JP2010521670A - Fanciおよびfanciを調整する薬剤の予後での、診断での、および癌治療での使用 - Google Patents
Fanciおよびfanciを調整する薬剤の予後での、診断での、および癌治療での使用 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本出願は、参照により本明細書に援用される2007年3月12日に出願した米国仮特許出願第60/906,724号に関連し、かつ35U.S.C. § 119(e)の下でこれに対する優先権を主張する。
本発明は、N.I.H.助成金RO1-HL52725およびRO1-DK43889の下で政府支援により為された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、一般に癌の治療のための組成物および方法に関する。
DNA損傷およびDNA複製ストレスを感知し、応答する能力は、細胞生存および生物生存のために重要である。遺伝毒性ストレスに対して適切に反応することができないと、発達障害および腫瘍形成を引き起こし得る。細胞は、遺伝毒性ストレスを検出して、特定タイプの修復を活性化すること、細胞周期を停止すること、および転写を変化させることによって反応する複雑なシグナル伝達経路を進化させてきた。このシグナル伝達経路の中核に、ATMおよびATRキナーゼがある(BakkenistおよびKastan(2004)Cell 118:9-17;Bartek et al.(2004)5:792-804;ZhouおよびElledge(2000)Nature 408:433-439)。これらのキナーゼは、損傷に応答して、Chk1およびChk2キナーゼを含む20以上の公知のタンパク質をリン酸化する。これらの経路に関する初期の理論では、これらの主要な役割が制御細胞周期移行であると考えたが、現在では、これらがDNA複製およびDNA修復の両方において必須な機能を調節するのに重要な役割を果たすことが明らかである。
本発明は、少なくとも部分的には、抗悪性腫瘍薬に対する癌の感受性における、FA経路によって果たされる重要な役割を示す一連の発見に基づく。FA経路におけるDNA損傷シグナリングに関するさらなる役割が発見され、DNA損傷感受性スクリーンと組み合わせたATMおよびATRキナーゼのための基質についてのプロテオミックスクリーンにより(Matsuokaら、提出済)、FANCI遺伝子が同定された。FANCIは、FANCD2パラログ(paralog)を同定し、また、リジン上でモノユビキチン化されることが、その機能にとって重要なことが示された。従って、本発明は、FANCIタンパク質が第2の重要なFAリガーゼ基質である可能性が高いことを開示し;またFANCIポリペプチドは、DNA損傷に応答して、FANCD2に結合してID複合体を形成し、クロマチン上にロードすることが示された。
本明細書に使用される「新生物」、「新生物障害」、「新形成」、「癌」、「腫瘍」および「増殖障害」という用語は、自律的増殖のための能力を有する細胞、すなわち、一般に構造的組織化および正常組織との機能的協調の部分的もしくは全体の欠如を示す異なる集団を形成する異常な状態または迅速に増殖している細胞増殖によって特徴づけられる状態をいう。本用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲段階にかかわらず、全てのタイプの前癌性、および癌性の増殖、または発癌過程、転移組織もしくは悪性形質転換された細胞、組織または器官を含む、造血性新生物(たとえば、リンパ腫または白血病)並びに固体新生物(たとえば、肉腫または癌腫)を包含することが意味される。造血性新生物は、骨髄球性、リンパ様または赤血球系統から生じる白血病(白血球(leukocytes)(白血球(white blood cell))並びに血液および骨髄におけるこれらの前駆体に関連した)、並びにリンパ腫(リンパ球に関連する)を含む造血性の構造(血液細胞の形成に関連する構造)および免疫系の成分に影響を及ぼす悪性腫瘍である。固体新生物には、筋肉、軟骨、血管、線維組織、脂肪または骨などの結合組織から生じる悪性新生物である肉腫を含む。また、固体新生物には、上皮構造(外部上皮(たとえば、皮膚、並びに胃腸管、肺および頸部の裏打ち)、並びに種々の腺(たとえば、乳房、膵臓、甲状腺)の内側を覆う内部上皮を含む)から生じる悪性新生物である癌腫を含む。本発明の方法による治療に特に感受性のある新生物の例は、白血病および肝細胞癌、肉腫、血管内皮癌、乳癌、中枢神経系癌(たとえば、星細胞腫、神経膠肉腫、神経芽細胞腫、乏突起細胞腫およびグリア芽細胞腫)、前立腺癌、肺および気管支癌、喉頭癌、食道癌、大腸癌、結直腸癌、胃腸癌、メラノーマ、卵巣癌および子宮体癌、腎臓癌および膀胱癌、肝臓癌、内分泌癌(たとえば、甲状腺)、並びに膵癌を含む。
C、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド(Temozolomide)およびトポテカンを含む。また、「遺伝毒性抗悪性腫瘍薬」には、被験体のDNAに損傷を生じさせるために十分な投与量の、照射、特に癌の治療のための放射線療法に使用されるタイプを含む。
from)、患者の感受性および投与の経路に応じて、この範囲内で変化する。
DNA損傷に対する細胞の反応は、細胞周期チェックポイント、DNA修復およびアポトーシスを媒介する経路の複雑な相互作用するネットワークである。これらの経路の研究のためのモデル病変は、迅速に細胞周期チェックポイントを誘導し、および多数の異なる経路によって修復されるDNA二本鎖切断であった。哺乳動物細胞では、相同的組換えおよび非相同組換え経路が利用される。哺乳動物細胞における広範な研究では、DNA修復および細胞周期チェックポイントタンパク質の複合が電離放射線によって誘導される二本鎖切断の部位に迅速に局在化したことが示されている。これらのタンパク質は、免疫蛍光解析によって検出することができるフォーカスを生じる。
1. FANCI結合リガンドを使用する検出
本明細書に開示したように、FANCIは、FANCIに特異的に結合する抗体を使用して容易に検出することができる。FANCIに特異的に結合することが本明細書に開示された市販の抗体には、抗KIAA1794抗体BL999およびBL1000(Bethyl)を含む。たとえば、FANCIに対するモノクローナル抗体を含む、FANCIに特異的に結合するさらなる抗体は、本明細書に記述した方法によって容易に調製することができる。
Laboratory; Cold Spring Harbor, N. Y. (1988), Chapter 6を参照されたい。また、抗体がFANCIポリペプチドに対して特異的であることを条件として、FANCIタンパク質の断片を認識し、および結合する抗体も含まれる。本発明の抗体は、当該技術分野において周知であり、ルーチンで実行される任意の方法を使用して産生することができる。
FANCI活性化およびフォーカス形成の検出のための代わりのアプローチは、蛍光タンパク質、たとえばGFPと融合されたFANCIタンパク質の使用である。FANCIおよびGFPの機能的な融合タンパク質は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する曝露により、フォーカスを形成することができる。次いで、これらのフォーカスは、蛍光顕微鏡によって見ることができる。従って、FANCIを含むフォーカスの形成は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する曝露に応答するFA経路の活性化のための代用マーカーとして測定することができる。このような融合タンパク質構築物を発生する方法、並びにFANCIを含むフォーカスの形成を検出するための方法は、本明細書に記述した方法を使用して、並びに米国出願第60/540,380号(これは、その全体が参照により本明細書に援用される)に記載されているようにFANC D2に対して以前に適用した方法の適応を介して行うことができる。
FANCIタンパク質の総細胞レベルは、DNA損傷に応答して有意に変化しない。むしろ、DNA損傷により、FANCIのモノユビキチン化、並びにFANCIを含むフォーカスへの漸増を生じる。FANCIを含むフォーカスの存在を測定するための代替法は、FANCIのモノユビキチン化された形態に特異的に結合するが、ユビキチン化されていない形態に結合しないリガンドを使用することであることが当業者に認識されるであろう。モノユビキチン化されたFANCIの存在を検出するためには、好ましくはリガンドを上記の通りに検出可能なラベルと結合させる。このようなリガンドを使用する主な利点は、当業者には理解されるであろうとおり、典型的にはDNA損傷を受けていない細胞におけるモノユビキチン化されたFANCIが低い基礎レベルであるため、FANCIを含むフォーカスのレベルを、代用マーカーとしてモノユビキチン化されたFANCIのレベルを使用して、生きた被験体から摂取した試料において測定することができることである。FANCIのモノユビキチン化された形態を特異的に認識する抗体(FANCI-L)は、迅速な診断としてかなりの有用性を有する。たとえば、この抗体は、以下のために使用することができる:
本発明は、FA経路の阻害剤を使用する新生物疾患の治療のために有用な方法および組成物を包含する。FA経路の阻害剤は、たとえば、本明細書に記述される方法、更には米国出願第10/165,099号および米国出願第60/540,380号(これらの内容は、参照により本明細書に援用される)において前述した方法によって、同定することができる。たとえば、FA経路の阻害剤は、米国出願第11,441,289号(この内容は、参照により本明細書に援用される)の図1に要約されたように、3段階アプローチを使用して系統的に同定することができる。
本発明は、FA経路の阻害剤の使用を想定する。FA経路の阻害剤には、通常はFANCIを含むフォーカスの形成を生じさせる遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の前に、後に、または同時に投与されたときに、FANCIを含むフォーカスの形成の阻害を生じる任意の化合物を含む。FANCIを含むフォーカスの形成を誘導する遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の例は、電離放射線(IR)およびシスプラチンまたはマイトマイシンCなどのDNAアルキル化剤を含むが、限定されない。また、FA経路の阻害剤は、通常ユビキチン化を誘導する薬剤に供された試料のユビキチン化されたFANCIポリペプチドのおよびユビキチン化されていないFANCIポリペプチドの相対量を測定することによって検出することができる。顕微鏡学的な検出手段を使用するFANCIを含むフォーカスの検出、並びにFANCIポリペプチドの相対的ユビキチン化状態の決定は、たとえば、2002年6月6日に出願の米国出願第10/165099号および2004年1月30日に出願の米国出願第60/540380号(これらの内容は、参照により本明細書に援用される)におけるFANC D2を含むフォーカスの検出のために記述したように行うことができる。簡潔には、FANCIを含むフォーカスは、抗FANCI抗体を使用する免疫蛍光顕微鏡観察を使用して検出することができる。あるいは、FANCIの蛍光タンパク質タグを付けたバージョンを関心対象の細胞にトランスフェクトして、顕微鏡によって測定されるFANCIを含むフォーカスの形成を、再び米国出願第60/540,380号においてFANC D2について記述したように、蛍光性「フォーカス」を検出することができる。ワートマニンおよびトリコスタチンAなどのFA経路を阻害する化合物は、たとえば2004年1月30日に出願の米国出願第60/540380号において、以前に開示されている。
