CN115916818A - 抗cd19抗体和多特异性结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文提供了抗CD19抗体和结合CD19、CD3和血清白蛋白的多特异性结合蛋白。还提供了包含这些抗体或多特异性结合蛋白的药物组合物、用于制备这些抗体或多特异性结合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及使用这些抗体或多特异性结合蛋白治疗癌症的方法。

Description

抗CD19抗体和多特异性结合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月11日提交的美国临时专利申请号62/946,931的权益和优先权，其公开内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及抗CD19抗体和结合CD19、CD3和任选的血清白蛋白的多特异性结合蛋白。此外，本发明涉及包含这些抗体或多特异性结合蛋白的药物组合物、用于制备这些抗体或多特异性结合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及使用这些抗体或多特异性结合蛋白治疗癌症的方法。
背景技术
双特异性分子如
Figure BDA0003786158540000011
(双特异性T细胞衔接器)构建体是由两个灵活连接的抗体衍生的结合结构域制成的重组蛋白构建体。
Figure BDA0003786158540000012
构建体的一个结合结构域特异于靶细胞上选定的肿瘤相关表面抗原，第二个结合结构域特异于CD3，即T细胞上T细胞受体复合物的亚基。通过这种设计，
Figure BDA0003786158540000013
构建体可以将T细胞与靶细胞瞬时连接，同时有效地激活T细胞对靶细胞的固有溶细胞潜能。
CD3受体复合物是由四条多肽链组成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物包含一条CD3γ(gamma)链、一条CD3δ(delta)链和两条CD3ε(epsilon)链。CD3γ(gamma)、CD3δ(delta)和CD3ε(epsilon)链是高度相关的免疫球蛋白超家族的细胞表面蛋白，包含单个细胞外免疫球蛋白结构域。这些链与T细胞受体(TCR)结合形成TCR-CD3复合物，并在抗原结合后在T淋巴细胞中生成激活信号。约95％的T细胞表达αβTCR，其含有α(alpha)链和β(beta)链。两条TCRξ(zeta)链也存在于TCR-CD3复合物中。αβTCR负责识别主要组织相容性复合体(MHC)呈递的抗原。当TCR与抗原肽和MHC复合体结合时，T淋巴细胞通过由相关酶、共受体、特化衔接分子和激活或释放的转录因子介导的一系列生化事件而激活。
CD19，也称为B细胞表面抗原B4或Leu-12，是在B淋巴细胞和滤泡树突细胞上表达的跨膜蛋白。CD19是B淋巴细胞上B细胞抗原受体复合物的共受体(参见Carter等人(2002)Science,256:105-07；van Zelm等人(2006)N.Eng.J.Med.,354:1901-12)。CD19与B细胞受体(BCR)共同调节对B细胞克隆扩增和体液免疫至关重要的内在和抗原受体诱导的信号传导阈值。CD19是人B细胞表面标志物，从前B细胞发育的早期阶段直到终末分化为浆细胞均有表达。其也在许多非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞和某些白血病上表达。已经开发了结合CD19的抗体，并在针对淋巴起源的癌症如B细胞恶性肿瘤的临床研究中进行了测试(参见，例如，Hekman等人(1991)Cancer Immunol.Immunother.,32:364-72；Vlasfeld等人(1995)CancerImmunol.Immunother.,40:37-47；Corny等人(1995)J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.,18:231-41；以及Manzke等人(2001)Int.J.Cancer，91：516-22)。此外，名为博纳吐单抗(blinatumomab)的
Figure BDA0003786158540000021
构建体已被开发用于临床。
据信
Figure BDA0003786158540000022
构建体会从机体中快速清除。因此，虽然它们能够快速渗透机体的许多区域，并且快速产生且易于处理，但它们的体内应用可能会受到它们在体内的短暂持久性的限制。由于博纳吐单抗和索利托单抗(solitomab)的短的体内半衰期，可能需要通过连续静脉内输注延长施用来实现其治疗效果。然而，这样的连续静脉内输注对患者来说是不方便的并且可能增加治疗成本。
尽管在构建抗CD19抗体和多特异性结合蛋白方面取得了重大进展，但仍然需要具有足够治疗功效、易于制备的形式和有利的药代动力学特性如更长的半衰期的新型有用蛋白用于治疗癌症。
发明概述
本发明部分基于结合CD19的新型抗体的开发。还提供了多特异性结合蛋白，其包含结合CD19(例如，人CD19)的第一结构域、结合CD3(例如，人CD3)的第二结构域和任选的半衰期延长结构域，其可以是结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的第三结构域，其中第一结构域衍生自这些新型抗体。这些结构域以特定方式连接以获得有利的治疗功效和体内半衰期。抗CD19抗体和多特异性结合蛋白可用于治疗与表达CD19的异常细胞相关的疾病和病症，如某些B细胞血液系统恶性肿瘤。
相应地，在一方面，本公开提供了一种多特异性结合蛋白，其包含：(a)以5pM至1nM范围内的KD结合人CD19的第一抗原结合位点；和(b)以0.5nM至20nM范围内的KD结合人CD3的第二抗原结合位点。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白是包含第一和第二抗原结合位点的融合蛋白。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白进一步包含半衰期延长结构域。在某些实施方案中，半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，半衰期延长结构域不位于多肽链中的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点之间。
在某些实施方案中，每个KD通过表面等离子共振测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以5pM至0.1nM范围内的KD结合人CD19，并且第二抗原结合位点以0.5nM至10nM范围内的KD结合人CD3。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人CD3的KD与第一抗原结合位点结合人CD19的KD的比值在10:1至1,000:1的范围内。
在某些实施方案中，每个KD通过生物层干涉法测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以50pM至1nM范围内的KD结合人CD19，并且第二抗原结合位点以1nM至20nM范围内的KD结合人CD3。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人CD3的KD与第一抗原结合位点结合人CD19的KD的比值在10:1至100:1的范围内。
在另一方面，本公开提供了结合人CD19的抗原结合位点，该抗体包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ IDNO:110、111、113、114、115和71的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。
在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ IDNO:110、117、119、114、120和71的氨基酸序列，但不包含分别为93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ IDNO:65、66、68、69、70和71的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:62至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:63至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点以低于或等于1nM的KD结合人CD19。
在另一方面，本公开提供了结合人CD19的抗原结合位点，该抗体包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、54、56、57、58和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、54、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、61、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:4、5、7、8、9和10的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点以低于或等于0.3nM的KD结合人CD19。
在另一方面，本公开提供了一种抗体，其包含如本文公开的结合CD19的抗原结合位点。
在另一方面，本公开提供了一种多特异性结合蛋白，其包含：(a)如本文所公开的结合人CD19的第一抗原结合位点；和(b)结合人CD3的第二抗原结合位点。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白进一步包含半衰期延长结构域。在某些实施方案中，半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:184、409和411的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ IDNO:184、185和187的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:189、190和192的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:189、193和195的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:123、124和126的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点的VH包含与SEQ ID NO:121至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第三抗原结合位点以低于或等于10nM的KD结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，第三抗原结合位点以低于或等于2nM的KD结合蛋白A。在某些实施方案中，第三抗原结合位点具有高于或等于60℃的解链温度。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含单条多肽链。在某些实施方案中，第三抗原结合位点不位于多肽链中的第一抗原结合位点和第二抗原结合位点之间。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的N端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的N端，并且第一抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的N端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的N端，并且第二抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的N端。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的C端。在某些实施方案中，第一抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的N端，并且第二抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的N端。在某些实施方案中，第二抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的N端，并且第一抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的N端。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的N端，并且第三抗原结合位点位于多肽链中第二抗原结合位点的N端。在其他实施方案中，第二抗原结合位点位于多肽链中第三抗原结合位点的N端，并且第三抗原结合位点位于多肽链中第一抗原结合位点的N端结合蛋白。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点包含单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含单结构域抗体(sdAb)。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含scFv。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人CD3ε。在某些实施方案中，第二抗原结合位点以1-100nM范围内的KD结合人CD3ε。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、416、418、419、420和421所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:412至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含SEQ ID NO:422或423的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、416、426、419、420和421所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:424至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含SEQ ID NO:427或428的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、431、418、419、420和432所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:429至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:430至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含SEQ ID NO:433或434的氨基酸序列。
在某些实施方案中，至少两个相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。在某些实施方案中，每个相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。在某些实施方案中，肽接头包含SEQ IDNO:298、299或302的氨基酸序列。在某些实施方案中，肽接头由SEQ ID NO:298、299或302的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含选自SEQ ID NO:694-710的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白不包含抗体Fc区。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为至少65kD。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的血清半衰期为至少24、36、48或60小时。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：(a)本文公开的多特异性结合蛋白或抗体；和(b)药学上可接受的载剂。
本公开还提供了编码本文公开的多特异性结合蛋白或抗体的分离的多核苷酸。此外，本公开提供了包含本文公开的多核苷酸的载体，以及包含本文公开的多核苷酸或载体的重组宿主细胞。
本公开还提供了产生多特异性结合蛋白或抗体的方法，该方法包括在允许多特异性结合蛋白或抗体表达的合适条件下培养本文公开的宿主细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离多特异性结合蛋白或抗体。在某些实施方案中，该方法进一步包括将分离的多特异性结合蛋白或抗体与药学上可接受的载剂共同配制。
此外，本公开提供了刺激针对表达CD19的细胞的免疫应答的方法，该方法包括将所述细胞和T淋巴细胞暴露于本文公开的多特异性结合蛋白、抗体或药物组合物。
本公开还提供了在有需要的受试者中治疗血液癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的多特异性结合蛋白、抗体或药物组合物。在某些实施方案中，血液癌症是B细胞血液系统恶性肿瘤。
此外，本公开提供了一种复合物，其包含表达CD3的T细胞、表达CD19的B细胞和本文公开的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白同时结合T细胞和B细胞。在某些实施方案中，复合物进一步包含血清白蛋白。
附图说明
图1是单链多特异性结合蛋白的六个结构域排列的示意图。scFv形式的CD19结合结构域、scFv形式的CD3结合结构域和sdAb形式的HSA结合结构域以不同的取向连接。每个构建体的顶部代表给定多肽链的N端，每个构建体的底部代表给定多肽链的C端。
图2A-2B是显示所示多特异性结合蛋白用于诱导T细胞对KILR-Raji细胞的细胞毒性的EC50值的条形图。
图3A是显示所示多特异性结合蛋白用于诱导细胞因子IL2、IFNγ和TNFα产生的EC50值与相同多特异性结合蛋白用于诱导T细胞对Raji细胞的细胞毒性(“存活％”)(当所培养的T细胞和Raji细胞的数量比例为5:1时)的EC50值相比的图。图3B是显示当所培养的T细胞和Raji细胞的数量比例为0.5:1时，由多特异性结合蛋白tAb0050、tAb0063和对照博纳吐单抗介导的T细胞细胞毒性百分比的条形图。
图4A-4D描绘了用于评估经多特异性结合蛋白治疗后的肿瘤消退的体内实验的结果。在一项实验中，小鼠接受了用测试多特异性结合蛋白的高剂量治疗(0.1mg/kg/剂)，并评估了肿瘤体积(图4A)和存活百分比(图4B)。在另一项实验中，小鼠接受了用测试多特异性结合蛋白的低剂量治疗(0.01mg/kg/剂)，并评估了肿瘤体积(图4C)和存活百分比(图4D)。
图5A-5D描绘了用多特异性结合蛋白tAb0050或博纳吐单抗治疗的小鼠中的体内剂量功效研究结果。肿瘤生长数据显示在图5A中。显示了0.01mg/kg/剂(图5B)、0.03mg/kg/剂(图5C)和0.1mg/kg/剂(图5D)的每种治疗的存活百分比。
发明详述
本发明部分基于结合CD19的新型抗体的开发。还提供了多特异性结合蛋白，其包含结合CD19(例如，人CD19)的第一结构域、结合CD3(例如，人CD3)的第二结构域和任选的半衰期延长结构域，其可以是结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的第三结构域，其中第一结构域衍生自这些新型抗体。这些结构域以特定方式连接以获得有利的治疗功效和体内半衰期。抗CD19抗体和多特异性结合蛋白可用于治疗与表达CD19的异常细胞相关的疾病和病症，如某些B细胞血液系统恶性肿瘤。
为了促进对本发明的理解，下文限定了多个术语和短语。
术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两个或更多个不同靶标(例如，两个或更多个不同抗原或相同抗原的两个或更多个不同表位)的蛋白质或蛋白质缀合物。例如，多特异性结合蛋白可以通过两个或更多个不同的结合结构域结合两个或更多个不同的靶标。多特异性结合蛋白的结构和/或功能可以基于抗体的结构和/或功能，抗体例如为全长或完整的免疫球蛋白分子、抗体重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(VL)、和/或单链抗体。在一个实例中，根据本发明的多特异性结合蛋白的每一个结合结构域包含允许靶标结合的抗体最低结构要求。该最低要求可以例如由至少三个重链CDR(即VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个轻链CDR(即VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3)的存在来限定。限定抗体的最低结构要求的可选方法是限定抗体结合的特定靶标的表位，或通过参考已知抗体，该已知抗体与所述抗体竞争结合已知抗体结合的相同表位。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫抗体、人源化抗体和人抗体。
根据本发明的多特异性结合蛋白的任何一个结合结构域可以包含上述CDR组。那些CDR可以包含在VH和/或VL的框架中。例如，Fd片段具有两个VH结构域，并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域形式的其他实例包括：(1)Fab片段，其为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab')2片段，其为具有通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，其可以衍生自例如scFv文库。根据本发明的多特异性结合蛋白的示例性形式描述于例如，WO2000006605A2、WO2005040220A1、WO2008119567A2、WO2010037838A2、WO2013026837A1、WO2013026833A1、US20140308285A1、US20140302037A1、WO2014144722A2、WO2014151910A1和WO2015048272A1。
根据本发明的多特异性结合蛋白还可以包含抗体的修饰片段，也称为抗体变体，如di-scFv或bi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、二价抗体(diabodies)、单链二价抗体、串联二价抗体(Tandab's)、串联di-scFv、串联tri-scFv、“多价抗体(multibodies)”如三价抗体(triabodies)或四价抗体(tetrabodies)，或单结构域抗体如纳米抗体或包含单个可变结构域的单可变结构域抗体，其可以是VH(在sdAb的情况下也称为VHH)或VL，它们独立于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位。
如本文所用，术语“单链Fv”、“单链抗体”和“scFv”是指包含来自重链和轻链的可变区但缺少恒定区的单多肽链抗体片段。通常，单链抗体进一步包含连接VH和VL结构域的肽接头，使其能够形成期望的结构以结合抗原。单链抗体由Pluckthun在The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,纽约,pp.269-315(1994)中详细讨论。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号WO 88/01649；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等人(1989)Nature334:54454；Skerra等人(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。在具体实施方案中，单链抗体也可以是双特异性的、多特异性的、人的、人源化的和/或合成的。
此外，本文所述的“多特异性结合蛋白”可以是单价、二价或多价构建体。此外，本文所述的“多特异性结合蛋白”可以包括仅由一条多肽链组成的分子，或由多于一条多肽链组成的分子，其中这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体)或不同的(异源二聚体、异源三聚体或异源寡聚体)。上述鉴定的抗体及其变体或衍生物的实例描述于例如Harlow和Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)；UsingAntibodies:a laboratory manual,CSHL Press(1999)；Kontermann和Dibel,AntibodyEngineering,Springer,2nd ed.2010；以及Little,Recombinant Antibodies forImmunotherapy,Cambridge University Press 2009中。
本发明的多特异性结合蛋白的结构域可以通过一个或多个肽键和/或肽接头连接。根据本发明，术语“肽接头”包含连接两个结构域的氨基酸序列。肽接头也可以用于将第三结构域与本发明的多特异性结合蛋白的其他结构域融合。此类肽接头的基本技术特征是其不包含任何聚合活性。合适的肽接头包括美国专利号4,751,180和4,935,233或WO198809344A1中描述的那些。
本发明的多特异性结合蛋白可以是体外生成的多特异性结合蛋白。术语“体外生成的多特异性结合蛋白”是指根据上述限定的多特异性结合蛋白，其中全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)通过非免疫细胞选择生成，例如通过体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可以测试候选序列与抗原结合的能力的任何其他方法生成。本发明的多特异性结合蛋白也可以通过动物免疫细胞中的基因组重排生成。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制备的抗体。
本发明的多特异性结合蛋白可以是单克隆的。如本文所用，术语“单克隆”是指从群体中获得的蛋白质基本上是同质的，即群体中的个体蛋白质除了可能存在的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外是相同的。在抗体的情况下，单克隆抗体是高度特异性的，直接针对抗原上的单个抗原侧或决定簇，这与通常包括直接针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂形成对比。修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
本发明的多特异性结合蛋白或其一个或多个抗原结合位点可以是亲和力成熟的。在免疫学中，亲和力成熟是B细胞在免疫应答过程中产生对抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。随着反复暴露于相同的抗原，宿主会产生亲和力逐渐增强的抗体。与天然原型一样，体外亲和力成熟基于突变和选择的原则。使用展示方法如噬菌体展示进行两轮或三轮突变和选择可以产生亲和力在低纳摩尔范围内的抗体片段。
通过取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基，可以将氨基酸取代变异引入多特异性结合蛋白中。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于生成它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。生成此类替代变体的一种方便方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，突变几个高变区侧(例如，6-7侧)以在每一侧生成所有可能的氨基酸取代。由此生成的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体颗粒中展示，作为与包装在每个颗粒内的M13基因III产物的融合体。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。为了鉴别用于修饰的候选高变区侧，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可选地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是根据本文阐述的技术进行取代的候选残基。一旦生成此类变体，就如本文所述对一组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步开发。
本发明的多特异性结合蛋白具体可以包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)或其片段，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的抗体或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种的抗体或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:6851-55)。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列或人恒定区序列。已经描述了制备嵌合抗体的多种方法。参见例如，Morrison等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:6851；Takeda等人(1985)Nature,314:452；美国专利号4,816,567；美国专利号4,816,397；欧洲专利号EP0171496；欧洲专利申请公开号EP0173494；和英国专利号GB2177096。
与本发明有关的术语“结合结构域”或“结合(抗原)的结构域”的特征在于与靶分子(抗原)上的给定靶表位或给定靶侧(特异性)结合或相互作用的结构域，靶分子(抗原)例如分别为CD19、血清白蛋白和CD3。第一结合结构域、第二结合结构域和/或第三结合结构域的结构和功能可以基于抗体的结构和/或功能，例如全长或完整的免疫球蛋白分子的结构和/或功能。结合结构域可以来自抗体的VH和/或VL或VHH结构域或其片段。例如，结合结构域可以包括三个轻链CDR(即，VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即，VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3)。结合结构域还可以包括VHH CDR(即，VHH区的CDR1、CDR2和CDR3)。
术语“可变结构域”和“可变区”可互换使用，是指抗体或免疫球蛋白结构域在其序列上显示出可变性并参与决定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分。可变性并非均匀分布在抗体的可变结构域中；其集中在每个重链和轻链可变区的亚结构域中。这些亚结构域称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守(即非高变)部分称为“框架”区(FRM或FR)，并为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。
在本发明中，多特异性结合蛋白的任一结合结构域可以包含单结构域抗体(sdAb)。单结构域抗体包含能够选择性结合特定抗原的单个单体抗体可变结构域，其独立于其它可变区或结构域。第一个单结构域抗体从骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来，这些抗体称为VHH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR)，从中可以获得称为VNAR片段的单结构域抗体。另一种方法是将来自常见免疫球蛋白(例如，来自人或啮齿动物)的二聚体可变结构域拆分为单体，从而获得作为单结构域抗体的VH或VL。尽管目前对单结构域抗体的大多数研究都基于重链可变结构域，但衍生自轻链的纳米抗体也已显示出特异性结合靶表位。单结构域抗体的实例包括纳米抗体和单可变结构域抗体。
如本文所用，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子或其衍生物或变体中参与抗原结合的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度发散的区段被称为“高变区”，其插入在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白高变区之间和附近的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物(如骆驼和软骨鱼)中，抗原结合位点由提供“单结构域抗体”的单条抗体链形成。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、保留抗原结合表面的抗体的抗原结合片段中、或在单个多肽中使用肽接头将重链可变结构域连接到轻链可变结构域的重组多肽如scFv中。
如本文所用，术语“抗体”指包含抗原结合位点的蛋白质或蛋白质缀合物。抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。
如本文所用，术语“一种”和“一个”表示“一个或多个”并且包括复数，除非在上下文中不合适。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指将通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如，鼠科动物、猿猴、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选地包括人。
