的单细胞悬液的至少一部分与免疫调节剂组合并确定(i)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，以及癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L和(ii)免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用，从而确定受试者是否可能响应免疫调节剂。

在以上方面的某些实施方案中，细胞计量术是流式细胞术、质谱细胞术、图像细胞术和/或单细胞技术(SCT)。

在以上方面的某些实施方案中，标记试剂选自由寡核苷酸、荧光团、红外标标记和重金属标记组成的组。

在以上方面的某些实施方案中，其中免疫细胞包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Treg)、B细胞和自然杀伤细胞)、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)，或其组合。

在某些实施方案中，细胞表面标志物进一步包括细胞激活标志物。

在某些实施方案中，细胞类型标志物包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Treg)、B细胞和自然杀伤细胞)和/或骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)上表达的标志物。在某些实施方案中，细胞类型标志物是癌细胞标志物，包括CD44、CD47、CD49f、CD271、CD326、细胞角蛋白(胞内)、E-钙粘蛋白和/或波形蛋白。

在某些实施方案中，细胞激活标志物包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40、CD44、CD62L、CD69、CD80、CD86、CD95、CD95L、CD127、CCR7(CD197)和/或功能标志物，例如，IFNγ、TNFα和/或其他细胞因子和/或颗粒酶B。

在某些实施方案中，IMR或IMR-L标志物包括PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、OX40(CD134)、TIM3(CD366)，GITR(CD357)、4-1BB(CD137)、KIR(CD158B)、2B4(CD244)、ICOS(CD278)、IDO、TIGIT、CD73、CD39、CD172a(SIRPa)、B7H4(B7S1)、VISTA(B7-H5)、CD355(CRTAM)、KLRG1、CD160(BY55、NK1、NK28)、CD30(TNFRSF8)、CD224(GGT1)、CD226、CD272(BTLA)和/或CD115(CSF-1R)。

在某些实施方案中，该方法进一步包括将细胞与免疫调节剂组合的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括确定免疫调节剂对癌细胞和/或免疫细胞上的至少一部分细胞标志物表达的作用。可以在将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合的步骤之前、之中或之后，将免疫调节剂与单细胞悬液组合。

在某些实施方案中，在细胞计量术过程中同时检测多种不同的标记的细胞。在某些实施方案中，在细胞计量术过程中同时检测多种不同的细胞表面标志物。在某些实施方案中，同时检测至少14种不同的细胞表面标志物。

在某些实施方案中，可以检测并任选定量标记的细胞之间的受体-配体相互作用。在某些实施方案中，受体-配体相互作用包括检查点抑制剂与其同源配体之间的相互作用。在某些实施方案中，受体-配体相互作用可以选自PD-1和PD-L1、CTLA-4和B7-1和/或B7-2、TIM3-和Gal9、GITR和GITRL、OX-40和OX40L、CD-27和CD70、4-1BB和4-1BBL，和/或CD-40L和CD40之间的相互作用。

在某些实施方案中，测定癌细胞和/或免疫细胞上表达的细胞激活标志物、IMR标志物、IMR-L标志物或激活标志物和IMR和/或IMR-L标志物的组合的存在和/或含量。

以上描述描述了本发明的多个方面和实施方案。该专利申请特意考虑了各方面和实施方案的所有组合和排列。在以下详述和权利要求中描述了本发明的这些和其他方面和特征。

附图简述

通过以下对附图中说明的优选实施方案的描述，本发明的前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见。相似的参考元素标识了相应附图中的共同特征，其中：

图1描绘了用于从预定的门控程序自动提取度量的门控树，所述门控程序用于Treg染色组中的颗粒酶B或细胞因子的表达和Treg的鉴定。利用Qognit软件包Ryvett和Verity Software House软件包Winlist的组合分析流式细胞术数据。门控树表现了用于鉴定细胞群的布尔逻辑，捕获所有细胞群并将它们分离成更离散的群作作为门控树的分支。

图2描绘了用于从预定的门控程序自动提取度量的门控树，所述门控程序用于鉴定T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞/巨噬细胞以及IMR和IMR-L在鉴定的细胞子集上的表达。使用Qognit软件包Ryvett和Verity Software House软件包Winlist的组合分析流式细胞术数据。门控树表现了用于鉴定细胞群的布尔逻辑，捕获所有细胞群并将它们分离成更离散的群作为门控树的分支。

图3描绘了根据本发明方法的可检测的免疫调节受体(IMR)/免疫调节配体(IMR-L)对。

图4A描绘了解离的肿瘤样品的表面和胞内表型流式细胞术图，显示了CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD25^hiFoxP3+Treg细胞的存在。图4B描绘了相关的数字绘图(表示为阳性百分比)，显示了CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD25^hiFoxP3+Treg细胞的占有率。CD4+CD25^hiFoxP3+Treg升高的水平表明了(a)伴随肿瘤扩散的免疫抑制特征和(b)预后和客观响应差。

(RD-PBMC＝在所有测定中使用的PBMC参考供体。)

图5描绘了关于一种或多种基础的或诱导的胞内可检测抗原的流式细胞术直方图和门控直方图的相关数字绘图(表示为阳性百分比)。在存在或不存在白细胞激活混合物和BD

的情况下，在从乳腺、肺和肾肿瘤的肿瘤微环境中分离的CD4+和CD8+T细胞中测定了胞内细胞因子表达(IFNγ和TNFα)。三角形代表乳腺肿瘤，正方形代表肺肿瘤，菱形代表肾肿瘤和圆形代表来自PBMC参考供体(RD-PBMC)的数据。

图6描绘了流式细胞术直方图和门控直方图的相关数字绘图(表示为阳性百分比)，显示了与对照(FMO)和健康供体PBMC相比，乳腺、肺和肾肿瘤的颗粒酶B CD8+细胞毒性T细胞的表达。三角形代表乳腺肿瘤，正方形代表肺肿瘤，菱形代表肾肿瘤和圆形代表来自PBMC参考供体的数据。MFI＝平均荧光强度。

图7描绘了解离的肿瘤样品的表面表型流式细胞术图，显示了CD45+白细胞、CD326+上皮肿瘤细胞、CD14+单核细胞/巨噬细胞以及CD4+和CD8+T细胞的存在。

图8描绘了流式细胞术直方图，显示了免疫抑制检查点TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)在CD4+、CD8+和CD14+细胞上的表达，但在CD326+上皮肿瘤细胞上无表达。FMO＝对照。

图9描绘了从一组分离的乳腺、肺和肾肿瘤获得的CD326+上皮肿瘤细胞上表达的几种IMR或IMR-L的数字表示(以百分比表示)。中灰色方块代表乳腺肿瘤中的表达水平，浅灰色方块代表肺肿瘤中的表达水平和深灰色方块代表肾肿瘤中的表达水平。

图10描绘了从一组分离的乳腺、肺和肾肿瘤获得的CD14+骨髓细胞上表达的几种IMR或IMR-L的数字表示(以百分比表示)。中灰色方块代表乳腺肿瘤中的表达水平，浅灰色方块代表肺肿瘤中的表达水平和深灰色方块代表肾肿瘤中的表达水平。

图11描绘了从一组分离的乳腺、肺和肾肿瘤获得的CD8+T细胞上表达的几种IMR或IMR-L的数字表示(以百分比表示)。中灰色方块代表乳腺肿瘤中的表达水平，浅灰色方块代表肺肿瘤中的表达水平和深灰色方块代表肾肿瘤中的表达水平。

详述

本发明部分基于以下发现：测定实体瘤微环境的组成并对位于肿瘤微环境(TME)内的免疫细胞和癌细胞进行单细胞表型和功能分析是可能的。更具体地，本文所述的方法和组合物有助于免疫抑制表型以及可靶向的免疫调节(例如，检查点)受体及其配体在TME内的细胞表达的定量表征。该方法和组合物可用于确定患有实体瘤的给定受试者是否可能响应使用特定免疫调节剂的治疗，使得受试者不暴露于不太可能提供阳性治疗结果的物质，而是用选择的以在受试者中获得阳性治疗结果的多种物质中的一种来治疗。

使用本文所述的方法和组合物，可以快速和定量地分析实体瘤的TME以提供基于TME内肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的表型和功能分析的临床相关信息，从而确定TME内的免疫状态。在TME背景下对TIL进行表征对于靶向免疫疗法可能是重要的。例如，TIL的表型子集分析可以与临床结果相关联，并用作免疫疗法的治疗指导分析。例如，CD8+和CD56+TIL密度增加预示着对免疫肿瘤治疗的积极响应。