細胞は、絶えず異なる種類のDNA損傷に供される。これらの損傷は、スーパーオキシド(O2 -)、過酸化水素(H2O2)などの活性酸素種を含む、種々の内部および外部の化学物質、並びに照射に対する曝露によって生じ得る。加えて、ヒトは、広範な発癌物質に常に曝露されており、これらの多くは、DNAに損傷を生じさせることによって作用する。こうむった損傷の型に応じて、少なくとも6つの異なるメカニズムが、ヒトにおけるDNA損傷修復のために存在することが示されている。
DNA二本鎖破壊(DSB)は、多くの環境因子または活性酸素種、電離放射線(IR)およびブレオマイシンのような一定の抗悪性腫瘍薬を含むその他の因子によって生じ得る。DSBを修復できないと、突然変異、染色体異常および最終的には細胞死を含む多くの結果を引き起こし得る。非相同末端連結(NHEJ)は、非正統的組換えとも呼ばれ、DSB修復の1つの主要な経路である。NHEJ経路のいくつかのメンバーを表1に示してある。
一本鎖DNA破壊(SSBs)は、細胞DNAにおいて生じる最も頻繁な病変の1つである。SSBsは、自発的に、または塩基除去修(BER)の間に塩基損傷の酵素の修復の中間体として生じ得る(Caldecott(2001)Bioessays 23(5):447-55)。DNAグリコシラーゼによる、ダメージを受けた塩基の除去に続くこの修復経路において、生じる脱プリン/脱ピリミジン(AP)部位は、最初にApel APエンドヌクレアーゼによってプロセスされて、5'デオキシリボース-ホスフェートを残し;次いでAPリアーゼ活性によって、3'β-除去産物を残す。DNA ポリメラーゼβによる、またはPCNA依存的ポリメラーゼによる、これらのAP部位のその後の除去により、単一ヌクレオチド(Polβについて)またはより長い修復パッチ(Polδ/εについて)のいずれかを充填するための修復合成、および次いで再連結が可能である(Wilson(1998)Mutat Res。407:203-15)。SSB部位が効率的にプロセスされて、除去されない場合、ダメージを受けた部位および止まった複製フォークのクラスターを形成して、細胞にとって潜在的に致死結果となるDSBの形成を生じる(Chaudhry & Weinfeld (1997) J Biol Chem. 272:15650-5;Harrison, Hatahet et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: 932- 41)。
ヌクレオチド除去修復(NER)は、大部分は正常塩基対形成を妨げる外来供与源によって生じる種々のヘリックスを歪めるDNA損傷に対して作用する。人におけるNERの主な機能は、紫外線(UV)によって誘導される損傷、たとえばピリミジンダイマの除去であるようである。7つの異なる遺伝子、XPA、XPB、XPC、XPD、XPE、XPFおよびXPGを含む、その欠陥が色素性乾皮症(XP)と呼ばれる常染色体性の劣性遺伝病を生じさせ得るNER経路のメンバーが同定されており、その全てが、NER経路において機能する(Hoeijmakers(2001)Mutat Res。485:43-59)。
ミスマッチ修復(MMR)は、DNAポリメラーゼにより不対合となったヌクレオチドおよび反復配列の複製の間のずれによって生じる挿入/欠失ループの両方を除去する(Harfe & Jinks-Robertson (2000) Annu Rev Genet 34:359-399)。最初に、ヘテロ二量体のMSH複合体がヌクレオチドミスマッチを認識して、その後にMLH1/PMS2およびMLH1/MLH3複合体と相互作用が続く。いくつかのタンパク質は、ヌクレオチド切除および再合成の進行に関与する。ミスマッチ修復が欠陥した腫瘍細胞は、正常細胞よりも非常に高い突然変異体頻度を有する(Parsons et al.(1993)Cell
75:1227-1236、Bhattacharyya et al.(1994)Proc Natl Acad。Sci
USA 91:6319-6323)。ミスマッチ修復に関与する少なくとも6つの遺伝子MSH2、MLH1、PMS2、MSH3、MSH6およびMLH3がヒトにおいて同定された。MSH3を除くこれらの遺伝子の欠陥は、遺伝性非ポリープ性大腸癌(HNPCC)を引き起こす(Hoeijmakers 2001)。
前述したように、一定の状況において、細胞のDNA損傷修復経路は、部分的に重複性であり得る。これは、1つの経路を特異的に遮断する薬剤を同定するのが困難なことを示す。従って、細胞が機能的DNA損傷経路を有する細胞に基づいた方法を使用して同定される阻害剤は、複数のDNA損傷修復経路に関与する複数の標的を有するであろう。従って、1つまたは複数のDNA損傷修復経路が欠損した株化細胞の使用により、新規の特異的阻害剤の同定が非常に促進されるであろう。従って、一つの側面に従って、非FA DNA損傷修復経路を阻害する薬剤を同定する方法が提供される。本方法は、FA経路に病変を有する細胞を使用する。本方法には、細胞を薬剤と接触させること、および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性について試験することを含む。機能的DNA損傷修復経路を含む対照細胞と比較ししたときに、FA経路に病変を含む試験細胞における遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する感受性の強化を与える薬剤は、該薬剤が、試験細胞が病変を含む経路以外の非FA DNA損傷修復経路を阻害することを示す。一つの態様において、試験細胞および対照細胞は、同質遺伝子的であるが、試験細胞がFA/BRCA経路の少なくとも1つ成分、たとえばとりわけFANCA、FANCB、FANCC、FANCD、FANC D2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCLおよびATRプロテインキナーゼに病変を含むことを除く。(ATRは、直接FA経路を調節するようであることに留意されたい)。ATRは、FANCD2のモノユビキチン化のために必要とされ(Andreassen et al.(2004)Genes Dev 18:1958-1963)、FANCD2機能のために必要にされるいくつかの部位に対してFANCD2をリン酸化する(Ho et al.(2006)Mol Cell
Biol 26:7005-7015;Taniguchi et al.(2002)Cell 109:459-472)。
DNA損傷修復経路の阻害剤と組み合わせた抗悪性腫瘍薬の組み合わせを使用して新生物障害患者を治療する方法を本明細書に開示してある。特に有用である抗悪性腫瘍薬は、DNAに損傷を生じさせる薬を含むが、限定されない。これらの薬剤には、DNAアルキル化剤、挿入剤等を含む。従って、以下を含むが、限定されないDNA損傷化学療法的な化合物の使用がさらに想定される:1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素(BCNU)、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロリムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド(Temozolomide)およびトポテカン。さらにまた、本明細書に記述した方法は、新生物障害を治療する放射線療法を使用することができる。一つの態様において、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬は、投与される濃度にて、DNA損傷修復を阻害しない。
細胞のFA経路の有効性は、化学療法薬に対する細胞の感受性と強く相関することが同定されている。従って、一つの側面において、本発明は、新生物障害または疾患をもつ被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するかどうかを予測する方法を提供する。本方法には、被験体から生体試料を得ること、および局在化(たとえば、FANCIを含むフォーカスのサイズおよび/または数を決定すること)および/または生体試料内のFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定することを含む。対照被検体からの生体試料と比較したときに減少された(たとえば、約70%未満、約50%未満、その他の)被験体の生体試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろう被験体を示す。同様に、対照細胞と比較したときのFANCIを含むフォーカスのサイズおよび/または数の減少は、また遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろう被験体を示す。
一定の態様において、被験体または患者は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与と同時に、前に、または後に、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬の治療上有効な用量で投与される。多くの抗悪性腫瘍薬の治療上有効な投薬量は、十分に確立されており、たとえばCancer Chemotherapy and Biotherapy: A Reference Guide Edition Number: 2 Tenenbaum, ed. Saunders & CO (1994)(参照により本明細書に援用される)において見出すことができる。
C、マイトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロミド(Temozolomide)およびトポテカン、並びに電離放射線からなる群より選択することができる。
DNA損傷修復経路の阻害剤を選択することができ、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤、CHK2阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグからなる群から選択することができる。
FANCIおよび/またはFA経路の阻害剤は、非FA DNA損傷修復経路の阻害剤の投与と同時に、または後に投与することができる。阻害剤は、非経口的、経口的または腫瘍内に直接投与することができる。
インビトロでまたはインビボの系であるかにかかわらず、本発明は、FANCIを含むフォーカスの形成を阻害することができる組成物、並びにFA経路以外のDNA損傷修復経路を阻害する組成物をスクリーニングする方法を包含する。合成または天然の化合物の大きなライブラリーからの候補モジュレーター化合物をスクリーニングすることができる。サッカリド、ペプチドおよび核酸をベースとする化合物のランダムおよび直接的合成のために多数の手段が現在使用されている。合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates (Merrimack, NH)およびMicrosource (New Milford, CT)を含む多数の会社から市販されている。珍しい化学物質ライブラリーは、Aldrich(Milwaukee、WI)から入手可能である。コンビナトリアルライブラリーを利用でき、調製することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーは、たとえば、Pan Lsboratory(Bothell, WA)またはMycoSearch(NC)から入手可能であり、または当該技術分野において周知の方法によって容易に生産することができる。加えて、天然および合成的に産生されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を介して、容易に修飾される。