如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益或期望结果的化合物(例如，本发明的化合物)的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不旨在限于特定的制剂或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括导致病症、疾病、失调等的改善或其症状的改善的任何效果，例如减轻、减少、调节、改善或消除。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使得该组合物特别适用于体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指任何标准药学载剂，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如，如油/水或水/油乳剂)，以及各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。对于载剂、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin,Remington'sPharmaceutical Sciences,15th Ed.,Mack Publ.Co.,Easton,PA(1975)。
在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在工艺和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，另外预期存在基本上由或由所列举的组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由或由所列举的加工步骤组成的根据本发明的工艺和方法。
一般而言，除非另有说明，否则指定百分比的组合物均按重量计。此外，如果变量没有附带限定，则以变量的先前限定为准。
I.抗CD19抗体
在一方面，本公开提供了结合CD19(例如，人CD19)的抗原结合位点，其衍生自表114中列出的抗体。本公开还提供了包含该抗原结合位点的抗体。除非用星号(*)指示，否则CDR序列根据Kabat编号方案标识。
表1.结合CD19的示例性抗体序列
Figure BDA0003786158540000141
Figure BDA0003786158540000151
Figure BDA0003786158540000161
Figure BDA0003786158540000171
Figure BDA0003786158540000181
在某些实施方案中，本发明的结合CD19的抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)，该VH包含与表1中公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与表1中公开的相同抗体的VL至少60％(例如至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表1中公开的抗体的VH和VL序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，NIHPublication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),JMol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表1中公开的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表1中公开的抗体的VH和VL序列。
系列1构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:52、54和55所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、58和59所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:22、23、16、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:3、14、22和29；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、15、23、34、39、42和48；HCDR3序列选自SEQ ID NO:6和16；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19、25和51；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:53、54和56所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、58和59所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:4和30；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、15、23、34、39、42和48；HCDR3序列选自SEQ IDNO:7和17；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19、25和51；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:1至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:2至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有分别由SEQ ID NO:20和13所示的VH和VL序列的抗原结合位点，具有更高的对人和/或食蟹猴CD19的结合亲和力。
系列2构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:52、54和55所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、60和59所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:22、23、16、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:3、14、22和29；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、15、23、34、39、42和48；HCDR3序列选自SEQ ID NO:6和16；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19和25；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:53、54和56所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、60和59所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:4和30；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、15、23、34、39、42和48；HCDR3序列选自SEQ IDNO:7和17；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19和25；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:1至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:2至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有分别由SEQ ID NO:20和13所示的VH和VL序列的抗原结合位点，具有更高的对人CD19的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过表面等离子共振(SPR)所测量的，抗原结合位点以低于或等于0.3nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以0.05-0.3nM范围内或0.1-0.3nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
系列3构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:52、61和55所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、60和59所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:22、23、16、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:3、14、22和29；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、23、34、42和48；HCDR3序列选自SEQ ID NO:6和16；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19和25；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:53、61和56中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:57、60和59中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:4和30；HCDR2序列选自SEQ ID NO:5、23、34、42和48；HCDR3序列选自SEQ IDNO:7和17；LCDR1序列选自SEQ ID NO:8、18、24、31、35、45和49；LCDR2序列选自SEQ ID NO:9、19和25；和/或LCDR3序列选自SEQ ID NO:10、26和36。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:1至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:2至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有分别由SEQ ID NO:20和13所示的VH和VL序列的抗原结合位点，具有更高的对人CD19的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，抗原结合位点以低于或等于0.2nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以0.05-0.2nM范围内或0.1-0.2nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
个体构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-101。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:3、5和6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:8、9和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、5和7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:8、9和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:1至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQID NO:2至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-102。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:14、15和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、19和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、15和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、19和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:12至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:13至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:12和13的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-103。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:22、23和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:24、25和26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、23和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:24、25和26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:20至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:21至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:20和21的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-104。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:29、23和6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:31、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:30、23和7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:31、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:27至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:28至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:27和28的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-105。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:14、34和6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:35、25和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、34和7所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:35、25和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:32至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:33至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-106。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:3、39和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:24、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、39和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:24、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:37至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:38至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:37和38的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-107。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:3、42和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、42和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、25和10所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:40至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:41至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:40和41的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-108。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:29、23和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:45、19和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:30、23和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:45、19和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:43至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:44至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:43和44的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-109。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:29、48和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:49、9和26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:30、48和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:49、9和26所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:46至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:47至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:46和47的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-110。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:22、23和16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、51和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:4、23和17所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:18、51和36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:20至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:50至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:20和50的氨基酸序列。
在某些实施方案中，相对于具有分别由SEQ ID NO:20和13所示的VH和VL序列的抗原结合位点，衍生自CNG-CD19-101、CNG-CD19-102、CNG-CD19-103、CNG-CD19-110、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-106、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点具有更高的对人和/或食蟹猴CD19的结合亲和力。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-101、CNG-CD19-102、CNG-CD19-103、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-106、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以低于或等于0.3nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-101、CNG-CD19-102、CNG-CD19-103、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-106、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以0.05-0.3nM范围内或0.1-0.3nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-101、CNG-CD19-103、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以低于或等于0.2nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-101、CNG-CD19-103、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以0.05-0.2nM范围内或0.1-0.2nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-103、CNG-CD19-110、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-106、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以低于或等于9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合食蟹猴CD19。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-103、CNG-CD19-110、CNG-CD19-104、CNG-CD19-105、CNG-CD19-106、CNG-CD19-107、CNG-CD19-108或CNG-CD19-109的抗原结合位点以1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合食蟹猴CD19。
本公开还提供了抗原结合位点，其与包含表1中提供的VH、VL和/或scFv序列的抗体或抗原结合位点竞争结合CD19(例如，人CD19)。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点是scFv的形式。在某些实施方案中，VH位于VL的C端。在某些实施方案中，VH位于VL的N端。在某些实施方案中，VH和VL通过肽接头连接，例如，在下文标题为“接头”的小节E中公开的接头。为了稳定scFv，VH的第44位和VL的第100位(根据Kabat编号)的氨基酸残基可以由Cys取代，从而促进VH和VL之间二硫键的形成。因此，在某些实施方案中，VH和VL分别在位置100和44处包含Cys。在某些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了结合CD19(例如，人CD19)的抗原结合位点，其衍生自表2中列出的抗体。本公开还提供了包含该抗原结合位点的抗体。除非用星号(*)指示，否则CDR序列根据Kabat编号方案标识。
表2.结合CD19的示例性抗体序列
Figure BDA0003786158540000281
Figure BDA0003786158540000291
Figure BDA0003786158540000301
Figure BDA0003786158540000311
Figure BDA0003786158540000321
在某些实施方案中，本发明的结合CD19的抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与表2公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与表2中公开的相同抗体的VL至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表2中公开的抗体的VH和VL序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，NIH Publication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表2中公开的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表2中公开的抗体的VH和VL序列。
系列1构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:109、111和112所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:114、115和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:92、87、67、80、70和71所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:64、75、85、92、96和105；HCDR2序列选自SEQ ID NO:66、77、87和107；HCDR3序列选自SEQ ID NO:67、78、82和88；LCDR1序列选自SEQ ID NO:69、80和108；LCDR2序列选自SEQ ID NO:70、94、100和102；和/或LCDR3序列是SEQ ID NO:71。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:110、111和113所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:114、115和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:93、87、68、80、70和71所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:65、76、86、93、97和106；HCDR2序列选自SEQ ID NO:66、77、87和107；HCDR3序列选自SEQ ID NO:68、79、83和89；LCDR1序列选自SEQ ID NO:69、80和108；LCDR2序列选自SEQ ID NO:70、94、100和102；和/或LCDR3序列是SEQ ID NO:71。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:62至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:63至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有分别由SEQ ID NO:90和74所示的VH和VL序列的抗原结合位点，具有更高的对人CD19的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过表面等离子共振(SPR)所测量的，抗原结合位点以低于或等于2nM、1nM或0.5nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以0.05-2nM范围、0.05-1nM范围或0.05-0.5nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
系列2构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:116、117和118所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:114、120和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别在SEQ ID NO:92、87、67、80、70和71所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:64、96和105；HCDR2序列选自SEQ ID NO:66、87和107；HCDR3序列选自SEQ ID NO:67和78；LCDR1序列选自SEQ ID NO:69和108；LCDR2序列选自SEQ ID NO:70、100和102；和/或LCDR3序列是SEQ ID NO:71。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:110、117和119所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:114、120和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL，其中该抗原结合位点不包含分别在SEQ ID NO:93、87、68、80、70和71所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:65、97和106；HCDR2序列选自SEQ ID NO:66、87和107；HCDR3序列选自SEQ IDNO:68和79；LCDR1序列选自SEQ ID NO:69和108；LCDR2序列选自SEQ ID NO:70、100和102；和/或LCDR3序列是SEQ ID NO:71。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:62至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:63至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有分别由SEQ ID NO:90和74所示的VH和VL序列的抗原结合位点，具有更高的对人CD19的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以低于或等于0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以0.05-0.4nM、0.05-0.3nM、0.05-0.2nM或0.05-0.1nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
个体构建体