类似地，本文所述的方法和组合物有助于评估TME中的肿瘤浸润性NK、T细胞(Treg、CD8+细胞毒性T细胞、耗竭的T细胞)、髓源性抑制细胞(MDSC)以及树突细胞(DC)和巨噬细胞(Mf)的各种子集。这些方法进一步促进了对免疫调节受体(IMR)/免疫调节受体配体(IMR-L)阳性免疫细胞和肿瘤细胞比例的评估。该方法还允许分析激活/耗竭标志物，如细胞因子和颗粒酶表达。

此外，本文所述的方法和组合物可用于确定TIL的功能状态，其可有助于预测患有肿瘤的给定受试者的临床响应。例如，使用本文所述的方法，可以确定对于给定的实体瘤样品，免疫细胞是否被激活或耗竭，以及免疫细胞是否在TME内被Treg、M2巨噬细胞和MDSC抑制。此外，该方法和组合物还有助于可靶向IMR及其同源配体的TIL和肿瘤细胞(共)表达谱的量化，这为医疗保健提供者提供了有关特定免疫调节剂是否可能对TME产生积极影响并促进使用免疫调节剂(单独或联合另一种癌症药物)的积极治疗结果的信息。例如，特定免疫调节剂的选择可能降低或消除特定癌细胞对特定癌症药物治疗可能具有的抗性。

通常，本文所述的方法包括将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞。该方法包括通过细胞计量术确定标记细胞的存在和/或含量，从而确定实体瘤微环境中癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，同时作为作为表型信息的细胞，所述表型信息关于细胞是否表达特定的表型标志物，如IMR、IMR-L和细胞激活标志物。

在某些实施方案中，该方法进一步包括将细胞与免疫调节剂(单独或联合癌症药物)组合并随后确定免疫调节剂是否影响癌细胞和/或免疫细胞上的细胞标志物表达的步骤。

本文所述的方法和组合物可以用于确定实体瘤患者是否可能响应免疫调节剂。例如，将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞。此外，将细胞的单细胞悬液的至少一部分接触免疫调节剂(单独或联合癌症药物)，然后可以通过细胞计量术分析标记的细胞，以确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量。此外，可以确定免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用。这个信息可以用于确定受试者是否可能积极地响应免疫调节剂。

本文所述的方法和组合物可以用于需要的受试者的实体瘤治疗中，由此将通过本文所述的方法选择的有效量的免疫调节剂给药于受试者，从而治疗实体瘤。通过使用包括以下步骤的方法来选择免疫调节剂：(a)将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞；(b)将细胞的单细胞悬液的至少一部分与免疫调节剂组合；和(c)确定(i)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，由此确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，和(ii)免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用，由此确定受试者是否可能响应免疫调节剂。

以下部分更详细地描述了怎样使用本文所述的方法和组合物来分析实体瘤的TME和怎样可能确定受试者是否可以顺利地响应给定的免疫调节剂。

I.细胞类型

应理解TME包括本文所述的肿瘤细胞和免疫细胞。

(a)肿瘤细胞

术语“肿瘤细胞”在本文中可与“癌细胞”互换使用。可以使用本文所述的方法和组合物探查的肿瘤细胞类型包括上皮衍生的细胞、内皮衍生的细胞和间充质衍生的细胞。

可以使用本文描述的方法探查的肿瘤包括但不限于肛门癌、膀胱癌、肠癌(大肠和小肠)、脑癌、乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、食道癌、输卵管癌、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、泌尿道癌、子宫癌和外阴癌。

示例性肿瘤包括，例如，卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌)、卵巢颗粒细胞瘤、输卵管腺癌、腹膜癌、子宫(内膜)腺癌、肉瘤样癌、宫颈细胞癌、宫颈腺癌、外阴癌、乳腺癌、原发性和转移性的(导管癌、粘液癌、小叶癌、恶性叶状瘤)、头颈癌、口腔癌(包括舌)、原发性和转移性的食管癌、腺癌、胃腺癌、原发性小肠癌、结肠腺癌、原发性和转移性的(腺癌、粘液癌、大细胞神经内分泌癌、胶体癌)、阑尾腺癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌(鳞状、基底样)、类癌瘤、原发性和转移性的(阑尾、小肠、结肠)、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌癌、胆管癌)、转移至肝的癌、肺癌、原发性和转移性的(鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、巨细胞癌、非小细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞癌神经内分泌癌、大细胞癌、支气管肺泡癌)、肾细胞(肾)癌，原发性和转移性的膀胱癌、原发性和转移性的前列腺腺癌、原发性和转移性的脑肿瘤、原发性和转移性的(胶质母细胞瘤、多形性、脑神经外胚层恶性肿瘤，神经外胚层肿瘤、少突胶质细胞瘤、恶性星形细胞瘤)、皮肤肿瘤(恶性黑素瘤、皮脂腺细胞癌)、甲状腺癌(乳头状和滤泡状)、胸腺癌、shenoidal癌、不明原发癌、神经内分泌癌、睾丸恶性肿瘤(精原细胞瘤、胚胎性癌、恶性混合性肿瘤)等。

(b)免疫细胞

根据本发明可以检测和分析的免疫细胞包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B细胞和自然杀伤细胞)、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞(衍生的粒细胞和单核细胞))。

II.样品加工和细胞计数

实体瘤样品可以从受试者获得并通过本领域已知的任何方式加工成细胞的单细胞悬液。如本文所用的，“单细胞悬液”是一种或多种细胞在液体样品中的悬浮液，其中细胞主要呈单细胞形式而不是细胞簇或聚集体的形式。在某些实施方案中，单细胞代表细胞悬液中60％、70％、80％、90％或95％的细胞。

在某些实施方案中，通过人工和/或酶消化实体瘤。例如，可以将实体瘤样品切成较小的块并使用胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNAse、分散酶和/或透明质酸酶进行酶消化。在某些实施方案中，将消化的组织进行过滤，以除去较大的、未消化的块。

除上述之外或替代于上述，可以使用自动组织匀浆器，如gent

OctoDissociator(Miltenyi Biotec GmbH，Bergish Gladbach，德国)进行组织解离。可以过滤细胞以去除未消化的组织，例如，使用70μM滤器。

所得到的单细胞悬液可包含存在于肿瘤微环境中的所有细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、基质细胞、肿瘤/癌细胞和免疫细胞。

解离后，可以将细胞洗涤、沉淀、重悬和/或计数。可以使用本领域已知的任何方式对细胞进行计数，例如使用手动细胞计数器或自动细胞计数器。例如，对于实体瘤，可以使用自动细胞计数器获得有核细胞计数，所述细胞计数器使用例如明场成像和/或荧光成像(例如双荧光成像)。示例性自动细胞计数器包括Nexcelom Cellometer 2000(Nexcelom，Lawrence，MA)、Countess II FL自动细胞计数器(ThermoFisher，Waltham，MA)和

自动细胞计数器(BioRad，Hercules，CA)。对于全血、骨髓、PBMC或BMMC，可以使用自动细胞计数器，如coulter计数器，例如Beckman Coulter Act2 Diff(Beckman Coulter,Inc.，Brea，CA)。

在确定样品中大致的细胞数后，可以基于细胞计数将细胞沉淀并以所需浓度重悬于缓冲液中。适用的缓冲液包括RPMI1640+10％FBS+1％青霉素链霉素和或RPMI1640+10％FBS或1X PBS+0.5％BSA。细胞可以以约0.5至约5×10⁶个细胞/mL，例如约0.5至约1×10⁶个细胞/mL、约0.5至约2×10⁶个细胞/mL、约0.5至约3×10⁶个细胞/mL、约0.5至约4×10⁶个细胞/mL、约1至约2×10⁶个细胞/mL、约1至约3×10⁶个细胞/mL、约1至约4×10⁶个细胞/mL、约1至约5×10⁶个细胞/mL、约2至约3×10⁶个细胞/mL、约2至约4×10⁶个细胞/mL、约2至约5×10⁶个细胞/mL、约3至约4×10⁶个细胞/mL、约3至约5×10⁶个细胞/mL、约4至约5×10⁶个细胞/mL的浓度重悬。在某些实施方案中，细胞以约1.2至约2.4×10⁶个细胞/mL、约1.2至约2×10⁶个细胞/mL、约1.2至约1.5×10⁶个细胞/mL、约1.5至约2.4×10⁶个细胞/mL、约1.5至约2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬。

III.细胞分析

为了分析最初与TME一起处置的细胞，将一旦转化为单细胞悬液的细胞与多种(例如，5、6、7、8、9、10、11、20、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多种)结合以选择细胞表面标志物的标记试剂，从而确定细胞是癌细胞还是免疫细胞或亚型，和/或此类细胞或亚型是否表达例如IMR、IMR-L或细胞激活标志物。