もう一つの側面において、本発明は、前述の節に記載されているような抗悪性腫瘍薬および/または非FA DNA損傷修復経路の阻害剤と組み合わせてFANCIおよび/またはFA経路の阻害剤と後述するような薬学的に許容される担体とを含む方法および医薬組成物に関する。FANCIおよび/またはFA経路の阻害剤を含む医薬組成物は、癌を含む種々の疾患および障害を治療するために有用であり、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する保護剤としても有用であろう。
a)FANCIの阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および、
b)遺伝毒性抗悪性腫瘍薬。
(a)FANCIおよび/またはFA経路の阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、および、
(b)DNA損傷修復経路の阻害剤。
(a)FANCIおよび/またはFA経路の阻害剤またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ、
(b)非FA DNA損傷修復経路の阻害剤、および、
(c)遺伝毒性抗悪性腫瘍薬またはその薬学的に許容される塩、エステル、誘導体、溶媒和物もしくはプロドラッグ。
株化細胞
補完した(complemented)株化細胞PD20およびGM6914は、以前に記述してあり(Taniguchi et al.(2002)Cell 109:459-472)、DR-U2OSは、Maria Jasinによって提供された(Xia et al.(2006)Mol Cell 22:719-729)。GM02188は、Coriellから、BD0952は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャー(http://www.ecacc.org.uk)から、およびU20S は、アメリカン・セル・カルチャー・コレクション(ATCC)から得た。接着株化細胞は、1mlにつき100単位のペニシリン、1mlにつき0.1mgのストレプトマイシン、L-グルタミン(2 mM)、非必須アミノ酸(0.1 mM)および株化細胞に応じて10%または15%(v/v)のFBS(Invitrogen)を補ったダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)において培養し、リンパ芽球株は、同じ補充でRPMIにおいて培養した。リンパ球のレトロウイルス形質導入は、1×106を、上清1mlにつき8μgのポリブレンを補った新たに収集したウイルスと共に、室温で45分間、2500rpmにて回転させることによって行った。
抗体は、以下の通りであった:KIAA1794;BL999およびBL1000(Bethyl)、ウサギFANCD2(Novus)マウスFANCD2(Santa Cruz)、FANCA(Rockland)、ORC2(BD Bioscience)、ビンキュリン(Vinculin)(Sigma)、HA(Covance)、MYC(Covance)、SMC3pS1083(Bethyl)、PhosphoH3(Upstate)、Ran(BD Bioscience)、γH2AX(Upstate)。免疫沈降のためには、抗HAアフィニティーマトリックス(Roche)、抗FLAG M2アガロース(Sigma)、c-MYC(Santa Cruz)およびプロテインA/G PLUS-アガロース(Santa Cruz)を使用した。IFのための二次抗体は、Molecular ProbesおよびAmershamから、およびウエスタンブロットのための二次抗体は、Jackson Laboratoriesより得た。
ヒトcDNAライブラリーに対して、Platinum
Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)を使用してPCRを行った(Elledge et al.(1991)Proc Natl Acad Sci US A 88:17311735)。BD0952細胞からの総RNAは、Trizol(Invitrogen)を使用して単離した。RNAは、Superscript III(Invitrogen)およびdTプライマーを用いて逆転写した。PCR工程は、Platinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen)を使用して行った。ゲノムDNAは、DNeasy Tissue kit(Qiagen)を使用して調製した。KIAAl794のcDNAクローニングに使用したプライマーは、5'-CCGCTCGAGGACCAGAAGATTTTATCTCTAGCAG-3'(配列番号:1)および5'-CCGGTTAACTTAACTCAGGCATTTCATTTATTTT-3'(配列番号:2)であった。BD0952(FANCI)細胞からcDNAをクローン化するために、また同じプライマーを使用した。ゲノムのPCRプライマーは、以下の通り:第1のコードエキソン:5'-TTCAGGATTATTTTGGTTAGGTTA-3'(配列番号:3)および5'-GGTCACAAATGCCCTCAAG-3'(配列番号:4)、第3のコードエキソン:5'-TCAAAGCCCTTAACCATTGC-3'(配列番号:5)および5'-TGCCATCTTACCTCCAGCAT-3'(配列番号:6)、第36のコードエキソン:5'-TCTTGATCTGATGACCTGAACC-3'(配列番号:7)および5'-GTCGGGGCAACTTCATAGGAT-3'(配列番号:8)。
FANCIの突然変異を作製するために、QuikChange(登録商標)II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)またはQuikChange(登録商標)Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を使用した。K523R突然変異は、突然変異プライマー、5'-GCTTGATACTTGTCCTTCGGCGAGCTATGTTTGCCAACCAGC-3'(配列番号:9)および5'-GCTGGTTGGCAAACATAGCTCGCCGAAGGACAAGTATCAAGC-3'(配列番号:10)によって、QuikChange商標 II XL Site-Directed Mutagenesis Kitを使用して産生した。QuikChange(登録商標)Multi Site-Directed Mutagenesis Kitは、FANCIにおけるP55L突然変異(プライマー5'-CTTCAAAGGTTCCCTCTGCTCTGAGGAAGCTGG-3'(配列番号:11))およびR1285Q突然変異(5'-GCTCAGCACCTCACAAGACTTCAAGATCAAAGG-3'(配列番号:12))を作製するために使用した。
ステルス(Stealth)siRNAs(Invitrogen)を、85 nMの総siRNAsの終濃度にて、オリゴフェクトアミン(Oligofectamine)(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48〜72時間後にアッセイを行った。別に示さない限り、同じ遺伝子に対する3つのsiRNAsの組み合わせを使用した。標的配列は以下の通りであった。siRNAsは、特に明記しない限りInvitrogenから購入した(図1Dおよび5Iに示した実験で使用したsiRNAsは、Qiagenから購入した):
lacZ(Qiagen)5'-AACGTACGCGGAATACTTCGA-3'(配列番号:13)、
FANCI(Qiagen)5'-CTGGCTAATCACCAAGCTTAA-3'(配列番号:14)、
USP1(Qiagen)5'-TCGGCAATACTTGCTATCTTA-3'(配列番号:15)
ATM:5'-GCGCAGTGTAGCTACTTCTTCTATT-3'(配列番号:16)、
5'-GGGCCTTTGTTCTTCGAGACGTTAT-3'(配列番号:17)、
5'-GCAACATTTGCCTATATCAGCAATT-3'(配列番号:18)、
ATR:5'-GGGAAATAGTAGAACCTCATCTAAA-3'(配列番号:19)、
5'-GGTCTGGAGTAAAGAAGCCAATTTA-3'(配列番号:20)、
5'-CCACCTGAGGGTAAGAACATGTTAA-3'(配列番号:21)、
FANCI #1:5'-TCTCCTCAGTTTGTGCAGATGTTAT-3'(配列番号:22)、
FANCI #2:5'-GGCAGCTGTGTGGACACCTTGTTAA-3'(配列番号:23)、
FANCI #3:5'-GCTGGTGAAGCTGTCTGGTTCTCAT-3'(配列番号:24)、
FANCD2 #2:5'-TTAGTTGACTGACAATGAGTCGAGG-3'(配列番号:25)、
FANCD2 #3:5'-AATAGACGACAACTTATCCATCACC-3'(配列番号:26)、
BRCA1:5'-AAATGTCACTCTGAGAGGATAGCCC-3'(配列番号:27)、
5'-TTCTAACACAGCTTCTAGTTCAGCC-3'(配列番号:28)、
5'-TAGAGTGCTACACTGTCCAACACCC-3'(配列番号:29)、
FANCA:5'-GGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTT-3'(配列番号:30)、
5'-CCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTA-3'(配列番号:31)、
5'-TCCCTCCTCACAGACTACATCTC-3'(配列番号:32)。
オートクレーブしたカバーガラスの上で培養した細胞を処理して、リン酸緩衝食塩水(PBS)でリンスし、室温で10分間、PBSで希釈した3.7%(w/v)のホルムアルデヒド(Sigma)中で固定した。細胞をPBSで一度洗浄し、PB中の0.5%(v/v)NP40において10分間透過化処理し、PBSで再び洗浄し、PBG(PBSにおける0.2%[w/v]の冷却した魚ゼラチン、0.5%[w/v]のBSA)で20分間ブロッキングした。カバーガラスは、室温にて、または4℃にて、加湿されたチャンバーにおいて一次抗体とともに2時間一晩インキュベートし、PBGで5分間を3回洗浄した後、次いで適切な二次抗体とともにインキュベートした。さらにPBGで3回洗浄した後、DAPIを補ったVectashield(Vector Laboratories)にカバーガラスを包埋した。Tritonプレ抽出は、PBS中の0.5% Tritonで、室温にて5分間細胞をインキュベートすることによって行った。PBSによる穏やかなリンスの後、上記の様に、細胞を固定して処理した。イメージは、Axovision 4.5ソフトウェアによりサポートされたAxioCam Mrm Zeissデジタルカメラを備えたAxioplan2 Zeiss顕微鏡で取り込んだ。リンパ芽球性株化細胞におけるIFについては、製造業者によって示唆されたように、無菌のPoly-D-リジン臭化水素酸塩(分子量>300,000(Sigma))でカバーガラスを処理した。細胞を付着した後(数時間)、上記のようにカバーガラスを処理した。いずれの共染色実験にも、異なるチャンネル間のシグナルの交差(crossing)を排除するために、適当な対照を含んだ。