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-701。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:64、66和67所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:65、66和68所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:62至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:63至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:62和63的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-702。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:75、77和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:76、77和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:73至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:74至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:73和74的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-703。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:64、66和82所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:65、66和83所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:81至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:74至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:81和74的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-704。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:85、87和88所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:86、87和89所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:80、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:84至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:74至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:84和74的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-705。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:92、87和67所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、94和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:93、87和68所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、94和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:90至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:91至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:90和91的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-706。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:96、87和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:97、87和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:95至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:63至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:95和63的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-707。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:64、66和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:65、66和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:98至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:63至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:98和63的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-708。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:64、66和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、100和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:65、66和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、100和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:98至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:99至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:98和99的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-709。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:64、66和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、102和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:65、66和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:69、102和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:98至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:101至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ ID NO:98和101的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点衍生自CNG-CD19-710。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:105、107和78所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:108、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:106、107和79所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:108、70和71所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ IDNO:103至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:104至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH和VL包含分别为SEQ IDNO:103和104的氨基酸序列。
在某些实施方案中，相对于具有分别由SEQ ID NO:90和74所示的VH和VL序列的抗原结合位点，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-702、CNG-CD19-703、CNG-CD19-704、CNG-CD19-705、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点具有更高的对人CD19的结合亲和力。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过表面等离子共振(SPR)所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-702、CNG-CD19-703、CNG-CD19-704、CNG-CD19-705、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以低于或等于2nM、1nM或0.5nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-702、CNG-CD19-703、CNG-CD19-704、CNG-CD19-705、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以0.05-2nM范围内、0.05-1nM范围内或0.05-0.5nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以低于或等于0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM的KD结合人CD19或其细胞外片段。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以0.05-0.4nM、0.05-0.3nM、0.05-0.2nM或0.05-0.1nM范围内的KD结合人CD19或其细胞外片段。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-702、CNG-CD19-703、CNG-CD19-704、CNG-CD19-705、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以低于或等于8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合食蟹猴CD19。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-CD19-701、CNG-CD19-702、CNG-CD19-703、CNG-CD19-704、CNG-CD19-705、CNG-CD19-706、CNG-CD19-707、CNG-CD19-708、CNG-CD19-709或CNG-CD19-710的抗原结合位点以1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合食蟹猴CD19。
本公开还提供了抗原结合位点，其与包含表2中提供的VH、VL和/或scFv序列的抗体或抗原结合位点竞争结合CD19(例如，人CD19)。
在某些实施方案中，结合CD19的抗原结合位点是scFv的形式。在某些实施方案中，VH位于VL的C端。在某些实施方案中，VH位于VL的N端。在某些实施方案中，VH和VL通过肽接头连接，例如，在下文标题为“接头”的小节E中公开的接头。为了稳定scFv，VH的第44位和VL的第100位(根据Kabat编号)的氨基酸残基可以由Cys取代，从而促进VH和VL之间二硫键的形成。因此，在某些实施方案中，VH和VL分别在位置100和44处包含Cys。
然而，可以理解的是，CNG-CD19-701至CNG-CD19-710表现出高的稳定性，当以Fab形式存在时具有在80-85℃范围内的解链温度。因此，预期衍生自这些抗体的抗原结合位点在不存在此类Cys取代的情况下是稳定的。进一步考虑，在多特异性结合蛋白的情况下，不存在Cys取代是有利的，因为多特异性结合蛋白可以包含另一个通过在引入的两个Cys残基之间形成的二硫键稳定的抗原结合位点。不希望受理论限制，两对Cys残基的存在可能会因为形成不期望的二硫键而增加错误折叠的风险。因此，当构建多特异性结合蛋白时，使用在不存在分子内二硫键的情况下稳定的抗原结合位点可以赋予选择另一个抗原结合位点的灵活性。因此，在某些实施方案中，VH和VL不包含分别在位置100和44处的Cys。在某些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
II.多特异性结合蛋白
在一方面，本公开提供了一种多特异性结合蛋白，其包含结合CD19(例如，人CD19)的第一结构域(例如，第一抗原结合位点)；结合CD3(例如，人和/或猕猴CD3)如CD3ε(epsilon)、CD3δ(delta)和/或CD3γ(gamma)的第二结构域(例如，第二抗原结合位点)；和任选的半衰期延长结构域。多特异性结合蛋白被配置为使表达CD19的细胞(如B细胞)与表达CD3的细胞(如T细胞)在空间上接近，以增强表达CD3的细胞对表达CD19的细胞的细胞毒性。这种靶标特异性细胞毒性对于治疗与表达CD19的细胞相关的疾病是期望的。表达CD3的细胞的激活也会导致细胞因子的产生。这种细胞因子的产生在适当的量下可以有利于T细胞激活和增殖，从而导致最佳和持续的T细胞重定向靶标杀伤。然而，当细胞因子产生过多时，其可以导致不期望的全身毒性如细胞因子释放综合征。为了在不引起过多细胞因子产生的情况下实现靶标特异性细胞毒性，设计了具有对CD19的高亲和力(如通过SPR所测量的，具有高于5pM且低于1nM的KD)和对CD3的不同亲和力(如通过SPR所测量的，具有从低于10nM到高于50nM的范围内的KD)的多特异性结合蛋白。下文实施例9中描述的结果，比较了对CD3具有不同结合亲和力的多特异性结合蛋白，证明了使用KD低于10nM的CD3结合结构域的益处，其中多特异性结合蛋白对CD19具有非常高的亲和力(例如，如通过SPR所测量的，具有低于1nM、0.1nM、50pM或20pM的KD)。具体而言，相对于如通过SPR所测量的以高于10nM的KD结合CD3的CD3结合结构域，如通过SPR所测量的以0.5nM至10nM范围内的KD结合CD3的CD3结合结构域赋予多特异性结合蛋白的细胞毒活性的改善至少与其诱导细胞因子产生的能力的增加一样强。因此，预期对CD19具有如通过SPR所测量的5pM至1nM范围内的KD的亲和力，以及对CD3具有如通过SPR所测量的0.5nM至10nM范围内的KD的亲和力的多特异性结合蛋白，可以在例如低剂量下使用，以实现治疗效果，同时最大限度地减少潜在的安全问题。因此，在本文公开的多特异性结合蛋白的某些实施方案中，第一结构域以5pM至1nM范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)，第二结构域以0.5nM至10nM范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)，每个KD通过SPR测量。
在某些实施方案中，每个KD通过表面等离子共振(SPR)测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过SPR所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：5pM至1nM、5pM至0.5nM、5pM至0.2nM、5pM至0.1nM、5pM至50pM、5pM至20pM、5pM至10pM、10pM至1nM、10pM至0.5nM、10pM至0.2nM、10pM至0.1nM、10pM至50pM或10pM至20pM。在某些实施方案中，第二抗原结合位点以如通过SPR所测量的以下范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)：0.5nM至10nM、0.5nM至5nM、0.5nM至2nM、0.5nM至1nM、1nM至10nM、1nM至5nM或1nM至2nM。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过SPR所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：5pM至0.1nM、5pM至50pM、5pM至20pM、10pM至1nM、10pM至0.1nM、10pM至50pM或10pM至20pM，并且第二抗原结合位点以如通过SPR所测量的0.5nM至10nM范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过SPR所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：5pM至0.1nM、5pM至50pM、5pM至20pM、10pM至1nM、10pM至0.1nM、10pM至50pM或10pM至20pM，并且第二抗原结合位点以如通过SPR所测量的1nM至10nM范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)。
在某些实施方案中，每个KD通过生物层干涉法(BLI)测量。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过BLI所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：50pM至1nM、50pM至0.5nM、50pM至0.2nM、50pM至0.1nM、0.1nM至1nM、0.1nM至0.5nM或0.1nM至0.2nM。在某些实施方案中，第二抗原结合位点以如通过BLI所测量的以下范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)：5nM至100nM、5nM至50nM、5nM至20nM、5nM至10nM、10nM至100nM、10nM至50nM或10nM至20nM。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过BLI所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：50pM至1nM、50pM至0.5nM、50pM至0.2nM、0.1nM至10nM、0.1nM至0.5nM或0.1nM至0.2nM，并且第二抗原结合位点以如通过BLI所测量的5nM至100nM范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)。在某些实施方案中，第一抗原结合位点以如通过BLI所测量的以下范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)：50pM至1nM、50pM至0.5nM、50pM至0.2nM、0.1nM至10nM、0.1nM至0.5nM或0.1nM至0.2nM，并且第二抗原结合位点以如通过BLI所测量的10nM至100nM范围内的KD结合CD3(例如，人CD3)。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合CD3(例如，人CD3)的KD与第一抗原结合位点结合CD19(例如，人CD19)的KD的比值在以下范围内：10:1至1,000:1、10:1至500:1、10:1至200:1、10:1至150:1、20:1至1,000:1、20:1至500:1、20:1至200:1、20:1至150:1、50:1至1,000:1、50:1至500:1、50:1至200:1、50:1至150:1、100:1至1,000:1、100:1至500:1、100:1至200:1或100:1至150:1。在某些实施方案中，第一抗原结合位点结合CD19的KD和第二抗原结合位点结合CD3的KD通过相同的方法测量(例如，均通过SPR或均通过BLI测量)。
任选的半衰期延长结构域可以是结合血清白蛋白(例如，HSA)的第三结构域(例如，第三抗原结合位点)。在本文公开的多特异性结合蛋白的某些实施方案中，第一结构域包含在上文标题为“抗CD19抗体”的部分0中公开的抗原结合位点。在某些实施方案中，第一、第二和第三结构域分别包含第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的第一抗原结合位点是上文标题为“抗-CD19抗体”部分0中公开的结合CD19的抗原结合位点。
多特异性结合蛋白的每个抗原结合位点可以采用多种形式，如单链可变片段(scFv)、Fab片段或单结构域抗体(sdAb)。在某些实施方案中，第一抗原结合位点包含scFv。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含scFv。在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含sdAb。
可选地，还考虑了一个或多个结合结构域可以不包含抗原结合位点。例如，美国专利申请公开号US20130316952A1公开了一种结合血清白蛋白的多肽，其具有氨基酸序列LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA(SEQ ID NO:282)。结合HSA的其他示例性多肽描述于Dennis等人(2002)J.Biol.Chem.,277:35035-43；Jacobs等人(2015)ProteinEng.Des.Sel.,28:385-93；以及Zorzi等人(2017)Nat.Commun.,8:16092。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白进一步包含抗体Fc区。Fc区的存在可以增加多特异性结合蛋白的血清半衰期。根据所使用的特定Fc亚型和变体，Fc区也可以改变多特异性结合蛋白的活性(例如，细胞毒性活性)。
在其他实施方案中，多特异性结合蛋白不包含抗体Fc区。Fc的缺失有助于多特异性结合蛋白的尺寸更小，这可以表现出改善的组织渗透和药代动力学特性。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白由或基本上由第一、第二和第三抗原结合位点以及它们之间的接头组成。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白基本上由第一、第二和第三抗原结合位点组成。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白单价结合CD19、CD3和/或血清白蛋白。额外的结合结构域的排除降低了非特异性免疫细胞激活的风险并减小了多特异性结合蛋白的尺寸。
A.结合CD19的抗原结合位点
多特异性结合蛋白的第一抗原结合位点结合CD19(例如，人CD19)。在某些实施方案中，第一抗原结合位点是上文标题为“抗-CD19抗体”部分0中公开的结合CD19的抗原结合位点。
可选地，结合CD19的第一抗原结合位点可以衍生自例如MT-103(单链双特异性CD19/CD3抗体；参见Hoffman等人(2005)Int.J.Cancer,115:98-104；Schlereth等人(2006)Cancer Immunol.Immunother.55:503-14)，CD19/CD16二价抗体抗体(参见Schlenzka等人(2004)Anti-cancer Drugs 15:915-19；Kipriyanov等人(2002)J.Immunol.169:137-44)、BU12-皂草素(参见Flavell等人(1995)Br.J.Cancer 72:1373-79)和抗CD19-伊达比星(参见Rowland等人(1993)Cancer Immunol.Immunother.55:503-14)。可衍生本发明的第一抗原结合位点的结合CD19的其他示例性抗原结合位点公开于美国专利申请公开号US20170174786A1、US20090042291A1、US20160046730A1、US20070154473A1、US20090142349A1、US20180142018A1、US20090136526A1、US20060257398A1和US20180230225A1以及PCT公开号WO2019057100A1。例如，在某些实施方案中，结合CD19的第一抗原结合位点衍生自表3中列出的抗体。
表3.结合CD19的示例性抗体序列
Figure BDA0003786158540000451
Figure BDA0003786158540000461
Figure BDA0003786158540000471
Figure BDA0003786158540000481
Figure BDA0003786158540000491
Figure BDA0003786158540000501
Figure BDA0003786158540000511
Figure BDA0003786158540000521
当VL和LCDR序列被标注为“N/A”时，抗原结合位点是仅具有VH(例如，VHH)的sdAb。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与表3中公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与表3中公开的相同抗体的VL至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表3中公开的抗体的VH和/或VL序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，NIH Publication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表3中公开的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表3中公开的抗体的VH和VL序列。
此类抗原结合位点可以采取scFv的形式。在某些实施方案中，VH位于VL的C端。在某些实施方案中，VH位于VL的N端。在某些实施方案中，VH和VL通过肽接头连接，例如，在下文标题为“接头”的小节E中公开的接头。为了稳定scFv，VH的第44位和VL的第100位(根据Kabat编号)的氨基酸残基可以由Cys取代，从而促进VH和VL之间二硫键的形成。因此，在某些实施方案中，VH和VL分别在位置100和44处包含Cys。
在其他实施方案中，第一抗原结合位点包含含有VH的sdAb，该VH包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。在某些实施方案中，VH包含与表3中提供的sdAb抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含根据以下方法确定的表3中公开的抗体的VH序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，NIHPublication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),JMol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，VH包含表3中提供的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，VH包含表3中提供的sdAb的VH的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点以低于或等于以下的KD结合CD19：20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。例如，在某些实施方案中，第一抗原结合位点以以下KD结合CD19：约5pM-约1nM、约5pM-约0.9nM、约5pM-约0.8nM、约5pM-约0.7nM、约5pM-约0.6nM、约5pM nM-约0.5nM、约5pM-约0.4nM、约5pM-约0.3nM、约5pM-约0.2nM、约5pM-约0.1nM、约5pM-约50pM、约5pM-约20pM、约5pM-约10pM、约10pM-约1nM、约10pM-约0.9nM、约10pM-约0.8nM、约10pM-约0.7nM、约10pM-约0.6nM、约10pM-约0.5nM、约10pM-约0.4nM、约10pM-约0.3nM、约10pM-约0.2nM、约10pM-约0.1nM、约10pM-约50pM、约10pM-约20pM、约50pM-约1nM、约50pM-约0.9nM、约50pM-约0.8nM、约50pM-约0.7nM、约50pM-约0.6nM、约50pM nM-约0.5nM、约50pM-约0.4nM、约50pM-约0.3nM、约50pM-约0.2nM、约50pM-约0.1nM、约0.1nM-约10nM、约0.1nM-约9nM、约0.1nM-约8nM、约0.1nM-约7nM、约0.1nM-约6nM、约0.1nM-约5nM、约0.1nM-约4nM、约0.1nM-约3nM、约0.1nM-约2nM、约0.1nM-约1nM、约0.1nM-约0.5nM、约0.5nM-约10nM、约1nM-约10nM、约2nM-约10nM、约3nM-约10nM、约4nM-约10nM、约5nM-约10nM、约6nM-约10nM、约7nM-约10nM、约8nM-约10nM或约9nM-约10nM。在某些实施方案中，KD值通过表面等离子共振(SPR)测量。在某些实施方案中，KD值通过生物层干涉法(BLI)测量。
应当理解，单独的第一抗原结合位点对CD19的结合亲和力可以不同于在本文公开的多特异性结合蛋白的情况下的相同抗原结合位点的结合亲和力，这可能是由于来自其他结构域的构象限制。环境相关的结合亲和力在下文标题为“结合亲和力”的小节G中描述。
在某些实施方案中，当以Fab形式存在时，第一抗原结合位点具有至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃或至少80℃的解链温度。在某些实施方案中，当以Fab形式存在时，第一抗原结合位点具有以下范围内的解链温度：60-85℃、60-80℃、60-75℃、60-70℃、60-65℃、65-85℃、65-80℃、65-75℃、65-70℃、70-85℃、70-80℃、70-75℃、75-85℃、75-80℃或80-85℃。
B.结合CD3的抗原结合位点
多特异性结合蛋白的第二抗原结合位点结合CD3(例如，人CD3和/或猕猴CD3)。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合CD3ε(epsilon)。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合CD3δ(delta)。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合CD3γ(gamma)。
早期的
Figure BDA0003786158540000541
构建体结合CD3的构象表位并且通常是物种特异性的(参见PCT公开号WO2008119567A2)。改进的
Figure BDA0003786158540000542
构建体，如博纳吐单抗(也称为AMG 103；参见PCT公开号WO1999054440A1)和索利托单抗(也称为AMG 110；参见PCT公开号WO2005040220A1)，结合CD3ε链N端的与环境无关的表位(例如，人CD3ε胞外域的氨基酸残基1-27)并显示出对人、普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)和松鼠猴(Saimirisciureus)CD3ε链的跨物种特异性(参见同上)。这些构建体不会以在早期
Figure BDA0003786158540000552
构建体中观察到的相同程度非特异性激活T细胞，因此据信具有较低的副作用风险(参见Brischwein等人(2007)J.Immunother.,30(8):798-807)。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的第二抗原结合位点结合CD3ε链N端的表位。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合位于人CD3ε胞外域的氨基酸残基1-27中的表位。该表位或其同源变体也存在于某些非人灵长类动物中。因此，在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合不同灵长类动物中的CD3，例如人、新世界灵长类动物(如普通狨(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)和松鼠猴(Saimiri sciureus))、旧世界灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿和非人人亚科。普通狨和绒顶柽柳猴是属于狨科的新世界灵长类动物，而松鼠猴是属于松鼠猴科的新世界灵长类动物。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合人CD3ε和/或猕猴CD3ε。在某些实施方案中，第二抗原结合位点还结合普通狨、绒顶柽柳猴和/或松鼠猴CD3ε。
结合人和/或猕猴CD3的细胞外表位的第二抗原结合位点可以衍生自例如，如WO2008101154中描述的muromonab-CD3(OKT3)；如WO2007145941中描述的奥昔组单抗(otelixizumab，TRX4)；如WO2013040164中描述的teplizumab(MGA031)；如WO2004052397中描述的维西珠单抗(Visilizumab，Nuvion)；如WO2015181098中描述的SP34；如WO2015006749中描述的X35、VIT3或BMA030(BW264/56)；如WO2004106381中描述的CLB-T3/3、CRIS7、CLB-T3.4.2、WT32、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2或F101.01，如WO2004106383中描述的YTH12.5或SPv-T3b，如WO2012084895中描述的Fl 11-409，如WO2013158856中描述的TR-66；如WO2000041474中描述的UCHT-1；如WO2016085889中描述的WT-31，或WO2008119567中描述的抗体。例如，在某些实施方案中，结合CD3的第二抗原结合位点衍生自表4中列出的抗体。
表4.结合CD3的示例性抗体序列
Figure BDA0003786158540000551
Figure BDA0003786158540000561
Figure BDA0003786158540000571
Figure BDA0003786158540000581
Figure BDA0003786158540000591
Figure BDA0003786158540000601
Figure BDA0003786158540000611
Figure BDA0003786158540000621
当VL和LCDR序列被标注为“N/A”时，抗原结合位点是仅具有VH(例如，VHH)的sdAb。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与表4中公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与表4中公开的相同抗体的VL至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表4中公开的抗体的VH和/或VL序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，NIH Publication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表4中公开的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表4中公开的抗体的VH和VL序列。