具体地，可以使用活体染料(例如，胺反应性染料Alexa750)对细胞进行涂布和染色以区分活细胞与死细胞。细胞可以在染色缓冲液(例如，1X PBS+0.5％BSA)中洗涤。可以使用例如Biotek ELx450深孔板清洗机，使清洗步骤自动化。可以使用本领域的标准方法固定和渗透细胞，例如使用来自eBioscience(ThermoFisher，Waltham，MA)的FOXP3/Transcription Staining Buffer Kit。然后可以在染色缓冲液(例如，1X PBS+0.5％BSA)中洗涤细胞并用一种或多种标记试剂染色来检测一种或多种细胞标志物。染色细胞的方法取决于所用的标记试剂。

(a)细胞表面标志物

本文公开的方法可以用于检测任何细胞表面标志物，如癌细胞标志物、激活标志物或IMR或IMR-L标志物。

细胞类型标志物是存在于特定细胞类型(例如，癌细胞或免疫细胞)之中或之上的蛋白质或其他分子。在某些实施方案中，特定的癌细胞标志物的存在可以指示癌症的类型。在某些实施方案中，特定的癌细胞标志物的存在提供了用于癌症治疗的靶标。示例性癌细胞标志物包括CD44、CD47、CD49f、CD271、CD326、细胞角蛋白(胞内)、E-钙粘蛋白和/或波形蛋白。在某些实施方案中，特定的免疫细胞标志物的存在将免疫细胞鉴定为特定的免疫细胞类型或亚型。示例性免疫细胞标志物提供于以下的表1中。

表1

激活标志物可以是蛋白质或其他分子。癌细胞或免疫细胞之中或之上的激活标志物的存在指示某些途径(例如，免疫途径)是有活性的。示例性激活标志物包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40、CD44、CD62L、CD69、CD80、CD86、CD95、CD95L、CD127、CCR7(CD197)和/或功能标志物(例如，IFNγ、TNFα和/或其他细胞因子和/或颗粒酶B。

示例性IMR或IMR-L标志物包括PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、OX40(CD134)、TIM3(CD366)，GITR(CD357)、4-1BB(CD137)、KIR(CD158B)、2B4(CD244)、ICOS(CD278)、IDO、TIGIT、CD73、CD39、CD172a(SIRPa)、B7H4(B7S1)、VISTA(B7-H5)、CD355(CRTAM)、KLRG1、CD160(BY55、NK1、NK28)、CD30(TNFRSF8)、CD224(GGT1)、CD226、CD272(BTLA)和/或CD115(CSF-1R)。

在某些实施方案中，根据本文的方法可以检测其他信号传导标志物。在某些实施方案中，所述方法包括检测受体或转运子(例如，CD3、CD4、CD5、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD25、CD27、CD28、CD31、CD34、CD38、CD45、CD45RA、CD45RO、CD56、CD69、CD71、CD80、CD86、CD90、CD117、CD123、CD133、CD135、CD235、细胞角蛋白、EPCAM、FOXP3、HLA-DR、IgD、IgG、IgM、MDR1、ABCG2)、DNA损伤或凋亡信号传导分子(例如Bcl-2、Bcl-xL、细胞色素C、Caspase 3或8、cPARP、膜联蛋白V、DNMT1、3a、3b、p-H2AX、p-53BP1、p-ATM、p-DNA-PKcs、p-p53、P53、p21、p-Chk2、p-RPA2、p-BRCA1)、免疫信号传导分子(例如p-Akt、p-Blnk、p-Erk、p-Gsk3b、p-Lyn、p-NFkB、p-Plcg2、p-S6、p-Stat5、p-Syk、p-SLP-76、p-ZAP-70、p-Lck、p-CD3z、p-Vav、p-Lat、p-Pyk2)、分化、成熟和/或细胞因子/趋化因子反应信号传导分子(例如p-Stat1、p-Stat3、p-Stat4、p-Stat5、p-Stat6、p-Erk、p-p38、p-NFkB、IkB、pRelB)、胞内细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL17A、IFNa、IFNg、TNFa)、细胞毒性效应子功能的度量(例如CD107a、颗粒酶、穿孔素、膜联蛋白V)、PKC、CA⁺⁺信号传导分子(例如p-Akt p-Erk、p-PLCg2、p-PKCa p-S6、p-p38)、存活、增殖、细胞周期和模式识别受体信号传导分子(例如p-Akt p-NFkB p-S6、IkB、p-Erk p-p38、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、p-CDK1、p-HH3、p-MK2、p21、p-CREB、p-c-JUN)

在某些实施方案中，测量一组细胞标志物，以鉴定细胞类型、IMR和/或IMR-L和/或耗竭标志物。示例性的细胞标志物组显示于表2中。

表2

例如，在某些实施方案中，同时检测至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或更多种不同的细胞表面标志物。在某些实施方案中，同时检测5至19种、6至18种、7至17种、8至16种、9至15种、10至14种、10至13种、11至12种、5至14种、6至14种、7至14种、8至14种、9至14种、10至14种、11至14种、12至14种、13至14种、5至16种、6至16种、7至16种、8至16种、9至16种、10至16种、11至16种、12至16种、13至16种、14至16种，或15至16种不同的细胞表面标志物。在本文所述方法的某些实施方案中，同时检测至少14种不同的细胞表面标志物。

在某些实施方案中，可以检测标记D细胞之间的受体-配体相互作用，例如检查点抑制剂与其同源配体之间的相互作用。示例性受体-配体对描绘于图3中。例如，受体-配体相互作用可以选自PD-1和PD-L1、CTLA-4和B7-1和/或B7-2、TIM-3和Gal9、TIGIT/CD112-CD155、GITR和GITRL、OX-40和OX40L、CD-27和CD70、4-1BB和4-1BBL、LAG3/MHC、KIR？MHC和/或CD-40L和CD40之间的相互作用。

(b)用于与单细胞悬液组合的标记试剂

预期单细胞悬液，一旦制备，可分布在多个接收容器之间，例如多孔板中的孔，例如96或364孔板，并准备用于细胞计数分析。

细胞涂布和随后的处理步骤可以自动进行，例如使用Hamilton机器人液体处理机(Hamilton Company，Reno，NV)。可以使用本领域已知的任何方法在暴露于标记试剂之前固定和渗透细胞。在某些实施方案中，如果标记试剂对固定敏感，则在没有固定和渗透的情况下或在固定和渗透之前，将细胞暴露于标记剂。在某些实施方案中，标记试剂包括与标记偶联(例如共价偶联)的结合剂(例如结合复合物的成员，例如抗体、蛋白质、适体、avimer、Adnectin和

配体、配体受体对的成员、小分子抑制剂)，其中结合剂结合细胞表面标志物(例如，癌细胞标志物、激活标志物或免疫调节受体(IMR)或IMR-配体(IMR-L)标志物)。在某些实施方案中，将细胞暴露于结合细胞表面标志物以形成细胞表面标志物/结合剂复合物的结合剂(例如，抗体)，并且将细胞表面标志物/结合剂复合物暴露于结合细胞表面标志物/结合剂复合物的标记试剂。在某些实施方案中，使用寡核苷酸缀合物(即，寡核苷酸标记)，其中结合剂(例如，抗体)与第一寡核苷酸缀合，而与第一寡核苷酸互补(即，能够结合(杂交))的第二寡核苷酸与一个或多个标记(例如，一个或多个荧光团)直接或间接缀合。第一和第二寡核苷酸的退火将结合剂连接到一个或多个标记。包含结合剂-标记缀合物的退火的寡核苷酸缀合物然后可用于细胞计数应用(例如，流式细胞术)中。

(c)结合剂

适用于根据本文方法的结合剂包括可优先结合本文所述的细胞表面标志物(例如，癌细胞标志物、激活标志物或免疫调节受体(IMR)或IMR-配体(IMR-L)标志物)的任何物质。例如，结合剂可以包括抗体(例如，单克隆抗体)蛋白质、肽适体、avimer、Adnectins和

配体、配体受体对的成员和小分子抑制剂。

示例性的结合剂可以包括CD44结合剂、CD47结合剂、CD49f结合剂、CD271结合剂、CD326结合剂、细胞角蛋白结合剂、E-钙粘蛋白结合剂、波形蛋白结合剂、CD25结合剂、CD26结合剂、CD27结合剂、CD28结合剂、CD38结合剂、CD40结合剂、CD44结合剂、CD62L结合剂、CD69结合剂、CD80结合剂、CD86结合剂、CD95结合剂、CD95L结合剂、CD127结合剂、CCR7(CD197)结合剂、IFNγ结合剂、TNFα结合剂、颗粒酶B结合剂、PD-1(CD279)结合剂、PD-L1(CD274)结合剂、CTLA-4(CD152)结合剂、LAG3(CD223)结合剂、OX40(CD134)结合剂、TIM3(CD366)结合剂、GITR(CD357)结合剂、4-1BB(CD137)结合剂、KIR(CD158B)结合剂、2B4(CD244)结合剂、ICOS(CD278)结合剂、IDO结合剂、TIGIT结合剂、CD73结合剂、CD39结合剂、CD172a(SIRPa)结合剂、B7H4(B7S1)结合剂、VISTA(B7-H5)结合剂、CD355(CRTAM)结合剂、KLRG1结合剂、CD160(BY55、NK1、NK28)结合剂、CD30(TNFRSF8)结合剂、CD224(GGT1)结合剂、CD226结合剂、CD272(BTLA)结合剂，和/或CD115(CSF-1R)结合剂。