クロマチン分画は、記述したように行った(Mendez and Stillman(2000)Mol Cell Biol 20:8602-8612;Zou et al.(2002)Genes Dev 16:198-208))。免疫沈降については、細胞は、0.5% NP-40、プロテアーゼ阻害剤(Roche)、1mM PMSF、5mM NaFおよび5mM Na3VO4および1mlの溶解緩衝液につき5OUのBenzonase(Novagen)を補ったTBS(20mM Tris +150 mM NaCl)に溶解した。図11Cに示した実験は、Benzonaseを添加することなく行った。1mgのタンパク質抽出物を、2μgの示した抗体および5μlのプロテインA/G PLUS-アガロース(Santa Cruz)と共にインキュベートした。溶解緩衝液での3回の洗浄に続いて、トリス-グリシンSDS試料緩衝液中に免疫沈降物を溶出し、トリス-グリシンゲル(Invitrogen)でサイズ分画した。変性条件下でのストレプトアビジン免疫沈降は、His-精製工程を省略したことを除いて、記述したとおりに行った(Tagwerker et al., 2006)。ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare)は、8M 尿素、200mM NaCl、100mM Tris pH 8、0.5% SDS、0.5% NP40からなる溶解・洗浄液緩衝液とともに使用した。
U2OS細胞をMSCVgfpまたはMSCVdsRedで感染し、これを、TransIT-293(Mirus)を使用して、VSVGベクターとの同時トランスフェクションによって293Tにパックされた。選択することなく、中間体発現についてAria Sorter(BD)を使用して細胞をソートした。gfp細胞は、rfp細胞よりわずかに速く増殖し、DNA損傷薬での処理による生存変化を算出するときに、これを考慮した。siRNAトランスフェクションは、対照siRNA(ルシフェラーゼ)でトランスフェクトされているgfp細胞および関心対象のsiRNAでトランスフェクトされたrfp細胞と共に、上記の通りに行った。トランスフェクション後3日目に、gfpおよびrfp細胞を計数し、1:1の比率で混合し、未処理のまま、またはIRもしくはMMCで処理した。非トランスフェクト細胞の約50%の生存を生じるようにMitomycin C(Sigma)の濃度を選択し、これは、U2OS細胞については約70nM MMCであった。7日の培養の後、全ての細胞を収集して、Cytomix FC500 Analyzer(Beckman Coulter)を使用して解析した。損傷後のLuc siRNA処理した細胞の相対生存率を100%とした。
U2OS細胞は、96ウェル形式において3日間、個々のsiRNAsでトランスフェクトした。細胞を5 Gyで放射線照射し、1時間回復させた後、G2/Mチェックポイントを迂回する細胞をトラップするために培地1 mlにつき100ngノコダゾールを添加した。放射線照射の9時間後に細胞を固定して、Phospho-H3に対する抗体で染色した。プレートは、自動化されたImageXpress Micro(Molecular Dynamics)で10倍にて画像化し、有糸分裂指数をMetaExpress Softwareパッケージを使用して算出した。ウェルあたり平均1000個の細胞を計数した。対照レベル以上を記録したウェルは、ソフトウェアによる正確なスコアリングを検証するために、視覚的に検査した。
S期内チェックポイントを評価するRDSアッセイ法は、以前に記述されたように行った(Silverman et al.(2004)Genes Dev 18:2108-2119)。簡潔には、U2OS細胞は、oligofectamine(Invitrogen)を使用して、対照siRNAまたはKIAA1794に対するsiRNAs(3つのsiRNAs組み合わせ、それぞれおよそ30nM)をトランスフェクトした。24時間後に、10 nCi/mLの[メチル-14C]チミジン(Amersham、CFA532)を含む培地を添加し、細胞を24時間インキュベートした。次いで、標識のない培地を24時間添加した。次いで、細胞には、5-15 Gyでの照射を受けさせた(セシウム137供与源)。37度で30分のインキュベーションに続いて、細胞を20分間、2.5μCi/mL[メチル-3H]チミジン(Amersham、TRK758)で標識して、次いで2.5mMの放射標識のないチミジン(血清なし)を含む培地で2回洗浄した。トリプシン処理によって細胞を収集し、真空マニホールドを使用してWhatman glass microfibre filters(GF/C、25mM、Fisher)でTCA沈澱を行った。エタノール洗浄に続いて、フィルタを乾燥し、液体シンチレーションカウンタ(Beckman LS6000)を使用して計数した。分毎の14Cカウントに対する分毎の3Hカウントの比は、チャンネル交差の結果である分毎のカウントについて修正し、DNA合成の測定とした。
HRアッセイ法は、記述されたように行ったが(Nakanishi et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:1110-1115;Xia et al.(2006)Mol Cell 22:719-729)、I-SceI発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の代わりに、I-SceI酵素を発現するアデノウイルスAdNGUS24i(McMaster大学のFrank Grahamによって提供された)を使用した。対照のアデノウイルスAdCA36(Addison et al.(1997)J Gen Virol 78:1653-1661)は、β-ガラクトシダーゼを発現した。このレベルのウイルスは、100%の感染を生じたが、細胞に対して目で見える有害作用を有さなかったことから、細胞につき5または10 pfuのアデノウイルスを使用した。イベントは、任意の二重項を除外するようにゲートした。ゲートした解析およびゲートしていない解析の両方とも、同様の結果を与えた。
U2OS細胞を24時間2.5mMチミジン(thymidine)で処理し、3回洗浄し、1mlにつき100ngノコダゾールを含む培地へ放出し、12時間インキュベートし、有糸分裂シェイクオフs(mitotic shakeoff)によって収集した。細胞を3回洗浄し、計数して、異なる時間にて収集するためにプレートにまいた。細胞周期解析については、収集された細胞を100μl(PBS)に再懸濁した。ボルテックスしながら、2mlの氷冷70%(v/v)のエタノールを液滴で添加し、懸濁液を少なくとも一晩40℃にて貯蔵した。FACSの30分前に、細胞を遠心沈殿し、プロピジウムヨウ素(PI)の混合物(500μl PBS、10μl RNase[10mg/mlの保存液]、25μl PI[1mg/mlの保存液])に再懸濁して、LSR2(Becton Dickinson)を使用して解析した。細胞周期解析は、FlowJoを使用して行われた。
対数増殖している細胞を計数し、1 mlにつき2×105細胞に希釈し、それぞれの薬物用量について三連でプレートにまき、新たに作製したマイトマイシンCの異なる濃度で処理した。培養の6日後に、細胞を収集し、Z2 Coulter Counter(Beckman Coulter)を使用して計数した。薬物で処理した試料における細胞数は、未処理の試料における細胞数に規準化した。
BLASTを、相同性検索のために使用した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res 25:3389-3402)。SCOPデータベースは、http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/にて見つけることができる(Murzin et al.(1995)J
Mol Biol 247:536-540)。整列は、ClustalXにおいて行い、ESPript 2.2を使用して与えた(http://espript.ibcp.fr;Gouet et al.(1999)Bioinformatics 15:305-308)。FANCIについてのGenBankアクセッション番号は、EF469766である。
ヒトFANCIタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清は、BethylおよびAbcamから購入可能である。
KIAA1794/FANCIは、IR処理に応じてリン酸化が誘導されるタンパク質として同定された(Matsuoka et al., submitted)。その研究では、DNA損傷の前後において、リン酸化抗体とその後の質量分析を使用したSILAC(Mann(2006)Nat Rev Mol Cell Biol 7:952-958)に概説されている)およびペプチド免疫沈降(Rush et al.(2005)Nat
Biotechnol 23:94-101)を、SQまたはTQのモチーフで誘導的にリン酸化されるこれらのタンパク質を同定するために使用した。ヒトKIAA1794タンパク質の3つのリン酸化部位:S730、T952、S1121およびマウスタンパク質の2つのその他の部位S555、T558が検出された。KIAA1794タンパク質は、以下に示すように、このタンパク質をコードする座位が、ファンコニー貧血相補群Iを有する個人において変異型として同定されたので、FANCIと改名した。ホスホ-SQ抗体をでのIR後のFANCIのイムノブロッティングにより、その誘導性のリン酸化が確認され(図1Aを参照、FANCI抗体(BL999)で行ったDNA損傷の前後での293T抽出物からの免疫沈降物に対する、SMC3のリン酸化型(SMC3 pS1083)に対して作られた抗体によるウエスタン解析を示している)、したがって、ATM/ATR経路にそれを位置づけた。
種々の遺伝的混乱がある細胞のDNA損傷感受性を効率的に研究するために、単純な競合アッセイが開発され、定量的かつ迅速であることが証明された(図1Bを参照、これは、多色競合アッセイ法(MCA)を概略的に図示し−ここでは、関心対象のタンパク質のノックダウンにより、gfp細胞が、損傷の非存在下でのこれらの増殖能力に影響せずに、DNA損傷感受性となった。si処理した細胞の損傷に対する相対抵抗性は、非si処理細胞の40%であった)。その色だけが異なっているU20S(骨肉腫)細胞の2つの集団は、赤色蛍光タンパク質(RFP)または緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によって作製された。関心対象のタンパク質のsiRNA枯渇は、緑色細胞で実施され、一方で、赤色細胞は、対照siRNAをトランスフェクトした。同等数の緑色および赤色細胞を混合し、未処理のまま、またはガンマ照射またはマイトマイシンC(MMC)で処理した。7日後に細胞を収集し、緑色細胞に対する赤色細胞の比率を、フローサイトメトリーを使用して決定した。未処理の細胞における赤色細胞に対する緑色細胞の比率は、相対的細胞増殖のための対照として作用した。アッセイは、siRNAsターゲットするATM(IR-感受性)およびATR(MMC-およびIR-感受性)を使用して確認した;図1Cおよび8を参照。図1Cは、ATMおよびATRに対するsiRNAsおよびFANCIに対する3つの異なるsiRNAsで処理したU2OS細胞におけるMCA解析の結果を表し、一方、図8は、ATMまたはATRを枯渇した細胞により行われる多色競合アッセイからの生データを示している)。