在某些实施方案中，结合CD3的第二抗原结合位点衍生自CNG-CD3-1。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:414、416和417所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和421所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:415、416和418所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和421所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:412至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:413至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗原结合位点的VH和VL包含分别为SEQ ID NO:412和413的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD3的第二抗原结合位点衍生自CNG-CD3-2。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:414、416和425所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和421所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:415、416和426所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和421所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:424至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:413至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗原结合位点的VH和VL包含分别为SEQ ID NO:424和413的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合CD3的第二抗原结合位点衍生自CNG-CD3-3。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:414、431和417所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和432所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含含有分别由SEQ ID NO:415、431和418中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的VH以及含有分别由SEQ ID NO:419、420和432中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的VL。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与SEQ ID NO:429至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与SEQ ID NO:430至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二抗原结合位点的VH和VL包含为SEQ ID NO:429和430的氨基酸序列。
此类抗原结合位点可以采取scFv的形式。在某些实施方案中，VH位于VL的C端。在某些实施方案中，VH位于VL的N端。在某些实施方案中，VH和VL通过肽接头连接，例如，在下文标题为“接头”的小节E中公开的接头。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含SEQ IDNO:422、427或433的氨基酸序列。为了稳定scFv，VH的第44位和VL的第100位(根据Kabat编号)的氨基酸残基可以由Cys取代，从而促进VH和VL之间二硫键的形成。因此，在某些实施方案中，VH和VL分别在位置100和44处包含Cys。在某些实施方案中，第二抗原结合位点包含SEQ ID NO:423、428或434的氨基酸序列。
在其他实施方案中，第二抗原结合位点包含含有VH的sdAb，该VH包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。在某些实施方案中，VH包含与表4中提供的sdAb抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含表4中提供的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，VH包含表4中提供的sdAb的VH的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点与包含表4中提供的VH、VL和/或scFv序列的抗体或其抗原结合片段竞争结合CD3(例如，人CD3和/或猕猴CD3)。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的第二抗原结合位点以约0.1nM-约1μM的解离常数(KD)结合CD3(例如，人CD3和/或猕猴CD3)。KD可以通过本领域已知的方法测量。在某些实施方案中，KD通过固定在芯片上的CD3或其细胞外片段的SPR测量。在某些实施方案中，通过流式细胞术测量细胞表面上表达的CD3的KD，例如，按照下文0中所述的方法。
在某些实施方案中，如通过SPR所测量的，第二抗原结合位点以低于或等于以下的KD结合CD3：20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。例如，在某些实施方案中，如通过SPR所测量的，第二抗原结合位点以以下范围内的KD结合CD3：约10pM-约1nM、约10pM-约0.9nM、约10pM-约0.8nM、约10pM-约0.7nM、约10pM-约0.6nM、约10pM-约0.5nM、约10pM-约0.4nM、约10pM-约0.3nM、约10pM-约0.2nM、约10pM-约0.1nM、约10pM-约50pM、0.1nM-约10nM、约0.1nM-约9nM、约0.1nM-约8nM、约0.1nM-约7nM、约0.1nM-约6nM、约0.1nM-约5nM、约0.1nM-约4nM、约0.1nM-约3nM、约0.1nM-约2nM、约0.1nM-约1nM、约0.1nM-约0.5nM、约0.5nM-约10nM、约0.5nM-约9nM、约0.5nM-约8nM、约0.5nM-约7nM、约0.5nM-约6nM、约0.5nM-约5nM、约0.5nM-约4nM、约0.5nM-约3nM、约0.5nM-约2nM、约0.5nM-约1nM、约1nM-约10nM、约1nM-约9nM、约1nM-约8nM、约1nM-约7nM、约1nM-约6nM、约1nM-约5nM、约1nM-约4nM、约1nM-约3nM、约1nM-约2nM、约2nM-约10nM、约3nM-约10nM、约4nM-约10nM、约5nM-约10nM、约6nM-约10nM、约7nM-约10nM、约8nM-约10nM或约9nM-约10nM。
在某些实施方案中，如通过BLI所测量的，第二抗原结合位点以低于或等于以下的KD结合CD3：50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM。例如，在某些实施方案中，如通过BLI所测量的，第二抗原结合位点以以下范围内的KD结合CD3：约0.1nM-约20nM、约0.1nM-约19nM、约0.1nM-约18nM、约0.1nM-约17nM、约0.1nM-约16nM、约0.1nM-约15nM、约0.1nM-约14nM、约0.1nM-约13nM、约0.1nM-约12nM、约0.1nM-约11nM、0.1nM-约10nM、约0.1nM-约9nM、约0.1nM-约8nM、约0.1nM-约7nM、约0.1nM-约6nM、约0.1nM-约5nM、约0.1nM-约4nM、约0.1nM-约3nM、约0.1nM-约2nM、约0.1nM-约1nM、约0.1nM-约0.5nM、约1nM-约50nM、约1nM-约40nM、约1nM-约30nM、约1nM-约20nM、约1nM-约19nM、约1nM-约18nM、约1nM-约17nM、约1nM-约16nM、约1nM-约15nM、约1nM-约14nM、约1nM-约13nM、约1nM-约12nM、约1nM-约11nM、约1nM-约10nM或约1nM-约5nM。
在某些实施方案中，如通过SPR所测量的，第二抗原结合位点以高于或等于以下的KD结合CD3(例如，人CD3，例如，人CD3ε)：1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM。在某些实施方案中，如通过SPR所测量的，第二抗原结合位点以以下范围内的KD结合CD3：约1nM-约100nM、约1nM-约90nM、约1nM-约80nM、约1nM-约70nM、约1nM-约60nM、约1nM-约50nM、约1nM-约40nM、约1nM-约30nM、约1nM-约20nM、约1nM-约10nM、约10nM-约100nM、约10nM-约90nM、约10nM-约80nM、约10nM-约70nM、约10nM-约60nM、约10nM-约50nM、约10nM-约40nM、约10nM-约30nM或约10nM-约20nM。在某些实施方案中，如通过BLI所测量的，第二抗原结合位点以高于或等于以下的KD结合CD3(例如，人CD3，例如，人CD3ε)：10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1μM。在某些实施方案中，如通过SPR所测量的，第二抗原结合位点以以下范围内的KD结合CD3：约10nM-约1μM、约10nM-约900nM、约10nM-约800nM、约10nM-约700nM、约10nM-约600nM、约10nM-约500nM、约10nM-约400nM、约10nM-约300nM、约10nM-约200nM、约10nM-约100nM、约100nM-约1μM、约100nM-约900nM、约100nM-约800nM、约100nM-约700nM、约100nM-约600nM、约100nM-约500nM、约100nM-约400nM、约100nM-约300nM或约100nM-约200nM。
应当理解，单独的第二抗原结合位点对CD3的结合亲和力可能不同于在本文公开的多特异性结合蛋白的情况下的相同抗原结合位点的结合亲和力，这可能是由于来自其他结构域的构象限制。环境相关的结合亲和力在下文标题为“结合亲和力”的小节G中描述。
在某些实施方案中，当以Fab形式存在时，第二抗原结合位点具有至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃或至少80℃的解链温度。在某些实施方案中，当以Fab形式存在时，第二抗原结合位点具有以下范围内的解链温度：60-85℃、60-80℃、60-75℃、60-70℃、60-65℃、65-85℃、65-80℃、65-75℃、65-70℃、70-85℃、70-80℃、70-75℃、75-85℃、75-80℃或80-85℃。
C.半衰期延长结构域
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含半衰期延长结构域。如本文所用，术语“半衰期延长结构域”是指在受试者(例如，受试者的血液)中延长与其融合的蛋白质的半衰期的蛋白质结构域。示例性的半衰期延长结构域包括Fc结构域、血清白蛋白结构域和结合血清白蛋白的蛋白质结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白中的半衰期延长结构域包含结合血清白蛋白(例如，HSA)的第三抗原结合位点。预期血清白蛋白结合结构域可通过与新生儿Fc受体(FcRn)结合来促进多特异性结合蛋白的再循环，从而延长多特异性结合蛋白的血清半衰期。因此，在某些实施方案中，第三抗原结合位点不结合HSA的D-III结构域(介导HSA和FcRn之间的相互作用的结构域)。在某些实施方案中，第三抗原结合位点延长多特异性结合蛋白的血清半衰期。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点是衍生自表5中列出的单结构域抗体的结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))的抗原结合位点。除非用星号(*)指示，否则CDR序列根据Kabat编号方案标识。
表5.结合血清白蛋白的示例性抗体序列
Figure BDA0003786158540000671
Figure BDA0003786158540000681
Figure BDA0003786158540000691
Figure BDA0003786158540000701
Figure BDA0003786158540000711
Figure BDA0003786158540000721
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点包含VH，该VH包含与表5中公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表5中公开的抗体的VH序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，NIH Publication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)TheImmunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表5中公开的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表5中公开的抗体的VH序列。
系列1构建体
在某些实施方案中，结合HSA的抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:408、409和410所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ IDNO:128、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:122、128、132、137、145、157和169；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133、146、151、153、161、165、171、179和181；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:125、134、142、147、154、158、162、166、172和176。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:184、409和411所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:123、129和170；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133、146、151、153、161、165、171、179和181；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:126、135、143、148、155、159、163、167、173和177。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:121至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有SEQ ID NO:196所示的VH序列的抗原结合位点，具有更高的对人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和/或蛋白A的结合亲和力。
系列2构建体
在某些实施方案中，结合HSA的抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:183、185和186所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ IDNO:128、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:122、128、132、145、157和169；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133、146、151、153、171、179和181；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:125、134、147、154、158、172和176。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:184、185和187所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:123、129和170；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133、146、151、153、171、179和181；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:126、135、148、155、159、173和177。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:121至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有SEQ ID NO:196所示的VH序列的抗原结合位点，具有更高的对人血清白蛋白的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以低于或等于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以1-10nM、1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合人血清白蛋白。
系列3构建体
在某些实施方案中，结合HSA的抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:188、190和191所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ IDNO:128、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:122、128、132和145；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133和161；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:125、134、162、147和176。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:189、190和192所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:123和129；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124、133和161；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:126、135、163、148和177。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:121至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有SEQ ID NO:196所示VH序列的抗原结合位点，具有更高的对蛋白A的结合亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以低于或等于2.5nM或2nM的KD结合蛋白A。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以1-2.5nM或1-2nM范围内的KD结合蛋白A。
系列4构建体
在某些实施方案中，结合HSA的抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:188、193和194所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ IDNO:128、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQID NO:122、128、132和145；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124和133；和/或HCDR3序列选自SEQID NO:125、134、147和176。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:189、193和195所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中抗原结合位点不包含分别由SEQ ID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，HCDR1序列选自SEQ ID NO:123和129；HCDR2序列选自SEQ ID NO:124和133；和/或HCDR3序列选自SEQ ID NO:126、135、148和177。
在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:121至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗原结合位点相对于具有SEQ ID NO:196所示的VH序列的抗原结合位点，具有更高的对人血清白蛋白的结合亲和力和更高的对蛋白A的亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以低于或等于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合人血清白蛋白，并以低于或等于2.5nM或2nM的KD结合蛋白A。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，抗原结合位点以1-10nM、1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合人血清白蛋白，并以1-2.5nM或1-2nM范围内的KD结合蛋白A。
个体构建体
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-101。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:122、124和125所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:123、124和126所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:121至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-102。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、124和125所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、124和126所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:127至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-103。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:122、124和125所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:123、124和126所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:130至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-104。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:132、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:131至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-105。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:137、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:136至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-106。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、124和139所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、124和140所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:138至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-107。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、124和142所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、124和143所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:141至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-108。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:145、146和147所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、146和148所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:144至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-109。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:145、133和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:149至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-110。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、151和134所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、151和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:150至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-111。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、153和154所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、153和155所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:152至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-112。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:157、133和158所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和159所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:156至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-113。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、161和162所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、161和163所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:160至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-114。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、165和166所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、165和167所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:164至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-115。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:169、171和172所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:170、171和173所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:168至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-116。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、133和147所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和148所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:174至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-117。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、133和176所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和177所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:175至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-118。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、179和147所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、179和148所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:178至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-119。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、181和125所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、181和126所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:180至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合血清白蛋白的抗原结合位点衍生自CNG-HSA-120。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQ ID NO:128、133和154所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含分别由SEQID NO:129、133和155所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH，该VH包含与SEQ ID NO:180至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列。
在某些实施方案中，相对于具有SEQ ID NO:196所示的VH序列的抗原结合位点，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点具有更高的对人、食蟹猴和/或小鼠血清白蛋白的结合亲和力。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以低于或等于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以1-10nM、1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合人血清白蛋白。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以低于或等于9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合食蟹猴血清白蛋白。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合食蟹猴血清白蛋白。