适用于根据本文方法的抗体包括抗CD44抗体、抗CD47抗体、抗CD49f抗体、抗CD271抗体、抗CD326抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗CD25抗体、抗CD26抗体、抗CD27抗体、抗CD28抗体、抗CD38抗体、抗CD40抗体、抗CD44抗体、抗CD62L抗体、抗CD69抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD95抗体、抗CD95L抗体、抗CD127抗体、抗CCR7(CD197)抗体、抗IFNγ抗体、抗TNFα抗体、抗颗粒酶B抗体、抗PD-1(CD279)抗体、抗PD-L1(CD274)抗体、抗CTLA-4(CD152)抗体、抗体-LAG3(CD223)抗体、抗OX40(CD134)抗体、抗TIM3(CD366)抗体、抗GITR(CD357)抗体、抗4-1BB(CD137)抗体、抗KIR(CD158B)抗体、抗2B4(CD244)抗体、抗ICOS(CD278)抗体、抗IDO抗体、抗TIGIT抗体、抗CD73抗体、抗CD39抗体、抗CD172a(SIRPa)抗体、抗B7H4(B7S1)抗体、抗VISTA(B7-H5)抗体、抗CD355(CRTAM)抗体、抗KLRG1抗体、抗CD160(BY55、NK1、NK28)抗体、抗CD30(TNFRSF8)抗体、抗CD224(GGT1)抗体、抗CD226抗体、抗CD272(BTLA)抗体，和/或抗CD115(CSF-1R)抗体。

(d)标记试剂

(i)荧光团(包括可见光荧光团标记和红外荧光团标记)

适用于根据本文方法使用的荧光团包括但不限于Cy5.5、Cy5和Cy7(GEHealthcare)；AlexaFluor488、AlexaFluor594、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750和AlexaFluor790(Invitrogen)；VivoTag680、VivoTag-S680和VivoTag-S750(VisEn Medical)；Dy677、Dy682、Dy752和Dy780(Dyomics)；DyLight547、DyLight647(Pierce)；HiLyte Fluor647、HiLyte Fluor680和HiLyte Fluor750(AnaSpec)；IRDye 800CW、IRDye 800RS和IRDye 700DX(Li-Cor)；和ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS(American Dye Source)和Kodak X-SIGHT650、Kodak X-SIGHT691、Kodak X-SIGHT751(Carestream Health)、PE、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、FITC、BV421、BV510、BV605。

(ii)重金属标记

将重金属标记，如镧系元素，用于本文所述方法的某些实施方案中，例如质谱细胞术。镧系元素包括但不限于镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)和镥(Lu)。在某些实施方案中，使用镧系元素同位素，包括例如¹³⁹La、¹⁴¹Pr、¹⁴²Nd、¹⁴⁴Nd、¹⁴⁵Nd、¹⁴⁶Nd、¹⁴⁷Nd、¹⁴⁷Sm、¹⁵²Sm、¹⁵¹Eu、¹⁵³Eu、¹⁵⁶Gd、¹⁵⁹Tb、¹⁶⁴Dy、¹⁶⁵Ho、¹⁶⁶Er、¹⁶⁹Tm、¹⁷¹Yb、¹⁷⁴Yb和¹⁷⁶Yb。

(e)细胞计量术

(i)流式细胞术

在某些实施方案中，使用流式细胞术分析标记的细胞。一旦使用例如本文所述的染色程序获得标记的细胞，通过流式细胞术分析标记的细胞。可用于本文方法的示例性流式细胞仪包括例如能够同时测量多种(例如，16种)荧光染料的Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher，Waltham，MA)、CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)、FACSVerse或FACSCanto II流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)或Aurora流式细胞仪(Cytek，Oakland，CA)。可以使用例如流式细胞仪的标准设置来分析来自流式细胞仪的数据捕获。

在某些实施方案中，在获取流式细胞术数据之前，使用来自Qognit，Inc.(Qognit，San Carlos，CA)的Ryvett软件将诸如样品ID、标记试剂以及流式细胞仪仪器设置和采集参数之类的信息并入板布局文件(plate layout file)中。这个板布局文件可以在采集之前导入到流式细胞术软件中。流式细胞术数据生成后，可以使用所需的门控程序在Ryvett软件中对流式细胞术标准(FCS)文件进行分析和门控。在手动审阅自动门控后，可以使用预定义的标准和数据提取程序将原始数据和计算出的指标导出到CSV文件中。

在某些实施方案中，流式细胞术数据可以使用WinList(Software House，Topsham，ME)、Ryvett(Qognit，Redwood City，CA)、FlowJo(FloJo LLC，Ashland，OR)或Kaluza(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)中的门控进行分析。

使用这种软件，可以探查TME中的细胞群，以确定TME中存在什么癌细胞和免疫细胞、它们的状态(例如，非活化、活化的或耗竭的)，以及细胞是否表达一种或多种IMR或IMR-L。

如本领域所理解的，可以使用门控树来分析来自流式细胞术实验的细胞群并将其分成更离散的群作为门控树的分支。图1和图2描绘了用于从预先确定的门控程序中自动提取指标的门控树，用于在Treg染色组中鉴定Treg和颗粒酶B或细胞因子的表达。每个门(在图1和图2中定义为G4、G9、G10、G17等)由多个区域组成，这些区域组合在一起以利用布尔逻辑(例如，“和”、“或”、和“非”语句)形成门控方案，来包括、排除或组合在门中展示的细胞群。

除了确定细胞上给定的细胞表面标志物(例如，细胞类型标志物、免疫调节受体(IMR)或IMR-配体(IMR-L)的存在，本文所述的方法可以包括定量测量此类标志物的含量，例如，可以以参考荧光团(EFR)的等价数量的方式来直接测量标志物的含量。参见，例如，Gaigalas等(2016)JOURNAL OF RESEARCH OF THE NATIONAL INSTITUTE OF STANDARDSAND TECHNOLOGY121:264-281。在某些实施方案中，如果测量的标志物(例如，IMR或IMR-L、激活和/或耗竭标志物)的含量超过特定阈值，则将受试者确定为可能响应免疫调节剂。

(ii)质谱细胞术

在某些实施方案中，使用质谱细胞术分析标记的细胞。质谱细胞术结合了流式细胞术和质谱。与通过测量不同报告分子的荧光谱来区分信号的流式细胞术相比，质谱细胞术使用与稳定的重金属同位素偶联的探针(例如，抗体)，使用质谱细胞仪，如通过飞行时间流式

系统(Fluidigm，San Francisco，CA)的细胞术。(Bandura等(2009)ANAL CHEM.81:6813-6822；Bjornson等(2013)CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY 25:484-494.)一旦使用例如本领域已知的方法获得标记的细胞，通过质谱细胞术分析标记的细胞。可用于本文方法的示例性质谱细胞仪包括例如

(Fluidigm，San Francisco，CA)。可以使用例如质谱细胞仪软件，例如

软件v.7.0(Fluidigm，San Francisco，CA)分析从质谱细胞仪捕获的数据。

在某些实施方案中，可以使用互信息的条件密度重采样估计(DREMI)分析质谱细胞术数据，它任选可以与条件密度重缩放可视化(DREVI)结合使用(Krishnaswamy等(2014)SCIENCE 346(6213):1250689)。

因此，与流式细胞术一样，质谱细胞术可以用于探查TME中的细胞群，以确定TME中存在哪些癌细胞和免疫细胞、它们的状态(例如，非活化、活化的或耗竭的)，以及细胞是否表达一种或多种IMR或IMR-L。此外，质谱细胞术可用于执行单细胞基因组测序，以揭示例如单细胞(例如免疫细胞或癌细胞)中的突变(例如，体细胞突变)。

(iii)图像细胞术

在某些实施方案中，使用图像细胞术分析标记的细胞。图像细胞术可以用于测量许多与流式细胞术一样的参数，但另外还包括使用自动显微镜和计算图像处理和分析的三维成像，这允许基于荧光和/或形态参数的数以万计的细胞事件的采集和识别。因此，与流式细胞术相比，图像细胞术还可以通过真实图像评估细胞事件。Barteneva等(2012)JHISTOCHEM CYTOCHEM 60(10):723-733提供了成像细胞术的概述。