FANCIでのBLAST解析により、ヒトからタマホコリカビ(Dictyostelium)の真核生物の中での高度な保存(酵母では保存されない)およびFANCD2に類似した予測された部分的エゾバフンウニ(S.purpuratus)配列までの限定的な保存が明らかになった(図2Aを参照、これは、FANCD2のエゾバフンウニ(S.p.)相同分子種の一部とヒトKIAA1794との保存を同定するBLAST整列を示している。図2Aにおける星は、FANCD2におけるK561に対応するリジンを示す)。相同性領域は、151アミノ酸にわたって及び、19%の同一性、45%の類似性をもつ。FANCIのコード領域は、ヒトリンパ球cDNAライブラリーから増幅され(Elledge et al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:17311735)、150kDaの算出分子量の1328アミノ酸のタンパク質をコードする3984ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを回収した。このcDNAは、染色体15q25-q26上のKIAA1794(Q9NVI1)座位の、推定スプライスバリアントアイソフォーム3に対応した。
ATM/ATR経路は、複数の細胞反応を制御する。FANCIが細胞周期の制御、DNA合成の制御またはDNA損傷に続いて起こる相同的組換えに関与するかどうかを調べた。FANCIに対するsiRNAは、U2OS細胞におけるG2/Mチェックポイントを抑止して(図3Aを参照)、更にS期内チェックポイントにおいて、小さいが再現性のある効果を有した(図3Bを参照)。(図3Aは、FANCIを枯渇した細胞がチェックポイント欠陥を有することを示す。図3Aでに示した実験については、U2OS細胞を概略に示したように処理した。2つの別の細胞の範囲を調べた。2つの範囲からの平均値および標準偏差を示してあり、siRNAにつき平均1000個の細胞を記録した。図3Bは、放射線抵抗性のDNA合成におけるFANCI枯渇の効果を示す。図3Aに示した実験については、3つの異なるsiRNAsの示した組み合わせをトランスフェクトしたU2OS細胞を、実験に応じてγ-IRの5Gyまたは10Gyで照射し、30分間回復させ、そしてDNA合成について三回アッセイした。4回の別の実験の平均値および標準偏差を示してある。比較のために、ATM siRNA-トランスフェクト細胞のIR処理により、未処理の細胞において見られるレベルの70-80%のDNA合成が生じた)。興味深いことに、非照射細胞では、FANCI枯渇により、ゲノムの安定性の維持における役割を示す、γ-H2AXによって判断される損傷の基礎レベルの増加が生じた(図3Cを参照、これは、FANCIの減少により自発滴DNA損傷が生じたことを示す。図3Cにおいて、3つの異なるsiRNAsの示した組み合わせをトランスフェクトしたU2OS細胞を3日後に収集し、γ-H2AXのレベルを、なんら外来性損傷を伴わずにアッセイした。Ran抗体によるウエスタン解析をローディング対照として作用した)。
FANCIの局在を評価するために、形質転換(U2OS、HeLaおよび293T)および初代(BJ)株化細胞に対して免疫蛍光実験を行った。2つの抗体、BL999およびBL1000を使用した解析により、未処理の一部の細胞およびDNA損傷後のほとんど全ての細胞におけるフォーカスが明らかになった。いくつかの実験において、核端染色をまた検出した。それらはFANCD2染色と共存したので、これらのFANCIのフォーカスは、損傷により誘導されたフォーカスに対応した(図4Aを参照、これは、BL999およびBL1000抗体を使用した内因性FANCIの局在化を示しいる;Garcia-Higuera et al.(2001)Mol Cell 7:249-262;図4Aに示した結果については、1μMマイトマイシンCで24時間処理したU2OS細胞を、抗FANCI(BL999またはBL1000)および抗FANCD2抗体で共染色する前にTritonで抽出した)。抗体の特異性の確認は、トランスフェクトしたMyc-FANCIおよび抗Myc抗体を使用して達成した(図11Aを参照、これは、外来性のmycタグの付いたFANCIの局在を示している。図11Aに示した結果については、U2OS細胞に、Myc-タグの付いたFANCI を有するレトロウイルスを導入して、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、細胞を、Tritonプレ抽出無しで、9E10抗体(myc)およびヒトFANCD2に対するウサギ抗体で共染色した)。siRNA処理した細胞は、Tritonプレ抽出の後に、BL999およびBL1000抗体で染色される損傷誘導されたフォーカスの減少を示した(データ示さず)。
3つの別々のsiRNAsを使用したU2OSにおけるFANCIの枯渇により、損傷におけるFANCD2のユビキチン化の減弱を生じ(図4Cを参照、これは、FANCIに対する個々のsiRNAsをトランスフェクトしたU2OS細胞におけるFANCD2のウエスタン解析を示している)、この修飾の喪失は、損傷誘導されたフォーカスにおけるFANCD2シグナルの顕著な減少、並びに目に見えるFANCD2フォーカスのない細胞の出現に対応した(図4Bを参照、これは、FANCIに対する個々のsiRNAsをトランスフェクトした細胞におけるFANCD2の局在を示している)。(図4Bに示した実験結果については、U2OS細胞に、FANCIに対する示した個々のsiRNAsをトランスフェクトし、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、Triton抽出に続いて、細胞をFANCD2およびH2AXに対する抗体で共染色した。図4Cに示した結果については、「L」は、長い(モノユビキチン化した)形態を指示し、一方、「S」は、短い形態のタンパク質を示す。図4Cのアステリスク(*)は、交差反応のバンドを示す)。そのうえ、FANCD2の定常状態量は、FANCIの枯渇により減少した(図4Cを参照)。FANCD2のノックダウンにより、FANCIのフォーカス形成の減少をも引き起こしたので、FANCD2およびFANCIの相互関係も存在した(図11 B上部パネルを参照、これは、FANCD2に対する2つの異なるsiRNAsをトランスフェクトした細胞におけるFANCIの局在を示している。図11B示した結果については、U2OS細胞に、FANCD2に対する示した個々のsiRNAsをトランスフェクトし、1μMマイトマイシンCで処理した。24時間後に、0.5% Triton抽出に続いて、細胞をFANCI、FANCD2またはH2AXに対する抗体で染色した)。FANCIの枯渇によるFANCD2の喪失は、複合体において見いだされている2つのタンパク質に、恐らく起因していた。HAまたはFLAGに対する抗体のいずれかによる、293T細胞に発現したHA-FLAGタグを付けたFANCIの免疫沈降により、内因性FANCD2の免疫共沈降が生じたが、MYCでは生じなかった(図11Cを参照、これは、HA-FLAG FANCIのレトロウイルスを安定に導入した293T細胞を10Gyのγ-IRで処理した結果を示している。図11Cに示した結果については、1mgの総タンパク質を、HA、FLAGまたはMyc抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2抗体によるウエスタンブロッティングによって解析した)。FANCIおよびFANCD2の相互作用は、DNA損傷とは無関係であり、かつ強く、総FANCD2の15-20%を免疫沈降させた。また、内因性FANCIの免疫沈降により、FANCD2を免疫共沈降することができ(図11Dを参照、これは、FANCD2および内因性FANCIの相互作用を示している)、FANCD2抗体での免疫沈降により、FANCIを回収した(図11Eを参照、これは、FANCD2 IP内のFANCD2およびFANCIの相互作用を示している)。(図11Dに示した結果については、FANCD2のWTまたはK561R対立遺伝子を発現するPD20線維芽細胞からの0.5mgの総タンパク質を、非損傷条件下において抗FANCI抗体(BL1000)で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはウサギ抗FANCD2抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した。図11 Eに示した結果については、FANCD2のWTまたはK561R対立遺伝子を発現しており、かつ更にHAFLAGタグを付けたWTまたはK523R対立遺伝子を発現するPD20線維芽細胞からの0.5mgの総タンパク質を、非損傷条件下において抗FANCD2抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはマウス抗HA抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した)。FANCD2のモノユビキチン化がこの相互作用に必要とされるかどうかを試験するために、WT FANCD2またはFANCD2のK561R突然変異体(これは、モノユビキチン化されない;Garcia-Higuera et a1, 2001)を補ったPD20細胞を免疫沈降実験に使用した。これらの細胞に発現されるHA-FLAGタグを付けたFANCIの免疫沈降により、WT FANCD2およびK561R突然変異体FANCD2の両方が回収され(図4D、レーン8および9を参照、これは、FANCD2およびFANCIの相互作用を示す)、これは、FANCD2のユビキチン化がFANCIとFANCD2の相互作用に必要ではなかったことを示している。(図4Dに示した結果については、示した構築物を発現するPD20線維芽細胞からの総タンパク質(0.5mg)を、非損傷条件下でFLAGまたは対照Myc抗体で免疫沈降した。免疫沈降物は、ウサギ抗FANCD2またはマウス抗HA抗体でのウエスタンブロッティングによって解析した)。