在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以低于或等于100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM的KD结合小鼠血清白蛋白。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119或CNG-HSA-120的抗原结合位点以1-100nM、1-90nM、1-80nM、1-70nM、1-60nM、1-50nM、1-40nM、1-30nM、1-20nM或1-10nM范围内的KD结合小鼠血清白蛋白。
在某些实施方案中，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-103、CNG-HSA-106、CNG-HSA-107、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-111、CNG-HSA-113、CNG-HSA-114、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-118或CNG-HSA-120的抗原结合位点以第一KD结合人血清白蛋白并以第二KD结合小鼠血清白蛋白，其中第二KD与第一KD的比值在以下范围内：0.5-10、0.5-9、0.5-8、0.5-7、0.5-6、0.5-5、0.5-4、0.5-3、0.5-2、0.9-10、0.9-9、0.9-8、0.9-7、0.9-6、0.9-5、0.9-4、0.9-3、0.9-2、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2。应当理解，具有更接近于1的比值的抗原结合位点具有与人血清白蛋白的亲和力更相似的与小鼠血清白蛋白的亲和力，这允许使用小鼠模型更高精度地评估抗原结合位点或包含该抗原结合位点的蛋白质的药代动力学。
在某些实施方案中，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117的抗原结合位点相对于具有SEQ ID NO:196所示VH序列的抗原结合位点，具有更高的对蛋白A的结合亲和力。应当理解，增加的对蛋白A的亲和力允许通过蛋白A层析纯化抗原结合位点或包含该抗原结合位点但不包含抗体Fc区的蛋白。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117的抗原结合位点以低于或等于10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM或3nM的KD结合人血清白蛋白，并以低于或等于2.5nM或2nM的KD结合蛋白A。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117抗原结合位点以1-10nM、1-9nM、1-8nM、1-7nM、1-6nM、1-5nM、1-4nM或1-3nM范围内的KD结合人血清白蛋白，并以1-2.5nM或1-2nM范围内的KD结合蛋白A。
在某些实施方案中，相对于具有SEQ ID NO:196所示VH序列的抗原结合位点，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117的抗原结合位点具有更高的对人血清白蛋白的结合亲和力以及更高的对蛋白A的亲和力。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117抗原结合位点以低于或等于2.5nM或2nM的KD结合蛋白A。在某些实施方案中，当抗原结合位点作为单体存在时，如通过SPR所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-116或CNG-HSA-117抗原结合位点以1-2.5nM或1-2nM范围内的KD结合蛋白A。
解链温度代表抗原结合位点的热稳定性，并且可以通过差示扫描荧光法测量，例如，如Durowoju等人(2017)J.Vis.Exp.(121):55262中所述。抗体或其片段的热稳定性可以通过将CDR移植到稳定的框架上、引入非标准二硫键和其他诱变来增强，如McConnell等人(2014)MAbs,6(5):1274-82；以及Goldman等人(2017)Front.Immunol.,8:865中所述。在某些实施方案中，如通过差示扫描荧光法所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-105、CNG-HSA-106、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117或CNG-HSA-120的抗原结合位点具有高于或等于60℃的解链温度。在某些实施方案中，如通过差示扫描荧光法所测量的，衍生自CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-106或CNG-HSA-120的抗原结合位点具有高于或等于65℃的解链温度。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点与包含表5中提供的VH序列的抗体或抗原结合位点竞争结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)和/或竞争结合蛋白A。
可选地，结合血清白蛋白的第三抗原结合位点可以衍生自例如美国专利号8,188,223以及PCT公开号WO2017085172和WO2018050833中公开的抗原结合位点。例如，在某些实施方案中，结合血清白蛋白的第三抗原结合位点衍生自表6中列出的抗体。
表6.结合血清白蛋白的示例性抗原结合位点序列
Figure BDA0003786158540000851
Figure BDA0003786158540000861
Figure BDA0003786158540000871
Figure BDA0003786158540000881
Figure BDA0003786158540000891
Figure BDA0003786158540000901
Figure BDA0003786158540000911
Figure BDA0003786158540000921
当VL和LCDR序列被标注为“N/A”时，抗原结合位点是仅具有VH(例如，VHH)的sdAb。当VH和HCDR序列被标注为“N/A”时，抗原结合位点是仅具有VL的sdAb。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点包含VH和VL，其中该VH包含与表6中公开的抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列，并且该VL包含与表6中公开的相同抗体的VL至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含根据以下方法确定的表6中公开的抗体的VH和/或VL序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，NIH Publication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表6中公开的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含表6中公开的抗体的VH和VL序列。
在其他实施方案中，第三抗原结合位点包含含有VH的sdAb，该VH包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3。在某些实施方案中，VH包含与表6中提供的sdAb抗体的VH至少60％(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，VH包含根据以下方法确定的表6中公开的抗体的VH序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3：Kabat(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，NIHPublication No.91-3242,Bethesda)、Chothia(参见，例如Chothia C&Lesk AM,(1987),JMol Biol 196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等人,(1996)J Mol Biol 262:732-745)、IMGT(参见Lefranc,(1999)The Immunologist,7,132-136)或本领域已知的任何其他CDR确定方法。在某些实施方案中，VH包含表6中提供的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。在某些实施方案中，VH包含表6中提供的sdAb的VH的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点以低于或等于以下的KD结合血清白蛋白(例如，HSA)：100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM。例如，在某些实施方案中，第三抗原结合位点以以下范围内的KD结合血清白蛋白：约0.1nM-约100nM、约0.1nM-约50nM、约0.1nM-约10nM、约0.1nM-约1nM、约1nM-约100nM、约1nM-约50nM、约1nM-约10nM、约10nM-约100nM或约10nM-约50nM。应当理解，鉴于血液中血清白蛋白的高丰度，对于有效延长多特异性结合蛋白的血清半衰期而言，可以不需要第三抗原结合位点对血清白蛋白的非常高的亲和力。因此，还考虑了对血清白蛋白具有较低亲和力的抗原结合位点。
应当理解，单独的第三抗原结合位点对血清白蛋白的结合亲和力可能不同于在本文公开的多特异性结合蛋白的情况下的相同抗原结合位点的结合亲和力，这可能是由于来自其他结构域的构象限制。环境相关的结合亲和力在下文标题为“结合亲和力”的小节G中描述。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点具有以下解链温度：至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少57℃、至少58℃、至少59℃、至少60℃、至少61℃、至少62℃、至少63℃、至少64℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、或至少80℃。在某些实施方案中，第三抗原结合位点具有在以下范围内的解链温度：50-80℃、50-70℃、50-65℃、50-60℃、50-55℃、55-70℃、55-65℃、55-60℃、56-65℃、56-60℃、57-65℃、57-60℃、58-65℃、58-60℃、59-65℃、59-60℃、60-80℃、60-75℃、60-70℃、60-65℃、65-80℃、65-75℃、65-70℃、70-80℃或70-75℃。
D.构建体形式
第一、第二和第三抗原结合位点可以采取各种形式。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三抗原结合位点包含两个抗体可变结构域(例如，VH和VL)。VH和VL可以突变以引入稳定抗原结合位点的二硫键(例如，在H44和L100之间)(参见，Zhao等人(2010)Int.J.Mol.Sci.,12(1):1-11)。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三抗原结合位点包含单个抗体可变结构域(例如，sdAb)。
在含有VH和VL的抗原结合位点中，VH和VL可以连接以形成scFv。VH可以位于VL的N端或C端。VH和VL通常通过接头如肽接头连接。肽接头的示例性序列在下文标题为“接头”的小节E中提供。在某些实施方案中，抗原结合结构域的VH通过具有表7中列出的氨基酸序列的肽接头连接至抗原结合结构域的VL。在特定实施方案中，抗原结合结构域的VH通过具有SEQ ID NO:298、299或302的氨基酸序列的肽接头连接至抗原结合结构域的VL，其中VH位于VL的N端。在其他特定实施方案中，抗原结合结构域的VH通过具有SEQ ID NO:298、299或302的氨基酸序列的肽接头连接至抗原结合结构域的VL，其中VH位于VL的C端。
或者，VH和VL可以存在于不同的多肽链上，并且VH-VL复合物的形成可以通过额外的结构域如抗体恒定区CH1和CL来促进。因此，在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含含有本文公开的VH和VL的Fab。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有单个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有单个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有单个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含sdAb形式的第一抗原结合位点、sdAb形式的第二抗原结合位点和sdAb形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有单个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有单个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有两个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含sdAb形式的第一抗原结合位点、sdAb形式的第二抗原结合位点和scFv形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有单个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有两个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有单个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含sdAb形式的第一抗原结合位点、scFv形式的第二抗原结合位点和sdAb形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有单个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有两个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有两个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含sdAb形式的第一抗原结合位点、scFv形式的第二抗原结合位点和scFv形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有两个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有单个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有单个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含scFv形式的第一抗原结合位点、sdAb形式的第二抗原结合位点和sdAb形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有两个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有单个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有两个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含scFv形式的第一抗原结合位点、sdAb形式的第二抗原结合位点和scFv形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有两个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有两个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有单个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含scFv形式的第一抗原结合位点、scFv形式的第二抗原结合位点和sdAb形式的第三抗原结合位点。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包含含有两个抗体可变结构域的第一抗原结合位点、含有两个抗体可变结构域的第二抗原结合位点和含有两个抗体可变结构域的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含scFv形式的第一抗原结合位点、scFv形式的第二抗原结合位点和scFv形式的第三抗原结合位点。
多特异性结合蛋白的三个抗原结合位点可以在氨基至羧基方向上以下列任一方向连接：
(i)第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)；
(ii)第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-第二抗原结合位点(CD3结合结构域)；
(iii)第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)；
(iv)第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-第一抗原结合位点(CD19结合结构域)；
(v)第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-第二抗原结合位点(CD3结合结构域)；和
(vi)第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-第一抗原结合位点(CD19结合结构域)，
其中上述破折号表示肽键和/或接头(例如，肽接头)。
在某些实施方案中，第三抗原结合位点不位于第一抗原结合位点和第二抗原结合位点之间。预期具有此形式的构建体具有良好的治疗功效和体内半衰期。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于第一抗原结合位点和第二抗原结合位点两者的N端或第一抗原结合位点和第二抗原结合位点两者的C端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于第一抗原结合位点和第二抗原结合位点两者的N端。在某些实施方案中，第三抗原结合位点位于第一抗原结合位点和第二抗原结合位点两者的C端。
如果单条多肽链包含两个抗原结合位点，则根据本领域已知的“N端”和“C端”的定义确定一个抗原结合位点相对于另一个的位置(N端或C端)。应当理解，如果抗原结合位点包含两条单独的多肽链，则其相对于另一个抗原结合位点(具有单条多肽链或两条多肽链)的位置(N端或C端)可以类似地确定(如果单独的多肽链包含至少一条前者的多肽链和至少一条后者的多肽链)。进一步理解，如果抗原结合位点A在抗原结合位点B的N端，并且抗原结合位点B在抗原结合位点C的N端，则认为抗原结合位点A位于抗原结合位点C的N端，即使抗原结合位点A和C不存在于任何单一的共同多肽链中。还考虑了多特异性结合蛋白的更复杂结构，其中一些可能具有难以使用如上所述的术语“N端”和“C端”来表征的方向，例如，由于一条多肽链上的两个抗原结合位点相对于另一条多肽链的不同相对位置，或环结构的存在。
根据本发明，多特异性结合蛋白及其组成结合结构域是一条或多条多肽的形式。此类多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如，化学接头或化学交联剂如戊二醛)。在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白包括第一抗原结合位点、第二抗原结合位点和第三抗原结合位点，其全部连接在一起形成单条多肽链。在某些实施方案中，第一、第二和第三抗原结合位点采取scFv和/或sdAb的形式，例如，以如上所述的组合形式，以形成单条多肽链。
E.接头
如上所述，本发明的多特异性结合蛋白的抗原结合位点可以通过肽键或接头(例如，肽接头)连接。在某些实施方案中，至少两个相邻的抗原结合位点通过接头(例如，肽接头)连接。在某些实施方案中，每两个相邻的抗原结合位点通过接头(例如，肽接头)连接。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的三个抗原结合位点可以通过表示为L1和L2的接头(例如，肽接头)在氨基到羧基方向上以任何一个以下方向连接：
(i)第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-L1–第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-L2–第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)；
(ii)第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-L1–第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-L2–第二抗原结合位点(CD3结合结构域)；
(iii)第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-L1–第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-L2–第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)；
(iv)第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-L1–第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-L2–第一抗原结合位点(CD19结合结构域)；
(v)第三抗原结合位点(血清白蛋白结合结构域)-L1–第一抗原结合位点(CD19结合结构域)-L2–第二抗原结合位点(CD3结合结构域)；和
(vi)第三抗原结合位点(血清白蛋白结合域)-L1-第二抗原结合位点(CD3结合结构域)-L2-第一抗原结合位点(CD19结合结构域)。可以理解，在给定的构建体中，L1、L2或L1和L2两者都可以由肽键代替。
可以理解，如果单条多肽链包含两个相邻的抗原结合位点，则连接这两个抗原结合位点的肽接头代表它们之间的氨基酸序列。如果抗原结合位点包含两条单独的多肽链，其中一条存在于作为相邻抗原结合位点或其多肽链的单条共同多肽中，则连接这两个抗原结合位点的肽接头代表在共同单条多肽中它们之间的氨基酸序列。
在某些实施方案中，接头L1和L2是肽接头。L1和L2的合适长度可以独立选择。例如，在某些实施方案中，L1和/或L2的长度为约50个或更少的氨基酸残基。在某些实施方案中，L1由约50个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L1由约20个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L2由约50个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L2由约20个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L1和L2独立地由约50个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L1和L2独立地由约20个或更少的氨基酸残基组成。
在一些实施方案中，肽接头L1和L2具有优化的长度和/或氨基酸组成。在一些实施方案中，L1和L2具有相同的长度并且具有相同的氨基酸组成。在其他实施方案中，L1和L2不同。在某些实施方案中，L1和/或L2是“短的”，即由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，在某些情况下，接头由约12个或更少的氨基酸残基组成。在某些实施方案中，L1和/或L2是“长的”，例如由15、20或25个氨基酸残基组成。在一些实施方案中，L1和/或L2由约3至约15个，例如8、9或10个连续氨基酸残基组成。
关于L1和L2的氨基酸组成，选择具有赋予本发明多特异性结合蛋白灵活性、不干扰结合结构域以及抵抗蛋白酶切割的性质的肽。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抗性。适用于连接多特异性结合蛋白中的结构域的接头的实例包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGSG)n、(GGSGG)n和(GGGGS)n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施方案中，L1和/或L2独立地选自表7中列出的肽序列。在一些实施方案中，L1和/或L2独立地选自SEQ ID NO:292、293、294、295、296、297、298、299、300、301或302。在一些实施方案中，L1和/或L2独立地选自SEQ ID NO:298、299和302。在一些实施方案中，L1和/或L2包含SEQ ID NO:298、299和302的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1和/或L2由SEQ ID NO:298、299和302的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，L1和/或L2各自包含SEQ ID NO:298、299和302的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1和/或L2各自由SEQ ID NO:298、299和302的氨基酸序列组成。
表7.示例性肽接头序列
Figure BDA0003786158540000991
Figure BDA0003786158540001001
接头，如本文公开的肽接头，也可用于连接scFv的VH和VL，如上文标题为“构建体形式”的小节D中所述。
F.示例性多特异性结合蛋白
下表8中列出了多特异性结合蛋白的实例，其包含结合CD19的scFv、结合CD3的scFv和结合血清白蛋白的sdAb。
表8.示例性多特异性结合蛋白
Figure BDA0003786158540001002
1该表中的多特异性结合蛋白作为单条多肽存在。该形式显示了从N端到C端的顺序为结合CD19的scFv、结合CD3的scFv和结合HSA的sdAb。
2结合CD3的scFv序列可以在VH的44位和VL的100位含有或缺少Cys取代。结果，为衍生自抗体CNG-CD3-1、CNG-CD3-2和CNG-CD3-3(也参见表4)中的每一种的scFv提供了两条序列。
tAb0050(SEQ ID NO:694)
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tAb0051(SEQ ID NO:695)
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表8给定行中列出的抗原结合位点可以通过上述小节E中描述的肽接头以行中指定的方向连接。在某些实施方案中，至少两个相邻的抗原结合位点通过具有SEQ ID NO:302的氨基酸序列的肽接头连接。在某些实施方案中，每两个相邻的抗原结合位点通过具有SEQID NO:302的氨基酸序列的肽接头连接，从而形成存在于单条多肽中的多特异性结合蛋白。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和422。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:694的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、422和72。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:695的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:72、121和422。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:696的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:422、121和72。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:697的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:72、422和121。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:698的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:422、72和121。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:699的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、11和422。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:700的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、422和11。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:701的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:422、121和11。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:702的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:11、422和121。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:703的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和423。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:704的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和427。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:705的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和428。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:706的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和433。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:707的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、72和434。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:708的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、11和427。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:709的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白从N端到C端包含SEQ ID NO:121、11和433。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:710的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含如本文公开的结合CD19的抗原结合位点、结合CD3的抗原结合位点和包含抗体Fc区的半衰期延长结构域。多特异性结合蛋白可以采用多种形式来组合抗原结合位点和Fc区。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含IgG抗体形式的抗CD19抗体，其在IgGFc区的C端与结合CD3的scFv融合。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含第一多肽链，其从N端到C端包含结合CD19的抗原结合位点的VH，IgG抗体(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，和结合CD3的scFv；以及第二多肽链，其从N端到C端包含结合CD19的抗原结合位点的VL和IgG抗体的轻链恒定(CL)结构域。在某些实施方案中，结合CD3的scFv包含位于VH结构域N端的VL结构域。在某些实施方案中，IgG抗体是人IgG1抗体。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含第一多肽链中的两个和第二多肽链中的两个，从而形成二聚抗体Fc区。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-1作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc_CNG-CD3-1-VL_CNG-CD3-1-VH(SEQ ID NO:712)
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CNG-CD19-701-VL_CL(SEQ ID NO:713)
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在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-2作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc_CNG-CD3-2-VL_CNG-CD3-2-VH(SEQ ID NO:714)