示例性成像细胞仪包括

Imaging Flow Cytometer和

Mk II Imaging Flow Cytometer(Luminex Corp.，Austin，TX)。

在某些实施方案中，使用图像细胞术来探查TME中的细胞群，以确定TME中存在哪些癌细胞和免疫细胞、它们的状态(例如，非活化、活化的或耗竭的)，以及细胞是否表达一种或多种IMR或IMR-L。此外，在某些实施方案中，使用图像细胞术来评估细胞(例如癌细胞和/或免疫细胞)的形态特征、两种蛋白质的共定位、两种细胞(例如癌细胞和/或免疫细胞)的结合、免疫突触形成的可视化和核易位。此外，图像细胞术可用于进行单细胞基因组测序，以揭示例如单细胞(例如免疫细胞或癌细胞)中的突变(例如，体细胞突变)。图像细胞术还可以与激光捕获显微切割(LCM)结合使用，用于激光消融质谱以及蛋白质组学和基因组或mRNA分析。

(iv)单细胞技术(SCT)

根据本文公开的方法也可以使用单细胞技术(SCT)来评估TME中的单个细胞以及它们在不同条件下(例如，在存在免疫调节和/或癌症药物的情况下)与其他细胞的相互作用。来自TME的单细胞可以使用多种不同的方法进行分离和操作，包括基于流体的、基于物理的、电场驱动的(例如，介电泳(DEP)、光电镊子(OET)和光学技术，如光镊。(参见，例如，Skelley等(2009)NAT.METHODS 6:147-152；Thieleche等(1999)IEEEENG.MED.BIOL.MAG.18:48-52；Taff等(2005)ANAL CHEM.77:7976-7983；Juan等(2011)NAT.PHOTONICS 5:349-356；和Mirsaidov等(2008)LAB CHIP 8:2174-2181。

在某些实施方案中，使用微流控芯片进行SCT。例如，SCT可以使用基于流体动力学的微流控芯片进行。在其他实施方案中，介电泳数字分选方法使用微流控芯片中的半导体控制电极阵列以在介电泳(DEP)笼中捕获单细胞。

在某些实施方案中，SCT使用微流体载玻片(例如，NanoString Technologies,Inc.，Seattle，WA的

Ann Arbor，MI的Genesis System)进行。

可以使用各种技术分析单细胞，包括生长速率的评估(Cermak等(2016)NAT.BIOTECH 34:1052-1059)、细胞膜电位的测量(Liu等(2017)NANO LETT.17:2757-2764)、细胞基因组和/或转录组的评估(Horgan(2011)OBSTET.GYNAECOL.13:189-195)、蛋白质组(Horgan(2011)上文)和质谱(Li等(2000)TRENDS BIOTECHNOL.18:151-160)。在某些实施方案中，使用之前的一种或多种SCT技术来评估细胞，以确定它们的细胞类型、它们的状态(例如，非活化、活化的或耗竭的)，以及细胞是否表达一种或多种IMR或IMR-L。

V.免疫调节剂

上述系统还可用于确定从TME分离的细胞是否响应单独的或与抗癌药物组合的免疫调节剂的添加。

适用于本文中的免疫调节剂包括能够调节免疫细胞的任何物质，例如，通过激活免疫系统来杀灭肿瘤细胞或通过从肿瘤细胞除去免疫细胞抑制细胞。在某些实施方案中，与标记试剂组合前，将细胞暴露于免疫调节剂。

在某些实施方案中，免疫调节剂是检查点抑制剂。检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂或TIGIT拮抗剂。

在某些实施方案中，检查点抑制剂是PD-1或PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T细胞表面的受体，其可作为免疫系统检查点，在适当的时间抑制或调节T细胞活性，以防止过度活跃的免疫反应。然而，癌细胞可以通过表达配体(例如PD-L1)来利用该检查点，所述配体与T细胞表面的PD-1相互作用以关闭或调节T细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的疗法。在美国专利No.8,728,474和9,073,994以及EP专利No.1537878B1中描述了采用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性治疗方法，并且例如包括使用抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体描述于，例如，在美国专利No.8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(

Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(

Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和匹利珠单抗(CT-011，Cure Tech)。示例性抗PD-L1抗体描述于例如美国专利No.9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括，例如，阿妥珠单抗(

Genentech)、达瓦鲁单抗(durvalumab)(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。

在某些实施方案中，免疫调节剂是CTLA-4抑制剂。在CTLA-4途径中，T细胞上的CTLA-4与其在抗原递呈细胞(而不是癌细胞)表面上的配体(例如，CD80，也称为B7-1，和CD86)相互作用，导致T-细胞抑制。示例性的基于CTLA-4的免疫检查点抑制剂方法描述于美国专利No.5,811,097,5,855,887,6,051,227之中。示例性的CTLA-4抗体描述于美国专利No.6,984,720、6,682,736、7,311,910；7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984，国际(PCT)公开No.WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424，以及欧洲专利No.EP1212422 B1中。示例性CTLA-4抗体包括伊匹单抗或曲美木单抗。

在某些实施方案中，将免疫调节剂结合IDO抑制剂来给药。示例性IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(称为吲哚莫德)、帕卡司他(epacadostat,INCB24360)、纳考莫德(navoximod,GDC-0919)和BMS-986205。

其他免疫调节剂包括，例如，抗CD20抗体，如

(奥法木单抗，GlaxoSmithKine)、

(利妥昔单抗，Genentech，Biogen)和

(利妥昔单抗，Roche)；和抗-CD52抗体，如

(阿仑单抗，Genzyme)。

其他基于抗体的免疫调节剂包括表3中列出的那些。对于表3中的某些抗体，还指示了抗体或抗体-药物偶联物靶向的癌症类型。

表3

一旦鉴定出一种或多种免疫调节剂(单独或结合抗癌药物(如下文讨论的化合物))提供对TME中的癌细胞和/或免疫细胞的积极结局，可以将该免疫调节剂(单独或结合抗癌药物)施用于受试者。

IX.药物组合物和免疫调节剂的给药

对于治疗用途，免疫调节剂优选与药学上可接受的载体组合。如本文所用的，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适用于与人和动物组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”是指适用于与人和动物组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。药学上可接受的载体包括任何标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如，例如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。该组合物还可包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，Remington’s PharmaceuticalSciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton，PA[1975]。药学上可接受的载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和物质用于药物活性物质的用途是本领域已知的。

在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。在这样的实施方案中，合适的配制材料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；双糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普流罗尼(pluronics)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯、Triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company，1990)。

在某些实施方案中，药物组合物可以含有纳米颗粒，例如，聚合纳米颗粒、脂质体或胶束(参见，Anselmo等(2016)BIOENG.TRANSL.MED.1:10-29)。

在某些实施方案中，药物组合物可以含有持续递送或受控递送制剂。用于配制持续递送或受控递送方式(如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和贮库注射剂)的技术也是本领域技术人员已知的。缓释制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或半渗透聚合物基质，其为成形制品形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(2-羟基乙基-乙基丙烯酸酯)、乙烯醋酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。缓释组合物还可以包括可以通过本领域已知的几种方法中的任一种制备的脂质体。

含有本文公开的免疫调节剂的药物组合物可以以剂量单位形式存在并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应配制成与其预期给药途径相容。给药途径的实例是静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜、鞘内和直肠给药。优选的给药途径是IV输注。有用的制剂可以通过制药领域已知的方法来制备。例如，参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版(Mack Publishing Company，1990年)。适用于肠胃外给药的制剂成分包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲剂，例，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的物质，如氯化钠或葡萄糖。

对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体在制造和储存条件下应当是稳定的，并且应当针对微生物进行保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适混合物的溶剂或分散介质。

药物制剂优选是无菌的。灭菌可以通过任何合适的方法来完成，例如通过无菌过滤膜过滤。在组合物被冻干的情况中，可以在冻干和重构之前或之后进行过滤灭菌。

本文所述的组合物可以局部或全身给药。给药通常是胃肠外给药。在优选实施方案中，药物组合物皮下给药，且在至更优选的实施方案中，静脉给药。胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。

通常，活性成分(例如免疫调节剂)的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg的范围内，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg。给药量将取决于变量，如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、患者的整体健康状况、抗体的体内效力、药物制剂和给药途径。初始剂量可以增加到超过上限以快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以小于最佳剂量，并且可以在治疗过程中逐渐增加日剂量。人剂量可以优化，例如，在设计为从0.5mg/kg运行到20mg/kg的常规I期剂量递增研究中进行优化。给药频率可能会有所不同，这取决于给药途径、剂量、免疫调节剂的血清半衰期和所治疗的疾病等因素。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是胃肠外，例如静脉内输注。在某些实施方案中，免疫调节剂是冻干的，并且随后在施用时在缓冲盐水中重构。