FANCIが、FANCD2のユビキチン化部位に対応するFANCIにおいて保存されたリジン残基にて、ユビキチン化されるかどうかを調べた。U2OS細胞、並びに初代BJ線維芽細胞(図5を参照、データ示さず)を含むその他の株化細胞において、2つの非オーバーラップ抗ペプチド抗体で行ったウエスタンブロットに存在するより遅く移動するバンド(図5Aを参照、これは、U20S細胞におけるFANCIのウエスタンブロット分析を示している)は、FANCIの修飾型がこれらの細胞に存在することを指示している。より遅く移動するバンド(長い形態、L)は、未処理の細胞に存在するが、MMC(図5Aを参照)またはHU(図5GおよびHを参照、これらは、それぞれ、USP1およびLacZ対照に対するsiRNAをトランスフェクトし、2mM HUで処理し、15時間後に収集したPD20(FA-D2)線維芽細胞におけるユビキチン化、およびHeLa細胞におけるFANCD2およびFANCIのユビキチン化の解析を示している)によって与えられるDNA損傷後に強度が増加した。長い形態および短い形態(S)間の分子量の差は、モノユビキチン化と一致していた。ユビキチン化について直接試験するために、HAタグを付けたユビキチンを発現する293T細胞からFANCIを免疫沈降して、HA-抗体でイムノブロットした(図5Bを参照、これは、FANCIのインビボでのユビキチン化を示している)。適切なサイズのバンドが同定され、FANCIの長い形態に一致したバンドが、対照細胞においてでなく、HAタグを付けたユビキチンをトランスフェクトした細胞においてのみ見いだされた。図5Bにおいて見られたモノユビキチン化したタンパク質がFANCIに関連したタンパク質であったという可能性を排除するために、His-ビオチン-ユビキチンを発現するHeLa抽出物からのプルダウンを、完全変性条件下でストレプトアビジンにより行った(Tagwerker et al.(2006)Mol Cell Proteomics 5:737-748)。これらの条件において、WT FANCIタンパク質は、沈殿したが、K523R FANCI変異タンパク質は、沈殿しなかった(下記参照)(図5Cを参照、これは、HeLa細胞におけるFANCIのインビボでのユビキチン化を示している)。従って、FANCIタンパク質は、FANCD2タンパク質のように、インビボでモノユビキチン化されることが同定された。(図5Aに示した結果については、U2OS細胞を1μM MMCで処理して、24時間後に細胞は2×Laemmlie緩衝液に直接溶解した。FANCIの長い(L)および短い(S)形態を図5 Aに示してあり、アステリスクは、交差反応バンドを示す。図5Bに示した結果については、HAタグを付けたユビキチンまたはdsRedマーカーを有する対照プラスミドを一過性にトランスフェクトした293T細胞の細胞全体の抽出物を、FANCIに対して作製した抗体を使用して免疫沈降し、FANCI抗体(左)およびHAタグを認識する抗体(右)によるウエスタンブロットによって解析した。図5Cについては、Hisおよびビオチン化シグナルでタグを付けたユビキチンを発現するHela細胞を、2mM HUで16時間処理し、8M尿素に溶解し、変性条件下でストレプトアビジンビーズを使用して沈殿させた。図5Gについては、ベクター、K561R突然変異体またはWT FANCD2を発現する細胞を、2mM HUで処理して、15時間後に収集した。FANCD2タンパク質の非存在(レーン1および2)または存在(レーン3、4、5、および6)を確認するために、FANCD2抗体を含む示した抗体でウエスタンブロッティングを行い、図5Gのアステリスクは、交差反応バンドを示す。図5Hについては、L/Sは、非ユビキチン化FANCIまたはFANCD2に対するモノユビキチン化の比を示す)。
FANCIのE3ユビキチンリガーゼを捜すために、FANCI修飾を、コアE3リガーゼ複合体について欠陥のあるFANCA突然変異体において調べた。FANCAを欠いているFA-A細胞GM6914細胞は、内因性またはHAタグの付いたFANCIのユビキチン化が無いことを示したが(図5F、レーン1、2、5、および6を参照、これは、GM6914(FAA)線維芽細胞におけるユビキチン化の解析を示している)、ユビキチン化は、WT FANCAの補完後に回復した(図5F、レーン3、4、7、8を参照)。(図5Fに示した結果については、ベクターまたはWT FANCAを発現する細胞に、空のベクターまたはHAタグを付けたWT FANCIを安定に導入した。1μM
MMC処理の24時間後に細胞を収集し、示した抗体でウエスタンブロッティングを行った)。
FANCIの保存されたリシン523が、ユビキチン化に必要であるかどうかを決定するために、HAタグの付いたWTまたはK523R突然変異体FANCIを、GM6914(図5Fを参照)および293T細胞において安定に発現させた(図12Aを参照、これは、K523R FANCIのユビキチン化が無いことを示している)。WT FANCIを発現した細胞においてのみL型(ユビキチン化形態)が、HA抗体で検出されたが、K523R突然変異体では、検出されなかった(図5F、レーン7、8、11、12および図12Aを参照)。面白いことに、FANCI K523R突然変異体を過剰発現する細胞は、FANCD2の減弱したモノユビキチン化を示したが、WTでは示さず(図5F、レーン11、12および図12Aを参照)、突然変異体FANCIがドミナントネガティブ活性を示すことを示している。(図12Aに示した結果については、293T細胞に、HA-FLAG-タグを付けたWTまたはK523R FANCI対立遺伝子を安定に導入した。15Gy IRまたは1μM MMC処理の8.5時間後に、細胞を収集し、Laemmli緩衝液に溶解した)。
MMCは顕著だが軽度のIR感受性のみを含む、ファンコニー貧血患者からの細胞と、FANCIのレベルが減少した細胞との表現型の類似性は(図IBを参照)、FANCIの突然変異がヒト疾患の原因である可能性が高いことを示した。公開された報告には、責任遺伝子が未知の残りの相補群、すなわちファンコニー貧血相補群Iのみを含んだ(Levitus et al.(2004)Blood 103:2498-2503)。このグループからの株化細胞が得られ、BD0952と命名され、これは、ファンコニー貧血の古典的症状を有する患者の末梢リンパ球由来のEBV-形質転換細胞株であった。BD0952は、対照細胞と比較して、正常レベルで全長FANCIタンパク質を発現することが同定された(GM03288;図6Aを参照、これは、WT FANCIの発現によるFA-I細胞におけるFANCD2ユビキチン化欠陥の相補を示している)。しかし、このタンパク質は、マイトマイシン
C処理の後でさえ、BD0952細胞においてユビキチン化されない(図6Aを参照およびデータを示さず)。(図6Aに示した結果については、空ベクター、HAタグを付けたWTまたはK523R FANCIを安定に導入した細胞を、100nM MMCで処理または未処理のままで、24時間後にLaemmli緩衝液に溶解することによって収集した。FANCD2、FANCIおよびHA抗体によるウエスタン解析を行った。GM02188(WT対照)細胞は、FANCD2およびFANCIの長い(L、ユビキチン化)形態の存在のための対照として作用し、補完していないBD0952細胞には存在しなかった。導入されたタンパク質の形態は、内因性(E)形態よりもわずかにゆっくり移動するため、T(タグの付いた)として示してある。また、図12Bを参照されたい。これは、WTのHAタグの付いたFANCIがユビキチン化されたことを示す同様の実験を示している。FANCI抗体で行ったウエスタンブロットの露光は、このブロットにおけるFANCIの長い形態を見るのには十分高くはなかった。しかし、導入したタンパク質の形態は、内因性(E)形態よりもわずかにゆっくり移動したので、同定可能であった(タグの付いたというT)。FANCIの長い形態は、HAタグを認識する抗体でプローブしたときに見えた。
上記に記述した顕微鏡観察方法、およびたとえば標識したFANCIポリペプチドおよび/または抗FANCI抗体(たとえば、BL999またはBL1000(Bethyl))を使用して、試験化合物(たとえば、Institute of Chemistry and Cell Biology(ICCB)、Harvard Medicalのコレクション中の489の公知の生物活性化合物)を、IRを媒介したFANCIフォーカス形成の阻害についてスクリーニングする。一次スクリーンを使用して陽性のものを同定し、これは、ハイスループット蛍光顕微鏡観察を使用して、電離放射線への曝露におけるFANCIを含むフォーカスの形成を遮断する薬剤を同定する。たとえば米国特許出願番号11/441,289(参照により本明細書に援用される)に記述されているように、候補化合物を同定し、特徴づける。
当業者であれば、本明細書に記述した本発明の具体的態様に対する多くの均等物、またはルーチン試験のみを使用して確認することができることを認識するであろう。このような均等物は、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
Claims (119)
- 被験体が癌を有するか、もしくは癌であるリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用してFANCIを含むフォーカスの存在について、前記被験体からの試料を試験することを含み、前記FANCIを含むフォーカスの存在は、前記被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能に標識されている、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される請求項1に記載の方法。
- 被験体が癌を有するか、もしくは癌であるリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、癌に関連したコード変化の存在について、前記被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、前記1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、前記被験体における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
- 前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項11に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項11に記載の方法。
- 前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが高いかどうかを決定する方法であって、前記方法は:
(a)前記被験体からDNA試料を提供する工程;
(b)実施例1に示したFANCI遺伝子特異的ポリヌクレオチドプライマーのいずれかで前記被験体からのFANCI遺伝子を増幅する工程;
(c)前記増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスする工程;および、
(d)前記被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較する工程、
を含み、前記2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連した欠陥の存在を示し、
前記1つまたは複数の癌に関連した欠陥の存在は、前記被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法。 - 前記患者がBRCA-1またはBRCA-2遺伝子の欠陥を生じさせる公知の癌を有さない、請求項15に記載の方法。
- 前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項15に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項17に記載の方法。
- 前記癌がメラノーマ、白血病、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 被験体がファンコニー貧血を有するか、もしくはファンコニー貧血を発症するリスクが高いかどうかを診断し、または決定する方法であって、前記方法は、ファンコニー貧血に関連したコード変化の存在について前記被験体のFANCI遺伝子を試験することを含み、前記1つまたは複数のファンコニー貧血に関連したコード変化の存在は、前記被験体におけるファンコニー貧血またはファンコニー貧血のリスクの増加を示す方法。