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CNG-CD19-701-VL_CL(SEQ ID NO:713)
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在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-3作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc_CNG-CD3-3-VL_CNG-CD3-3-VH(SEQ ID NO:715)
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CNG-CD19-701-VL_CL(SEQ ID NO:713)
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在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含IgG抗体形式的抗CD19抗体，其在IgG轻链恒定区的C端与结合CD3的scFv融合。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含第一多肽链，其从N端到C端包含结合CD19的抗原结合位点的VH，IgG抗体(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域；以及第二多肽链，其从N端到C端包含结合CD19的抗原结合位点的VL、IgG抗体的轻链恒定(CL)结构域和结合CD3的scFv。在某些实施方案中，结合CD3的scFv包含位于VH结构域N端的VL结构域。在某些实施方案中，IgG抗体是人IgG1抗体。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含第一多肽链中的两个和第二多肽链中的两个，从而形成二聚抗体Fc区。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-1作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc(SEQ ID NO:716)
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CNG-CD19-701-VL_CL_CNG-CD3-1-VL_CNG-CD3-1-VH(SEQ ID NO:717)
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在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-2作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc(SEQ ID NO:716)
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CNG-CD19-701-VL_CL_CNG-CD3-2-VL_CNG-CD3-2-VH(SEQ ID NO:718)
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在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含CNG-CD19-701作为CD19结合结构域和CNG-CD3-3作为CD3结合结构域。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含具有以下两个氨基酸序列的多肽链：
CNG-CD19-701-VH_CH1_Fc(SEQ ID NO:716)
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CNG-CD19-701-VL_CL_CNG-CD3-3-VL_CNG-CD3-3-VH(SEQ ID NO:719)
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在某些实施方案中，本文公开的多特异性结合蛋白进一步包含标签肽，例如Flag标签、6×His标签或10×His标签(HHHHHHHHHH，SEQ ID NO:711)。此类标签肽可用于纯化多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，标签肽(例如，10×His标签)位于多特异性结合蛋白的C端。在某些实施方案中，标签肽(例如，10×His标签)位于多特异性结合蛋白的N端。
G.结合亲和力
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以约5pM-约100μM范围内的KD结合CD19(例如，人CD19)、CD3(例如，人CD3和/或猕猴CD3)和/或血清白蛋白(例如，HSA)。KD可以通过本领域已知的方法测量，如通过SPR、BLI、或通过如下实施例1、2或7中描述的流式细胞术来测量。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以低于或等于(即，结合强于或等于)以下的KD结合CD19、CD3和/或血清白蛋白：20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM或10pM。例如，在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以以下范围内的KD结合CD19、CD3和/或血清白蛋白：约10pM-约1nM、约10pM-约0.9nM、约10pM-约0.8nM、约10pM-约0.7nM、约10pM-约0.6nM、约10pM-约0.5nM、约10pM-约0.4nM、约10pM-约0.3nM、约10pM-约0.2nM、约10pM-约0.1nM、约10pM-约50pM、0.1nM-约10nM、约0.1nM-约9nM、约0.1nM-约8nM、约0.1nM-约7nM、约0.1nM-约6nM、约0.1nM-约5nM、约0.1nM-约4nM、约0.1nM-约3nM、约0.1nM-约2nM、约0.1nM-约1nM、约0.1nM-约0.5nM、约0.5nM-约10nM、约1nM-约10nM、约2nM-约10nM、约3nM-约10nM、约4nM-约10nM、约5nM-约10nM、约6nM-约10nM、约7nM-约10nM、约8nM-约10nM或约9nM-约10nM。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以高于或等于(即，结合弱于或等于)以下的KD结合CD19、CD3和/或血清白蛋白：10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM或100nM。例如，在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以以下范围内的KD结合CD19、CD3和/或血清白蛋白：约10nM-约1000nM、约10nM-约900nM、约10nM-约800nM、约10nM-约700nM、约10nM-约600nM、约10nM-约500nM、约10nM-约400nM、约10nM-约300nM、约10nM-约200nM、约10nM-约100nM、约10nM-约50nM、约50nM-约1000nM、约100nM-约1000nM、约200nM-约1000nM、约300nM-约1000nM、约400nM-约1000nM、约500nM-约1000nM、约600nM-约1000nM、约700nM-约1000nM、约800nM-约1000nM或约900nM-约1000nM。
在某些实施方案中，与CD19或CD3结合的KD在不存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量。在某些实施方案中，与CD19或CD3结合的KD在基本上不存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量。在某些实施方案中，与CD19或CD3结合的KD在存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量，例如在存在约10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量。
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合蛋白以与单独的各个抗原结合位点或具有相同抗原结合位点的单克隆抗体相似的KD值结合CD19、CD3和/或血清白蛋白。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白结合CD19、CD3和/或血清白蛋白的KD值相较于单独的各个抗原结合位点或具有相同抗原结合位点的单克隆抗体结合CD19、CD3和/或血清白蛋白的KD值增加不超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合蛋白在存在血清白蛋白的情况下以与不存在或基本上不存在血清白蛋白的情况下相似的KD值结合CD19和/或CD3。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在存在血清白蛋白的情况下结合CD19和/或CD3的KD值相较于不存在或基本上不存在血清白蛋白的情况下结合CD19和/或CD3的KD值增加不超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。
H.治疗活性
本文公开的多特异性结合蛋白设计为同时结合B细胞和T细胞。T细胞的募集促进了涉及溶细胞性突触的形成以及穿孔素和颗粒酶递送的B细胞的裂解。结合的T细胞能够进行连续的靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见例如，WO2007042261A2。因此，多特异性结合蛋白与靶B细胞的结合破坏靶细胞和/或损害B细胞相关疾病的进展。
可以在体外以多种方式测量由本发明的多特异性结合蛋白介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如刺激的富集(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是猕猴来源的或表达的或经第一结构域结合的猕猴靶细胞表面抗原转染，则效应细胞也应该是猕猴来源的，如猕猴T细胞系例如4119LnPx。靶细胞应表达CD19，例如人或猕猴CD19。靶细胞可以是用CD19稳定或瞬时转染的细胞系(如CHO)。可选地，靶细胞可以是天然表达CD19的细胞系，如B淋巴细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)的比例通常为约10:1，但也可以有所不同。靶细胞的杀伤可以在51Cr释放测定(孵育时间约18小时)或在基于FACS的细胞毒性测定(孵育时间约48小时)中测量。测量细胞死亡的其他方法是技术人员熟知的，如MTT或MTS测定、基于ATP的测定包括生物发光测定、磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆形成测定和ECIS技术。
在某些实施方案中，由本文公开的多特异性结合蛋白介导的细胞毒性活性在上述基于细胞的细胞毒性测定中测量。其由EC50值表示，该值对应于最大有效浓度的一半(在基线和最大值中间诱导细胞毒性反应的多特异性结合蛋白的浓度)。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的EC50值为≦5000pM，例如，≦4000pM、≦3000pM、≦2000pM、≦1000pM、≦500pM、≦400pM、≦300pM、≦200pM、≦100pM、≦50pM、≦20pM、≦10pM、≦5pM、≦4pM、≦3pM、≦2pM或≦1pM。
应当理解，相较于未刺激的PBMC，当使用刺激/富集的CD8+T细胞作为效应细胞时，EC50值通常较低。进一步理解，相较于低水平的靶抗原，当靶细胞表达高水平的靶细胞表面抗原时，EC50值通常较低。例如，当刺激/富集的人CD8+T细胞用作效应细胞时(以及靶细胞表面抗原转染的细胞如CHO细胞或靶细胞表面抗原阳性人细胞系用作靶细胞时)，多特异性结合蛋白的EC50值≦1000pM，例如≦500pM、≦250pM、≦100pM、50pM、≦10pM或≦5pM。当人PBMC用作效应细胞时，多特异性结合蛋白的EC50值≦5000pM，例如≦4000pM、≦2000pM、≦1000pM、≦500pM、≦200pM、≦150pM、≦100pM、≦50pM、≦10pM或≦5pM。当猕猴T细胞系如LnPx4119用作效应细胞时，以及猕猴靶细胞表面抗原转染细胞系如CHO细胞用作靶细胞系时，多特异性结合蛋白的EC50值≦2000pM，例如，≦1500pM、≦1000pM、≦500pM、≦300pM、≦250pM、≦100pM、≦50pM、≦10pM或≦5pM。
因此，在某些实施方案中，使用刺激/富集的人CD8+T细胞作为效应细胞测量EC50值。在某些实施方案中，使用人PBMC作为效应细胞测量EC50值。在某些实施方案中，使用猕猴T细胞系如LnPx4119作为效应细胞和工程化以表达猕猴CD19的细胞(例如，CHO细胞)作为靶细胞来测量EC50值。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合蛋白不诱导或不介导不表达CD19的细胞的裂解。术语“不诱导裂解”或“不介导裂解”或其语法等价物是指多特异性结合蛋白在最高达500nM的浓度下不诱导或不介导不表达CD19的细胞的超过30％的裂解，例如，不超过30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或5％，其中表达CD19的细胞系的裂解设置为100％。
在某些实施方案中，本文公开的多特异性结合蛋白在杀伤表达CD19的细胞(例如，癌细胞)方面比在相同摩尔浓度下的相应的各抗CD19或抗CD3单克隆抗体更有效。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在杀伤表达CD19的细胞(例如，癌细胞)方面比各自在相同摩尔浓度下的相应的各抗CD19和抗CD3单克隆抗体的组合更有效。
多特异性结合蛋白的细胞毒活性可以在存在或不存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量。在某些实施方案中，上文公开的细胞毒活性是在不存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量的。在某些实施方案中，上文公开的细胞毒活性是在基本上不存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量的。在某些实施方案中，上文公开的细胞毒活性在存在血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量，例如在存在约10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL血清白蛋白(例如，HSA)的情况下测量。
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合蛋白在存在血清白蛋白的情况下以与不存在或基本不存在血清白蛋白的情况下相似的EC50值杀伤表达CD19的细胞。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在存在血清白蛋白的情况下杀伤表达CD19的细胞的EC50值相较于不存在或基本不存在血清白蛋白的情况下杀伤表达CD19的细胞的EC50值增加不超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。应当理解，血清白蛋白的存在(例如，约10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL血清白蛋白)也可以非特异性地改变多特异性结合蛋白的EC50值。可以通过比较不含血清白蛋白结合结构域的对照蛋白在存在和不存在血清白蛋白的情况下的EC50值来评估非特异性作用。在某些实施方案中，倍数变化由血清白蛋白对对照蛋白如结合CD19和CD3的双特异性蛋白的非特异性作用抵消。
I.构建体尺寸
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为约40kD至约100kD。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为至少60kD、至少65kD、至少70kD、至少75kD、至少80kD、至少85kD、至少90kD或至少95kD。可以理解，较小的尺寸通常有助于更快的扩散和组织渗透，但对于治疗血液中大量存在靶细胞(例如，癌细胞)的适应症而言，尺寸减小可能并不那么重要。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为从约40kD至约90kD、从约40kD至约80kD、从约40kD至约70kD、从约40kD至约60kD、从约40kD至约50kD、从约50kD至约100kD、从约50kD至约90kD、从约50kD至约80kD、从约50kD至约70kD、从约50kD至约60kD、从约60kD至约100kD、从约60kD至约90kD、从约60kD至约80kD、从约60kD至约70kD、从约65kD至约100kD、从约65kD至约90kD、从约65kD至约80kD、从约65kD至约70kD、从约70kD至约100kD、从约70kD至约90kD、从约70kD至约80kD、从约80kD至约100kD、从约80kD至约90kD或从约90kD至约100kD。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量低于40kD。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的分子量为约50kD-约90kD、约50kD-约80kD、约50kD-约70kD、约50kD-约60kD、约60kD-约90kD、约60kD-约80kD、约60kD-约70kD、约65kD-约90kD、约65kD-约80kD、约65kD-约70kD、约70kD-约90kD或约70kD-约80kD。
J.血清半衰期
已经开发出融合蛋白来增加小蛋白，特别是抗体片段的体内半衰期。例如，与异二聚化抗体Fc区(如具有一个或多个延长体内半衰期的突变的Fc)的融合描述于美国专利申请公开号US20140302037A1、US20140308285A1以及PCT公开号WO2014144722A2、WO2014151910A1和WO2015048272A1中。另一种策略是与人血清白蛋白(HSA)或HSA结合肽融合(参见，例如PCT公开号WO2013128027A1和WO2014140358A1)。新生儿Fc受体(FcRn)似乎与延长循环中白蛋白的寿命有关(参见Chaudhury等人(2003)J.Exp.Med.,3:315-22)。白蛋白和IgG与FcRn的不同位点非协同结合并形成三分子(参见同上)。人FcRn与HSA和人IgG的结合是pH依赖性的，在酸性pH下较强，在中性或生理pH下较弱(参见同上)。这一观察结果表明，与那些含有IgG(特别是Fc)的蛋白质和蛋白质复合物相似，含有白蛋白的蛋白质和蛋白质复合物通过与FcRn的pH敏感性相互作用而免受降解(参见同上)。使用表面等离子共振(SPR)测量单独的HSA结构域结合固定化的可溶性人FcRn的能力，结果表明FcRn和白蛋白通过白蛋白的D-III结构域以pH依赖性方式在不同于IgG结合位点的位点相互作用(参见，Chaudhury等人(2006)Biochemistry 45:4983-90和PCT公开号WO2008068280A1)。
本公开提供了具有延长的半衰期的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白具有至少24、36、48、60、72、84或96小时的血清半衰期。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白具有至少约50小时的血清半衰期。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白具有至少约100小时的血清半衰期。测量血清半衰期的方法是本领域已知的，示例性方法描述于0。在某些实施方案中，血清半衰期在非人灵长类动物中测量。在某些实施方案中，血清半衰期在人中测量。
在某些实施方案中，在向受试者静脉内施用50小时后，多特异性结合蛋白的血清浓度为在向所述受试者施用后1小时多特异性结合蛋白的血清浓度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在某些实施方案中，多特异性结合蛋白具有比对照多特异性结合蛋白长至少20％的血清半衰期，其中对照多特异性结合蛋白包括与所述多特异性结合蛋白的第一抗原结合位点相同的第一结构域，与所述多特异性结合蛋白的第二抗原结合位点相同的第二结构域，但不包括与所述多特异性结合蛋白的第三抗原结合位点相同或基本相同的第三结构域。在某些实施方案中，除了不存在半衰期延长结构域，对照多特异性结合蛋白与所述多特异性结合蛋白相同。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的血清半衰期比对照多特异性结合蛋白的血清半衰期长至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白的血清半衰期比对照多特异性结合蛋白的血清半衰期长至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
III.制备方法
可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术制备上述抗体和多特异性结合蛋白。例如，可以将编码所述抗体或多特异性结合蛋白的一种或多种分离的多核苷酸连接到其他合适的核苷酸序列，包括例如恒定区编码序列和表达控制序列，以产生编码期望的抗体或多特异性结合蛋白的常规基因表达构建体(即，表达载体)。所限定的基因构建体的产生在本领域的常规技术范围内。
可以将编码期望抗体或多特异性结合蛋白的核酸引入(连接)到表达载体中，该表达载体可以通过常规转染或转化技术引入宿主细胞。示例性宿主细胞是大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和不产生IgG蛋白的骨髓瘤细胞。转化的宿主细胞可以在允许宿主细胞表达编码抗体或多特异性结合蛋白的基因的条件下生长。
具体的表达和纯化条件将根据所使用的表达系统而变化。例如，如果要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将工程化基因定位在合适的细菌启动子(例如，Trp或Tac)和原核信号序列的下游，而将其克隆到表达载体中。表达的蛋白质可以分泌。表达的蛋白质可以积聚在折光小体或包涵体中，可以在通过法式压榨或超声处理破坏细胞后收获。然后将折光小体溶解，并且可以通过本领域已知的方法重折叠和/或切割蛋白质。
如果工程化基因要在真核宿主细胞，例如CHO细胞中表达，首先将其插入到含有合适的真核启动子、分泌信号、poly A序列和终止密码子的表达载体中。任选地，载体或基因构建体可以含有增强子和内含子。在涉及包含抗体或其部分的融合蛋白的实施方案中，表达载体任选地含有编码恒定区的全部或部分的序列，使得重链或轻链的整体或部分能够得到表达。可以使用常规技术将基因构建体引入真核宿主细胞。
本文公开的抗体或多特异性结合蛋白可以包含单条多肽链。在这种情况下，宿主细胞可以用表达多肽的单一载体(例如，含有与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列)转染。可选地，本文公开的抗体或多特异性结合蛋白可以包含两条或更多条多肽。在这种情况下，宿主细胞可以用一种以上的表达载体例如表达每条多肽的一种表达载体共转染。宿主细胞也可以用表达两条或更多条多肽的单一表达载体转染。例如，两条或更多条多肽的编码序列可以可操作地连接到不同的表达控制序列(例如，启动子、增强子和/或内部核糖体进入位点(IRES))。两条或更多条多肽的编码序列也可以通过核糖体跳跃序列或自切割序列(如2A肽)分隔开。
在某些实施方案中，为了表达抗体或多特异性结合蛋白，蛋白质构建体中包括N端信号序列。示例性的N端信号序列包括来自白介素2、CD-5、IgG kappa轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素的信号序列。
转染后，可以使用本领域已知的方法，如有限稀释、ELISA、FACS、显微镜检查或Clonepix，来分离单个克隆以用于细胞库生成。克隆可以在适合生物反应器放大和维持抗体或多特异性结合蛋白表达的条件下培养。
可以使用本领域已知的方法分离和纯化抗体或多特异性结合蛋白，这些方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、均质化、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱和混合模式色谱。
IV.药物组合物
本公开的特征还在于含有治疗有效量的本文所述的抗体或多特异性结合蛋白的药物组合物。该组合物可以配制用于多种药物递送系统。一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载剂也可以包括在组合物中以用于适当的制剂。用于本公开的合适制剂见于Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985。对于药物递送方法的简要回顾，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在此类实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；混悬剂；表面活性剂或润湿剂(如pluronics、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醇)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送载剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.(MackPublishing Company,1990)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有纳米颗粒，例如聚合物纳米颗粒、脂质体或微胶粒(参见Anselmo等人(2016)Bioeng.Transl.Med.1:10-29)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有持续或控制递送制剂。用于配制持续或控制递送方式的技术，如脂质体载体、生物可侵蚀微粒或多孔珠和长效注射剂，也是本领域技术人员已知的。缓释制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或成型制品形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。缓释基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。缓释组合物还可以包括可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制备的脂质体。
含有本文公开的抗体或多特异性结合蛋白的药物组合物可以以剂量单位形式存在并且可以通过任何合适的方法制备。药物组合物应配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜、鞘内和直肠施用。在某些实施方案中，本文公开的重组人唾液酸酶、重组人唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过IV输注施用。在某些实施方案中，本文公开的重组人唾液酸酶、重组人唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过瘤内注射施用。有用的制剂可以通过制药领域已知的方法制备。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.(Mack Publishing Company,1990)。适用于肠胃外施用的制剂组分包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载剂在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该抗微生物保存。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，及其合适混合物。
静脉给药制剂可以包含在注射器、笔或袋子中。在某些实施方案中，可以将袋子连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方案中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方案中，制剂可以冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方案中，制剂可以是冷冻干燥的并且45mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方案中，约40mg-约100mg的冷冻干燥制剂可以包含在一个小瓶中。在某些实施方案中，组合来自12、27或45个小瓶的冷冻干燥制剂以获得静脉内药物制剂中蛋白质的治疗剂量。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶至约1,000mg/小瓶的形式储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约600mg/小瓶的形式储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶的形式储存。
这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或者可以无菌过滤。所得水溶液可以按原样或冻干包装使用，冻干制剂在施用前与无菌水性载剂组合。制剂的pH通常在3和11之间，更优选地在5和9之间或6和8之间，最优选地在7和8之间，如7至7.5。所得固体形式的组合物可以包装在多个单剂量单元中，每个单元含有固定量的上述一种或多种药剂。固体形式的组合物也可以包装在容器中以获得灵活的量。
在某些实施方案中，本公开提供了具有延长的保质期的制剂，其包括本公开的蛋白质与以下组合：甘露醇、柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠。
在某些实施方案中，在pH缓冲溶液中制备包含本公开的蛋白质的水性制剂。本发明的缓冲剂可以具有约4至约8范围内的pH，例如约4.5至约6.0，或约4.8至约5.5，或可以具有约5.0至约5.2的pH。上述pH的中间范围也意在成为本公开内容的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。
在某些实施方案中，制剂包括缓冲系统，其含有柠檬酸盐和磷酸盐以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方案中，pH范围可以为约4.5至约6.0，或约pH 4.8至约5.5，或约5.0至约5.2的pH范围。在某些实施方案中，缓冲系统包括柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、磷酸二钠二水合物和/或磷酸二氢钠二水合物。在某些实施方案中，缓冲系统包括约1.3mg/mL的柠檬酸(例如，1.305mg/mL)、约0.3mg/mL的柠檬酸钠(例如，0.305mg/mL)、约1.5mg/mL的磷酸二钠二水合物(例如，1.53mg/mL)、约0.9mg/mL的磷酸二氢钠二水合物(例如，0.86)和约6.2mg/mL的氯化钠(例如，6.165mg/mL)。在某些实施方案中，缓冲系统包括1-1.5mg/mL的柠檬酸、0.25-0.5mg/mL的柠檬酸钠、1.25-1.75mg/mL的二水合磷酸二钠、0.7-1.1mg/mL的二水合磷酸二氢钠和6.0至6.4mg/mL的氯化钠。在某些实施方案中，制剂的pH用氢氧化钠调节。
作为张度剂(tonicifrer)的多元醇，可以稳定抗体或多特异性结合蛋白，也可以包含在制剂中。多元醇以可以根据制剂的期望等渗性而变化的量添加到制剂中。在某些实施方案中，水性制剂可以是等渗的。添加的多元醇的量也可以根据多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如，甘露醇)。在某些实施方案中，可以在制剂中用作张度剂的多元醇是甘露醇。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以为约5至约20mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以为约7.5至15mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以为约10-14mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以为约12mg/mL。在某些实施方案中，多元醇山梨糖醇可以包括在制剂中。
还可以将去污剂或表面活性剂添加到制剂中。示例性去污剂包括非离子去污剂，如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量使得其减少配制的抗体的聚集和/或最小化制剂中颗粒的形成和/或减少吸附。在某些实施方案中，制剂可以包括表面活性剂，其为聚山梨醇酯。在某些实施方案中，制剂可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler,Lexikon der Hifsstoffe,Editio Cantor Verlag Aulendorf,4thedi.,1996)。在某些实施方案中，制剂可以含有在约0.1mg/mL和约10mg/mL之间的聚山梨醇酯80，或在约0.5mg/mL和约5mg/mL之间。在某些实施方案中，可以在制剂中加入约0.1％的聚山梨醇酯80。
在实施方案中，将本公开的蛋白质产品配制成液体制剂。液体制剂可以以10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，小瓶用橡胶塞封闭并用铝压接密封封口密封。塞子可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方案中，液体制剂可以用0.9％盐水溶液稀释。