VI.疗法

一旦为给定的受试者选择了合适的免疫调节剂，无论是单独的还是与抗癌药物组合的，都可以根据常规的医疗保健实践来治疗该受试者。特别地，可以给受试者施用有效量的免疫调节剂，单独或与有效量的另一种抗癌药物组合。如本文所用的，术语“有效量”是指足以产生有益或所需结果的活性剂(例如，免疫调节剂)的量。有效量可以在一次或多次给药、应用或剂量中给药并且不旨在限于特定的制剂或给药途径。

如本文使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指治疗受试者(例如人)的疾病。这包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；(b)缓解疾病，即引起疾病状态的消退。如本文所用的，术语“受试者”和“患者”是指将通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物优选包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，且更优选包括人。

可以通过本文所述的方法治疗的癌症的实例描述于部分I中。在某些实施方案中，癌症是转移性癌。在某些实施方案中，癌症是难治性癌。

如上所述，预期免疫调节剂可以单独或与另一种癌症药物或治疗剂联合施用。本文所用的术语“联合”被理解为是指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多)不同的治疗，使得治疗对患者的作用在某个时间点重叠。在某些实施方案中，当第二种治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在发生，从而在给药方面存在重叠。这有时在本文中被称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的某些实施方案中，由于联合给药，治疗更有效。例如，与第一种治疗不存在下施用第二种治疗看到的相比，第二种治疗更有效，例如，使用较少的第二种治疗看到了相等的效果，或第二次治疗在更大程度上减轻了症状，或使用第一种治疗看到类似的情况。在某些实施方案中，递送使得与病症相关的症状或其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的。递送可以使得在递送第二种治疗时仍可检测到递送的第一种治疗的效果。

在某些实施方案中，免疫调节剂与一种或多种另外的疗法(例如手术、放疗)或另一种治疗制剂的给药联合施用。在某些实施方案中，另外的疗法可以包括化疗，例如细胞毒剂。在某些实施方案中，另外的治疗可以包括靶向治疗，例如，酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，其他的疗法可以包括抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增殖化合物，例如类固醇、生物免疫调节剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀、抗炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在某些实施方案中，另外的疗法可以包括不同类别的疗法的组合。

可以与本文所述的方法或组合物联合施用的示例性癌症药物包括，例如，抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、铂化剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC抑制剂，例如伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替司他(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古抑菌素A(TSA)、莫西司他(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228，缩肽)、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷、埃坡霉素、插入剂、能够干扰信号传导途径的物质、促进凋亡和辐射的物质，或结合表面蛋白以递送毒性剂的抗体分子缀合物。在一个实施方案中，可以用本文所述的方法或组合物施用的细胞毒剂是基于铂的药剂(如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、托泊替康、伊立替康、阿扎胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷类(例如紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙碱、蒽环类(例如，多柔比星或表柔比星)、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素、蓖麻毒蛋白或美登素。

如本文所用的，术语“受试者”和“患者”可互换使用并且指将通过本发明的方法和组合物治疗的生物体。此类生物优选为哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类动物，如猴、黑猩猩、狒狒和恒河猴)，且更优选为人。

如本文所用的，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍改善的任何效果，例如减轻、减少、调节、阻止、减缓病症、疾病、障碍的进展，改善或消除病症、疾病、障碍等。例如，治疗癌症或肿瘤可意味着减少癌症或肿瘤的生长、调节癌症或肿瘤以阻止癌症或肿瘤的生长、减缓癌症或肿瘤的进展、改善或消除癌症或肿瘤的生长。治疗可以是治愈、改善或至少部分减轻病症，例如癌症。在某些实施方案中，治疗是治愈疾病，例如癌症。除非另有说明，否则术语“障碍”指的是术语疾病、病症或病，并可与这些术语互换使用。

在本申请中，当元素或组分被称为包括在和/或选自所列举的元素或组分的列表中时，应当理解，该元素或组分可以是所列举的元素或组分中的任何一个，或者元素或组分可以选自由两个或更多个所列举的元素或组分组成的组。

在整个说明书中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分，或者过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，预期另外存在基本上由或由所述组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由或由所述加工步骤组成的根据本发明的过程和方法。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

在整个说明书中，当组合物和试剂盒被描述为具有、包括或包含特定组分，或者过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，预期另外存在基本上由或由所述组分组成的本发明的组合物和试剂盒，并且存在基本上由或由所述加工步骤组成的根据本发明的过程和方法。

此外，应当理解，本文描述的组合物或方法的元素和/或特征可以以多种方式组合而不脱离本发明的精神和范围，无论是本文明确的还是隐含的。例如，当提及特定化合物时，除非从上下文另有理解，否则该化合物可用于本发明组合物和/或本发明方法中的各种实施方案。换句话说，在本申请中，已经以能够编写和绘制清晰简洁的申请的方式描述和描绘了实施方案，但是意图并且将意识到实施方案可以在不脱离目前的教导和发明的情况下以各种方式组合或分离。例如，应当理解，本文描述和描绘的所有特征可以适用于本文描述和描绘的本发明的所有方面。

冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本公开中用于指一个或多个(即至少一个)冠词的语法对象，除非上下文不合适。例如，“一个元素”是指一个元素或一个以上的元素。

术语“和/或”在本公开中用于表示“和”或“或”，除非另有指示。

应当理解表述“至少一个”包括表述后的所述对象中的单独的每一个以及两个或更多个所述对象的各种组合，除非从上下文和使用中另有理解。结合三个或更多个所述对象的表述“和/或”应当理解具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括(include)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(have)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”的使用包括其语法等价体，通常应当理解为开放式的和非限制性的，例如，不排除其他未描述的元素或步骤，除非另外特意指出或从上下文另有理解。

当术语“约”的使用在定量值之前时，本发明还包括特定的定量值本身，除非另外特别说明。如本文所用的，除非另有说明或推断，术语“约”是指与标称值的±10％变化。

在提供例如聚合物的分子量而不是绝对值的情况下，除非另有说明或从上下文另有理解，否则分子量应被理解为平均分子量。

一般而言，除非另有说明，否则说明组成的百分比是按重量计的。此外，如果变量没有定义，则以变量的先前定义为准。

应当理解，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或进行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

本文使用的任何和所有实例或示例性语言，例如“如”或“包括”，仅旨在更好地说明本发明，并不构成对本发明范围的限制，除非声称。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。

实施例

本公开通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为将本公开在范围或精神上限于本文所述的具体程序。应当理解，提供这些实施例是为了说明某些实施方案，并且无意由此限制本公开的范围。

实施例1-测定肿瘤微环境的组成

这个实施例显示了要求保护的方法利用表面和胞内标志物确定来自肺、乳腺和肾实体瘤的肿瘤微环境的组成的能力。显示升高水平的CD4+CD25^hiFoxP+Treg的肿瘤表明具有肿瘤扩散的免疫抑制特征，因此预后和客观响应较差，这有助于为患者制定治疗策略。

在这个实施例中，获得肺、乳腺和肾实体瘤样品，并在维持在2-8℃的Therapak受控速率托运装置中的Miltenyi组织运输缓冲液中运送到Pierian Biosciences。收到后，使用无菌一次性手术刀将肿瘤切成2-3mm碎片并放入肿瘤解离缓冲液(RPMI1640+青霉素/链霉素)中。然后使用来自Miltenyi的人肿瘤解离试剂盒的酶和Miltenyi的带有加热器的gent

Octo分离器，将肿瘤碎片机械解离成单细胞悬液。随后将单细胞悬液通过70μM滤器过滤并计数。然后将细胞悬液离心并以所需的细胞浓度重悬于RPMI1640+10％FBS或1XPBS+0.5％BSA中。

在合适的缓冲液中重悬细胞后，将80μL接种到深孔96孔板(2mL体积)的指定孔中。随后，细胞最初使用胺活性染料Alexa750染色15min，以区分活细胞与死细胞。然后使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1XPBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。随后使用来自eBioscience的FOXP3/转录染色缓冲液试剂盒，根据制造商针对在深孔板中处理和染色细胞的建议，对细胞进行固定和渗透。然后使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1X PBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。然后用荧光标记的抗体混合物将细胞染色以检测CD3+、CD4+、CD8+和Treg(CD4+CD25^hiFoxP3+)。将染色的细胞在环境温度下避光孵育1h。然后在终浓度为1％的PFA中固定前，使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1X PBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。

使用Thermo-Fisher Attune NxT 16-色流式细胞仪直接从96孔深孔板获得染色细胞。在采集前，使用来自Qognit,Inc.的Ryvett软件将所有需要的信息(例如样品ID、抗体染色组以及预先确定和固定的流式细胞仪仪器设置和采集参数)合并到96孔板布局中。在采集前将该板布局文件导入Attune NxT软件中。采集后，使用预先确定的门控程序在Ryvett软件中自动分析和门控FCS文件。在手动审阅自动门控后，使用预定义的标准和数据提取程序将原始数据和计算指标导出到CSV文件中。结果显示于图4A-B中。图4A显示了示例性流式细胞术图，显示了CD3+、CD4+、CD8+和Treg(CD4+CD25^hiFoxP3+)的检测。图4B提供的点图显示了CD3+T细胞(以CD45+白细胞的百分比表示)、CD4+和CD8+T细胞(以CD3+T细胞的百分比表示)和Treg(以CD4+T细胞的百分比表示)的表达。