- 前記ファンコニー貧血に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項20に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項21に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドにおける変化がR1285Qである、請求項21に記載の方法。
- 被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加してしているかどうかを決定する方法であって:
(a)前記被験体からDNA試料を提供する工程;
(b)FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーで前記被験体からのFANCI遺伝子を増幅する工程;
(c)増幅されたFANCI遺伝子をシーケンスする工程;および、
(d)前記被験体からのFANCI遺伝子配列を参照FANCI遺伝子配列と比較する工程、
を含み、前記2つの遺伝子配列の間の相違は、癌に関連したコード変化の存在を示し、
前記1つまたは複数の癌に関連したコード変化の存在は、前記被験体が癌を有するか、または癌を発症するリスクが増加していることを示す方法。 - 前記癌に関連したコード変化がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置におけるFANCIポリペプチドの変化をコードする、請求項24に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項25に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項25に記載の方法。
- 前記癌が、メラノーマ、白血病、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記FANCI遺伝子特異的なポリヌクレオチドプライマーが配列番号:1〜8からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測する方法であって、FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して前記被験体からの試料におけるFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、前記フォーカスの数またはサイズが、対照被験体からの試料におけるフォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、前記被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項30に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能的に標識されている、請求項30に記載の方法。
- 前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項30に記載の方法。
- 前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記新生物障害がメラノーマ、白血病、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項30に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項39に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項39に記載の方法。
- 前記試料が、前記フォーカスの数またはサイズを決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項30に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項43に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項43に記載の方法。
- 前記被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズが対照被検体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズの約70%未満である、請求項30に記載の方法。
- 新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを予測する方法であって、前記被験体からの試料におけるFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定することを含み、前記試料における前記FANCIポリペプチドのユビキチン化の程度が、対照被検体からの試料と比較したときに減少される場合、前記被験体は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応すると予測される方法。
- 前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項47に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項48に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項48に記載の方法。
- 前記試料がFANCIポリペプチドのユビキチン化の程度を決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項47に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射からなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項52に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項52に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用する免疫ブロット分析によって決定される、請求項47に記載の方法。
- 遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性である腫瘍を同定する方法であって、試験被験者からの試料においてFANCIを含むフォーカスのサイズまたは数を決定することを含み、前記フォーカスの数またはサイズが対照被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズと比較して減少される場合、前記試験被験者からの試料は、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に感受性の腫瘍として同定される方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体である、請求項56に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体である、請求項56に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項56に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が検出可能的に標識されている、請求項56に記載の方法。
- 前記検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、ビオチン化ラベおよび蛍光ラベルからなる群より選択される、請求項60に記載の方法。
- 前記試料が心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血およびリンパ球からなる群より選択される組織に由来する、請求項56に記載の方法。
- 前記試料が被験体からの血液試料、被験体からの組織の生検試料および株化細胞からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記腫瘍が、メラノーマ、星細胞腫(astocytoma)、グリア芽細胞腫、神経膠腫、並びに膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、下垂体、腎臓、胃、食道および直腸の癌からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記被験体が、試料が前記被験体から得られる前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項56に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量以下である、請求項65に記載の方法。
- 前記曝露が治療的に有効な用量の約50%以下である、請求項65に記載の方法。
- 前記試料が前記フォーカスの数またはサイズを決定する前に、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に曝露された、請求項56に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬がシスプラチンである、請求項69に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が電離放射線である、請求項69に記載の方法。
- 前記被験体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズが、対照被検体からの試料における前記フォーカスの数またはサイズの約70%未満である、請求項56に記載の方法。
- 前記被験体がヒトである、前述の請求項のいずれか1項に記載の方法。
- ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、
(a)細胞を試験化合物と接触させること;
(b)工程(a)の前、後または同時に前記細胞を遺伝毒性抗新生物化合物と接触させること;
(c)FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片を使用して前記細胞におけるFANCIを含むフォーカスを定量化すること;を含み、前記フォーカスの量が、前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触されたが、前記試験化合物と接触されていない対照細胞におけるよりも少ない場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法。 - 前記請求項74に記載の方法であって:
(d)工程(c)において阻害剤として同定された試験化合物について、前記細胞においてFANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度を決定する工程;をさらに含み、前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度が前記対照細胞におけるよりも少ない場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される方法。 - 前記請求項75に記載の方法であって:
(e)工程(d)において阻害剤として更に同定された試験化合物について、機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を前記試験化合物および前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること;
(f)前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞の感受性を測定すること;および、
(g)前記薬剤に対する前記試験細胞の感受性を前記第2の対照細胞のものと比較すること;
をさらに含み、前記第2の対照細胞は、前記試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、欠陥のあるファンコニー貧血経路を有し;かつ前記試験細胞の感受性が第2の対象細胞の感受性と同等である場合、前記試験化合物は、ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として更に同定される方法。 - 前記FANCIを含むフォーカスの数が工程(c)において決定される、請求項74に記載の方法。
- 前記FANCIを含むフォーカスのサイズが工程(c)において決定される、請求項74に記載の方法。
- 前記工程(c)が高スループット形式で行われる、請求項74に記載の方法。
- 工程(d)における前記FANCIポリペプチドのモノユビキチン化の程度が免疫ブロット分析によって決定される、請求項75に記載の方法。
- 前記抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞および前記第2の対照細胞の感受性が前記抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度における細胞生存を測定することによって決定される、請求項76に記載の方法。
- 前記試験細胞および前記第2の対照細胞がヒト細胞である、請求項76に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項74に記載の方法。
- 非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を同定する方法であって、
(a)機能的なファンコニー貧血経路を有する試験細胞を試験化合物および遺伝毒性抗悪性腫瘍薬と接触させること;
(b)前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に対する試験細胞の感受性を測定すること;および、
(c)前記薬剤に対する前記試験細胞の感受性を対照細胞のものと比較すること、
を含み;前記対照細胞は、前記試験細胞に対して同質遺伝子的であるが、突然変異体FANCI遺伝子を有し;かつ前記試験細胞の感受性が前記対照細胞の感受性よりも高い場合、前記試験化合物は、非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤として同定される方法。 - 前記抗悪性腫瘍薬に対する前記試験細胞および前記対照細胞の感受性が、前記抗悪性腫瘍薬の1つまたは複数の濃度において細胞生存を測定することによって決定される、請求項84に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項84に記載の方法。
- 前記試験化合物がファンコニー貧血経路を阻害しない、請求項84に記載の方法。
- 前記突然変異体FANCI遺伝子がK523、K1269、R1285、S730、T952、S1121およびP55からなる群より選択される位置に前記FANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項88に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項88に記載の方法。
- 前記試験細胞および対照細胞がヒト細胞である、請求項84に記載の方法。
- 癌治療的薬をスクリーニングする方法であって:
(a)1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有するFANCI遺伝子を含む1つまたは複数の細胞を提供する工程;
(b)潜在的癌治療薬の存在下において前記細胞を増殖する工程;および、
(c)前記潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較して、前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率を決定する工程、
を含み、
前記潜在的癌治療薬の非存在下において増殖した同等の細胞の増殖率と比較した、前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率の減少は、前記潜在的癌治療薬が癌治療薬であることを示す方法。 - 前記1つまたは複数の癌に関連した欠陥を有する前記FANCI遺伝子が、K523、K1269、R1285、S730、T952、Sl121およびP55からなる群より選択される位置に前記FANCIポリペプチドの変化をコードするコード変化を含む、請求項92に記載の方法。
- 前記位置がR1285である、請求項93に記載の方法。
- 前記FANCIポリペプチドの変化がR1285Qである、請求項93に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項92に記載の方法。
- 前記細胞がBD0952細胞である、請求項92に記載の方法。
- 化学感作薬をスクリーニングする方法であって:
(a)FANCIの潜在的阻害剤を提供する工程;
(b)1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬に耐性である腫瘍株を提供する工程;
(c)前記腫瘍株および前記FANCIの潜在的阻害剤を前記1つまたは複数の抗悪性腫瘍薬と接触させる工程;および、
(d)前記FANCIの阻害剤および前記抗悪性腫瘍薬の存在下において前記腫瘍株の増殖速度を測定する工程、
を含み、
前記抗悪性腫瘍薬の存在下および前記FANCIの阻害剤の非存在下における腫瘍株の細胞と比較した、前記腫瘍株の増殖速度の減少は、前記潜在的阻害剤が化学感作薬であることを示す方法。 - 遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、遺伝毒性抗悪性腫瘍薬を受けているが、前記薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与することを含む方法。
- 前記FANCIの阻害剤がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片および抗FANCI RNA干渉薬からなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
- 前記FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項100に記載の方法。
- 前記抗FANCI RNA干渉薬が配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24からなる群より選択されるFANCIの配列をターゲットする、請求項100に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項99に記載の方法。
- 遺伝毒性抗悪性腫瘍薬での治療に対して被験体を感作する方法であって、
(a)遺伝毒性抗悪性腫瘍薬で治療を受けているが、前記薬剤に耐性である被験体にFANCIの阻害剤を投与する工程;および
(b)非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤を被験体に投与する工程
を含む方法。 - 前記FANCIの阻害剤がFANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片および抗FANCI RNA干渉薬からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記FANCIに特異的な抗体またはその抗原結合断片がBL999およびBL1000からなる群より選択される抗KIAA1794抗体である、請求項105に記載の方法。
- 前記抗FANCI RNA干渉薬が配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24からなる群より選択されるFANCIの配列をターゲットする、請求項105に記載の方法。
- 非ファンコニー貧血DNA損傷修復経路の阻害剤が、PARP阻害剤、DNA-PK阻害剤、mTOR阻害剤、ERCC1阻害剤、ERCC3阻害剤、ERCC6阻害剤、ATM阻害剤、XRCC4阻害剤、Ku80阻害剤、Ku70阻害剤、XPA阻害剤、CHK1阻害剤およびCHK2阻害剤からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が、1,3-ビス(2-クロロエチル)-1-ニトロソ尿素、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、テモゾロマイド、トポテカンおよび電離放射線からなる群より選択される、請求項104に記載の方法。
- 前記遺伝毒性抗悪性腫瘍薬が前記FANCIの阻害剤および前記非ファンコニー貧血DNA修復経路の阻害剤と同時に投与される、請求項104に記載の方法。
- 癌患者における治療薬の有効性を予測する方法であって:(a)前記治療薬で治療される前記癌患者から組織試料を提供する工程;(b)前記組織試料の細胞においてDNA損傷を誘導する工程;(c)前記細胞においてユビキチン化されたFANCIタンパク質の存在を検出する工程を含み;前記ユビキチン化されたFANCIの存在は、前記癌患者における前記治療薬の有効性の減少を示す方法。
- 被験体が癌を有するか、または癌のリスクが高いかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体または抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および請求項1に記載の方法を行うための説明書を含むキット。
- 新生物障害がある被験体が遺伝毒性抗悪性腫瘍薬に反応するであろうかどうかを決定するためのキットであって、FANCIに特異的な抗体または抗原結合断片、そのためのパッケージング材料および請求項30に記載の方法を行うための説明書を含むキット。
- ファンコニー貧血経路の阻害剤を同定するためのキットであって、請求項74に記載の試験細胞および対照細胞とそのためのパッケージング材料とを含むキット。
- 非ファンコニー貧血経路の阻害剤を同定するためのキットであって、請求項84に記載の試験細胞および対照細胞とそのためのパッケージング材料とを含むキット。
- BD0952細胞の突然変異体FANCIヌクレオチド配列を含む単離されたヌクレオチド配列。
- 図9に示したBD0952細胞の突然変異体FANCIポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド配列。
- FANCIポリペプチドのN末端の200アミノ酸残基に融合されたGSTを含む単離されたポリペプチド配列。
- 配列番号:22、配列番号:23および配列番号:24からなる群より選択されるFANCI標的に対する抗FANCI siRNA。
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