在某些实施方案中，本公开的液体制剂可以制备为10mg/mL浓度的溶液，其与稳定水平的糖组合。在某些实施方案中，液体制剂可以在水性载剂中制备。在某些实施方案中，可以以不大于可能导致不期望或不适合静脉内施用的粘度的量添加稳定剂。在某些实施方案中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方案中，液体制剂还可以包括缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
在某些实施方案中，液体制剂的pH可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，碱可以是氢氧化钠。
本文感兴趣的水性载剂是药学上可接受的(对人施用安全且无毒)并且可用于制备液体制剂的水性载剂。示例性载剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏液或右旋糖溶液。
可以任选地将防腐剂添加到本文的制剂中以减少细菌作用。例如，防腐剂的添加可以促进多用途(多剂量)制剂的生产。
抗体或多特异性结合蛋白可以冻干以产生包括蛋白质和冻干保护剂的冻干制剂。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方案中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可以包括缓冲剂、表面活性剂、填充剂和/或防腐剂中的一种或多种。
用于稳定冻干药物产品的蔗糖或麦芽糖的量可以是至少1:2的蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比。在某些实施方案中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以是1:2至1:5。在某些实施方案中，冻干之前的制剂的pH可以通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方案中药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，药学上可接受的碱可以是氢氧化钠。在冻干之前，可以将含有本发明的蛋白质的溶液的pH调节在6和8之间。在某些实施方案中，冻干药物产品的pH范围可以是7至8。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的期望治疗反应，而对患者没有毒性的活性成分的量。
具体剂量可以是每个患者的统一剂量，例如50-5,000mg蛋白质。可选地，可以根据患者的近似体重或体表面积定制患者的剂量。确定合适剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重程度、施用途径以及患者的年龄、性别和医疗状况。本领域技术人员通常对确定治疗的适当剂量所需的计算进行进一步细化，特别是根据本文公开的剂量信息和测定。剂量也可以通过使用确定用于结合适当的剂量-反应数据的剂量的已知测定来确定。个体患者的剂量可以随着疾病进展的监测而调整。可以测量患者体内可靶向构建体或复合物的血液水平，以查看是否需要调整剂量以达到或维持有效浓度。药物基因组学可用于确定哪些可靶向构建体和/或复合物及其剂量最有可能对给定个体有效(Schmitz等人,Clinica Chimica Acta 308:43-53,2001；Steimer等人,Clinica ChimicaActa 308:33-41,2001)。
通常，基于体重的剂量为约0.01μg至约100mg/kg体重，如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。
剂量可以每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2至20年一次。本领域普通技术人员可以基于测量的停留时间和体液或组织中可靶向构建体或复合物的浓度容易地预估给药的重复率。本发明的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。其可以每天一次或多次，每周一次或多次，每月一次或多次，以及每年一次或多次施用。
V.治疗应用
预期抗体或多特异性结合蛋白可以单独使用或与其他治疗剂联合使用。
A.适应症
本公开提供了用于在有需要的受试者中治疗或改善增殖性疾病、肿瘤性疾病、炎性疾病、免疫紊乱、自身免疫性疾病、感染性疾病、病毒性疾病、过敏反应、寄生虫反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病的方法，该方法包括施用本文公开的结合CD19的多特异性结合蛋白或抗体。
在某些实施方案中，待治疗的癌症是非霍奇金淋巴瘤，如B细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是B细胞淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或原发性中枢神经系统淋巴瘤。在某些其他实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。在某些其他实施方案中，待治疗的癌症是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在某些实施方案中，ALL是复发性/难治性成人和儿童ALL。
B.联合疗法
本文所述的方法和组合物可以单独使用或与其他治疗剂和/或形式联合使用。如本文所用，术语“联合”施用应理解为在受试者患上病症的过程中向受试者递送两种(或多种)不同的治疗，使得治疗对患者的影响在某个时间点重叠。在某些实施方案中，当第二种治疗开始递送时，一种治疗的递送仍在进行，因此在施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的某些实施方案中，治疗由于联合施用更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，相比于在没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗可以观察到的，更少的第二种治疗可以观察到相同的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻症状；或者类似的情况也存在于第一种治疗中。在某些实施方案中，递送使得与病症相关的症状或其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的。递送可以使得递送的第一种治疗的效果在递送第二种治疗时仍然可检测到。
在一方面，本公开提供了通过将第二治疗剂与一种或多种本文公开的结合CD19的多特异性结合蛋白和/或抗体联合施用来治疗受试者的方法。
可用作治疗癌症的联合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如放射线、丝裂霉素、维甲酸、苯达莫司汀、吉西他滨、长春新碱、依托泊甙、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、阿霉素、卡波醌、喷司他丁、二胺硝吖啶、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法屈唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他米特、氟他胺、甘氨硫嘌呤、卡莫氟、雷佐生、sizofilan、卡铂、二溴卫矛醇、喃氟啶、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、溶链菌制剂、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、黄体酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白细胞介素-2、促黄体激素释放因子和上述药物可能表现出与其同源受体的差异结合并增加或减少血清半衰期的变体。
可用作治疗癌症的联合疗法的一部分的另一类药物是免疫检查点抑制剂。检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂或TIGIT拮抗剂。
在某些实施方案中，检查点抑制剂是PD-1或PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T细胞表面的受体，可作为免疫系统检查点，在适当的时间抑制或以其他方式调节T细胞活性，以防止过度活跃的免疫应答。然而，癌细胞可以通过表达配体(例如PD-L1)来利用这一检查点，该配体与T细胞表面的PD-1相互作用以关闭或调节T细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。采用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性治疗方法描述于美国专利号8,728,474和9,073,994以及欧洲专利号1537878B1中，并且例如包括使用抗PD-1抗体。示例性抗PD-1抗体描述于例如美国专利号8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802。示例性的抗PD-1抗体包括例如，纳武单抗(
Figure BDA0003786158540001261
Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(
Figure BDA0003786158540001262
Merck Sharp&DohmeCorp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011,Cure Tech)。示例性抗PD-L1抗体描述于例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括例如，阿特珠单抗(
Figure BDA0003786158540001263
Genentech)、度伐单抗(duvalumab，AstraZeneca)、MEDI4736、avelumab和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂联合施用。在CTLA-4通路中，T细胞上的CTLA-4与其抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面的配体(例如，CD80(也称为B7-1)和CD86)的相互作用导致T细胞抑制。基于CTLA-4的示例性免疫检查点抑制方法描述于美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性抗CTLA-4抗体描述于美国专利号6,984,720、6,682,736、7,311,910；7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984，国际(PCT)公开号WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424，以及欧洲专利号EP 1212422B1中。示例性的CTLA-4抗体包括易普利姆玛(ipilimumab)或替西木单抗(tremelimumab)。
在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物与(i)PD-1或PD-L1抑制剂，例如本文公开的PD-1或PD-L1抑制剂，和(ii)CTLA-4抑制剂，例如本文公开的CTLA-4抑制剂联合施用。
在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物与IDO抑制剂联合施用。示例性IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(称为吲哚莫德(indoximod))、艾卡哚司他(epacadostat)(INCB24360)、那伏莫德(navoximod)(GDC-0919)和BMS-986205。
可用作治疗癌症的联合疗法的一部分的其他药剂是靶向非检查点靶标的单克隆抗体药剂(例如赫赛汀)和非细胞毒剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。
其他类别的抗癌剂包括，例如：(i)选自以下的抑制剂：ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂，DNA-PK和mTOR抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；(iii)选自以下的细胞因子：IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF。
应当理解，本文公开的旨在激活T淋巴细胞的抗体或多特异性结合蛋白可能会引起副作用如神经毒性。因此，在某些实施方案中，可与抗体或多特异性结合蛋白联合使用的第二治疗剂包含减轻抗体或多特异性结合蛋白的副作用(例如，降低神经毒性)的药剂。在某些实施方案中，第二治疗剂抑制T细胞运输，例如减少或抑制免疫细胞穿过血脑屏障。此类治疗剂的非限制性实例包括免疫细胞上的粘附分子(例如，α4整合素)的拮抗剂(例如，拮抗性抗体)，如那他珠单抗。在某些实施方案中，第二治疗剂增加1-磷酸鞘氨醇(SIP)受体(例如，S1PR1或S1PR5)的内化，如芬戈莫德或奥扎莫德。在某些实施方案中，第二治疗剂是一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，如ronopterin、cindunistat、A-84643、ONO-1714、L-NOARG、NCX-456、VAS-2381、GW-273629、NXN-462、CKD-712、KD-7040或胍基乙基二硫化物。在某些实施方案中，第二治疗剂是CSFl或CSFlR的拮抗剂，如培西达替尼(pexidartinib)、emactuzumab、卡比利珠单抗(cabiralizumab)、LY-3022855、JNJ-40346527或MCS110。第二治疗剂的其他非限制性实例包括多硫酸戊聚糖、米诺环素、抗ICAM-1抗体、抗P-选择素抗体、抗CD11a抗体、抗CD162抗体和抗IL-6R抗体(例如，托珠单抗)。
可以选择抗体或多特异性结合蛋白和另外的治疗剂的量以及施用的相对时间以实现期望的联合治疗效果。例如，当向需要此类施用的患者施用联合疗法时，组合中的治疗剂或包含治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序如顺序地、共同地、一起地、同时地等施用。此外，例如，抗体或多特异性结合蛋白可以在另外的治疗剂发挥其预防或治疗作用时施用，反之亦然。
在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在工艺和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，另外预期存在基本上由或由所列举的组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由或由所列举的加工步骤组成的根据本发明的工艺和方法。
在本申请中，当元素或组分被称为包括在列举的元素或组分的列表中和/或从列表中选择时，应理解该元素或组分可以是所列举的元素或组分中的任何一个，或者元素或组分可以选自由两个或更多个所列举的元素或组分组成的组。
此外，应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，无论是在本文中明确的还是暗示的，本文所述的组合物或方法的元素和/或特征可以以多种方式组合。例如，当提及特定化合物时，该化合物可用于本发明组合物的各种实施方案和/或本发明的方法中，除非从上下文中另有理解。换言之，在本申请中，实施方案已经以能够使得申请清晰和简明地书写和绘制的方式进行描述和描绘，但是意图并且将被理解的是，实施方案可以在不脱离本教导和发明的情况下以各种方式组合或分离。例如，应当理解，本文描述和描绘的所有特征都可以适用于本文描述和描绘的本发明的所有方面。
应当理解，除非从上下文和用途中另外理解，否则“至少一个”的表述包括在表述之后的每个列举对象以及两个或更多个列举对象的各种组合。除非从上下文中另外理解，否则与三个或更多个列举的对象有关的“和/或”表述应被理解为具有相同的含义。
应理解术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”、“有”、“存在”、“包括”、“包含”或“含有”的使用，包括其语法等价物，通常作为开放式的和非限制性的，例如不排除另外的未列举的元素或步骤，除非另有具体说明或从上下文中理解。
在术语“约”的使用在定量值之前的情况下，本发明还包括具体的定量值本身，除非另有明确说明。如本文所用，除非另有说明或推断，否则术语“约”是指与标称值相差±10％的变化。
应当理解，步骤的顺序或进行某些动作的顺序是无关紧要的，只要本发明保持可操作即可。此外，可以同时执行两个或多个步骤或操作。
本文使用的任何和所有示例或示例性语言，例如“如”或“包括”仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非要求保护。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
以上描述描述了本发明的多个方面和实施方案。本专利申请特别考虑了各个方面和实施方案的所有组合和排列。
实施例
现在一般性地描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，包括这些实施例仅仅是为了说明本发明的某些方面和实施方案，并非旨在限制本发明。
实施例1.新型抗CD19抗体的表征
本实施例描述了新型抗CD19抗体CNG-CD19-101至CNG-CD19-110和CNG-CD19-701至CNG-CD19-710。上表1中提供了CNG-CD19-101至CNG-CD19-110的氨基酸序列，上表2中提供了CNG-CD19-701至CNG-CD19-710的氨基酸序列。
CNG-CD19-101至CNG-CD19-110和CNG-CD19-701至CNG-CD19-710分别从亲本抗体CNG-CD19-1和CNG-CD19-7通过将多样性引入VH和/或VL以及对VH和VL序列的片段进行改组来优化。选择抗体克隆以相对于各自的亲本抗体提升对生物素化的人CD19的结合亲和力。然后从酵母细胞产生所选抗体，并使用蛋白A柱纯化。
如前所述，使用ForteBio Octet HTX系统通过表面等离子共振测量抗体与分离的CD19的结合亲和力(参见例如,Estep等人,High throughput solution-basedmeasurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.Mabs 5(2),270-278(2013))。简而言之，通过将IgG在线加载到抗hIgG Fc捕获(AHC)传感器上来进行ForteBio亲和力测量。传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以建立基线。将加载有IgG的传感器暴露于100nM人血清白蛋白3分钟，然后转移到测定缓冲液中3分钟以进行解离率(off-rate)测量。使用1:1结合模型分析所有动力学。
还测量了抗体对在细胞表面上表达的CD19的结合亲和力。简而言之，用洗涤缓冲液洗涤约100,000个过表达抗原的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并在室温下用100μl 100nMIgG孵育15分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并与100μl 1:100人-PE在冰上孵育15分钟。然后用洗涤缓冲液再洗涤细胞两次，并在FACS Canto II分析仪(BD Biosciences)上进行分析。
表9.抗CD19抗体与CD19蛋白和表达CD19的细胞的结合
Figure BDA0003786158540001301
如表9所示，CNG-CD19-101至CNG-CD19-110对人CD19和/或食蟹猴CD19的结合亲和力高于CNG-CD19-1。特别是，CNG-CD19-101至CNG-CD19-109以低于CNG-CD19-1的KD值结合人CD19；CNG-CD19-103至CNG-CD19-110以低于CNG-CD19-1的KD值结合食蟹猴CD19。CNG-CD19-101和CNG-CD19-103至CNG-CD19-110相较于CNG-CD19-1显示出增加的与表达人CD19的CHO细胞的结合。
表10.抗CD19抗体与CD19蛋白和表达CD19的细胞的结合
Figure BDA0003786158540001302
Figure BDA0003786158540001311
如表10所示，CNG-CD19-701至CNG-CD19-710相较于CNG-CD19-7显示出对人CD19和食蟹猴CD19更高的结合亲和力。特别是，CNG-CD19-701至CNG-CD19-710以低于CNG-CD19-7的KD值结合人CD19和食蟹猴CD19。CNG-CD19-701至CNG-CD19-710相较于CNG-CD19-7显示出增加的与表达人CD19的CHO细胞的结合。
通过表面等离子共振(SPR)对在VH的44位和VL的100位有或没有通过Cys取代引入的二硫键的抗CD19 VL-VH scFv进行额外的动力学分析。使用Biacore 8K光学生物传感器在HBS-EP+运行缓冲系统(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20)中连续稀释scFv蛋白并在25℃下评估(Global Life Sciences Solutions USA,Marlborough,MA)。在每次实验期间，样品室保持在10℃。
每个实验周期起始于在流动池1和2上注射(500s，2μL/min)在运行缓冲液中的生物素CAPture试剂(Global Life Sciences Solutions USA)1:20溶液。随后注射(300s，4.0μL/min)生物素化CD-19(40nM)到流动池2。在将CD19捕获到传感器表面后，将测试scFv(16.2至0.067nM，在运行缓冲液中稀释3倍)注射(300s，30uL/min)到流动池1和2。监测scFv的解离持续2564s。最后，注射(90s，10μL/min)再生溶液(0.25M NaOH中的6M胍-HCl)到流动池1和2用于准备传感器表面以进行另一个循环。
处理所得数据并拟合如下。传感图裁剪为仅包括scFv结合和解离步骤。随后使用Biacore Insight评估软件版本3.0.11.15423对齐裁剪的数据，减去双参考，然后将非线性最小二乘拟合到1:1结合模型(Myszka D.(1999)J.Mol.Recognit.12(5):279-284)。
每次测试的scFv的所得KD和koff值总结在表11中。
表11.抗CD19抗体与人CD19蛋白的结合
Figure BDA0003786158540001321
1在每个scFv构建体中，通过Cys取代在VH的44位和VL的100位引入二硫键。
实施例2.新型抗血清白蛋白抗体的表征
本实施例描述了新型抗血清白蛋白抗体CNG-HSA-101至CNG-HSA-120。这些抗体的氨基酸序列在上表5中提供。
CNG-HSA-101至CNG-HSA-120从亲本抗体CNG-HSA-1(单结构域抗体)通过将多样性引入重链可变区、通过易错PCR生成随机突变和改组VH片段进行优化。选择抗体克隆以相对于亲本抗体提升对生物素化人血清白蛋白的结合亲和力。此外，VH改组优化循环采用了热选择压力。通过在不同温度下孵育文库，然后选择在热孵育后保留抗原结合的抗体来施加热选择压力。然后从酵母细胞产生所选抗体，并使用蛋白A柱纯化。
如前所述，使用ForteBio Octet HTX系统通过表面等离子共振测量抗体对分离的血清白蛋白的结合亲和力(参见例如,Estep等人,High throughput solution-basedmeasurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.Mabs5(2),270-278(2013))。简而言之，通过将重链抗体(HCAb)在线加载到AHC传感器上来进行ForteBio亲和力测量。传感器在测定缓冲液中离线平衡30分钟，然后在线监测60秒以建立基线。将加载有HCAb的传感器暴露于100nM人血清白蛋白中3分钟，然后转移到测定缓冲液中3分钟以进行解离率测量。使用1:1结合模型分析所有动力学。
通过动态扫描荧光法(DSF)测量VHH片段的解链温度(Tm)。简而言之，将10μL 20XSypro Orange染料添加到20μL 0.2-1mg/mL HCAb中。使用BioRad CFX96 RT PCR机器以0.5℃的增量将样品板温度从40℃升高到95℃，每个温度平衡2分钟。原始数据的一阶导数的负值用于提取Tm。
表12.抗血清白蛋白抗体与血清白蛋白和蛋白A的结合
Figure BDA0003786158540001331
Figure BDA0003786158540001341
1N.B.表示在该测定条件下未检测到结合。
2N.D.表示未测定。
如表12所示，CNG-HSA-101至CNG-HSA-101-120相较于CNG-HSA-1显示出对人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和/或蛋白A更高的结合亲和力。特别是，所有这些抗体以低于CNG-HSA-1的KD值结合小鼠血清白蛋白。CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-110、CNG-HSA-111、CNG-HSA-112、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117、CNG-HSA-118、CNG-HSA-119和CNG-HSA-120以低于CNG-HSA-1的KD值结合人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白。CNG-HSA-101、CNG-HSA-103、CNG-HSA-106、CNG-HSA-107、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-111、CNG-HSA-113、CNG-HSA-114、CNG-HSA-115、CNG-HSA-116、CNG-HSA-118和CNG-HSA-120以比相同抗体结合人血清白蛋白的KD高小于4倍的KD值结合小鼠血清白蛋白。CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-104、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116和CNG-HSA-117以低于CNG-HSA-1的KD值结合蛋白A。CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-104、CNG-HSA-105、CNG-HSA-106、CNG-HSA-108、CNG-HSA-109、CNG-HSA-113、CNG-HSA-116、CNG-HSA-117和CNG-HSA-120显示出高于或等于60℃的解链温度，其中CNG-HSA-101、CNG-HSA-102、CNG-HSA-103、CNG-HSA-106和CNG-HSA-120显示出高于或等于65℃的解链温度。
实施例3.多特异性结合蛋白的产生
本实施例描述了多特异性结合蛋白的产生和纯化。
构建编码单链多特异性结合蛋白(参见表13)的核酸并进行密码子优化以在人细胞中表达，并按照标准程序克隆到哺乳动物表达载体中。在序列验证之后，使用PlasmidPlus纯化试剂盒(Qiagen)制备足量的质粒形式的表达载体用于转染。将人胚肾293(HEK293)细胞传代至适当的密度用于瞬时转染。用表达载体瞬时转染细胞并培养六天。
各种多特异性结合蛋白的氨基酸序列总结在表13中。构建体tAb0027至tAb0032各自含有具有SEQ ID NO:9中所示氨基酸序列的抗CD19 scFv、具有SEQ ID NO:105中所示氨基酸序列的抗CD3 scFv和具有SEQ ID NO:121中所示氨基酸序列的抗HSA sdAb。构建体tAb0033至tAb0038各自含有具有SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的抗CD19 scFv、具有SEQID NO:105中所示氨基酸序列的抗CD3 scFv和具有SEQ ID NO:121中所示氨基酸序列的抗HSA sdAb。
表13.示例性多特异性结合蛋白
Figure BDA0003786158540001361
Figure BDA0003786158540001371
Figure BDA0003786158540001381
Figure BDA0003786158540001391
Figure BDA0003786158540001401
Figure BDA0003786158540001411
通过以4000rpm离心收集培养物，并通过0.22mm过滤器过滤上清液。在C端带有10×His标签的多特异性结合蛋白分两步纯化。第一步是镍亲和层析，使用含有400mM咪唑的PBS进行洗脱。第二步是尺寸排阻色谱，在pH7.2的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中洗脱。通过紫外光谱测定多特异性结合蛋白浓度，必要时浓缩蛋白样品。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相色谱(HPLC)测定蛋白质的纯度。具体而言，使用在PBS中以0.2mL/min运行的MabPac尺寸排阻柱在Agilent 1100系列仪器上进行HPLC。收集洗脱时间为约225-240分钟的级分用于进一步表征。
如上所述，所产生的一些构建体含有具有SEQ ID NO:9或18中所示氨基酸序列的抗CD19 scFv。两个CD19结合结构域对CD19的结合亲和力通过SPR使用与人IgG1 Fc融合的单体CD19胞外域和二聚体CD19胞外域进行测量。结合动力学参数通常如前所述使用ForteBio仪器测量(参见Estep等人(2013)MAbs,5(2):270-78)。当用单体CD19蛋白测量时，具有SEQ ID NO:9的序列的CD19结合结构域的KD值为7nM，具有SEQ ID NO:18的序列的CD19结合结构域的KD值为11nM。当用二聚体CD19蛋白测量时，具有SEQ ID NO:9的序列的CD19结合结构域的KD值为5nM，具有SEQ ID NO:18的序列的CD19结合结构域的KD值为15nM。
一些多特异性结合蛋白含有衍生自CNG-CD3-1、CNG-CD3-2或CNG-CD3-3的分别具有表4中SEQ ID NO:422、427或433的氨基酸序列的抗CD3 scFv。这些scFv构建体对人CD3的结合亲和力通过SPR使用国际专利申请公开号WO2018208864A1中描述的BiaCore方法测量。CNG-CD3-1 scFv构建体以1.9nM的KD值结合人CD3；CNG-CD3-2 scFv构建体以16nM的KD值结合人CD3；CNG-CD3-3 scFv构建体以26nM的KD值结合人CD3。这些scFv构建体与人CD3的结合亲和力通过BLI使用国际专利申请公开号WO2018208864A1中描述的Octec方法测量。CNG-CD3-1 scFv构建体以4.4nM的KD值结合人CD3；CNG-CD3-2 scFv构建体以27nM的KD值结合人CD3；CNG-CD3-3 scFv构建体以54nM的KD值结合人CD3。
实施例4.多特异性结合蛋白诱导针对CD19+靶细胞的T细胞细胞毒性本实施例描述了多特异性结合蛋白的细胞毒性活性。
使用KILR Raji细胞模型评估多特异性结合蛋白和BiTE蛋白的T细胞重定向活性。简而言之，使用商业试剂盒(例如Easy Sep Human T Cell Enrichment Kit，StemCellTechnologies)通过阴性选择从来自单个健康供体的原代人PBMC中分离泛T细胞。将T细胞维持在补充有10％血清和300IU/mL IL-2的RPMI 1640培养基中以扩增T细胞。将收获的T细胞洗涤两次以去除任何血清。
在表面表达CD19的KILR Raji细胞用作靶细胞。为了调理靶细胞，将每种多特异性结合蛋白或BiTE(参见表13)在补充有5％热灭活低IgG胎牛血清和青霉素-链霉素-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中与靶细胞在37℃下一起孵育30分钟。以10个不同剂量连续稀释添加蛋白质，每个剂量重复运行。将人血清白蛋白以15mg/mL的终浓度添加到某些样品的培养基中。还用CD19阴性的KILR SKOV3细胞作为阴性对照以评估选择性蛋白质。
调理后，将靶细胞与泛T细胞以10:1的效应细胞与靶细胞(E:T)的比率在37℃下一起孵育6小时。KILR Raji细胞的杀伤导致标记的管家蛋白从这些细胞释放到培养基中，这通过添加KILR检测试剂(DiscoverX)来量化。在Envision读板器上读取来自所有孔的发光信号。每个板上都包括自发释放和总裂解对照，以计算杀伤百分比。
使用以下公式从发光信号值计算杀伤百分比：
杀伤％＝(来自测试蛋白质样品的值-来自自发释放对照的平均值)/(来自总裂解对照的平均值-来自自发释放对照的平均值)×100。通过使用GraphPad Prism软件拟合剂量反应曲线从杀伤百分比计算EC50值。
表14列出了示例性多特异性结合蛋白和对照抗CD19 BiTE蛋白在不存在和存在人血清白蛋白的情况下的T细胞重定向杀伤的EC50值。针对CD19阴性KILR SKOV3细胞没有观察到明显的杀伤作用。
表14.多特异性结合蛋白的细胞毒性活性
Figure BDA0003786158540001421
Figure BDA0003786158540001431
如表14所示，无论构建体形式、CD3结合结构域、HSA结合结构域如何以及无论测定培养基中是否存在HSA，含有具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的抗CD19 scFv的多特异性结合蛋白比含有具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的抗CD19 scFv的多特异性结合蛋白表现出更强的细胞毒性活性。根据该数据，预期含有这种对CD19具有更高结合亲和力的抗CD19scFv的构建体与含有具有较低结合亲和力的其他抗CD19 scFv的构建体相比，将显示出更强的治疗活性。
此外，所有测试的多特异性结合蛋白在不存在HSA的情况下比在存在HSA的情况下，显示出更低的EC50值(即更强的诱导细胞毒性的能力)。不希望受理论的限制，似乎HSA的存在引起了蛋白复合物的变化，这种变化对含有HSA结合结构域的多特异性结合蛋白是特异性的，而不是用博纳吐单抗观察到的非特异性效应。存在HSA时的EC50值与不存在HSA时的EC50值的比率，在本文中也称为“变化倍数”，用于评估HSA对多特异性结合蛋白的潜在治疗活性的影响。如表14所示，具有位于CD19结合结构域和CD3结合结构域N端的HSA结合结构域的构建体形式(即tAb0031、tAb0032、tAb0037和tAb0038)显示出比其他构建体形式更低的变化倍数，无论构建体中使用了何种CD19结合结构域。