以上结果表明了可以使用本文所述的方法在肿瘤微环境中检测特定类型免疫细胞的存在和含量。了解肿瘤微环境中免疫细胞的组成，例如CD4+/CD8+细胞和CD8+/Treg的比率，对于确定患者响应给予的免疫疗法的潜力非常重要。

实施例2-通过基础和诱导状态下靶标的表面和胞内染色评估来自分离的肿瘤的细胞的功能能力

这个实施例显示了要求保护的方法能通过利用表面和胞内标志物测量来自乳腺、肺和肾实体瘤的已鉴定免疫细胞中功能读数的基础和诱导水平两者来确定功能能力。

在合适的缓冲液中重悬细胞后，将80μL接种到深孔96孔板(2mL体积)的指定孔中。随后，细胞最初使用胺活性染料Alexa750染色15min，以区分活细胞与死细胞。然后使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1XPBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。随后使用白细胞激活混合物和来自Becton Dickinson的BD GolgiPlug^TM，将细胞调制3h。白细胞激活混合物与BD GolgiPlug^TM是即用的多克隆细胞激活混合物，其含有佛波酯、PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯)、钙离子载体(离子霉素)和蛋白质转运抑制剂BD

(布雷菲尔德菌素A)。3h后，随后使用来自eBioscience的FOXP3/转录染色缓冲液试剂盒，根据制造商针对在深孔板中处理和染色细胞的建议，对细胞进行固定和渗透化。然后使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1X PBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。然后用荧光标记的抗体混合物将细胞染色以检测CD3+、CD4+、CD8+和Treg(CD4+CD25^hiFoxP3+)。将染色的细胞在环境温度下避光孵育1h。然后在终浓度为1％的PFA中固定前，使用BiotekELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1X PBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。

使用Thermo-Fisher Attune NxT 16-色流式细胞仪直接从96孔深孔板获得染色细胞。在采集前，使用来自Qognit,Inc.的Ryvett软件将所有需要的信息(例如样品ID、抗体染色组以及预先确定和固定的流式细胞仪仪器设置和采集参数)合并到96孔板布局中。采集后，使用预先确定的门控程序在Ryvett软件中自动分析和门控FCS文件。在手动审阅自动门控后，使用预定义的标准和数据提取程序将原始数据和计算指标导出到CSV文件中。结果显示于图5-6中。图5显示了示例性流式细胞术图，证明检测了CD4+和CD8+T细胞中的基础和诱导的IFNγ和TNFα，以及相关的点图，显示了IFNγ和TNFα的表达(以阳性百分比表示)。图6显示了示例性流式细胞术图，证明检测了来自乳腺、肺和肾肿瘤的CD4+和CD8+T细胞中的颗粒酶B表达。

IFNγ和TNFα是指示具有更大免疫应答潜力的“发炎”肿瘤的细胞因子，在初始免疫疗法治疗和随后的随访中，升高水平的IFNγ和TNFα分别与初始和持久应答相关。颗粒酶B是在CD8+细胞中发现的效应分子，并且是颗粒酶B-穿孔素复合物的一部分，CD8+细胞利用它来杀灭靶肿瘤细胞。降低水平的颗粒酶B与降低的CD8+细胞毒性潜力有关，并且是T细胞耗竭的指标。确定肿瘤中表达颗粒酶B的CD8+细胞的百分比和颗粒酶B表达的定量水平对于预测对免疫疗法的响应和为患者制定治疗策略是有用的。

实施例3-评估来自实体瘤的免疫检查点和耗竭标志物及其同源配体

在这个实施例中，测量了TIL和肿瘤上皮细胞上的免疫检查点/耗竭标志物及其同源配体的表达水平。免疫疗法治疗目前依赖于肿瘤细胞上IMR配体PD-L1表达的单一IHC测量作为治疗指导，但这并不能充分识别肿瘤微环境内任何其他细胞成分上的IMR和IMR-L表达。本文所述的整体方法可以改进患者分层和治疗策略。

在合适的缓冲液中重悬细胞后，将80μL接种到深孔96孔板(2mL体积)的指定孔中。随后，细胞最初使用胺活性染料Alexa750染色15min，以区分活细胞与死细胞。然后使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1XPBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。随后用荧光标记的抗体混合物将细胞染色，以检测CD326+、CD45+、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+和CD14+细胞。另外的标记的抗体用于鉴定以下IMR或IMR-L：CD73、CD112、CD155、CD172ab、CD274、CD279、CD366、TIGIT、TIM-3。将染色的细胞在环境温度下避光孵育20min。然后在终浓度为1％的PFA中固定前，使用Biotek ELx450深孔板洗涤机在染色缓冲液(1X PBS+0.5％BSA)中将细胞洗涤2次。

使用Thermo-Fisher Attune NxT 16-色流式细胞仪直接从96孔深孔板获得染色细胞。在采集前，使用来自Qognit,Inc.的Ryvett软件将所有需要的信息(例如样品ID、抗体染色组以及预先确定和固定的流式细胞仪仪器设置和采集参数)合并到96孔板布局中。采集后，使用预先确定的门控程序在Ryvett软件中自动分析和门控FCS文件。在手动审阅自动门控后，使用预定义的标准和数据提取程序将原始数据和计算指标导出到CSV文件中。

如图7中所示的，肿瘤微环境内检测到CD45+白细胞、CD326+上皮细胞、CD14+单核细胞/巨噬细胞以及CD4+和CD8+T细胞的存在。抑制检查点受体表达的实例显示于图8中，其中在肿瘤微环境中的细胞子集上检测到抑制性IMR TIGIT。具体地，在CD4+、CD8+和CD14+白细胞上检测到TIGIT，但在CD326+肿瘤细胞上未检测到。

测量了IMR/耗竭标志物及其配体(CD279/CD274[PD1/PD-L1]、TIGIT/CD112-CD155、CD366[TIM-3]/Galectin-9、CD172a[SIRPa]/CD47、CD73)的水平，以概括TIL的功能状态。如图9-11中所示的，观察到IMR/IMR-L阳性TIL与阴性TIL以及IMR/IMR-L阳性肿瘤细胞与阴性肿瘤细胞的可靠分离，具有明显的异质性，跨越了细胞和肿瘤类型(乳腺、肺和肾)。这包括TIL上的几种IMR-L以及上皮细胞和基质细胞上的IMR的表达升高，表明调节检查点相互作用的肿瘤-和TIL-内在机制。

这些结果表明了可以使用本文所述的方法鉴定肿瘤微环境中特定细胞类型上的IMR/耗竭标志物及其配体。了解肿瘤微环境中的特定细胞类型(例如，免疫细胞)上的IMR/耗竭标志物及其配体的组成对于确定患者响应给予的免疫疗法的潜力是重要的。

实施例4-用免疫调节剂治疗患者

根据实施例1-3中所述的方法从患者接收肿瘤样品并评价。测量了一组IMR/耗竭标志物及其配体(CD279/CD274[PD1/PD-L1]、TIGIT/CD112-CD155、CD366[TIM-3]/Galectin-9、CD172a[SIRPa]/CD47、CD73)，以概括TIL的功能状态。结果表明了在T细胞上存在PD-1(CD279)，以及在树突细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞中的一种或多种上存在PD-L1(CD274)。考虑如果用抗PD-L1或抗PD-1抗体治疗受试者，肿瘤可能会消退。

实施例5-用免疫调节剂的组合治疗患者

根据实施例1-3中所述的方法从患者接收肿瘤样品并评价。测量了一组IMR/耗竭标志物及其配体(CD279/CD274[PD1/PD-L1]、TIGIT/CD112-CD155、CD366[TIM-3]/Galectin-9、CD172a[SIRPa]/CD47、CD73)，以概括TIL的功能状态。结果表明了在T细胞上存在PD-1(CD279)，以及在树突细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞中的一种或多种上存在PD-L1(CD274)。结果还显示了T细胞和NK细胞上存在免疫检查点蛋白TIGIT，以及在树突细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞中的一种或多种上存在相应的配体CD112和CD255。考虑如果用抗PD-L1或抗PD-1抗体和抗TIGIT抗体两者治疗受试者，肿瘤可能会消退。

按引用并入

本文中提及的每份专利和科学文件的全部公开内容按引用并入用于所有目的。

等效体

本发明可以以其他特定形式实施而不脱离本发明的精神或基本特征。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述来指明，并且在权利要求的等效含义和范围内的所有变化都旨在包括在其中。