此外，在具有相同CD19结合结构域、CD3结合结构域和HSA结合结构域的构建体中，CD19:CD3:HSA形式的构建体(即，CD19结合结构域位于CD3结合结构域的N端，并且CD3结合结构域位于HSA结合结构域的N端)，即tAb0027和tAb0033，在不存在和存在HSA的情况下显示出最低或次低的EC50值。
实施例5.多特异性结合蛋白对CD19+靶细胞的细胞毒性
本实施例提供了用于确定多特异性结合蛋白的细胞毒性活性的替代方法。
本文公开的多特异性结合蛋白可以在体外测定中评估它们对B细胞抗原阳性靶细胞的T细胞依赖性细胞毒性的介导。例如，使用杀伤免疫裂解反应(KILR)测定法(euroFins，DiscoverX)在体外评估本文公开的CD19结合多特异性结合蛋白对CD19+靶细胞的T细胞依赖性细胞毒性的介导。
简而言之，产生了如表8中所述的多特异性结合蛋白tAb0050至tAb0064。将Raji细胞工程改造为表达KILR报告蛋白以产生KILR-Raji细胞。KILR-Raji细胞的细胞毒性引起KILR蛋白释放到培养基中，其可以通过添加KILR检测试剂来量化。在测定前，将来自单个健康供体的冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)在补充有1X L-谷氨酰胺的完全生长培养基中静息至少24小时。通过阴性选择分离泛T细胞。为评估多特异性结合蛋白的重定向裂解，将每种多特异性结合蛋白以指定浓度一式两份添加到KILR-Raji细胞中，并在15mg/mL HSA存在下，在RPMI-1640+4％热灭活的极低IgG FBS，1×PSG中37℃下孵育30分钟。然后在37℃以10:1的E:T比添加泛T细胞6小时。通过添加KILR检测试剂量化细胞毒性并在Envision读板器上读取。使用四参数逻辑回归计算每个参数的EC50。
图2A中的多特异性结合蛋白除tAb0063之外，均具有衍生自CNG-CD3-1的CD3结合剂，其如通过SPR所测量的以1.9nM的KD结合人CD3。tAb0063构建体具有衍生自CNG-CD3-3的CD3结合剂，其如通过SPR所测量的以26nM的KD结合人CD3。与tAb0063相比，含有CNG-CD3-1scFv的多特异性结合蛋白在介导T细胞细胞毒性方面显示出更低的EC50值(即更强的活性)。类似地，在图2B中，tAb0050、tAb0054和tAb0060具有衍生自CNG-CD3-1的CD3结合剂，其以1.9nM的KD结合人CD3；tAb0061和tAb0062具有衍生自CNG-CD3-2的CD3结合剂，其以16nM的KD结合人CD3；tAb0063和tAb0064具有衍生自CNG-CD3-3的CD3结合剂，其以26nM的KD结合人CD3，每个KD均通过SPR测量。与含有相对较低亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白相比，含有相对较高亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白在介导T细胞细胞毒性方面显示出更低的EC50值(即更强的活性)。观察到CD3结合剂的CD3结合亲和力对多特异性结合蛋白的靶细胞杀伤活性的影响与CD19结合剂、CD3结合剂和HSA结合剂之间的相对定位无关。
图2A还显示了在具有相同CD19结合剂、CD3结合剂和HSA结合剂的构建体之间，在从N端到C端具有HSA结合剂、CD19结合剂和CD3结合剂(tAb0050和tAb0056)，或者从N端到C端具有CD19结合剂、CD3结合剂和HSA结合剂(tAb0054、tAb0059)的多特异性结合蛋白中观察到引起T细胞细胞毒性的较低EC50值。
替代地，本文公开的结合CD19的多特异性结合蛋白可以在体外测定中评估其对CD19+靶细胞的T细胞依赖性细胞毒性的介导。荧光标记的CD19+MEC-1细胞(CD19+人慢性B细胞白血病细胞系)与作为效应细胞的随机供体的分离PBMC或CB15 T细胞(标准化T细胞系)在存在CD19结合多特异性结合蛋白的情况下共同孵育。在加湿培养箱中于37℃下孵育4小时后，在分光荧光计中测定荧光染料从靶细胞到上清液中的释放。在没有结合CD19的多特异性结合蛋白的情况下孵育的靶细胞和在孵育结束时通过添加皂苷完全裂解的靶细胞分别用作阴性和阳性对照。基于测得的剩余活靶细胞，可以根据以下公式计算特异性细胞裂解百分比：[1-(活靶标数(样品)/活靶标数(自发)]×100％。使用GraphPad软件通过非线性回归/4参数逻辑拟合计算S型剂量反应曲线和EC50值。对于给定的多特异性结合蛋白浓度获得的裂解值用于通过使用Prism软件的4参数逻辑拟合分析计算S型剂量反应曲线。预计由结合CD19的多特异性结合蛋白诱导的靶细胞裂解率高于由缺乏CD19结合结构域或CD3结合结构域的类似构建体诱导的靶细胞裂解率。
替代地，使用人T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定来测量多特异性结合蛋白指导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力(Nazarian等人2015,J.Biomol.Screen,20:519-27)。在该测定中，T细胞和靶癌细胞系细胞在384孔板中以10:1的比例混合在一起，并添加不同量的多特异性结合蛋白。48小时后，洗去T细胞，留下未被T细胞杀死的靶细胞附着在平板上。为了定量剩余的活细胞，使用
Figure BDA0003786158540001451
Luminescent Cell Viability Assay(Promega)。预期由结合CD19的多特异性结合蛋白诱导的表达B细胞抗原的癌细胞的杀伤率将高于由缺乏CD19结合结构域或CD3结合结构域的相似构建体和/或其他阴性对照分子所诱导的杀伤率。
实施例6.具有HSA结合结构域的多特异性结合蛋白的药代动力学
本实施例旨在确定多特异性结合蛋白的药代动力学。
在药代动力学(PK)研究的背景下，在食蟹猴中测试含有结合CD19的结构域、结合CD3的结构域和结合血清白蛋白的结构域的多特异性结合蛋白，以评估多特异性结合蛋白的血清消除时间。
多特异性结合蛋白作为静脉推注或静脉输注施用。多特异性结合蛋白分别以0.5μg/kg至3μg/kg、6μg/kg、12μg/kg和15μg/kg的剂量线性药代动力学相关范围施用。出于可比性的目的，对多特异性结合蛋白的血清浓度进行了剂量标准化和分子量标准化(以nmol为单位)。
对于每种多特异性结合蛋白，使用一组至少两到三只动物。收集血液样品并制备血清以测定多特异性结合蛋白的血清浓度。使用免疫测定法测量血清多特异性结合蛋白水平。该测定通过经由CD19结合结构域捕获多特异性结合蛋白来进行，而针对多特异性结合蛋白的CD3结合结构域的抗体用于检测。血清浓度-时间曲线用于使用已知的分析方法确定PK参数，已知的方法如Ritschel W A和Kearns G L,1999,IN:Handbook Of BasicPharmacokinetics Including Clinical Applications,5th edition,AmericanPharmaceutical Assoc.,Washington,D.C.中描述的那些以及软件如WinNonlin software(
Figure BDA0003786158540001461
Professional V.3.1 WinNonlinTMCopyright 1998-1999.PharsightCorporation.Mountain View,Calif.)。
替代地，通过在实验中包括另一个接受对照构建体的食蟹猴组，将含有血清白蛋白结合结构域的各种多特异性结合蛋白的血清半衰期与能够结合CD19和CD3但缺乏血清白蛋白结合结构域的对照构建体的血清半衰期进行比较。可以包括额外的结构域，以使对照构建体在大小上与多特异性结合蛋白相似。
预计与能够结合CD19和CD3但缺乏血清白蛋白结合结构域的类似构建体和/或其他阴性对照分子相比，结合CD19的多特异性结合蛋白将具有显著更长的血清半衰期。
实施例7.通过流式细胞术测定抗原亲和力
本实施例旨在确定多特异性结合蛋白对抗原的亲和力。
测试本文公开的多种多特异性结合蛋白与人CD3+细胞和相应的B细胞表面抗原阳性细胞如人CD19+细胞的结合亲和力。还测试了多特异性结合蛋白与食蟹猴CD3+细胞和相应的B细胞表面抗原阳性细胞如食蟹猴CD19+细胞的结合亲和力。
CD3+和CD19+细胞与100μL多特异性结合蛋白的连续稀释液共同孵育。用FACS缓冲液洗涤3次后，将细胞与0.1mL的10μg/mL小鼠单克隆抗独特型抗体在相同缓冲液中在冰上孵育45分钟。在第二次洗涤循环后，将细胞与0.1mL的15μg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体在与之前相同的条件下共同孵育。作为对照，将细胞与抗-His IgG共同孵育，然后在没有多特异性结合蛋白的情况下与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体共同孵育。然后再次洗涤细胞并重悬于含有2μg/mL碘化丙啶(PI)的0.2mL FACS缓冲液中以排除死细胞。使用商用流式细胞仪和软件测量1×104个活细胞的荧光。使用软件如CXP软件(Beckman-Coulter,Krefeld,德国)或Incyte软件(Merck Millipore,Schwalbach,德国)计算细胞样品的平均荧光强度。可以使用归一化的荧光强度值和已知的计算方程来计算单点结合的KD值，计算方程如GraphPad Prism软件(GraphPad Software,La Jolla Calif.美国)中提供的那些。CD3结合亲和力和交叉反应性在针对CD3+Jurkat细胞和食蟹猴CD3+HSC-F细胞系的滴定和流式细胞术实验中进行评估。针对人CD19+肿瘤细胞系评估CD19结合和交叉反应性。可以使用针对表达重组人抗原或重组食蟹猴抗原的CHO细胞系确定的KD值计算交叉反应性的KD比值。
实施例8.由多特异性结合蛋白诱导的细胞因子产生
本实施例旨在确定多特异性结合蛋白诱导免疫细胞产生细胞因子的能力。
使用用于TNFα和干扰素γ的AlphaLISA测定法(Perkin Elmer)来获得在靶细胞如CD19+B细胞存在的情况下，T细胞由本发明的多特异性结合蛋白(如结合CD19的多特异性结合蛋白)激活的证据。对于该测定，如细胞毒性测定中所述，将表达B细胞表面抗原的原代人T细胞和人肿瘤细胞在结合CD19的多特异性结合蛋白的存在下进行孵育。孵育48小时后，根据制造商的说明分析2微升等分试样上清液。预期由结合CD19的多特异性结合蛋白诱导的TNFα或干扰素γ水平高于由缺乏CD19结合结构域或CD3结合结构域的类似构建体和/或其他阴性对照分子诱导的水平。
实施例9.体外细胞毒性和细胞因子释放研究中的抗体分析
本实施例旨在确定多特异性结合蛋白增强T细胞的细胞毒性和诱导所述T细胞的细胞因子产生的能力。
将从单个冷冻保存的PBMC供体纯化的CD3+T细胞与eFluor670标记的Raji细胞在存在测试物品和15mg/mL HSA的情况下以5:1的E:T比在37℃下孵育48小时。孵育后，沉淀细胞并用活/死可固定染料标记，同时储存上清液用于细胞因子分析。固定细胞并通过流式细胞仪评估。通过计算未用活/死染色标记的eFluor670+细胞的比例来确定活Raji细胞的百分比。使用来自R&D Systems的DuoSet ELISA评估上清液中细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα的浓度。使用四参数逻辑回归计算每个参数的EC50。
类似地，将从单个冷冻保存的PBMC供体中纯化的CD3+T细胞与eFluor670标记的Raji细胞在存在测试物品的情况下以0.5:1的E:T比在37℃下孵育6天，培养基和测试物品在第3天重新供给。孵育后，沉淀细胞并用活/死可固定染料标记。固定细胞并通过流式细胞仪评估。通过计算未用活/死染色标记的eFluor670+细胞的比例来确定活Raji细胞的百分比。
为评估多特异性结合蛋白的功效及其安全性，将测试蛋白介导T细胞细胞毒性的EC50值与诱导IL-2、IFNγ和TNFα产生的EC50值进行比较。介导T细胞细胞毒性的效力通常是期望的。某些细胞因子的产生也促进了针对表达CD19的靶细胞的免疫应答。然而，过多的细胞因子产生可能与多特异性结合蛋白的较低耐受性有关并且是不期望的。如图3A所示，观察到的总体趋势是，含有较高亲和力的CD3结合剂(CNG-CD3-1)的多特异性结合蛋白相对于含有低亲和力的CD3结合剂(CNG-CD3-2或CNG-CD3-3)的多特异性结合蛋白在所有活性上显示出更低的EC50值。包含衍生自CNG-CD3-1的CD3结合剂的tAb0050、tAb0054和tAb0060构建体以比诱导所测试的三种细胞因子中的一种(在tAb0054的情况下)或两种(在tAb0050和tAb0060的情况下)产生的EC50值更低的EC50值实现T细胞细胞毒性。含有衍生自CNG-CD3-2或CNG-CD3-3的CD3结合剂的tAb0061、tAb0062、tAb0063和tAb0064构建体以比诱导所测试的三种细胞因子中的至少两种产生的EC50值更高的EC50值实现T细胞细胞毒性。这些结果表明，含有高亲和力的CD3结合剂(CNG-CD3-1)的多特异性结合蛋白通常比含有低亲和力的CD3结合剂(CNG-CD3-2或CNG-CD3-3)的多特异性结合蛋白更有效。鉴于它们在实现T细胞细胞毒性方面的效力至少与它们诱导细胞因子产生的能力成比例地增加，预期这些含有较高亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白相对于含有较低亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白，可以在较低剂量下表现出治疗效果，而不会引起过多的细胞因子产生。
还在tAb0050、tAb0063和博纳吐单抗之间比较了介导T细胞细胞毒性的EC50值。如图3B所示，含有衍生自CNG-CD3-1的CD3结合剂的tAb0050在介导T细胞细胞毒性方面比tAb0063和博纳吐单抗更有效。
实施例10.多特异性结合蛋白功效的体内研究
本实施例旨在确定多特异性结合蛋白在小鼠模型中诱导体内肿瘤消退的能力。
将0.1mL PBS中的1x106 HuCELL A20-hCD19细胞接种到CD3εHuGEMM小鼠的右前腹。当平均肿瘤大小达到约68mm3时，将小鼠随机分组。在随机分组当天以指定剂量水平对小鼠进行一次静脉内治疗。随后每周测量肿瘤2-3次，如果肿瘤体积超过3000mm3，则处死小鼠。使用四参数逻辑回归计算每个参数的EC50。
如图4A-4D所示，在低剂量(0.01mg/kg，单次注射)和高剂量(0.1mg/kg，单次注射)下，用tAb0050和tAb0060(两者都含有衍生自CNG-CD3-1的CD3结合剂，其以1.6nM的KD结合人CD3)治疗导致相似程度的肿瘤生长抑制，并且与tAb0061或tAb0063(包含衍生自CNG-CD3-2或CNG-CD3-3的低亲和力的CD3结合剂)相比，两者都更有效。此外，如表15所示，与tAb0061或tAb0063相比，tAb0050和tAb0060的完全响应率均更高。该结果表明含有较高亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白在体内治疗表达CD19的肿瘤方面比含有较低亲和力的CD3结合剂的多特异性结合蛋白更有效。
表15.每个治疗组中经历完全响应的小鼠百分比。
Figure BDA0003786158540001491
Figure BDA0003786158540001501
进行了类似的体内研究以比较不同剂量水平的tAb0050与博纳吐单抗。如图5A-5D所示，在0.03mg/kg和0.1mg/kg剂量水平下，tAb0050的完全响应率比博吐纳单抗更高。总之，这些数据证明了tAb0050相对于博吐纳单抗的增强的体内功效。
援引并入
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等效物
在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他具体形式体现。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而非限制本文描述的本发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述指示，并且所有落入权利要求的等同意义和范围内的变化都旨在包含在其中。

Claims (82)

1.一种多特异性结合蛋白，其包含：
(a)以5pM至1nM范围内的KD结合人CD19的第一抗原结合位点；和
(b)以0.5nM至20nM范围内的KD结合人CD3的第二抗原结合位点。
2.权利要求1的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白是包含所述第一和第二抗原结合位点的融合蛋白。
3.权利要求1或2的多特异性结合蛋白，其进一步包含半衰期延长结构域。
4.权利要求3的多特异性结合蛋白，其中所述半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。
5.权利要求2-4的多特异性结合蛋白，其中所述半衰期延长结构域不位于多肽链中的所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点之间。
6.权利要求1-5中任一项的多特异性结合蛋白，其中每个KD通过表面等离子共振测量。
7.权利要求6的多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点以5pM至0.1nM范围内的KD结合人CD19，并且所述第二抗原结合位点以0.5nM至10nM范围内的KD结合人CD3。
8.权利要求6或7的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点结合人CD3的KD与所述第一抗原结合位点结合人CD19的KD的比值在10:1至1,000:1的范围内。
9.权利要求1-5中任一项的多特异性结合蛋白，其中每个KD通过生物层干涉法测量。
10.权利要求9的多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点以50pM至1nM范围内的KD结合人CD19，并且所述第二抗原结合位点以1nM至20nM范围内的KD结合人CD3。
11.权利要求9或10的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点结合人CD3的KD与所述第一抗原结合位点结合人CD19的KD的比值在10:1至100:1的范围内。
12.结合人CD19的抗原结合位点，所述抗体包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:110、111、113、114、115和71的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。
13.权利要求12的抗原结合位点，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:110、117、119、114、120和71的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ IDNO:93、87、68、80、70和71的氨基酸序列。
14.权利要求13的抗原结合位点，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:65、66、68、69、70和71的氨基酸序列。
15.权利要求12-14中任一项的抗原结合位点，其中所述VH包含与SEQ ID NO:62至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:63至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
16.权利要求12-15中任一项的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
17.权利要求12-16中任一项的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点以低于或等于1nM的KD结合人CD19。
18.结合人CD19的抗原结合位点，所述抗体包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、54、56、57、58和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。
19.权利要求18的抗原结合位点，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、54、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。
20.权利要求19的抗原结合位点，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:53、61、56、57、60和59的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:4、23、17、18、19和10的氨基酸序列。
21.权利要求20的抗原结合位点，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别为SEQ ID NO:4、5、7、8、9和10的氨基酸序列。
22.权利要求18-21中任一项的抗原结合位点，其中所述VH包含与SEQ ID NO:1至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:2至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
23.权利要求22的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
24.权利要求18-23中任一项的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点以低于或等于0.3nM的KD结合人CD19。
25.一种抗体，其包含权利要求12-24中任一项所述的抗原结合位点。
26.一种多特异性结合蛋白，其包含：
(a)结合人CD19的第一抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点是权利要求12-24中任一项的抗原结合位点；和
(b)结合人CD3的第二抗原结合位点。
27.权利要求26的多特异性结合蛋白，其进一步包含半衰期延长结构域。
28.权利要求27的多特异性结合蛋白，其中所述半衰期延长结构域包含结合人血清白蛋白的第三抗原结合位点。
29.权利要求28的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:184、409和411的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。
30.权利要求29的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:184、185和187的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。
31.权利要求29的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:189、190和192的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。
32.权利要求29-31中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:189、193和195的氨基酸序列，但不包含分别为SEQ ID NO:129、133和135的氨基酸序列。
33.权利要求32的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别为SEQ ID NO:123、124和126的氨基酸序列。
34.权利要求29-33中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的所述VH包含与SEQ ID NO:121至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。
35.权利要求29-34中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点的所述VH包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
36.权利要求29-35中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点以低于或等于10nM的KD结合人血清白蛋白。
37.权利要求29-36中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点以低于或等于2nM的KD结合蛋白A。
38.权利要求29-37中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点具有高于或等于60℃的解链温度。
39.权利要求1-11和26-38中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白包含单条多肽链。
40.权利要求39的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点不位于所述多肽链中的所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点之间。
41.权利要求40的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点位于所述多肽链中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点的N端。
42.权利要求41的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点位于所述第一抗原结合位点的N端，并且所述第一抗原结合位点位于所述多肽链中所述第二抗原结合位点的N端。
43.权利要求41的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点位于所述第二抗原结合位点的N端，并且所述第二抗原结合位点位于所述多肽链中所述第一抗原结合位点的N端。
44.权利要求40的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点位于所述多肽链中所述第一抗原结合位点和所述第二抗原结合位点的C端。
45.权利要求44的多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点位于所述第二抗原结合位点的N端，并且所述第二抗原结合位点位于所述多肽链中所述第三抗原结合位点的N端。
46.权利要求44的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点位于所述第一抗原结合位点的N端，并且所述第一抗原结合位点位于所述多肽链中所述第三抗原结合位点的N端。
47.权利要求39的多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点位于所述第三抗原结合位点的N端，并且所述第三抗原结合位点位于所述多肽链中所述第二抗原结合位点的N端。
48.权利要求39的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点位于所述第三抗原结合位点的N端，并且所述第三抗原结合位点位于所述多肽链中所述第一抗原结合位点的N端。
49.权利要求1-11和26-48中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第一抗原结合位点包含单链可变片段(scFv)。
50.权利要求4-11和28-49中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第三抗原结合位点包含单结构域抗体(sdAb)。
51.权利要求1-11和26-50中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含scFv。
52.权利要求1-11和26-51中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点结合人CD3ε。
53.权利要求52的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点以1-100nM范围内的KD结合人CD3ε。
54.权利要求1-11和26-53中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、416、418、419、420和421所示的氨基酸序列。
55.权利要求54的多特异性结合蛋白，其中所述VH包含与SEQ ID NO:412至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
56.权利要求54或55的多特异性结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含SEQ ID NO:422或423的氨基酸序列。
57.权利要求1-11和26-53中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、416、426、419、420和421所示的氨基酸序列。
58.权利要求57的多特异性结合蛋白，其中所述VH包含与SEQ ID NO:424至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:413至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
59.权利要求57或58的多特异性结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含SEQ ID NO:427或428的氨基酸序列。
60.权利要求1-11和26-53中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述第二抗原结合位点包含含有互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH和含有互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别由SEQ ID NO:415、431、418、419、420和432所示的氨基酸序列。
61.权利要求60的多特异性结合蛋白，其中所述VH包含与SEQ ID NO:429至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:430至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
62.权利要求60或61的多特异性结合蛋白，其中所述抗原结合位点包含SEQ ID NO:433或434的氨基酸序列。
63.权利要求1-11和26-62中任一项的多特异性结合蛋白，其中至少两个相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。
64.权利要求63的多特异性结合蛋白，其中每个所述相邻的抗原结合位点通过肽接头连接。
65.权利要求63或64的多特异性结合蛋白，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:298、299或302的氨基酸序列。
66.权利要求63或64的多特异性结合蛋白，其中所述肽接头由SEQ ID NO:298、299或302的氨基酸序列组成。
67.权利要求1-11和26-66中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白包含选自SEQ ID NO:694-710的氨基酸序列。
68.权利要求1-11和26-67中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白不包含抗体Fc区。
69.权利要求1-11和26-68中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白的分子量为至少65kD。
70.权利要求1-11和26-69中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白的血清半衰期为至少24、36、48或60小时。
71.一种药物组合物，其包含：
(a)权利要求1-11和26-70中任一项的多特异性结合蛋白或权利要求25的抗体；和
(b)药学上可接受的载剂。
72.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-11和26-70中任一项的多特异性结合蛋白或权利要求25的抗体。
73.一种载体，其包含权利要求72的多核苷酸。
74.一种重组宿主细胞，其包含权利要求72的多核苷酸或权利要求73的载体。
75.一种产生多特异性结合蛋白或抗体的方法，所述方法包括在允许所述多特异性结合蛋白或所述抗体表达的合适条件下培养权利要求74的宿主细胞。
76.权利要求75的方法，其进一步包括分离所述多特异性结合蛋白或所述抗体。
77.权利要求76的方法，其进一步包括将所述分离的多特异性结合蛋白或抗体与药学上可接受的载剂一起配制。
78.一种刺激针对表达CD19的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括将所述细胞和T淋巴细胞暴露于权利要求1-11和26-70中任一项的多特异性结合蛋白、权利要求25的抗体或权利要求71的药物组合物。
79.一种在有需要的受试者中治疗血液癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-11和26-70中任一项的多特异性结合蛋白、权利要求25的抗体或权利要求71的药物组合物。
80.权利要求79的方法，其中所述血液癌症是B细胞血液系统恶性肿瘤。
81.一种复合物，其包含表达CD3的T细胞、表达CD19的B细胞和权利要求1-11和26-70中任一项的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白同时结合所述T细胞和所述B细胞。
82.权利要求81的复合物，其进一步包含血清白蛋白。
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