Claims

1.一种测定实体瘤微环境组成的方法，该方法包括步骤：

(a)将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，其中细胞表面标志物包括细胞类型标记、免疫调节受体(IMR)和IMR配体(IMR-L)，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞；和

(b)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而(i)确定实体瘤微环境中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量和(ii)确定癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L，从而确定实体瘤微环境。

2.权利要求1的方法，其中细胞计量术选自由流式细胞术、质谱细胞术、图像细胞术和单细胞技术(SCT)组成的组。

3.权利要求1或2的方法，其中多种标记试剂包括至少一种选自由荧光团、红外标记和重金属标记的标记试剂组成的组。

4.之前任一项权利要求的方法，其中免疫细胞包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)，或其组合。

5.之前任一项权利要求的方法，其中细胞表面标志物进一步包括细胞活化标志物。

6.权利要求5的方法，其中细胞类型标志物包括在淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)和/或骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)上表达的标志物。

7.之前任一项权利要求的方法，其中细胞类型标志物是癌细胞标志物。

8.权利要求7的方法，其中癌细胞标志物包括CD44、CD47、CD49f、CD271、CD326、细胞角蛋白(胞内)、E-钙粘蛋白和/或波形蛋白。

9.权利要求5的方法，其中细胞活化标志物包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40、CD44、CD62L、CD69、CD80、CD86、CD95、CD95L、CD127、CCR7(CD197)和/或功能标志物，例如，IFNγ、TNFα和/或其他细胞因子和/或颗粒酶B。

10.权利要求1-9任一项的方法，其中IMR或IMR-L标志物包括PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、OX40(CD134)、TIM3(CD366)，GITR(CD357)、4-1BB(CD137)、KIR(CD158B)、2B4(CD244)、ICOS(CD278)、IDO、TIGIT、CD73、CD39、CD172a(SIRPa)、B7H4(B7S1)、VISTA(B7-H5)、CD355(CRTAM)、KLRG1、CD160(BY55、NK1、NK28)、CD30(TNFRSF8)、CD224(GGT1)、CD226、CD272(BTLA)和/或CD115(CSF-1R)。

11.权利要求1-10任一项的方法，进一步包括将细胞与免疫调节剂组合的步骤。

12.权利要求11的方法，进一步包括确定免疫调节剂对癌细胞和/或免疫细胞上的至少一部分细胞标志物表达的作用。

13.一种确定患有实体瘤的受试者是否可能响应免疫调节剂的方法，该方法包括步骤：

(a)将源自实体瘤的细胞的单细胞悬液与能够结合癌细胞和/或免疫细胞上表达的相应多种细胞表面标志物的多种标记试剂组合，其中细胞表面标志物包括细胞类型标记、免疫调节受体(IMR)和IMR-配体(IMR-L)，并允许所述试剂同时与单细胞悬液中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者结合以产生标记的细胞；

(b)将细胞的单细胞悬液的至少一部分与免疫调节剂组合；和

(c)确定(i)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，以及癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L，和(ii)免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用，从而确定受试者是否可能响应免疫调节剂。

14.权利要求13的方法，其中在步骤(a)之前、之中或之后，将免疫调节剂与单细胞悬液组合。

15.权利要求13或权利要求14的方法，其中细胞计量术选自由流式细胞术、质谱细胞术、图像细胞术和单细胞技术(SCT)组成的组。

16.权利要求13-15的方法，其中多种标记试剂包括至少一种选自由荧光团、红外标记和重金属标记的标记试剂组成的组。

17.权利要求13-17的方法，其中免疫细胞包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)，或其组合。

18.权利要求13-17的方法，其中细胞表面标志物进一步包括细胞活化标志物。

19.权利要求13-18的方法，其中细胞类型标志物包括在淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)和/或骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)上表达的标志物。

20.权利要求13-19的方法，其中细胞类型标志物是癌细胞标志物。

21.权利要求20的方法，其中癌细胞标志物包括CD44、CD47、CD49f、CD271、CD326、细胞角蛋白(胞内)、E-钙粘蛋白和/或波形蛋白。

22.权利要求18的方法，其中细胞激活标志物包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40、CD44、CD62L、CD69、CD80、CD86、CD95、CD95L、CD127、CCR7(CD197)和/或功能标志物，例如，IFNγ、TNFα和/或其他细胞因子和/或颗粒酶B。

23.权利要求13-22任一项的方法，其中IMR或IMR-L标志物包括PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、OX40(CD134)、TIM3(CD366)，GITR(CD357)、4-1BB(CD137)、KIR(CD158B)、2B4(CD244)、ICOS(CD278)、IDO、TIGIT、CD73、CD39、CD172a(SIRPa)、B7H4(B7S1)、VISTA(B7-H5)、CD355(CRTAM)、KLRG1、CD160(BY55、NK1、NK28)、CD30(TNFRSF8)、CD224(GGT1)、CD226、CD272(BTLA)和CD115(CSF-1R)。

24.一种治疗需要的受试者中的实体瘤的方法，该方法包括将有效量的免疫调节剂给药于受试者，由此来治疗实体瘤，其中通过使用包括以下步骤的方法来选择免疫调节剂：

(b)将细胞的单细胞悬液的至少一部分与免疫调节剂组合；和

(c)确定(i)通过细胞计量术确定标记的细胞的存在和/或含量，从而确定实体瘤中存在的癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者的存在和/或含量，以及癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者是否表达至少一种IMR和/或至少一种IMR-L和(ii)免疫调节剂对癌细胞、免疫细胞或癌细胞和免疫细胞两者之上或之中的细胞标志物的作用，从而确定受试者是否可能响应免疫调节剂。

25.权利要求24的方法，其中在步骤(a)之前、之中或之后，将免疫调节剂与单细胞悬液组合。

26.权利要求24或权利要求25的方法，其中细胞计量术选自由流式细胞术、质谱细胞术、图像细胞术和单细胞技术(SCT)组成的组。

27.权利要求24-26任一项的方法，其中多种标记试剂包括至少一种选自由荧光团、红外标记和重金属标记的标记试剂组成的组。

28.权利要求24-27任一项的方法，其中免疫细胞包括淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)、骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)，或其组合。

29.权利要求24-27任一项的方法，其中细胞表面标志物进一步包括细胞活化标志物。

30.权利要求24-29任一项的方法，其中细胞类型标志物包括在淋巴细胞(例如，T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg)、B-细胞和自然杀伤细胞)和/或骨髓细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞和骨髓源性抑制细胞)上表达的标志物。

31.权利要求24-30任一项的方法，其中细胞类型标志物是癌细胞标志物。

32.权利要求31的方法，其中癌细胞标志物包括CD44、CD47、CD49f、CD271、CD326、细胞角蛋白(胞内)、E-钙粘蛋白和/或波形蛋白。

33.权利要求29的方法，其中细胞活化标志物包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD38、CD40、CD44、CD62L、CD69、CD80、CD86、CD95、CD95L、CD127、CCR7(CD197)和/或功能标志物，例如，IFNγ、TNFα和/或其他细胞因子和/或颗粒酶B。

34.权利要求24-33任一项的方法，其中IMR或IMR-L标志物包括PD-1(CD279)、PD-L1(CD274)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、OX40(CD134)、TIM3(CD366)，GITR(CD357)、4-1BB(CD137)、KIR(CD158B)、2B4(CD244)、ICOS(CD278)、IDO、TIGIT、CD73、CD39、CD172a(SIRPa)、B7H4(B7S1)、VISTA(B7-H5)、CD355(CRTAM)、KLRG1、CD160(BY55、NK1、NK28)、CD30(TNFRSF8)、CD224(GGT1)、CD226、CD272(BTLA)和/或CD115(CSF-1R)。

35.权利要求1-34任一项的方法，其中在细胞计量术过程中同时检测多种不同标记的细胞。

36.权利要求1-35任一项的方法，其中在细胞计量术过程中同时检测多种不同的细胞表面标志物。

37.权利要求36的方法，其中同时检测至少14种不同的细胞表面标志物。

38.权利要求1-37任一项的方法，其中可以检测并任选地定量标记的细胞之间的受体-配体相互作用。

39.权利要求38的方法，其中受体-配体相互作用包括检查点抑制剂及其同源配体之间的相互作用。

40.权利要求39的方法，其中受体-配体相互作用选自PD-1和PD-L1、CTLA-4和B7-1和/或B7-2、TIM-3和Gal9、GITR和GITRL、OX-40和OX40L、CD-27和CD70、4-1BB和4-1BBL，和/或CD-40L和CD40之间的相互作用。

41.权利要求1-40任一项的方法，其中测定癌细胞和/或免疫细胞上表达的细胞活化标志物、IMR标志物、IMR-L标志物或活化标志物和IMR和/或IMR-L标志物的组合的存在和/或含量。